BR112013005278B1 - Produtos que comprendem matriz de tecido vascular xenogênico acelular e método de preparação de um tecido vascular xenogênico acelular - Google Patents

Abstract

produtos vasculares acelulares. a presente invenção refere-se a um produto que compreende uma matriz de tecido vascular xenogênico acelular natural que possui pelo menos 80% de redução no conteúdo de dna, em comparação com uma matriz de tecido vascular de controle não tratada e sendo antigenicamente inerte por estar substancialmente livre de epitopos capazes de reagir com os anticorpos humanos pré-formados e também sem ter a capacidade de ativar o complemento substancialmente. a invenção também inclui métodos de preparação de tais produtos e utilizaçoes dos produtos, especialmente em cirurgia de bypass.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PRODUTOS QUE COMPREENDEM MATRIZ DE TECIDO VASCULAR XENOGÊNICO ACELULAR E MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM TECIDO VASCULAR XENOGÊNICO ACELULAR.

A presente invenção refere-se a matrizes acelulares xenogênicas e, em particular, a produtos vasculares de diâmetro médio e pequeno, tais como artérias acelulares que são fisicamente compatíveis e não imunogênico. A presente invenção inclui, entre outros, usos dos produtos acelulares especialmente na cirurgia de ponte vascular e métodos para produzir as matrizes acelulares vasculares.

ANTECEDENTES

A ativação de complemento é um potente mediador e indicador de diagnóstico de inflamação e rejeição de transplantes de órgãos sólidos. Mecanicamente, uma série de moléculas efetoras nas cascatas do complemento medeiam funções pró-inflamatórias que podem representar a quimiotaxia e ativação de células do sistema imune inato, tais como granulócitos e monócitos. Ao mesmo tempo, muitos destes mesmos mediadores complemento ativam e perturbam a interface entre a célula endotelial do receptor e do transplante, além disso, o complemento pode estimular linfócitos B e T do sistema imune adaptativo. Complemento também participa na depuração não inflamatória das células apoptóticas. Por isso, a cascata do complemento pode ser ativada através de vários mecanismos e vários componentes do complemento são capazes de modular a resposta para transplantes em diferentes direções.

Até hoje, nenhum estudo de xenotransplante foi inteiramente bem sucedido, devido aos muitos obstáculos resultantes da resposta do sistema imune do receptor. Esta resposta, que é, geralmente, mais extrema do que em alotransplantes, finalmente, resulta em rejeição do xenoenxerto. Existem vários tipos de rejeição de xenoenxerto: rejeição hiperaguda e rejeição vascular aguda, que são devidas à resposta do sistema imune humoral e rejeição celular e rejeição crônica que se baseia na imunidade celular.

Rejeição hiperaguda é mediada pela ligação de anticorpos naturais xenorreativos (XNAs) ao endotélio doador provocando a ativação do sistema de complemento humano, o alvo XNAs de epítopo principal é o epí2!3Α topo α-gal (gala 1-3gaip 1-(3)-4glcnac-r) que existe em abundância em glicolipideos e glicoproteínas de mamíferos não primatas e macacos do novo mundo, devido a glicosilação pela enzima a1,3galactosiltransferase (a1, 3GT). Em seres humanos, os primatas e macacos do velho mundo, este epi5 topo está ausente porque o gene a1,3GT foi inativado em ancestrais primatas do velho mundo. Em vez disso, os seres humanos, símios e macacos do Velho Mundo produzem o anticorpo anti-gal, o qual interage especificamente com epitopos α-gal e que constituem aproximadamente 1 % das imunoglobulínasOireulantes. A resposta imune devido a epitopos α-gal é um fator impor10 tante no insucesso do transplante de tecido / órgão xenogênico. A eliminação da interação entre os anticorpos naturais anti-gal e epitopos α-gal nos xenoenxertos é um pré-requisito para o sucesso de xenoenxertos em seres humanos. Anti-gal funcionou como uma barreira imunológica, evitando que o transplante de órgãos de porcos em humanos, porque anti-gal se liga aos 15 epitopos α-gal expressos em células de porco. É conhecido do estado da técnica para gerar porcos knockout a1,3gt que carecem de epitopos α-gal, o que resultou em uma eliminação parcial desta barreira imunológica e, portanto, parcialmente supera rejeição hiperaguda, contudo a produção transgênica de suínos é tanto cara e demorada. Além disso, a níveis baixos, mas 20 potencialmente significativos de gala(1,3)gal são ainda expressos nos tecidos de animais knockout at1,3gt, o que indica um outro glicosiltransferase envolvido na síntese deste epitopo (Milland Biol e outros, Cell Immunol. 2005, 83, 687-693). É também conhecido a partir da técnica anterior que agalactosidase de grãos de café verde e agalactosidase humana recombinan25 te podem remover epitopos α-gal a partir da superfície de células de tecidos, tal como a válvula aórtica porcina e o tecido pericárdico, mas os tratamentos enzimáticos têm limitações não só em relação custo-eficácia, mas também podem afetar a histoarquitetura do tecido e deixar resíduos enzimáticos indesejáveis. De forma a ultrapassar a rejeição hiperaguda é também conhe30 cido por inibir a cascata de complemento do receptor através da utilização de fator de veneno de cobra (que esgota C3), o tipo de receptor de complemento solúvel 1, anticorpos anti-C5, ou inibidor de C1 (C1-INH). As desvan3/34 tagens deste método incluem a toxicidade do fator de veneno de cobra, e mais importante destes tratamentos é privar o indivíduo de um sistema de complemento funcional. No que se refere a rejeição vascular aguda, este tipo de rejeição ocorre em xenoenxertos discordantes dentro de 2 a 3 dias, no caso de rejeição hiperaguda ser impedida. O processo é muito mais complexo do que a rejeição hiperaguda e não está completamente entendido, entretanto, se rejeição hiperaguda e aguda vascular são evitadas, acomodação é possível, que é a sobrevivência do xenoenxerto, apesar da presença de XNAs circulantes. Ao enxerto é dada uma pausa de rejeição humoral quando a cascata de complemento é interrompida, os anticorpos circulantes são removidos, ou a sua função é alterada, ou se houver uma alteração na expressão de antígenos de superfície no enxerto. Isto permite que o xenoenxerto regule e, eventualmente, expresse genes protetores.

