CN103124570A - 无细胞血管产物 - Google Patents
无细胞血管产物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103124570A CN103124570A CN2011800463525A CN201180046352A CN103124570A CN 103124570 A CN103124570 A CN 103124570A CN 2011800463525 A CN2011800463525 A CN 2011800463525A CN 201180046352 A CN201180046352 A CN 201180046352A CN 103124570 A CN103124570 A CN 103124570A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acellular
- product
- blood vessel
- tissue
- ica
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000002792 vascular Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 93
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims abstract description 9
- 210000004004 carotid artery internal Anatomy 0.000 claims description 108
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 88
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 65
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 claims description 53
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 claims description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 32
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 28
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 28
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 20
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 15
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 13
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 12
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 12
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 9
- 210000003090 iliac artery Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims description 8
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 claims description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 5
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 claims description 5
- -1 factor Xa inhibitor Chemical compound 0.000 claims description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 3
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 claims description 3
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 claims description 3
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OVBICQMTCPFEBS-SATRDZAXSA-N (2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-acetamido-3-naphthalen-2-ylpropanoyl]amino]-3-(4-chlorophenyl)propanoyl]amino]-3-pyridin-3-ylpropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-6-[bi Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.C([C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN=C(NCC)NCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN=C(NCC)NCC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@H](C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](CC=1C=NC=CC=1)NC(=O)[C@@H](CC=1C=CC(Cl)=CC=1)NC(=O)[C@@H](CC=1C=C2C=CC=CC2=CC=1)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OVBICQMTCPFEBS-SATRDZAXSA-N 0.000 claims description 2
- 229940123900 Direct thrombin inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 claims description 2
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 claims description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 2
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108700032141 ganirelix Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001349 mammary artery Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001758 mesenteric vein Anatomy 0.000 claims description 2
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 2
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 claims description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 claims description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical group [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 claims 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 75
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 51
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 50
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 19
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 17
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 15
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 108010070228 surgisis Proteins 0.000 description 11
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 10
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 10
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 10
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 10
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 108010025435 Permacol Proteins 0.000 description 9
- 241000881705 Porcine endogenous retrovirus Species 0.000 description 9
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 9
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 9
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 9
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 6
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 6
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 5
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 4
- FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N diazinon Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC(C)=NC(C(C)C)=N1 FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 4
- DVNYTAVYBRSTGK-UHFFFAOYSA-N 5-aminoimidazole-4-carboxamide Chemical compound NC(=O)C=1N=CNC=1N DVNYTAVYBRSTGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 3