Portanto, é desejável que matrizes acelulares xenogênicas vasculares não ativem complemento. É também desejável que as matrizes acelulares xenogênicas vasculares sejam desprovidas de componentes antigênicos e, especialmente, epítopos α-gal de modo a mitigar reações inflamatórias mediadas por anticorpo. É também desejável proporcionar um método alternativo e de custo mais eficaz para a preparação de produtos vasculares de diâmetro mediano e menor para a cirurgia de ponte. É também desejável fornecer matrizes acelulares xenogênicas vasculares para transplante que são desprovidas de resíduos enzimáticos de α-galactosidase residuais. BREVE SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção é provido um produto que compreende uma matriz de tecido vascular xenogênico acelular natural que possui pelo menos uma redução de 80% no conteúdo de DNA, em comparação com uma matriz de tecido vascular de controle não tratada, sendo o produto substancialmente livre de epítopos capazes de reagir com anticorpos humanos pré-formados, e também sem a capacidade para substancialmente ativar o complemento.

A referência aqui a sem a capacidade para substancialmente ativar o complemento indica que o produto da presente invenção tem apro4/34 ximadamente o mesmo nível de ativação de complemento, como artérias femorais humanos frescas em um ensaio de ativação de complemento.

De preferência, o tecido vascular xenogênico acelular é substancialmente livre de epitopos a-gal.

Referência aqui a substancialmente isento de epitopos capazes de reagir com os anticorpos humanos pré-formados indica que o produto da presente invenção tem aproximadamente o mesmo nível de epitopos a-gal que artérias femorais humanas frescas ou acelulares.

De preferência, a matriz de tecido vascular xenogênico acelular pode ter uma redução de conteúdo de DNA, em comparação com uma matriz de tecido vascular de controle não tratada ou natural de pelo menos 80% ou mais, ou seja, ele pode ter uma redução de qualquer número inteiro maior do que 80% e no máximo 100%.

De preferência, o tecido vascular é porcino ou bovino na origem. De preferência, o tecido vascular derivado de porcino é um vaso sanguíneo de pequeno e médio diâmetro e mais preferivelmente é uma artéria ilíaca externa porcina (EIA) ou uma artéria carótida interna porcina (ICA).

Será apreciado que o tecido vascular pode também ser derivado de outras espécies de mamíferos, tais como, sem limitação, ovinos ou Ihama, grandes espécies aviárias (por exemplo, avestruz) e grandes espécies de marsupiais (por exemplo, canguru).

Será apreciado que o tecido vascular pode também ser de vaso sanguíneo de grande diâmetro para o exemplo de aorta porcina ou bovina.

Referência aqui a vasos sanguíneos de pequeno diâmetro é um termo aceito na técnica e refere-se a vasos sanguíneos com um diâmetro interno ou interno de menos de 6 mm da etapa que diâmetro médio refere-se a vasos sanguíneos com um diâmetro interno ou interno compreendido entre 6 a 15 mm e diâmetro grande refere-se a vasos sanguíneos com um diâmetro interno ou interno de cerca de 25 mm.

Nas modalidades da invenção em que a matriz de tecido vascular xenogênico acelular é derivada de bovino, o tecido vascular é selecionado a partir do grupo que compreende a artéria carótida, artéria mamária in

5/34 terna, artéria torácica interna, veia mesentérica e veia jugular.

De preferência, o tecido vascular xenogênico acelular tem um colágeno equivalente ou não substancialmente diferente, glicosaminoglicano e conteúdo de elastina em relação ao tecido fresco ou não tratado.

Níveis típicos de colágeno fresco de tecido ICA não tratado estão na faixa de 400-1000 pg/mg e mais preferivelmente na faixa de 600-800 pg/mg e para EIA estão na faixa de 200-1000 ppg/mg e mais preferivelmente na faixa de 450-650 pg/mg. Tipicamente, os níveis de glicosaminoglicano de tecidos ICA e EIA frescos não tratados estão na faixa de 25-200 pg/mg e mais preferivelmente na faixa de 50-100 pg/mg.

De preferência, o tecido vascular xenogênico acelular tem um valor equivalente ou não significativamente diferente para a pressão de ruptura, retenção de sutura, resistência à tração, dilatação e baixos valores de taxa de tensão de falha, em comparação com o tecido fresco ou não tratado.

Tipicamente, a pressão de ruptura média de tecido ICA e EIA não tratado fresco é acima de 3000 mmHg, geralmente a retenção de sutura de tecido ICA e EIA não tratado fresco está na faixa de 1 a 5 N, normalmente, baixa falha de taxa de tensão ou ICA e AIA não tratado fresco é na direção axial na faixa de 2,5 a 6,5 MPa e mais preferivelmente está na faixa de 3,5 a 5,5 MPa e na direção circunferencial está na faixa de 1 a 6 MPa e de preferência está na faixa de 2 a 5 MPa, tipicamente a resistência à ruptura média de tecido ICA e EIA não tratado fresco está na faixa de 3 a 5 MPa.

De preferência, um comprimento típico de tecido vascular derivado acelular xenogênico porcino é de até cerca de 30 cm, e até cerca de 80 cm para o tecido derivado de bovino.

O tecido vascular xenogênico acelular da presente invenção é um andaime natural, isto é, que não é geneticamente alterado e é substancialmente livre de quaisquer resíduos de enzima α-galactosidase. Além disso, vantajosamente, tem aproximadamente as mesmas propriedades bioquímicas e mecânicas que o tecido fresco ou não tratado de modo que ele funciona como um tecido fresco ou não tratado, sendo embora de forma eficaz antigenicamente inerte. Deste modo, é um candidato ideal para o transplante

6/34 do produto e por cirurgia de substituição de ponte.

De preferência, o tecido vascular xenogênico acelular compreende ainda um revestimento, o revestimento sendo provido por um material adequado para revestir um ou ambos de uma superfície interna (lúmen) ou superfície externa do mesmo. Esta modalidade da presente invenção é de particular utilidade para enxertos vasculares.

De preferência, o material de revestimento é selecionado para melhorar a permeabilidade do vaso, ou para auxiliar / restaurar o lúmen do vaso ou o revestimento endotelial sobre a superfície interior do lúmen do vaso.

De preferência, o revestimento é um revestimento luminal e o material de revestimento é selecionado a partir do grupo que compreende: os anticoagulantes, tais como heparina, inibidores sintéticos pentassacarídeo, inibidores diretos de trombina, antagonistas da vitamina K, inibidores de fator Xa, prata, colágeno IV, elastina, glicoproteínas tais como o a laminina ou a fibronectina, os glicosaminoglicanos tais como ácido hialurônico, sulfato de condroitina e os peptídeos sintéticos ou naturais ou as suas misturas.

De preferência, o tecido vascular xenogênico acelular pode ser semeado com uma única população mista de células ou semeado nelas, a população de células sendo selecionada de acordo com um local de transplante, sendo selecionado a partir do grupo constituído por células epiteliais, tais como endotélio, mesotélio, ou células do músculo liso, FIBROBLASTOS, células tronco pluripotentes e multipotentes, tais como células tronco de adultos autólogas e alogênicas, células tronco hematopoiéticas, mesenquimais, neuronais, endoteliais, e embrionárias.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provido um método de preparação de um tecido vascular natural xenogênico acelular o método compreendendo, obter um vaso sanguíneo de substituição adequado e submetê-lo às seguintes etapas metodológicas:

(i) uma incubação com EDTA;

(ii) uma primeira lavagem de desinfecção;

(iii) pelo menos dois ciclos de uma incubação com um tampão

7/34 hipotônico e um detergente aniônico;

(iv) um tratamento com nuclease;

(v) uma lavagem hipertônico; e (vi) um processo de esterilização terminal.

De preferência, etapas (i) e (ii) podem ser realizadas em ordem inversa, de fato as etapas da presente invenção não se limitam à forma como dada acima e não se destinam a limitar o âmbito da invenção.

Preferencialmente, a incubação com EDTA é realizada em solução de tampão hipertônico, tais como por exemplo a 50 mM de TRIS, 1,5 M de NaCI e um protocolo típico será 200 mM de EDTA em tal um tampão hipertônico a cerca de 4 °C, durante pelo menos 24 horas. A solução hipertônica tem um pH fisiológico de aproximadamente que é muito fracamente alcalino e é aproximadamente um pH de entre 7,2 a 7,4.

De preferência, a primeira lavagem desinfetante da etapa (ii) compreende uma lavagem em uma solução de tampão hipotônico contendo vancomicina, gentamicina e polimixina, um período de lavagem adequado é de cerca de 30 min a uma temperatura de cerca de 37 °C.

De preferência, a etapa de incubação hipotônica da etapa (iii) compreende uma primeira incubação com um tampão hipotônico, tipicamente constituído por 10 mM de TRIS e, subsequentemente, com um tampão hipotônico, que compreende adicionalmente 2,7 mM de EDTA, 10 KIU / ml de aprotinina. As condições de incubação são tipicamente de entre 24 a 56 horas a cerca de 4 °C. Para uma outra incubação, o tampão hipotônico compreende adicionalmente um detergente aniônico tal como SDS em torno de uma concentração de 0,1% (p / v), durante esta parte da incubação a temperatura é de cerca de 37 °C. Este ciclo de incubações pode ser repetido uma ou mais vezes.

De preferência, o tecido pode então ser lavado várias vezes com salina tamponada de fosfato da Dulbecco antes de sujeitar o tecido ao tratamento com nuclease da etapa (iv). O tratamento com nuclease compreende, tipicamente, um período de incubação de cerca de 3 horas a 37 °C em uma solução de nuclease contendo TRIS 50 mM, 50 U/ml de DNAase e 1

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U/ml de ARNase. O tecido é então lavado repetidamente antes da etapa (v).

Preferencialmente, a incubação hipertônica da etapa (v) compreende uma incubação durante cerca de 24 horas a 37 °C em 50 mM de TRIS, 1,5 M de NaCl. O tecido é então lavado repetidamente antes da etapa 5 (vi).