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 3
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 210000005097 arteria cerebelosa anteroinferior Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 3
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 2
- 101710172562 Cobra venom factor Proteins 0.000 description 2
- 102000055157 Complement C1 Inhibitor Human genes 0.000 description 2
- 108700040183 Complement C1 Inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 229920001651 Cyanoacrylate Polymers 0.000 description 2
- MWCLLHOVUTZFKS-UHFFFAOYSA-N Methyl cyanoacrylate Chemical compound COC(=O)C(=C)C#N MWCLLHOVUTZFKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282894 Sus scrofa domesticus Species 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- IPZJQDSFZGZEOY-UHFFFAOYSA-N dimethylmethylene Chemical group C[C]C IPZJQDSFZGZEOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- JECYNCQXXKQDJN-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methylhexan-2-yloxymethyl)oxirane Chemical compound CCCCC(C)(C)OCC1CO1 JECYNCQXXKQDJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJVRPNIWWODHHA-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoprop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)C#N IJVRPNIWWODHHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YGEHCIVVZVBCLE-FSYGUOKUSA-N 3alpha-galactobiose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](O)C=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YGEHCIVVZVBCLE-FSYGUOKUSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- GXGJIOMUZAGVEH-UHFFFAOYSA-N Chamazulene Chemical group CCC1=CC=C(C)C2=CC=C(C)C2=C1 GXGJIOMUZAGVEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004821 Contact adhesive Substances 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000289581 Macropus sp. Species 0.000 description 1
- 241000289419 Metatheria Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- FCBXCSMDIVQNDS-UHFFFAOYSA-N O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na].[Na].OP(O)(O)=O Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na].[Na].OP(O)(O)=O FCBXCSMDIVQNDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000288935 Platyrrhini Species 0.000 description 1
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 241000533293 Sesbania emerus Species 0.000 description 1
- 241000271567 Struthioniformes Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010060872 Transplant failure Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000001765 aortic valve Anatomy 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 235000010985 glycerol esters of wood rosin Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003692 ilium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 230000002879 macerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000005033 mesothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 1
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001846 repelling effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/04—Hollow or tubular parts of organs, e.g. bladders, tracheae, bronchi or bile ducts
- A61F2/06—Blood vessels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
- A61L27/3625—Vascular tissue, e.g. heart valves
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3695—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the function or physical properties of the final product, where no specific conditions are defined to achieve this
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/507—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials for artificial blood vessels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Battery Electrode And Active Subsutance (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种包含天然无细胞异种血管组织基质的产物，所述无细胞异种血管组织基质的DNA含量与未处理对照血管组织基质相比有至少80%的下降，并且通过基本不含能与预形成人抗体反应的表位并且也没有实质性活化补体的能力而为抗原惰性。本发明也包含制备这种产物的方法和所述产物特别在搭桥手术中的应用。
Description
本发明涉及无细胞异种基质且特别是小和中等直径血管产物例如物理相容和非免疫原性的无细胞(acellular)动脉。本发明包含无细胞产物特定在血管搭桥手术中的应用和生成无细胞血管基质的方法。
背景技术
补体活化是实体器官移植物中炎症和排斥的潜在调节物和诊断指示物。补体级联中一系列效应分子机械化地调节促炎功能，所述促炎性功能能引起先天免疫系统细胞（例如粒细胞和单核细胞）的趋化作用和活化。同时，很多这些相同的补体调节物活化和破坏受体和移植物之间的内皮细胞界面，另外，补体能刺激获得性免疫系统的B和T淋巴细胞。补体也参与凋亡细胞的非炎性清除。因此，所述补体级联能由多个机制活化，并且各种补体成分能调节不同方向上对移植物的反应。
因为受体免疫系统响应会产生很多障碍，至今尚没有异种移植术试验完全成功。这种反应通常比异体移植术更极端，最终造成异种移植物的排斥。有数种异种移植物排斥类型:源于体液免疫系统响应的超急性排斥和急性血管排斥，以及基于细胞免疫的细胞排斥和慢性排斥。
超急性排斥由异种反应性天然抗体(XNA)与供体内皮之间的结合来调节，所述结合造成人补体系统的活化，主要表位XNA靶标是由于酶α1,3半乳糖转移酶(α1,3gt)的糖基化而在非灵长类哺乳动物和新大陆猴的糖脂和糖蛋白上丰富存在的α-gal表位(galα1-3galβ1-(3)4glcnac-r)。因为α1,3gt基因在祖先旧大陆灵长类动物中失活，这种表位在人、猿和旧大陆猴中不存在，相反，人、猿和旧大陆猴生成抗gal抗体，所述抗体与α-gal表位特异结合并且构成约1%循环免疫球蛋白。源于α-gal表位的免疫反应是异种器官/组织移植失败的重要因素。异种移植物上天然抗gal抗体和α-gal表位之间相互作用的消除是人中异种移植成功的先决条件。抗gal有作为免疫屏障的功能，防止猪器官移植到人中，因为抗gal结合猪细胞上表达的α-gal表位。从现有技术已知生成缺乏α-gal表位的α1,3gt敲除猪，造成这种免疫屏障的部分消除和因此部分克服超急性排斥，然而转基因生成猪既昂贵且耗时。另外，α1,3gt敲除动物的组织上仍然表达低但是潜在显著水平的galα(1,3)gal，指示了另一种糖基转移酶参与这种表位的合成(Milland等，Immunol.Cell Biol2005,83,687-693)。从现有技术也已知绿咖啡豆α-半乳糖苷酶和重组人α-半乳糖苷酶能去除组织（如猪主动脉瓣和心包组织）细胞表面的α-gal表位，但是酶处理不仅在成本效率上有局限性而且影响组织的组织工程学和留有不需要的酶残留物。为了克服超急性排斥，已知通过使用眼镜蛇毒因子(耗尽C3)、可溶性补体受体1型、抗C5抗体或C1抑制剂(C1-INH)来抑制受体的补体级联。这个方法的缺点包含眼镜蛇毒因子的毒性，和最重要的是这些处理会剥夺功能补体系统的个体。在血管排斥方面，如果预防了超急性排斥，2-3天内不协调异种移植物中发生此类排斥。所述工艺比超急性排斥复杂许多，并且当前没有完全理解，然而，如果避免了超急性和急性血管排斥，异种移植物存活的适应性是可能的，尽管存在循环XNA。当所述补体级联反应被打断，循环抗体被去除或其功能改变，或者移植物表面抗原表达改变时，体液排斥破坏了所述移植物。这使得异种移植物上调并且最终表达保护基因。