De preferência, o processo de esterilização terminal provê a depuração viral e uma redução da biocarga para o tecido vascular xenogênico acelular antes do armazenamento ou transplante para um recipiente.

por qualquer um ou mais dos seguintes processos, por exemplo: a incorporação ou revestimento de agentes antimicrobianos, tais como antibióticos, defensinas e metais, tais como Ag²⁺, o tratamento com um agente de reticulação tal como glutaraldeído, carbodiimidas; tratamento com agentes de esterilização, tais como ácido peracético, óxido de etileno, óxido de propileno e 15 hidróxido de sódio, irradiação com, por exemplo, γ ou e-feixes e tratamento com CO₂ supercrítico.

A etapa de esterilização pode ser, por exemplo, uma segunda lavagem de desinfecção que compreende de uma etapa compreendendo a incubação com o ácido peracético, em uma concentração de cerca de 0,1% 20 v / v por cerca de 4 horas a 37 °C. O tecido pode então ser ainda lavado com uma solução de limpeza terminal adequada, tal como salina tamponada com fosfato da Dulbecco.

As concentrações e as condições de incubação não se destinam a limitar o escopo do pedido, mas apenas para fornecer exemplos de condi25 ções metodológicas.

De preferência, o método adicionalmente inclui a etapa de revestimento de uma superfície interna e/ou externa, quer do tecido natural xenogênico acelular vascular com um agente de revestimento, tal como aqui descrito antes.

De preferência, o método adicionalmente inclui a etapa de semear o tecido natural xenogênico acelular vascular com uma única população de células ou misto, tal como aqui descrito antes.

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Tecidos vasculares, tais como as artérias são eficazmente tubulares e por isso, é muito difícil assegurar que as superfícies internas do lúmen arterial são suficientemente tratadas para remover epítopos capazes de reagir com os anticorpos humanos pré-formados e epítopos capazes de ativar o complemento. Em uma modalidade da invenção, o tecido vascular pode ser perfundido continuamente movendo meios fluidos. Além disso, ou em alternativa, o tecido vascular pode também ser distendido durante a preparação e as etapas de incubação de modo a diluir as paredes do tecido vascular para estimular a penetração de vários fluidos. Os inventores demonstraram que a metodologia da presente invenção resulta em tratamento com sucesso, mesmo para superfícies internas.

De acordo com um aspecto ainda adicional da invenção, é fornecido um produto que compreende um produto de tecido de matriz de tecido vascular xenogênico acelular natural obtido pelos métodos da presente invenção para utilização como um tecido para transplante.

De preferência, o produto de tecido para transplante é para uso em cirurgia de ponte e, especialmente, a cirurgia coronária e de ponte em membros, é também para uso em acessos vasculares, por exemplo, acesso de AV.

Modalidades da invenção usando tecido vascular derivado de bovino são de utilidade particular na cirurgia de ponte e, como meios de acesso vascular por causa do comprimento do material vascular sendo na faixa de cerca de 80 cm de comprimento.

De acordo com um aspecto ainda adicional da invenção, é provido um método de cirurgia de ponte vascular que compreende a substituição de um vaso sanguíneo danificado ou bloqueado com um produto de tecido de matriz de tecido vascular xenogênico acelular natural do primeiro aspecto da invenção, ou como preparados pelos métodos da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Modalidades da invenção são descritas adicionalmente a seguir com referência aos desenhos anexos, nos quais:

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te	A FIGURA 1 mostra um diagrama de fluxo do protocolo decelularização para produzir tecido acelular. A FIGURA 2 mostra carótida interna porcina (ICA) nas Figuras 2 A-H e artérias ilíacas externas (EIA) nas Figuras l-L tratadas usando dois
5	ciclos de tampão hipotônico e solução de SDS (1 mg.ml·1) e, em seguida, coradas usando hematoxilina e eosina. A FIGURA 3 mostra ICA porcino (C-D) e EIA (EF) tratados usando dois ciclos de tampão hipotônico e solução SDS (1 mg.ml·1) e corados utilizando DAPI. ICA porcino fresco (A) e EIA (B) foram utilizados como con-
10	troles positivos. A FIGURA 4 mostra EIA fresca (C) e acelular porcino tratados
*<*	usando dois ciclos de tampão hipotônico e solução SDS (1 mg.ml'1), Figuras D e E são etiquetadas usando um anticorpo monoclonal contra o epitopo de α-Gal, ou um isotipo de controle (F). Pele porcina fresca foi usada como um
15	controle positivo (A, B). A FIGURA 5 mostra ICA acelular tratado utilizando 200 mM de EDTA a 4 °C (E-) e um ciclo de tampão hipertônico a 37 °C e marcado com um anticorpo monoclonal contra o epitopo α-Gal. As Figuras 5 A, B, E e F são marcadas com o anticorpo em bruto, as Figuras C e G com 0,39 mg.ml·1
20	de anticorpo purificado e as Figuras D e H com 0,16 mg.ml·1 de anticorpo puro. A FIGURA 6 mostra EIA acelular preparado de acordo com o protocolo da Figura 1 e marcado com um anticorpo monoclonal contra o epitopo de α-Gal, (A) purificado, adsorvido contra BSA (B), ou adsorvido contra
25	α-Gal BSA (C) ou um isotipo IgM de controle (D). A Figura 7 mostra ICA acelular marcado usando um anticorpo monoclonal contra o epitopo de α-Gal, purificada (A), adsorvida aginast BSA (B), ou adsorvida contra α-Gal BSA (C) ou um controle do isotipo IgM (D). A FIGURA 8 mostra ELISA para detecção de anticorpos para o
30	epitopo α-Gal após adsorção com vasos alogênicos frescos e acelulares, suínos e humanos. Os dados são expressos como média de (n = 6) ± 95% de limites de confiança. * representa uma diferença significativa, tal como

11/34 determinado por ANOVA de uma via e teste de T post hoc. ICA fresco suíno ICA; AICA acelular porcino ICA; artéria femoral comum humana CFA fresco; artéria femoral comum humana CCPA acelular; artéria ilíaca externa EIA fresca suína; artéria ilíaca externa AEIA acelular porcino, NTC sem controles de tecido.