因此，需要无细胞异种血管基质不活化补体。也需要无细胞异种血管基质没有抗原组分和特别是α-gal表位，从而减少了抗体介导的炎症反应。也需要提供为搭桥手术制备小和中等直径血管产品的替代物的或更具成本效益的方法。也需要为没有残基α-半乳糖苷酶酶残基的移植术提供的无细胞异种血管基质。
发明简述
由于本发明的第一方面提供了包含天然无细胞异种血管组织基质（所述组织基质的DNA含量相比于未处理的对照血管组织基质有至少80%下降）的产物，所述产物基本没有能与预形成人抗体反应的表位并也没有实质性（substantially）活化补体的能力。
本文提到“没有实质性（substantially）活化补体的能力”指示了本发明产物在补体活化试验中具有与新鲜人股动脉大致相同水平的补体活化。
优选所述无细胞异种血管组织基本没有α-gal表位。
本文提到“基本没有能与预形成人抗体反应的表位”指示了本发明产物有与新鲜或无细胞人股动脉大致相同的α-gal表位水平。
优选地，所述无细胞异种血管组织基质可以有相较未处理对照或天然血管组织基质至少80%或更多的DNA含量下降，即其可以有大于80%和最大100%的任何整数下降。
优选地，所述血管组织来源于猪或牛。优选猪衍生血管组织是小或中等直径血管，并更优选是猪髂外动脉(EIA)或猪颈内动脉(ICA)。
应理解所述血管组织可以来源于其他哺乳动物物种，例如但不限于绵羊或美洲驼、大的禽类物种(如鸵鸟)和大的有袋目哺乳动物物种(如袋鼠)。
应理解所述血管组织也可以是大直径血管，例如猪或牛主动脉。
本文体积“小直径”血管是本领域可接受的术语，并且指内部或内径小于6mm的血管，而“中等直径”指有内部或内径为6-15mm的血管，和“大直径”指内部或内径约25mm的血管。
在所述无细胞异种血管组织基质来源于牛的本发明实施方式中，所述血管组织选自颈动脉、乳内动脉、胸廓内动脉、肠系膜静脉和颈静脉。
优选地，所述无细胞异种血管组织相较新鲜或未处理组织有等同或基本不同的胶原、糖胺聚糖和弹性蛋白含量。
通常新鲜未处理ICA组织的胶原水平范围为400-1000μg/mg和更优选范围600-800μg/mg，以及对EIA而言范围为200-1000μg/mg和更优选范围450-650μg/mg。通常，新鲜未处理ICA和EIA组织的所述糖胺聚糖水平范围为25-200μg/mg，和更优选范围50-100μg/mg。
优选地，所述无细胞异种血管组织相较新鲜或未处理组织有等同或未显著不同的爆破压力值、缝线保留值、极限抗张强度值、扩张值和低应变率破坏值。
通常新鲜未处理ICA和EIA组织的平均爆破压力大于3000mmHg，通常新鲜未处理ICA和EIA组织的缝线保留范围为1-5N，通常新鲜未处理ICA和EIA组织的低应变率破坏是轴向的且范围为2.5-6.5MPa，更优选范围3.5-5.5MPa，圆周方向上范围为1-6MPa且更优选范围2-5MPa，通常新鲜未处理ICA和EIA组织的平均极限抗张强度值范围为3-5MPa。
优选猪衍生的无细胞异种血管组织的典型长度至多约30cm且牛衍生组织至多约80cm。
本发明无细胞异种血管组织是天然支架（scaffold），即遗传上没有改变，并且基本没有任何α-半乳糖苷酶酶残基。另外，优点是具有与新鲜或未处理组织大约相同的生物化学和机械属性，从而其用作新鲜或未处理组织而同时为有效的抗原惰性。因此其是移植和搭桥置换手术的理想产品候选。
优选所述无细胞异种血管组织还包含涂层，所述涂层由合适材料涂覆内表面(腔)或其外表面之一或两者而成。本发明的这个实施方式对血管移植物特别有用。
优选地，选择所述涂层材料以提高血管通畅，或者帮助/恢复血管腔或血管腔内表面上排列的表皮细胞。
优选地，所述涂层是腔涂层，和所述涂层材料选自：抗凝剂如肝素、合成的五糖抑制剂、直接凝血酶抑制剂、维生素K拮抗剂、因子Xa抑制剂、银、胶原IV、弹性蛋白、糖蛋白如层连蛋白或纤连蛋白、糖胺聚糖如透明质酸、硫酸软骨素和合成或天然的肽或其混合物。
优选地，所述无细胞异种血管组织可以在其上或其内接种单细胞群或混合细胞群，根据移植位点选择所述细胞群，并且所述细胞群选自上皮细胞如内皮细胞、间皮细胞或平滑肌细胞、成纤维细胞、多潜能（pluripotent）和多能干细胞如自体和同源成人干细胞、造血、间充质、神经元、内皮以及胚胎干细胞。
根据本发明的其他方面，提供了制备天然无细胞异种血管组织的方法，所述方法包含获得合适的置换血管并用于下面方法步骤处理：
(i)用EDTA孵育；
(ii)第一消毒洗涤；
(iii)至少两轮用低渗缓冲液和阴离子去污剂孵育；
(iv)核酸酶处理；
(v)高渗洗涤；和
(vi)最终灭菌工艺。
优选步骤(i)和(ii)可以逆序进行，确实，本发明步骤并不局限于上面给定的顺序，并且也不意在限定本发明的范围。
优选所述EDTA孵育在高渗缓冲液如50mM TRIS、1.5M NaCl中进行，典型操作是200mM EDTA在所述高渗缓冲液中约4°C持续至少24小时。所述高渗缓冲液有非常轻度碱性的大致生理pH，并且是约pH7.2-7.4。
优选步骤(ii)的第一消毒洗涤包括含有万古霉素、庆大霉素和多粘菌素的低渗缓冲溶液中的洗涤，合适的洗涤段是在约37°C温度约30分钟。
优选地，步骤(iii)的所述低渗孵育步骤包含用通常含有10mM TRIS的低渗缓冲液进行第一孵育，和随后用额外含有2.7mM EDTA、10KIU/ml抑肽酶的低渗缓冲液孵育。孵育条件通常是约4°C下持续24–56小时。对进一步孵育，所述低渗缓冲液还包含阴离子去污剂如约0.1%(w/v)浓度下的SDS，此部分孵育中温度为约37°C。这种孵育循环能重复一次或多次。
优选地，在对组织进行步骤(iv)的核酸酶处理前，所述组织可随后在杜尔伯科磷酸盐缓冲盐水中重复洗涤。所述核酸酶处理通常包含在含有50mMTRIS、50U/ml DNA酶和1U/ml RNA酶的核酸酶溶液中37°C孵育约3小时。然后在步骤(v)前重复洗涤所述组织。
优选地，步骤(v)的高渗孵育包含在50mM TRIS、1.5M NaCl中于约37°C孵育24小时。然后在步骤(vi)前重复洗涤所述组织。
优选地，在存储或移植到受体前，最终灭菌工艺清除了病毒并降低了无细胞异种血管组织生物负载。
所述最终灭菌步骤可以理想地由一种或多种下列工艺进行：抗微生物剂如抗生素的结合或涂覆，防御素和金属如Ag2+;用交联剂如戊二醛、碳二亚胺处理;用杀菌剂如过氧乙酸、环氧乙烷、环氧丙烷和氢氧化钠处理，用例如γ或e-束辐射和用超临界CO2处理。
灭菌步骤可以例如是第二消毒洗涤，包括含有用过氧乙酸以约0.1%v/v浓度37°C孵育约4小时的步骤。然后，所述组织可进一步用合适的末端清洗溶液如杜尔伯科磷酸盐缓冲盐水洗涤。
所述浓度和孵育条件不意在限定本发明的范围，而仅提供示例性方法条件。
优选地，所述方法还包含用本文所述涂层剂涂覆天然无细胞异种血管组织的内和/或外表面的步骤。
优选地，所述方法还包含用本文前述单细胞群或混合细胞群接种天然无细胞异种血管组织的步骤。
血管组织如动脉是有效的管，并且因此非常难于确保有效处理动脉腔的内表面以除去能与预形成人抗体反应的表位和能活化补体的表位。在本发明的一个实施方式中，所述血管组织可以用连续移动流体培养基灌注。此外或替代地，所述血管组织还可以在制备和孵育步骤中扩张，从而使血管组织的壁变薄以鼓励多种液体渗透。本发明人证实本发明的方法甚至对内表面产生成功的处理。
根据本发明其他方面，提供了包含由本发明方法所获得天然无细胞异种血管组织基质组织产物的产品，用作移植组织。
优选所述移植组织产物用于搭桥手术且和特别是冠状动脉和肢搭桥手术，还用于血管通路例如AV通路。
本发明使用牛衍生血管组织的实施方式在肢搭桥手术中特别有用，并且由于血管材料的长度为至多80cm的长度范围而作为血管通路方法。
根据本发明其他方面，还提供了血管搭桥手术的方法，包含用本发明第一方面或通过本发明方法制备的天然无细胞异种血管组织基质组织产物取代受损或阻塞的血管。
附图简要说明
下面参照附图进一步描述本发明的实施方式，其中：
图1显示了生成无细胞组织的脱细胞操作的流程图。
图2显示了使用两轮低渗缓冲液和SDS溶液(1mg.ml-1)处理并且然后使用苏木精和伊红染色的猪颈内动脉(ICA)（图2A-H）和髂外动脉(EIA)（图I-L）。
图3显示了使用两轮低渗缓冲液和SDS溶液(1mg.ml-1)处理以及使用DAPI染色的猪ICA(C-D)和EIA(E-F)。新鲜猪ICA(A)和EIA(B)用作阳性对照。
图4显示了使用两轮低渗缓冲液和SDS溶液(1mg.ml-1)处理的新鲜(C)和无细胞猪EIA，图D和E使用针对α-Gal表位、或同种型对照(F)的单克隆抗体标记。新鲜猪皮用作阳性对照(A,B)。
图5显示的无细胞ICA使用200mM EDTA在4°C下(E-)和一轮高渗缓冲液37°C下处理，以及使用针对α-Gal表位的单克隆抗体标记。图5A、B、E和F用粗抗体标记，图C和G用0.39mg.ml-1纯化抗体，且图D和H用0.16mg.ml-1纯化抗体。
图6显示的无细胞EIA根据图1方案制备和使用针对α-Gal表位、纯化(A)、针对BSA吸收(B)、或针对α-Gal BSA吸收(C)或IgM同种型对照(D)的单克隆抗体标记。
图7显示了使用针对α-Gal表位、纯化(A)、针对BSA吸收(B)、或针对α-Gal BSA吸收(C)或IgM同种型对照(D)的单克隆抗体标记的无细胞ICA。
图8显示了用新鲜和无细胞、猪和人同种异体血管吸收后，用于检测α-Gal表位的抗体的ELISA。数据表示为平均值(n=6)±95%置信区间。*表示了由单向ANOVA和事后T检验测定的显著差异。ICA新鲜的猪ICA;AICA无细胞猪ICA;CFA新鲜人股总动脉;ACFA无细胞人股总动脉;EIA新鲜猪髂外动脉;AEIA无细胞猪髂外动脉;NTC无组织对照。
图9显示了新鲜和无细胞猪EIA(图9A)和ICA(图9B)的胶原、变性胶原和硫酸蛋白聚糖含量。数据表示为平均值(n=6)±95%置信区间。
图10显示了用氰基丙烯酸盐培养的幼仓鼠肾细胞接触粘合剂(A)胶原凝胶(B,E),或无细胞猪EIA(C,F)和ICA(D,G)48小时，使用相差显微术观察和使用吉姆萨染色剂染色。
图11显示了用氰基丙烯酸盐培养的小鼠3T3细胞接触粘合剂(A)胶原凝胶(B,E),或无细胞猪EIA(C,F)和ICA(D,G)48小时，使用相差显微术观察和使用吉姆萨染色剂染色。
图12显示了用新鲜或无细胞猪EIA(图12B)和ICA(图12A)提取物样品孵育的小鼠3T3细胞的相对ATP含量，或者用新鲜或无细胞猪EIA(图12D)和ICA(图12C)提取物样品孵育的幼仓鼠肾细胞的相对ATP含量，用DMSO40%(v/v)孵育的每个样品用作细胞毒性的阳性对照且DMEM作为细胞毒性的阴性对照。数据表示为平均值(n=6)±95%置信区间。*表示了由单向ANOVA和事后T检验测定的与DMSO对照的显著差异。
图13显示了从新鲜和无细胞猪EIA和ICA、新鲜和无细胞人股总动脉(CFA)、Surgisis、Permacol和CollaMend提取的DNA定量，使用260nm吸光度。数据表示为平均值(n=3)±95%置信区间。
图14显示了新鲜和无细胞猪EIA和ICA的缝线保留测试。数据表示为平均值(n=6)±95%置信区间。
图15显示了新鲜和无细胞猪ICA(A,B)和EIA(C,D)的扩张测试，数据代表随着内压增加而变化的根直径中变化百分比。X轴(A,C)或Y轴(C,D)。数据表示为平均值(n=3)±95%置信区间，所述数据已反正弦变换以进行前后（on and back）转换的统计分析。
图16显示新鲜和无细胞猪EIA(A)和ICA(B)的圆周方向和轴向上的极限拉伸强度。数据表示为平均值(n=6)±95%置信区间。
图17显示新鲜和无细胞猪EIA(A)和ICA(B)的圆周方向和轴向上的胶原蛋白相位斜率（collagen phase slope）。数据表示为平均值(n=6)±95%置信区间。
图18显示新鲜和无细胞猪EIA(A)和ICA(B)的圆周方向和轴向上的弹性蛋白相位斜率。数据表示为平均值(n=6)±95%置信区间。
图19显示了正常人血清与组织培养塑料、PBS、BSA、α-Gal BSA或酵母聚糖反应后，检测(a)C3a或(b)C5a的ELISA。数据表示为平均值(n=6)±95%置信区间，*代表单向ANOVA和事后T检验测定的显著差异[与聚苯乙烯相比]。
图20显示了正常人血清与组织培养塑料、PBS、BSA、α-Gal BSA或酵母聚糖或者一定范围的市售可得无细胞生物支架(Surgisis,Collamend,Permacol)反应后，检测(a)C3a或(b)C5a的ELISA。数据表示为平均值(n=6)±95%置信区间，*代表单向ANOVA和事后T检验测定的显著差异[与聚苯乙烯相比]。心包膜新鲜猪心包膜;输尿管,新鲜猪输尿管,ICA,新鲜猪ICA EIA,新鲜猪髂外动脉AICA,无细胞猪ICA CFA,新鲜人股总动脉AP,无细胞猪心包膜AU,无细胞猪输尿管AICA,无细胞猪颈内动脉AEIA,无细胞猪髂外动脉,ACFA无细胞人股总动脉。
具体实施方式
在整个说明书的描述和权利要求书中，词语“包含”和“含有”及其变型是指“包括但不限于”，并且其并不旨在（以及不）排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。在本说明书的描述和权利要求书中，除非另有说明，单数形式也包括复数。具体说，使用不定冠词时，除非上下文另有说明，本说明书应理解为考虑到复数以及单数。
应理解，除非与之不相容结合本发明的特定方面、实施方式或实施例描述的特征、整数、特症、化合物、化学部分或基团也可应用于本文所述的任何其它方面、实施方式或实施例。本说明书（包括任何所附权利要求、摘要和附图）中公开的所有特征和/或如此公开的任方法或工艺的所有步骤可以任何方式组合，除了其中至少一些此类特征和/或步骤相互排斥的组合。本发明不限于任何上述实施方式的细节。本发明延伸至本说明书（包括任何所附的权利要求、摘要和附图）所公开特征的任一新型组合或任何新型组合，或者延伸至如此公开的任何方法或工艺步骤的任一新型组合或任何新型组合。
读者应注意，与本申请相关的与本说明书同时或之前提交的并且与本说明书一起向公众查阅开放的所有论文和文献，以及所有这些论文和文献的内容均以引用的方式并入本文。
本发明提供了无细胞产物和其生成方法。鉴定了两种特别合适的血管，猪髂外和颈内动脉，以及初步研究建立了能从血管中去除全部细胞和>80%DNA的方案，这是基于分别使用两轮4°C下低渗缓冲液和37°C下1mg.ml-1SDS溶液。当使用苏木精和伊红与DAPI染色时，使用单轮低渗缓冲液和SDS溶液脱细胞的血管显示了残留细胞和细胞残余物的存在。因此选择两轮低渗缓冲液和SDS作为最优脱细胞的工艺，因为其能可靠生成无细胞血管。
使用针对α-Gal表位的单克隆抗体的抗体标记显示了其在无细胞髂外动脉和颈内动脉中存在。使用冷冻包埋（cryoembedd）的组织样品、锌固定的石蜡包埋样品和福尔马林固定的石蜡包埋样品进行抗体标记。市售仅有从单一来源的单个抗体；其作为粗制品提供。相对于IgM负对照抗体，所述粗制品持续生成高背景染色。所述抗体使用IgM结合柱纯化。所述抗体然后透析和使用离心过滤设备浓缩。使用纯化抗体的标记显示了相较所述粗制品的显著下降背景水平。冷冻包埋样品生成了最敏感标记且福尔马林固定样品生成最弱标记。因此，锌固定石蜡包埋样品用作标准技术，因为产生优于冷冻包埋样品的组织学和比福尔马林固定样品增加的灵敏度。当与新鲜对照组织相比时，遍布所述基质的α-Gal水平基本更低。然而，可检测所述表位。通过使用增加轮的低渗缓冲液和SDS溶液循环来尝试去除α-Gal表位。单克隆抗体标记显示了当相较单轮循环使用两轮循环时，α-Gal水平基本没有下降。
两轮低渗缓冲液和SDS溶液未能从无细胞基质中去除α-Gal。假设从血管腔表面去除内皮细胞的起始步骤会减少无细胞基质中的α-Gal量。为此，在脱细胞工艺前使用Versene和各种浓度EDTA，从而螯合任何金属离子以帮助从血管腔释放内皮细胞。使用200mM EDTA在4°C预处理25小时证明成功地降低有无细胞血管的α-Gal水平，这纳入到本发明的脱细胞工艺。
脱细胞后，在脱细胞工艺中使用高渗缓冲液(10mM Tris,1.5M氯化钠pH7.4)处理以进一步降低无细胞心血管组织中存在的α-Gal水平。其他抗体标记显示了一轮37°C下高渗缓冲液持续24小时与使用200mM EDTA4°C下搅拌预处理24小时组合成功地降低了有无细胞血管的α-Gal水平。也显示了增加轮(至多三轮)的37°C下高渗缓冲液处理在降低α-Gal上非显著改善。
为了测定在无细胞基质中是否有残留α-Gal，测定抗体的特异性是基础的。这通过使用α-Gal BSA吸收纯化抗体完成。也包含BSA作为对照。吸附后，所述α-Gal抗体可以结合到α-Gal BSA，并且因此消除在标记组织中结合任何α-Gal表位的能力。因此，使用这种方法的任何染色能视作背景。仅使用BSA的吸附显示了蛋白:蛋白相互作用不影响抗体检测α-Gal表位的能力。比较使用吸附有BSA的抗体与吸附有脱细胞组织的α-Gal BSA的抗体，和用α-半乳糖苷酶处理的脱细胞组织获得的数据，表明了：无细胞EIA显示了有能进一步使用酶降低的残留α-Gal。这种染色是在基质中，而不是在内膜表面。所述无细胞ICA有不能通过使用α-半乳糖苷酶除去的一些极弱染色。所述数据整体显示了无细胞血管中有最小α-Gal。
所述抗体吸附试验使用相同的单克隆抗体。这种试验的优势是相较受限于极薄切片（section）的免疫细胞化学，能检测容积大许多的材料。另外，抗体吸附试验产生不同组织样品中所存在α-Gal水平的半定量评价。新鲜血管样品显示了α-Gal表达的最高水平。用α-半乳糖苷酶处理的新鲜猪EIA和ICA显示了缺乏α-Gal(与无组织对照没有不同)，指示所述试验是成功的。无细胞EIA和ICA样品显示了与新鲜和无细胞人股总动脉以及无组织对照非显著不同的α-Gal水平。
组织学评价显示了基质结构和无细胞样品的组成与新鲜对照相似。所述无细胞基质显示了比新鲜猪血管更松弛开放的结构。与新鲜血管相比较，无细胞EIA或ICA的GAG、胶原或弹性蛋白含量上没有显示出任何本质上的差异。羟基脯氨酸、变性胶原和糖胺聚糖试验的结果指示了脱细胞工艺不会造成组织损失胶原或糖胺聚糖。同时，定量生物化学分析提供了无细胞基质的胶原和糖胺聚糖含量的信息，其限制在于不可能评价成分的结构完整性。因此在α糜蛋白酶处理后测定变性胶原的水平，其能消化降解胶原而不影响天然胶原(Bank等,1997)。消化后，测试所述组织上清液(包含任何降解的胶原)中羟基脯氨酸的存在。结果指示相较于新鲜血管，无细胞EIA或ICA上存在的变性胶原总量非显著增加。
关于存在残留SDS的问题，通过在用于生成无细胞EIA和ICA的各脱细胞溶液中SDS浓度的定量来解决。使用放射性标记SDS(C14)显示了在用于脱细胞工艺的最终洗涤溶液中存在极低水平的SDS。
使用提取和接触细胞毒性试验显示了无细胞基质的生物相容性。每个试验使用两个不同的细胞系，即幼仓鼠肾细胞和小鼠3T3细胞。前面数据显示了经SDS处理基质的体内生物相容性，并且不需使用无细胞EIA或ICA来重复此。
使用很多不同试验的DNA定量指示了脱细胞后DNA水平下降大于90%，并且这些值显著低于从Surgisis分离的DNA量。从无细胞猪EIA和ICA分离的DNA水平与Permacol和CollaMend的DNA水平相当。无细胞EIA和ICA分别包含0.014μg.mg-1和0.019μg.mg-1的DNA。Surgisis包含
μg.mg-1,Permacol包含0.028μg.mg-1和CollaMend包含0.017μg.mg-1的DNA。PCR显示了任何残留DNA是不能扩增或非编码‘废弃’DNA的较小片段化DNA片段。猪内源性逆转录病毒的存在是任何猪衍生异种移植物关心的问题。尽管如此，实际上没有关于这种病毒对人的影响、转移潜能或最小安全水平的信息。PERV拷贝数目使用Taqman探针用定量PCR测定。所述数据指示了PERVDNA在无细胞猪EIA和ICA以及人皮肤成纤维细胞的所有样品中存在。无细胞CFA的拷贝数目与新鲜相较时有六个对数下降，和无细胞ICA有七个对数下降。无细胞ICA和EIA中存在的拷贝数目显著低于任何市售可得产品，因为猪内源性逆转录病毒相较市售可得产物没有已建立最小安全水平是关键的。这种试验没有测定是否存在完整PERV基因组或其是否有转录活性。无细胞猪EIA和ICA的生物机械属性和适应性通过爆破压力测试、缝线保留测试、扩张测试和低应变率破坏测试来评价。重要的是任何移植物材料具有与其所取代动脉相似的生物机械特性。无细胞猪血管的属性相对于新鲜猪组织没有大改变。相较新鲜血管，无细胞EIA或ICA的爆破压力之间没有注意到有显著差异。爆破压力值比在120mmHg区域内的动脉中经历的正常生理压力高许多。从无细胞动脉获得的结果与人动脉的最大爆破压力(2031-4225mmHg)和人隐静脉的最大爆破压力(1680-2273mmHg;L'Heureux,N.等2006)相当。
关于C3a或C5a的补体活化和检测(图20)，与市售可得产品相比，并且有趣的是也与相同方法制备的猪输尿管相比，本发明方法生成的无细胞血管显示了可忽略的活化。这指示成功消除了无细胞血管组织的抗原表位。
迄今收集的数据显示了两种无菌无细胞血管能使用新型脱细胞方案可靠地生成，产生显示>90%(w/w)DNA下降、最小α-Gal水平的生物相容性血管，以及在生物化学或生物机械上不同于新鲜血管。另外，数据显示无细胞EIA和ICA的PERV含量显著低于有已证明患者使用临床记录的市售可得产品。
猪髂外动脉(EIA)和颈内动脉(ICA)的脱细胞
至多200mm长度的冷冻EIA和ICA血管如图1所述使用200ml各溶液制备，其中使用前预热各溶液到合适温度。将血管置于单独250ml无菌容器中，并且所有孵育在240rpm搅拌下进行，除了核酸酶步骤是在80rpm。如第一步，如果EIA和ICA冷冻，则所述组在织37°C融化20分钟，然后使用消毒溶液（包含万古霉素、硫酸庆大霉素和多粘菌素B）37°C洗涤30分钟。第一孵育步骤是使用200mM EDTA在4°C洗涤24小时，然后使用低渗缓冲液(10mM TRIS、2.7Mm EDTA、10KIU/ml抑肽酶)在4°C洗涤24小时和使用含0.1%(w/v)SDS的低渗缓冲液37°C洗涤24小时。使用低渗缓冲液在4°C进一步洗涤24小时，然后使用包含抑肽酶的DPBSa EDTA在4°C洗涤48–56小时，和使用含0.1%(w/v)SDS的低渗缓冲液在37°C洗涤24小时。所述组织然后洗涤三次，每次用DPBSa在37°C持续30分钟和核酸酶溶液(5mM TRIS、50μg/ml BSA、50U/ml DNA酶、1U/ml RNA酶)在37°C持续三小时。所述组织然后洗涤三次，每次使用包含抑肽酶的DPBSa EDTA在37°C持续30分钟和使用高渗缓冲液在37°C进一步孵育24小时，再洗涤三次，每次使用包含抑肽酶的DPBSa EDTA在37°C下持续30分钟。所述组织然后使用0.1%(v/v)过氧乙酸溶液在27°C灭菌4小时。在II型生物安全柜中无菌进行下列后续步骤，(i)洗涤三次，每次使用包含抑肽酶的DPBSa EDTA在37°C持续30分钟，(ii)使用DPBSa在4°C持续24小时。然后在DPBSa中4°C存储组织，直到需要时。
组织/组织学制备
组织样品固定在10%(v/v)中性缓冲福尔马林，并且然后脱水和包埋在石蜡中。取系列切片，使用标准苏木精和伊红(H&E)(英国斯凯默斯代尔的欧洲Bios有限公司（Bios Europe Ltd）)染色以评价组织的组织结构（histioarchitecture）和使用Miller弹性蛋白染色以评价弹性蛋白含量。使用DAPI染色(西格玛-艾尔德里奇公司（Sigma-Aldrich）)和赫斯特33258(西格玛-艾尔德里奇公司)染色核酸。针对α-Gal表位的单克隆抗体IgM获自美国圣地亚哥市的Alexis生物化学公司（Alexis biochemicals），并在使用前纯化。
α-Gal的抗体吸附试验
ELISA用于在组织样品孵育后测定未结合的α-Gal抗体水平。样品用500μl含5%(w/v)BSA的DPBS在4°C孵育过夜，然后处理BSA，并且各管使用500μl DPBS持续两分钟、洗涤三次。准确称量100mg组织，并且精细浸软和置于有溶于抗体稀释剂的1ml抗α-gal单克隆抗体（0.37mg.ml-1）的封闭微管中，并且在旋转器中4°C过夜。所述包含组织的微管以600x g离心15分钟(或微量离心管上13,000rpm)，并且移出750μl上清液到新鲜封闭微管中，再加入750μl TBS叠氮化物BSA并且然后混合和600x g离心15分钟。再移出750μl上清液并且由ELISA测试上清液的α-Gal抗体，通过加入50μl溶于DPBS的10μg.ml-1α-Gal BSA到Maxisorb微量滴定板孔中4°C过夜。这些使用300μl DPBS吐温搅拌洗涤3x10分钟，并且已涂层Maxisorb微量滴定板的各孔使用250μl含5%(w/v)BSA的DPBS在4°C封闭过夜。然后每个孔使用300μl DPBS吐温搅拌持续30分钟、洗涤x3，并且转移100μl样品到涂层和封闭微量滴定板的相关孔中。然后室温孵育三小时，并且在加入50μl辣根过氧化物酶偶联的第二兔抗小鼠抗体(1:1000稀释)前，进一步洗涤。室温孵育1小时，并且在加入100μl OPD溶液和室温避光孵育10分钟前进一步洗涤。向各孔加入50μl3M硫酸，并且光学密度使用微板分光光度计在492nm测量，参照滤光片为630nm。各个样品的值作图为平均值±95%置信区间并且测定任何显著差异。