A FIGURA 9 mostra o colágeno, colágeno desnaturado e conteúdo proteoglicano sulfatado de EIA fresco e acelular porcino (Figura 9A) e ICA (Figura 9B). Os dados são expressos como média de (n = 6) limites de ± 95% fresco e acelular porcino de confiança.

A FIGURA 10 mostra as células de rim de hamster bebê cultivadas com adesivo de cianoacrilato de contato (A) gel de colágeno (Β, E), ou AIA acelular porcino (C, F) e ICA (D, G) durante 48 horas, visualizados por microscopia de contraste de fase e corando usando coloração da Giemsa.

A FIGURA 11 mostra células 3T3 murinas cultivadas com adesivo de contato de cianoacrilato (A) em gel de colágeno (Β, E), ou AIA acelular porcino (C, F) e ICA (D, G) durante 48 horas, visualizadas por microscopia de contraste de fase e corando usando coloração da Giemsa.

A FIGURA 12 mostra o conteúdo ATP relativo de células 3T3 de camundongo incubadas com ou EIA acelular porcino fresco (Figura 12B) e ICA (Figura 12A) ou amostras de extrato de células de rim de hamster bebê incubadas com EIA porcino fresco ou acelular (Figura 12D) e amostras de extrato ICA (Figura 12C) sendo cada amostra incubada com DMSO a 40% (v / v) foram utilizadas como controle positivo para a citotoxicidade e DMEM como um controle negativo para a citotoxicidade. Os dados são expressos em média de (n = 6) ± 95% de limites de confiança. * representa uma diferença significativa para o controle DMEM como determinado por uma análise de variância e teste T post hoc.

FIGURA 13 mostra a quantificação de DNA extraído a partir de EIA fresco e acelular porcino e ICA, artérias femorais humanos comuns frescas e acelulares (CFA), Surgisis, Permacol, e CollaMend usando absorvância a 260 nm. Os dados são expressos como média (n = 3) ± 95% de limites de confiança

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FIGURA 14 mostra o teste de retenção de sutura de EIA e ICA fresco e acelular porcino. Os dados são expressos como média (n = 6) ± 95% limites de confiança.

A FIGURA 15 mostra o teste de dilatação de ICA (A, B) e EIA (C, D) fresco e acelular porcino dos dados que representa a mudança percentual no diâmetro da raiz como uma função do aumento da pressão interna. Eixo X (A, C) ou eixo Y (C, D). Os dados são expressos como média (n = 3) ± 95% de limites de confiança, os dados foram transformados em arco seno a fim de realizar uma análise estatística, e transformados de volta.

A FIGURA 16 mostra a resistência à tração axial e circunferencial final de EIA (A) e ICA (B) fresco e acelular porcino. Os dados são expressos como média (n = 6) de ± 95% de limites de confiança.

A FIGURA 17 mostra a inclinação de fase axial e circunferencial de colágeno de EIA (A) e ICA (B) acelular porcino fresco. Os dados são expressos como média (n = 6) de ± 95% de limites de confiança.

A FIGURA 18 mostra a inclinação de fase de axial e circunferencial de elastina de EIA (A) e ICA (B) acelular porcino fresco. Os dados são expressos como média (n = 6) de ± 95% de limites de confiança.

A FIGURA 19 mostra ELISA para a detecção de (a) C3a ou (b) C5a seguinte a reação de soro humano normal, com um plástico de cultura de tecidos, PBS, BSA, α-Gal BSA ou Zymosan. Os dados são expressos como média (n = 6) ± 95% de limites de confiança, * representa uma diferença significativa [em relação ao poliestireno] tal como determinado por ANOVA de uma via e teste T de post hoc.

A FIGURA 20 mostra ELISA para a detecção de (a) C3a ou (b) C5a seguinte a reação de soro humano normal, com um plástico de cultura de tecidos, PBS, BSA, α-Gal BSA ou Zymosan ou um intervalo de scaffolds acelulares biológicos comercialmente disponíveis (Surgisis, Collamend, Permacol). Os dados são expressos como média (n = 6) ± 95% de limites de confiança, * representa uma diferença significativa [em relação ao poliestireno] tal como determinado por ANOVA de uma via e teste T de post hoc. Pericárdio de suíno fresco de pericárdio; uréter, uréter suíno fresco, ICA, ICA

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EIA fresco suíno, artéria ilíaca fresca suína externa AICA, ICA CFA acelular porcino, artérias femorais AP novas humanas comuns, pericárdio UA acelular porcino, uréter AICA acelular porcino, artéria carótida acelular porcino interna AEIA, artéria ilíaca externa acelular porcina, artéria femoral comum humana acelular CCPA.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Ao longo da descrição e das reivindicações desta especificação, as palavras compreende e contém e as variações das mesmas significam incluindo mas não limitado a, e não se destinam a (e não) excluem outros radicais, aditivos, componentes, números inteiros ou etapas. Ao longo da descrição e reivindicações desta especificação, o singular inclui o plural, a menos que o contexto imponha interpretação diferente. Em particular, quando o artigo indefinido é usado, a especificação deve ser entendida como contemplando a pluralidade, bem como a singularidade, a menos que o contexto exija de outra forma.