羟基脯氨酸试验
在进行羟基脯氨酸试验前，在通过6M盐酸(HCL)120°C孵育4小时水解和使用氢氧化钠(NaOH)中和前，样品冻干到恒定重量。采用的方法基于Edwards和O’Brien所述的方法[29]。使用反-4-羟基-L-脯氨酸(西格玛（Sigma）)制备标准校准器溶液。将测试溶液(50μl)加入到平底96孔板的孔中，其中加入100μl氧化溶液(氯胺T水合物;西格玛)并且温和搅拌5分钟。然后向各孔中加入Ehrlich试剂(100μl)。然后覆盖所述板，并且在570nm读取吸光度前，60°C水浴孵育45分钟。然后通过内插法从羟基脯氨酸标准曲线测定羟基脯氨酸的浓度。
糖胺聚糖试验
硫酸化糖(GAG)的量通过二甲基亚甲基蓝结合测定(Enobakhare等,Anal.Biochem.243,189,1996;Farndale等,Biochim.Biophys.Acta.,883,173,1986)。简单说，测试溶液用二甲基亚甲基蓝溶液孵育并在525nm读取吸光度。GAG的量通过内插法从使用硫酸软骨素和磷酸盐试验缓冲液(0.1M正磷酸二氢钠、0.1M正磷酸氢二钠,pH6.8)制备的标准曲线在一定浓度范围内计算。
实施例1
福尔马林固定处理的猪ICA和EIA在5μm处切片，并且使用苏木精和伊红染色(图2)。当使用两轮低渗缓冲液和SDS时，没有残留细胞或细胞残留物的证据(图2)。其他所述基质组织结构似乎在处理后保持完整。就双链DNA存在使用DAPI染色福尔马林固定处理的猪ICA和EIA切片，新鲜猪ICA和EIA用作阳性对照(图3)。所述染色显示了相较新鲜对照组织，基质内缺乏双链DNA和细胞(图3)。当暴露时间以10倍增加时，由于双链DNA和因而细胞存在引起的荧光不明显。
实施例2
如果临床使用，需要无细胞异种基质缺乏α-Gal表位，从而缓解抗体介导的炎症反应。因此，需要发展可靠方法以检测其在无细胞血管中的存在。新鲜和无细胞猪EIA(两轮SDS循环)样品用福尔马林固定、石蜡包埋并且在5μm处切片。使用IgM单克隆抗体(Alexis801-090,克隆M86,稀释1:10)就α-Gal表位的存在标记新鲜和无细胞猪EIA切片。所述Dako Envision试剂盒用于观察一级抗体(图4)。结果显示了脱细胞后存在α-Gal表位。也有高度的背景染色;这在使用IgM同种型对照抗体标记样品时消失。其他实验显示了新鲜组织用IgM单克隆抗体证明良好阳性标记(数据未显示)，并且所述纯化抗体相较粗制品似乎生成更高特异性的标记(数据未显示)。当联用高渗缓冲液与4°C进行24小时的200mM EDTA洗涤时，所述标记显示了α-Gal含量的下降(图5)。当使用增加轮的高渗缓冲液循环时，α-Gal含量水平没有区别。因此，采用一次高渗缓冲液37°C孵育24小时与4°C进行24小时的初始200mM EDTA洗涤，以从无细胞基质去除α-Gal表位，
对后续组织，采用图1中的脱细胞操作方案。
实施例3
为了测定在无细胞血管中是否存在残留α-Gal，重要的是测定抗体标记的特异性。就α-Gal表位的存在使用IgM单克隆抗体(Alexis ALX-801-090)克隆M86标记新鲜和无细胞EIA及ICA以及新鲜和无细胞α-半乳糖苷酶处理的EIA及ICA样品，并且使用Dako Envision试剂盒观察。使用抗体的三个不同制品:(i)纯化抗体(1:4稀释-0.39mg.ml-1)(ii)使用BSA吸附的纯化抗体，和(iii)使用α-Gal BSA吸附的纯化抗体。图6显示的无细胞EIA用针对α-Gal表位、纯化(A)、针对BSA吸收(B)、或针对α-Gal BSA吸收(C)或IgM同种型对照(D)的单克隆抗体标记，原始放大倍数为x100。图7显示相同，除了无细胞ICA以外。
新鲜组织的抗体标记显示了遍及基质的强定义阳性标记;在α-半乳糖苷酶处理后这能显著降低。所述结果指示了纯化抗体还通过用BSA吸附进一步“清除”。所述用BSA吸附的“纯化”抗体对α-Gal特异，因为用α-Gal BSA吸附总体上消除了与新鲜组织的结合。另外，无细胞ICA和EIA中存在最小α-Gal，内腔表面总体透明（clear）。通过显微镜仔细研究切片揭示了用BSA吸附抗体的任何背景标记最小。所述研究还显示了背景标记不能通过使用α-半乳糖苷酶处理来去除。
实施例4
半定量抗体吸附试验用于估计猪组织中α-Gal出现的量。用浸软组织样品孵育后，ELISA用于定量存在的未结合抗α-Gal抗体。所用阴性对照是无组织对照，并且所述数据指示了无组织对照、无细胞血管和人皮肤之间有显著差异。新鲜和无细胞同种异体股总动脉用作所述试验的对照(图8)。所述试验显示了新鲜和无细胞股总动脉没有α-Gal表位。相较无组织对照、或新鲜和无细胞同种异体股总动脉，α-Gal抗体与无细胞猪EIA或ICA的结合非显著差异(图8)。然而，相较新鲜EIA和ICA，结合无细胞的抗体之间有显著差异(图8;单向ANOVA和事后T检验)。
实施例5
为了全面评价脱细胞操作方案对基质的效果，测试新鲜和无细胞EIA和ICA样品(n=6)以测定其主要成分。为了定量胶原酸，按照Edwars和O’Biran方法(1980)测试水解组织样品的羟脯氨酸含量。所述试验生成了使用反-4-羟基-L-脯氨酸生成的标准曲线和570nm吸光度之间的线性关系。所述试验值转化成μg.mg-1和羟基脯氨酸值通过乘以7.46转变成胶原。发现新鲜和无细胞ICA的胶原含量分别是795.2μg.mg-1和700.6μg.mg-1。发现新鲜和无细胞EIA的胶原含量分别是572.3μg.mg-1和547.3μg.mg-1。所述值非显著差异(单向ANOVA和事后T检验)。
为了定量GAG含量，使用二亚甲基蓝染料就硫酸化羧酸化糖含量测试酸水解组织样品(Farndale等，1986)。所述试验生成使用硫酸软骨素B生成的标准曲线和525nm吸光度之间的线形关系，所述试验值对样品质量标准化并且表示为μg.mg-1。测定新鲜ICA的硫酸化GAG含量为63.8μg.mg-1，相比之下无细胞ICA为57.0μg.mg-1。发现新鲜和无细胞EIA的GAG含量分别是64.5μg.mg-1和54.7μg.mg-1。所述值非显著差异(单向ANOVA和事后T检验；图9A和9B)。
使用组织的酶消化评价变性或受损胶原含量，用α-糜蛋白酶然后酸水解。测定羟基脯氨酸水平，并转变成胶原。所述试验生成了使用反-4-羟基-L-脯氨酸生成的标准曲线和570nm吸光度之间的线性关系。发现新鲜和无细胞ICA的变性胶原含量分别是30.8μg.mg-1和26.6μg.mg-1。新鲜和无细胞EIA的变性胶原含量分别是30.8和21.5μg.mg-1。所述值非显著差异(单向ANOVA和事后T检验；图9A和9B)。
实施例6
所述接触细胞毒性试验用于测定无细胞基质对细胞生长的影响;这用作生物相容性的初步评价。小样品的无细胞猪EIA和ICA(n=3)进行无菌解剖并且使用胶原凝胶附着到组织培养板孔的中心，向各孔加入没有支原体的小鼠3T3或幼仓鼠肾细胞的悬浮液，并且培养48小时。福尔马林固定和使用吉姆萨染色剂染色后，各个孔使用相差显微术观察。接触细胞毒性板的显微镜检测显示了小鼠3T3成纤维细胞(图11)和幼仓鼠肾细胞(图10)生长并且接触无细胞材料。没有注意到细胞形态或和细胞裂解的明显改变。显示了氰基丙烯酸酯胶(阳性对照)造成细胞裂解。仅胶原(阴性对照)没有显示细胞毒性迹象。
实施例7
新鲜和脱细胞猪EIA和ICA样品浸软并以浓度100mg.ml-1在DMEM中37°C搅拌孵育72小时，从而提取任何可溶成分。这种提取物与单层没有支原体的小鼠3T3和幼仓鼠肾细胞一起孵育48小时，然后使用市售可得的ATP-Lite-M试验(帕金埃尔默公司（Perkin Elmer）)测定ATP水平。使用两个不同的细胞系；小鼠3T3细胞成纤维细胞细胞系和幼仓鼠肾细胞表皮细胞系。结果显示相对ATP含量与因此用DMEM孵育的小鼠3T3细胞的活力和无细胞猪ICA提取样品之间非显著不同(图12A和12B)。当小鼠3T3细胞用无细胞猪EIA提取物孵育时，细胞活力有显著增加(图12B)。相较新鲜组织提取物，DMEM孵育的3T3细胞或无细胞提取物之间的ATP含量有显著不同(图12A)。存在40%(v/v)DMSO下培养的3T3细胞中出现的ATP水平显著低于任何其他测试样品(图12A和12B)。相较DMEM，用无细胞猪EIA或ICA提取物培养的幼仓鼠肾细胞的ATP水平有显著增加(图12C和12D)。相较新鲜组织提取物，DMEM孵育的幼仓鼠肾细胞或无细胞提取物的ATP含量之间非显著不同(图12C和12D)。存在40%(v/v)DMSO下培养的幼仓鼠肾细胞中出现的ATP水平显著低于任何其他测试样品(图12C和12D)。
实施例8
使用市售可得试剂盒(凯杰（Qiagen）)从新鲜和无细胞猪EIA和ICA样品(n=3)中分离DNA，并使用260nm吸光度定量。分析中也包含很多市售可得产品:Surgisis、Permacol和CollaMend。数据指示了脱细胞后DNA水平下降大于90%。无细胞EIA和ICA分别包含0.014μg.mg-1和0.019μg.mg-1DNA(图13)。Surgisis包含0.119μg.mg-1,1Permacol包含0.028μg.mg-1和CollaMend包含0.017μg.mg-1DNA(图13)。无细胞EIA和ICA包含比Surgisis显著更低的DNA量(图13)。
实施例9
使用提取的DNA和总RNA进行PCR和RT-PCR。使用针对GAPDH和TNFα的引物扩增从新鲜和无细胞EIA及ICA提取的DNA。使用荧光染料syber绿检测任何PCR产物。所述PCR反应不能检测无细胞EIA或ICA所提取DNA样品中的任何GAPDH或TNFα产物(表1)。因此，存在的任何DNA可能是片段和非编码的，并且因此仅就“管家”活性而言为非功能DNA。
表1显示了循环数目，其中当针对GAPDH和TNFα的引物对syber绿PCR中所分离DNA使用时检测PCR产物。
| 样品 | 引物 | 临界值 | Ct值 |
| 新鲜EIA | GAPDH | 0.210 | 33.75 |
| 无细胞EIA | GAPDH | 0.210 | 没有ct值 |
| 无细胞ICA | GAPDH | 0.210 | 没有ct值 |
| 新鲜EIA | NPC | 0.210 | 没有ct值 |
| 无细胞EIA | NPC | 0.210 | 没有ct值 |
| 无细胞ICA | NPC | 0.210 | 没有ct值 |
| 新鲜EIA | TNF | 0.210 | 29.99 |
| 无细胞EIA | TNF | 0.210 | 没有ct值 |
| 无细胞ICA | TNF | 0.210 | 没有ct值 |
| 没有模板对照 | GAPDH | 0.210 | 没有ct值 |
| 没有模板对照 | TNF | 0.210 | 没有ct值 |
使用从新鲜和无细胞EIA和ICA提取的总RNA的两步RT-PCR反应完成GAPDH(表2)和TNFα(表3)的检测。使用荧光染料syber绿检测任何PCR产物。与新鲜样品相比，所述RT-PCR反应不能检测从无细胞EIA或ICA所提取总RNA样品中的任何GAPDH或TNFα产物。
表2显示了循环数目，其中当针对GAPDH的引物对两步RT-PCR中所分离RNA使用时，检测PCR产物。
| 样品 | 引物 | 临界值 | Ct值 |
| 新鲜EIA | GAPDH | 0.212 | 47.03 |
| 无细胞EIA | GAPDH | 0.212 | 没有ct值 |
| 新鲜ICA | GAPDH | 0.212 | 49.14 |
| 无细胞ICA | GAPDH | 0.212 | 没有ct值 |