Características, números inteiros, características, compostos, radicais ou grupos químicos descritos em conjunto com um aspecto particular, modalidade, ou o exemplo da presente invenção são para ser entendidos como sendo aplicável a qualquer outro aspecto, incorporação ou exemplo aqui descrito, a menos que incompatível com a mesma. Todas as características descritas nesta especificação (incluindo quaisquer reivindicações anexas, resumo e desenhos), e/ou todas as etapas de qualquer método ou processo assim divulgado, podem ser combinadas em qualquer combinação, exceto combinações onde pelo menos algumas de tais características e/ou etapas se excluam mutuamente. A invenção não está restrita aos detalhes de quaisquer modalidades anteriores. A invenção estende-se a qualquer uma nova, ou qualquer combinação nova, das características descritas nesta divulgação (incluindo quaisquer reivindicações anexas, resumo e desenhos), ou a qualquer uma nova, ou qualquer combinação nova, das etapas de qualquer método ou processo assim divulgados.

A atenção do leitor é direcionada para todos os papéis e documentos que são apresentados ao mesmo tempo ou anterior a esta especifi

14/34 cação, em relação a este pedido e que estão abertos à inspeção pública com esta especificação, e os conteúdos de todos esses artigos e documentos são aqui incorporados por referência.

A presente invenção provê produtos acelulares e métodos para a sua produção. Dois recipientes particularmente adequados foram identificados, artérias carótidas interna e ilíaca externa suína e estudos iniciais estabeleceram um protocolo capaz de remover todas as células e > 80% de DNA dos vasos, isto foi baseado no uso de dois ciclos de tampão hipotônico, a 4 °C e 1 mg.ml·¹ de soluçãCLde SDS a37 °(X respectivamente. Vasos decelularizados usando um único ciclo de tampão hipotônico e solução de SDS demonstrou a presença de células residuais e os restos celulares, quando corados com hematoxilina e eosina e DAPI. Portanto dois ciclos de tampão hipotônico e SDS foram escolhidos como o processo de de-celularização ideal como este foi produzir com fiabilidade vasos acelulares.

Rotulagem de anticorpo utilizando um anticorpo monoclonal contra o epitopo de α-Gal demonstrou que ele estava presente nas artérias ilíacas externas acelulares e artérias carótidas internas. Rotulagem de anticorpos foi realizada usando amostras de tecido crioinseridas, amostras embutidas de parafina fixada com zinco e amostras embutidas de cera de parafina fixadas com formalina. Comercialmente há apenas um clone de anticorpo único a partir de uma fonte única, isto é fornecido como uma preparação de produto bruto. A preparação em bruto produziu consistentemente coloração de fundo elevado em comparação com o anticorpo de controle de IgM negativo. O anticorpo foi purificado utilizando uma coluna de IgM. O anticorpo foi então dialisado e concentrado utilizando dispositivos de filtro centrífugas. Rotulagem utilizando o anticorpo purificado demonstrou níveis significativamente reduzidos de fundo em comparação com a preparação em bruto. Amostras Crioembutidas produziram a rotulagem mais sensível e amostras fixadas em formalina a rotulagem mais fraca. Portanto amostras de parafina embutidas fixadas em zinco foram usadas como uma técnica padrão como esta produziu histologia superior em comparação com as amostras crioembutidas e uma sensibilidade aumentada sobre as amostras fixas de formali

15/34 na. Os níveis de um α-Gal ao longo da matriz foram substancialmente mais baixos quando comparados com os tecidos de controle frescos. No entanto, o epitopo era detectável. Foram feitas tentativas para remover o epitopo aGal usando os ciclos crescentes de tampão hipotônico e solução de SDS. Rotulagem de anticorpos monoclonais demonstraram a existência de qualquer redução substancial dos níveis de um α-Gal, quando dois ciclos foram utilizados em relação a um único ciclo.

O buffer hipotônico de dois ciclos e solução de SDS não conseguirami remover α-Gal a partir das matrizes acelulares. Foi hipotetizado que uma etapa inicial para remover as células endoteliais da superfície do lúmen do vaso iria reduzir a quantidade de α-Gal no interior das matrizes acelulares. Para este fim Versene e várias concentrações de EDTA foram usadas antes do processo de de-celularização a fim de quelar os íons de metal para auxiliar a liberação das células endoteliais a partir do lúmen do vaso. O prétratamento com 200 mM de EDTA a 4 °C durante 25 horas provou ser eficaz na redução dos níveis de α-Gal com vasos acelulares, este foi incorporado no processo de descelularização da presente invenção.

Tratamento com tampão hipertônico (10 mM de Tris, 1,5 M de cloreto de sódio pH 7,4) seguinte a de-celularização tem sido usado durante o processo de de-celularização para reduzir ainda mais os níveis de a-Gal presentes dentro de tecidos cardiovasculares acelulares. Rotulagem de anticorpo adicional demonstrou um único ciclo de tampão hipertônico a 37 °C durante 24 horas, em combinação com o pré-tratamento com 200 mM de EDTA a 4 °C durante 24 horas com agitação foi bem sucedido na redução dos níveis de α-Gal com os vasos acelulares. Também mostrou que não houve melhoria óbvia na redução de α-Gal, com o aumento de ciclos (até três) de tratamento com tampão hipertônico, a 37 °C.