| 没有模板对照 | GAPDH | 0.212 | 没有ct值 |
| 新鲜EIA | 没有引物对照 | 0.212 | 没有ct值 |
| 无细胞EIA | 没有引物对照 | 0.212 | 没有ct值 |
| 新鲜ICA | 没有引物对照 | 0.212 | 没有ct值 |
| 无细胞ICA | 没有引物对照 | 0.212 | 没有ct值 |
表3显示了循环数目，其中当针对TNFα的引物对两步RT-PCR中所分离RNA使用时，检测PCR产物。
| 样品 | 引物 | 临界值 | Ct值 |
| 新鲜EIA | TNF | 0.123 | 37.52 |
| 无细胞EIA | TNF | 0.123 | 没有ct值 |
| 新鲜ICA | TNF | 0.123 | 36.78 |
| 无细胞ICA | TNF | 0.123 | 没有ct值 |
| 没有模板对照 | TNF | 0.123 | 没有ct值 |
| 新鲜EIA | 没有引物对照 | 0.123 | 没有ct值 |
| 无细胞EIA | 没有引物对照 | 0.123 | 没有ct值 |
| 新鲜ICA | 没有引物对照 | 0.123 | 没有ct值 |
| 无细胞ICA | 没有引物对照 | 0.123 | 没有ct值 |
实施例10
使用taqman探针通过定量实时PCR进行猪内源性逆转录病毒的检测和定量。使用市售可得试剂盒(凯杰)从新鲜和无细胞猪EIA和ICA样品(n=3)中分离DNA，并使用260nm吸光度定量。分析中也包含很多市售可得产品:Surgisis、Permacol和CollaMend。还从市售来源获得的原代人皮肤成纤维细胞中分离DNA。
表4显示了猪、EIA、ICA、Permacol、CollaMend、Surgisis和原代人成纤维细胞中存在的PERV基因组的拷贝数目。数据代表平均值(n=3)。
| 样品 | Ct值 | 拷贝数 |
| 新鲜EIA | 22.54 | 4.52E+05 |
| 无细胞EIA | 36.76 | 2.54E-01 |
| 新鲜ICA | 23.94 | 2.61E+05 |
| 无细胞ICA | 38.21 | 8.32E-02 |
| Permacol | 32.14 | 5.92 |
| CollaMend | 35.21 | 13.46 |
| Surgisis | 31.02 | 2.54E+01 |
| 成纤维细胞 | 18.44 | 2.30E+01 |
| NTC | 没有ct值 | 不适用 |
数据指示了在所有测试样品中存在PERV DNA(表4)。当与新鲜相比时，无细胞CFA的拷贝数目有六个对数下降，和无细胞ICA有七个对数下降。无细胞ICA和EIA中存在的拷贝数目显著低于任何市售可得产品(单向ANOVA和事后T检验)。所述试验没有测定是否存在完整PERV基因组或其是否有转录活性。
实施例11
就其耐受增加压力的能力使用定制设计的爆破压力器材测试新鲜和无细胞猪EIA和ICA(15cm长度)样品。各个血管的内压力增加到最大3750mmHg。测试使用0.1%(v/v)过氧乙酸处理3-4小时的无细胞猪EIA，以测定此步骤是否对基质生物机械学产生有害影响。结果显示了新鲜或无细胞猪EIA或ICA能耐受的最大压力之间非显著不同(数据未显示)。两种新鲜样品使用缝线在连接区域失败，并且作为设定或在连接或依附位点上的结果，无细胞样品都成功了。相较无细胞EIA的3750mmHG，无细胞ICA的平均爆破压力是3624mmHG。用0.1%(v/v)过氧乙酸处理3-4小时的无细胞EIA之间非显著不同。
实施例12
在无细胞猪EIA和ICA上进行缝线保留测试，数据与新鲜样品比较。单个缝线使用4-0Prolene置于组织样品中，和使用三迭结（triple knot）缝住。使用Instron5860系列表模型测试系统以速度10mm.min-1完成测试。数据表示为牛顿的最大力，在缝线除去前，各个组织能够耐受。相较无细胞样品，新鲜EIA或ICA的最大缝线保留强度之间非显著不同(图14)。
实施例13
本研究的目的是定量新鲜和无细胞猪EIA和ICA的圆周方向和轴向上的膨胀(n=3)。扩张测试中需要的数据还包含在递增应用压力间隔上新鲜和无细胞猪EIA和ICA的图像(n=3)。所有图像在imagepro plus V5.41软件中分析。测定X和Y轴的扩张。结果表述为随着内压增加而变化的根直径改变百分比的函数(图15A-D)。数据显示了两个统计上显著结果;X轴上无细胞ICA的扩张(图15A)显著高于新鲜ICA的扩张。另外，Y轴上无细胞猪ICA的扩张大于新鲜ICA的扩张(图15B)。各个其他扩张曲线相似，并且显示了新鲜和无细胞组织之间非显著不同(图15A-D)。
实施例14
使用Instron5860系列表模型测试系统以速度10mm.min-1测试新鲜和无细胞猪EIA和ICA的样品。在低应变率破坏测试中，对各个测试持续期间记录以mm计的十字头冲程（stroke）、负载转换器反应和以ms计的时间。各个组织样品的尺寸进行标准化，并且装入测试设备前使用厚薄规记录厚度。在轴向和圆周方向上进行各个测试(n=6)。使用微软excel和GraphPad Prism和就每个样品生成的应力应变曲线分析数据。使用数据和应力应变曲线测定下列参数:极限拉伸强度(N),胶原蛋白和弹性模量(MPa;图16、17和18)。
数据显示了与新鲜组织相比时，无细胞EIA或ICA的机械属性上非显著不同。发现新鲜ICA的平均极限拉伸强度在轴向和圆周方向上分别是3.90±0.64MPa和4.13±1.00MPa。无细胞ICA的对应值是3.92±0.87MPa和4.82±0.87MPa。剩余生物机械参数的平均值列于表5。生物机械数据指示了脱细胞过程不引起组织产生任何显著改变。
表5显示了从低应变率到破坏测试，新鲜和无细胞猪EIA和ICA的生物机械参数。数据表示为平均值(n=6)±95%置信区间。
实施例15
由于广泛研究显示了本发明发展的工艺去除α-Gal，如免疫细胞化学和半定量ELISA所测，决定对组织进行进一步功能测试以测定是否无细胞猪动脉移植物会活化人血清中的补体。脱细胞工艺生成的动脉移植物与市售可得竞争物产品作比较。各个生物材料的样品在正常人血清存在下37°C孵育1小时。收集血清并且进行ELISA以测定C3a或C5a的存在。当与PBS阴性对照相比时，起始结果显示了酵母聚糖[阳性对照]造成正常人血清的补体活化(图20)。结果显示了偶联BSA的α-Gal能启动正常人血清中的补体活化(图19)。
ELISA结果显示了正常人血清中响应新鲜猪组织生成C3a和C5a(图20)。这在与无细胞猪、无细胞人或新鲜人组织反应的血清中没有观察到。当人血清与Surgisis反应时，生成C3a和C5a。当人血清与PermacolTM或CollaMendTM反应时，没有观察到C3a或C5a的增加(图21)。这些研究提供有力证明显示无细胞猪支架不包含能与预形成人抗体反应且活化补体的表位。
Claims (28)
1.一种包含天然无细胞异种血管组织基质的产物，所述无细胞异种血管组织基质的DNA含量与未处理对照血管组织基质相比有至少80%的下降，所述产物基本不含能与预形成人抗体反应的表位，并且也没有实质性(substantially)活化补体的能力。
2.如权利要求1所述的产物，其特征在于，所述产物基本没有α-gal表位。
3.如前述权利要求中任一项所述的产物，其特征在于，所述产物来源于猪或牛。
4.如前述权利要求中任一项所述的产物，其特征在于，所述产物来源于猪并且有小于15mm的内径。
5.如前述权利要求中任一项所述的产物，其特征在于，所述产物是猪髂外动脉(EIA)或者猪颈内动脉(ICA)。
6.如权利要求1-3中任一项所述的产物，其特征在于，所述产物来源于牛并且有25mm或更小的内径。
7.如权利要求1-3和6中任一项所述的产物，其特征在于，所述产物是牛源的，并且选自颈动脉、乳内动脉、胸廓内动脉、肠系膜静脉和颈静脉。
8.如前述权利要求中任一项所述的产物，其特征在于，所述产物相较新鲜或未处理组织有等同或非显著(substantially)不同的胶原、胶原、糖胺聚糖和弹性蛋白含量。
9.如前述权利要求中任一项所述的产物，其特征在于，所述产物相较新鲜或未处理组织有等同或非显著不同的爆破压力、缝线保留、极限拉伸强度和低应变率破坏值。
10.如前述权利要求中任一项所述的产物，其特征在于，所述产物还包含涂层，所述涂层由合适材料涂覆内表面(腔)或其外表面之一或两者而成。
11.如权利要求10所述的产物，其特征在于，所述涂层材料选自抗凝血剂、合成的五糖抑制剂、直接凝血酶抑制剂、维生素K拮抗剂、因子Xa抑制剂、银、胶原IV、弹性蛋白、糖蛋白、糖胺聚糖和合成或天然的肽或其混合物。
12.如前述权利要求中任一项所述的产物，其特征在于，所述产物在其上或其内接种了单细胞群或混合细胞群。
13.如权利要求12所述的产物，其特征在于，所述细胞群根据移植位点选择，并且所述细胞群选自上皮细胞、平滑肌细胞、多潜能和多能干细胞以及成纤维细胞。
14.一种制备天然无细胞异种血管组织的方法，所述方法包含获得合适的供体血管并且用下列方法步骤处理:
(i)用乙二胺四乙酸（EDTA）孵育；
(ii)第一消毒洗涤；
(iii)至少两轮用低渗缓冲液和阴离子去污剂孵育；
(iv)核酸酶处理；
(v)高渗洗涤；和
(vi)最终灭菌工艺。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(i)和(ii)以逆序进行。
16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述EDTA孵育在高渗缓冲溶液中进行。
17.如权利要求14–16中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)的第一消毒洗涤包括含有万古霉素、庆大霉素和多粘菌素的低渗缓冲溶液中的洗涤。
18.如权利要求14–17中任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
19.如权利要求14–18中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(iv)的核酸酶处理包括含有低渗缓冲液（包含DNA酶和RNA酶）的核酸酶溶液孵育。
20.如权利要求14–19中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(v)的高渗孵育包括含有TRIS和NaCl的高渗缓冲液孵育。
21.如权利要求14–20中任一项所述的方法，其特征在于，所述最终灭菌工艺清除了病毒并降低了生物负载。
22.如权利要求14–21中任一项所述的方法，其特征在于，所述最终灭菌工艺是一种或多种选自下组的工艺：抗微生物剂的整合或涂覆、用交联剂处理、用杀菌剂处理、用超临界CO2辐射和处理。
23.如权利要求14–22中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含用如权利要求11中所述材料涂覆所述天然无细胞异种血管组织的内和/或外表面的步骤。
24.如权利要求14–23中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含用如权利要求13中所述单细胞群或混合细胞群接种所述天然无细胞异种血管组织的步骤。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述猪供体血管长度至多30cm和所述牛供体血管长度至多80cm。
26.一种包含如权利要求14–25中任一项所述方法获得的包含天然无细胞异种血管组织基质组织产品的产物用作移植组织。
27.如权利要求26所述的产物，其特征在于，所述产物用于搭桥手术或血管通路。
28.一种血管搭桥手术的方法，所述方法包含使用如权利要求1–13中任一项所述或如权利要求14–25中任一项所述方法制备的天然无细胞异种血管组织基质组织产物取代受损或阻断的血管。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB1016150.3A GB201016150D0 (en) | 2010-09-27 | 2010-09-27 | Acellular vascular products |