A fim de determinar se houve α-Gal residual no interior das matrizes acelulares, era essencial que a especificidade do anticorpo fosse determinada. Isto foi conseguido por adsorção do anticorpo purificado utilizando α-Gal BSA. BSA também foi incluído como um controle. Seguinte à adsorção do anticorpo, α-Gal teria ligado ao BSA α-Gal e assim ablação da sua

16/34 capacidade de se ligar a quaisquer epitopos de α-Gal, dentro do tecido sendo etiquetado. Por conseguinte, qualquer coloração utilizando este pode ser considerada como o fundo. Adsorção utilizando BSA sozinho demonstrou que a interação proteína: proteína não iria afetar a capacidade do anticorpo 5 para detectar um epitopo α-Gal. A comparação dos dados obtidos com o anticorpo absorvido com BSA e o anticorpo absorvido com α-Gal BSA com os tecidos de-celularizados e os tecidos de-celularizados tratados com aGalactosidase revelaram que: EIA acelular parecia ter α-Gal residual, que pode ser ainda mais reduzido através da utilização da enzima. Esta colora10 ção foi na matriz e não sobre a superfície da íntima. O ICA acelular tinha alguma coloração muito fraca que não pode ser removida através da utilização de α-Galactosidase. Os dados globais indicaram que havia um mínimo de α-Gal nos vasos acelulares.

O ensaio de adsorção de anticorpo utilizou o mesmo anticorpo 15 monoclonal. A vantagem deste teste é que um volume muito maior de material pode ser testado em comparação com a imunocitoquímica, que se limita a seções muito finas. Além disso, o anticorpo de ensaio de adsorção fez uma avaliação semiquantitativa de níveis de uma α-Gal presente nas amostras de tecido diferentes. Amostras de vasos frescos demonstraram altos 20 níveis de expressão de α-Gal. EIA e ICA porcinos frescos tratados com agalactosidase mostraram ser desprovidos de α-Gal (não diferente para o não controle de tecido), indicando que o ensaio foi bem sucedido. Amostras de EIA acelular e ICA demonstraram níveis de α-Gal, que não foram significativamente diferentes de artéria femoral fresca e acelular comum humana, bem 25 como o não controle de tecido.

A avaliação histológica demonstrou a arquitetura de matriz e da composição das amostras acelulares como sendo semelhantes aos controles frescos. As matrizes acelulares mostraram uma estrutura mais relaxada aberta quando comparadas aos frascos porcinos frescos. Não parecia ter 30 quaisquer diferenças qualitativas na GAG, colágeno, elastina ou conteúdo do EIA acelular ou ICA comparado aos frascos frescos. Resultados do colágeno, hidroxiprolina desnaturado e ensaios de glicosaminoglicano indicaram

17/34 que o processo de de-celularização não levou a perda de colágeno ou glicosaminoglicanos do tecido. Embora as análises bioquímicas quantitativas fornecessem informações sobre o conteúdo de colágeno e glicosaminoglicanos da matriz acelular, elas foram limitadas na medida em que não foi possível avaliar a integridade estrutural dos componentes. Os níveis de colágeno desnaturado foram, por conseguinte, determinados em conformidade com tratamento de α-quimotripsina, que é capaz de digerir o colágeno degradado, sem afetar o colágeno nativo (Bank e outros, 1997). Após a digestão, o sobrenadante de tecido (contendo qualquer colágeno degradado) foLtestado para a presença de hidroxiprolina. Os resultados indicaram que não houve aumento significativo na quantidade total de colágeno presente desnaturado em EIA acelular ou ICA comparado aos frascos frescos.

Preocupações em relação à presença de SDS residual foram tratadas através da quantificação da concentração de SDS dentro de cada uma das soluções utilizadas para produzir de-celularização EIA acelular e ICA. A utilização de SDS radiomarcado (C¹⁴), demonstrou a existência de níveis extremamente baixos de SDS presente nas soluções de lavagem finais utilizadas no processo de de-celularização.

Biocompatibilidade de matrizes acelulares foi demonstrada usando o extrato e ensaios de citotoxicidade de contato. Cada ensaio utilizou duas linhagens diferentes de células, células de rim de hamster bebê e células 3T3 de camundongo. Dados anteriores demonstraram a biocompatibilidade in vivo em matrizes SDS tratadas e não era necessário repetir isso usando EIA acelular ou ICA.

Quantificação do DNA, utilizando um número de diferentes ensaios indicou a existência de uma redução superior a 90% nos níveis de DNA seguintes a de-celularização e estes valores foram significativamente menores do que a quantidade de DNA isolado a partir de Surgisis. Os níveis de DNA isolados a partir de EIA e ICA acelular porcino eram comparáveis aos do Permacol e CollaMend. EIA acelular e ICA continha 0,014 pg.mg'¹ e 0,019 pg.mg'¹, respectivamente, do DNA. Surgisis continha 0,119 pg.mg'¹, Permacol 0,028 pg.mg'¹ e CollaMend 0.017 pg.mg'¹ de DNA. PCR demons

18/34 trou qualquer DNA residual era tanto pequenos pedaços fragmentados de DNA que não poderíam ser amplificados ou 'junk' de DNA não codificante. A presença de retrovírus endógenos suínos é uma preocupação para qualquer enxerto xenogênico derivado de porcino. Apesar disso, não existe virtualmente nenhuma informação sobre os efeitos de tais vírus em seres humanos, o potencial para a transmissão ou a um nível mínimo de segurança. Número de cópias PERV foi determinado utilizando PCR quantitativo utilizando uma sonda Taqman. Os dados indicaram DNA PERV estando presente em todas as amostras de porcino EIA e ICA açelular, bem como fibroblastos da derme humana. Houve uma redução de seis log em número de cópias em CFA açelular quando comparado com fresco e uma redução de sete log para ICA açelular. O número de cópias presentes dentro de ICA açelular e EIA foi significativamente mais baixo do que qualquer um dos produtos comercialmente disponíveis, tal como não existem níveis seguros mínimos estabelecidos de retrovírus endógenos suínos em comparação com os produtos comercialmente disponíveis é crítico. O ensaio não determina se o genoma PERV inteiro está presente ou se é transcricionalmente ativo. As propriedades biomecânicas e cumprimento de EIA e ICA açelular porcino foram avaliados através de testes de pressão de ruptura, teste de retenção de sutura, testes de dilatação e testes de falha de taxa de baixa tensão. É essencial que qualquer material de enxerto tenha características biomecânicas semelhantes às artérias que eles substituem. Não houve grandes mudanças nas propriedades de vasos suínos acelulares em comparação com tecido porcino fresco. Não houve diferenças significativas observadas entre as pressões de ruptura do EIA açelular ou ICA em comparação com vasos frescos. Os valores da pressão de ruptura foram muito maiores do que as pressões fisiológicas normais experimentadas dentro das artérias que se encontram na região de 120 mmHg. Os resultados obtidos para as artérias acelulares foram comparáveis com as pressões de ruptura máxima de artérias humanas (2031 - 4225 mmHg) e na veia safena humana (1680 - 2273 mmHg; L'Heureux, N. e outros, 2006).

Com relação à ativação de complemento e à detecção de C3a

19/34 ou C5a (Figura 20) os vasos acelulares produzidos pelos métodos da presente invenção mostram a ativação insignificante quando comparada com os produtos comercialmente disponíveis e também é interessante, em comparação com uréter de porcino preparado pelos mesmos métodos. Isto indica que não houve uma ablação com sucesso de epítopos antigênicos de dois tecidos de vasos acelulares.

Os dados recolhidos até hoje demonstram que dois vasos estéreis acelulares podem ser eficazmente produzidos utilizando um protocolo de de-celularização novo que resulta em um vaso biocompatível demonstrando uma redução > 90% (p / p) de DNA, os níveis mínimos de α-Gal e não é bioquímica ou biomecanicamente distinto de vasos novos. Além disso, os dados mostraram o conteúdo do EIA PERV acelular e ICA como sendo significativamente menor do que os produtos disponíveis no mercado, que têm um histórico clínico comprovado de uso em pacientes.

De-celularização de Artérias ilíacas externas porcinas (EIA) e artérias carótidas internas (ICA)

Frascos de ICA e EIA congelado de até 200 mm de comprimento foram preparados tal como descrito na Figura 1, usando 200 ml de cada solução em que cada solução é previamente aquecida até a temperatura apropriada antes da utilização. Os vasos são colocados em 250 ml individuais recipientes estéreis e todas as incubações são efetuadas com agitação a 240 rpm, com exceção da etapa de nuclease que está a 80 rpm. Como uma primeiro etapa, se o EIA e ICA é congelado o tecido é descongelado a 37 °C durante 20 minutos, depois foi lavado com solução de desinfecção que compreende a vancomicina, gentamicina e sulfato de polimixina B durante 30 minutos a 37 °C. A primeira etapa de incubação é uma lavagem, utilizando 200 mM de EDTA a 4 °C durante 24 horas, seguido por uma lavagem com tampão hipotônico (10 mM de TRIS, 2,7 mM de EDTA, 10KIU/ml de aprotinina) 4 °C durante 24 horas e uma lavagem usando 0,1% (p / v) de SDS em tampão hipotônico, a 37 °C durante 24 horas. Uma lavagem adicional com tampão hipotônico, a 4 °C durante 24 horas é seguida por uma lavagem usando EDTA DPBSa contendo aprotinina para entre 48 a 56 horas a 4 °C e

20/34 uma lavagem com 0,1% (p / v) de SDS em tampão hipotônico a 37 °C durante 24 horas. O tecido é então lavado três vezes com DPBSa a 37 °C durante 30 minutos cada e uma solução de nuclease (5 mM de TRIS, 50 g / ml de BSA, 50 U / ml de DNAase, 1 U / ml de ARNase), a 37 °C durante três horas. O tecido é então lavado três vezes com DPBSa EDTA contendo aprotinina a 37 °C durante 30 minutos cada e uma lavagem de incubação posterior com solução hipertônica de 24 horas a 37 °C e três lavagens adicionais utilizando DPBSa EDTA contendo aprotinina a 37 °C durante 30 minutos cada. O tecido é então esterilizado com 0,1% (v / v) de solução de ácido peracético, durante quatro horas a 27 °C. As seguintes etapas subsequentes são realizadas de forma asséptica no interior de um armário de segurança de classe II, (i) lavar três vezes usando DPBSa EDTA contendo aprotinina a 37 °C durante 30 minutos cada (ii) lavagem usando DPBSa a 4 °C durante 24 horas. O tecido é então armazenado em DPBSa a 4 °C até ser necessário.

Preparação de Tecido / Histologia

Os espécimens de tecido foram fixados em 10% (v / v) de formalina tamponada neutra e, em seguida, desidratados e embebidos em cera de parafina. Seções seriadas foram tomadas e coloração com hematoxilina e eosina padrão (Η & E) (Bios Europe Ltd, Skelmersdale, UK) foi utilizada para avaliar a histioarquitetura de tecidos e coloração com elastina de Miller foi utilizada para avaliar o conteúdo de elastina. Os ácidos nucleicos foram corados utilizando DAPI coloração (Sigma-Aldrich) e Hoechst 33258 (SigmaAldrich). Anticorpos IgM monoclonais contra um epitopo α-Gal foram obtidos a partir de compostos bioquímicos Alexis, San Diego, EUA, e purificados antes da utilização.

Ensaio de Adsorção de Anticorpo para a-Gal

ELISA foi utilizado para