| GB1016150.3 | 2010-09-27 | ||
| GB1020846.0 | 2010-12-09 | ||
| GBGB1020846.0A GB201020846D0 (en) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | Acellular vascular products |
| PCT/GB2011/051817 WO2012042250A1 (en) | 2010-09-27 | 2011-09-26 | Acellular vascular products |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103124570A true CN103124570A (zh) | 2013-05-29 |
| CN103124570B CN103124570B (zh) | 2015-04-22 |
Family
ID=45892022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201180046352.5A Expired - Fee Related CN103124570B (zh) | 2010-09-27 | 2011-09-26 | 无细胞血管产物 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9510933B2 (zh) |
| EP (1) | EP2621548B1 (zh) |
| JP (1) | JP5881711B2 (zh) |
| CN (1) | CN103124570B (zh) |
| AU (2) | AU2011309900B2 (zh) |
| BR (1) | BR112013005278B1 (zh) |
| CA (1) | CA2808478C (zh) |
| ES (1) | ES2628441T3 (zh) |
| HK (1) | HK1185292A1 (zh) |
| PL (1) | PL2621548T3 (zh) |
| WO (1) | WO2012042250A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108699522A (zh) * | 2016-01-13 | 2018-10-23 | 高等教育联邦系统-匹兹堡大学 | 血管细胞外基质水凝胶 |
| CN113368306A (zh) * | 2020-03-23 | 2021-09-10 | 成都中科奥格生物科技有限公司 | 低免疫原性生物材料及其制备方法和用途 |
| CN113425905A (zh) * | 2020-03-23 | 2021-09-24 | 成都中科奥格生物科技有限公司 | 一种血管材料及其制备方法和用途 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10058630B2 (en) * | 2012-10-22 | 2018-08-28 | Concievalve, Llc | Methods for inhibiting stenosis, obstruction, or calcification of a stented heart valve or bioprosthesis |
| US10213526B2 (en) | 2014-03-21 | 2019-02-26 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Methods for preparation of a terminally sterilized hydrogel derived from extracellular matrix |
| CN113425912A (zh) * | 2020-03-23 | 2021-09-24 | 成都中科奥格生物科技有限公司 | 一种脱细胞真皮材料及其制备方法和用途 |
| CN116983476B (zh) * | 2023-07-28 | 2024-07-09 | 海迈医疗科技(苏州)有限公司 | 一种纳米结构低免疫原性生物型人工血管及其制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4776853A (en) * | 1986-07-28 | 1988-10-11 | Hsc Research Development Corporation | Process for preparing biological mammalian implants |
| WO2002096476A1 (en) * | 2001-05-24 | 2002-12-05 | University Of Leeds | Decellularisation of matrices |
| CN101185775A (zh) * | 2007-12-27 | 2008-05-28 | 南京市儿童医院 | 猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法 |
| US20080306610A1 (en) * | 2007-06-07 | 2008-12-11 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Tissue processing for nonimmunogenic implants |
| CN101474426A (zh) * | 2009-01-14 | 2009-07-08 | 首都医科大学宣武医院 | 一种脱除血管组织内细胞的血管基质及其制备方法 |
| CN101573148A (zh) * | 2006-11-16 | 2009-11-04 | 利兹大学 | 半月板移植用组织的制备 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040208842A1 (en) * | 2001-09-18 | 2004-10-21 | Ritchie Branson W. | Antimicrobial cleansing compositions and methods of use |
| AU2003238162A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-19 | Cardio Inc | Decellularized tissue |
| WO2005089411A2 (en) * | 2004-03-17 | 2005-09-29 | Revivicor, Inc. | Tissue products from animals lacking functional alpha 1,3 galactosyl transferase |
| US20050266390A1 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-01 | Yuichiro Ueda | Processes for removing cells and cell debris from tissue and tissue constructs used in transplantation and tissue reconstruction |
| US7682808B2 (en) | 2005-03-04 | 2010-03-23 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Coagulation and fibrinolytic cascades modulator |
| EP2094325B1 (en) * | 2006-11-16 | 2011-08-31 | The University Of Leeds | Preparation of tissue for meniscal implantation |
| WO2009009620A2 (en) * | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Lifecell Corporation | Acellular tissue matrix compositions for tissue repair |
| US8735054B1 (en) * | 2008-01-04 | 2014-05-27 | Lifecell Corporation | Acellular tissue matrix preservation solution |
| EP3545980A1 (en) * | 2010-02-26 | 2019-10-02 | DeCell Technologies Inc. | Methods for tissue decellularization |
-
2011
- 2011-09-26 AU AU2011309900A patent/AU2011309900B2/en not_active Ceased
- 2011-09-26 CA CA2808478A patent/CA2808478C/en active Active
- 2011-09-26 PL PL11764272T patent/PL2621548T3/pl unknown
- 2011-09-26 EP EP11764272.8A patent/EP2621548B1/en active Active
- 2011-09-26 JP JP2013529715A patent/JP5881711B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-26 CN CN201180046352.5A patent/CN103124570B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-26 ES ES11764272.8T patent/ES2628441T3/es active Active
- 2011-09-26 BR BR112013005278-3A patent/BR112013005278B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-09-26 US US13/876,429 patent/US9510933B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-26 WO PCT/GB2011/051817 patent/WO2012042250A1/en active Application Filing
-
2013
- 2013-11-15 HK HK13112846.6A patent/HK1185292A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-06-25 AU AU2014203460A patent/AU2014203460B2/en not_active Ceased
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4776853A (en) * | 1986-07-28 | 1988-10-11 | Hsc Research Development Corporation | Process for preparing biological mammalian implants |
| WO2002096476A1 (en) * | 2001-05-24 | 2002-12-05 | University Of Leeds | Decellularisation of matrices |
| CN101573148A (zh) * | 2006-11-16 | 2009-11-04 | 利兹大学 | 半月板移植用组织的制备 |
| US20080306610A1 (en) * | 2007-06-07 | 2008-12-11 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Tissue processing for nonimmunogenic implants |
| CN101185775A (zh) * | 2007-12-27 | 2008-05-28 | 南京市儿童医院 | 猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法 |
| CN101474426A (zh) * | 2009-01-14 | 2009-07-08 | 首都医科大学宣武医院 | 一种脱除血管组织内细胞的血管基质及其制备方法 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108699522A (zh) * | 2016-01-13 | 2018-10-23 | 高等教育联邦系统-匹兹堡大学 | 血管细胞外基质水凝胶 |
| US11406736B2 (en) | 2016-01-13 | 2022-08-09 | University of Pittsburgh—Of the Commonwealth Systems of Higher Education | Vascular extracellular matrix hydrogel |
| CN113368306A (zh) * | 2020-03-23 | 2021-09-10 | 成都中科奥格生物科技有限公司 | 低免疫原性生物材料及其制备方法和用途 |
| CN113425905A (zh) * | 2020-03-23 | 2021-09-24 | 成都中科奥格生物科技有限公司 | 一种血管材料及其制备方法和用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2012042250A1 (en) | 2012-04-05 |
| JP2013537828A (ja) | 2013-10-07 |
| PL2621548T3 (pl) | 2017-11-30 |
| HK1185292A1 (zh) | 2014-02-14 |
| AU2011309900B2 (en) | 2014-07-24 |
| JP5881711B2 (ja) | 2016-03-09 |
| CN103124570B (zh) | 2015-04-22 |
| CA2808478A1 (en) | 2012-04-05 |
| AU2014203460A1 (en) | 2014-07-17 |
| AU2014203460B2 (en) | 2016-04-14 |
| US9510933B2 (en) | 2016-12-06 |
| CA2808478C (en) | 2015-10-06 |
| EP2621548A1 (en) | 2013-08-07 |
| BR112013005278B1 (pt) | 2019-07-09 |
| AU2011309900A1 (en) | 2013-05-02 |
| US20130197667A1 (en) | 2013-08-01 |
| ES2628441T3 (es) | 2017-08-02 |
| EP2621548B1 (en) | 2017-05-24 |
| BR112013005278A2 (pt) | 2016-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103124570B (zh) | 无细胞血管产物 | |
| Schneider et al. | Decellularized human placenta chorion matrix as a favorable source of small-diameter vascular grafts | |
| Hussein et al. | Biocompatibility evaluation of tissue-engineered decellularized scaffolds for biomedical application | |
| Mancuso et al. | Decellularized ovine arteries as small-diameter vascular grafts | |
| Caralt et al. | Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation | |
| Ramm et al. | Decellularization combined with enzymatic removal of N‐linked glycans and residual DNA reduces inflammatory response and improves performance of porcine xenogeneic pulmonary heart valves in an ovine in vivo model | |
| Haag et al. | Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue | |
| Simsa et al. | Effect of fluid dynamics on decellularization efficacy and mechanical properties of blood vessels | |
| Wilshaw et al. | Development and characterization of acellular allogeneic arterial matrices | |
| Aguiari et al. | In vitro comparative assessment of decellularized bovine pericardial patches and commercial bioprosthetic heart valves | |
| Milan et al. | Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery | |
| Wolf et al. | Predicting in vivo responses to biomaterials via combined in vitro and in silico analysis | |
| Anilkumar et al. | Biomaterial properties of cholecyst‐derived scaffold recovered by a non‐detergent/enzymatic method | |
| Mangold et al. | Evaluation of decellularized human umbilical vein (HUV) for vascular tissue engineering–comparison with endothelium‐denuded HUV | |
| Naso et al. | Differential distribution of structural components and hydration in aortic and pulmonary heart valve conduits: impact of detergent-based cell removal | |
| Higuita et al. | Antigen removal process preserves function of small diameter venous valved conduits, whereas SDS-decellularization results in significant valvular insufficiency | |
| Ansari et al. | Development and characterization of a porcine liver scaffold | |
| Kallenbach et al. | Guided tissue regeneration: porcine matrix does not transmit PERV | |
| Assmann et al. | Improvement of the in vivo cellular repopulation of decellularized cardiovascular tissues by a detergent‐free, non‐proteolytic, actin‐disassembling regimen | |
| Meiring et al. | Tissue engineered small vessel conduits–the anti-thrombotic effect of re-endothelialization of decellularized baboon arteries: A preliminary experimental study | |
| Kajbafzadeh et al. | Sheep colon acellular matrix: immunohistologic, biomechanical, scanning electron microscopic evaluation and collagen quantification | |
| Dal Sasso et al. | RegenHeart: a time-effective, low-concentration, detergent-based method aiming for conservative decellularization of the whole heart organ | |
| Akbarzadeh et al. | Decellularised whole ovine testis as a potential bio-scaffold for tissue engineering | |
| WO2006137546A1 (ja) | 生体由来移植用組織の石灰化を抑制するための処理方法および処理された組織 | |
| Nooshin et al. | Effects of different perfusing routes through the portal vein, hepatic vein, and biliary duct on whole rat liver decellularization |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1185292 Country of ref document: HK |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: TISSUE REGENIX LIMITED Free format text: FORMER OWNER: UNIV. OF LEEDS Effective date: 20150703 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150703 Address after: Yorkshire Patentee after: Organization of heavy Gene Co.,Ltd. Address before: Yorkshire Patentee before: University OF LEEDS |
|
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1185292 Country of ref document: HK |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150422 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |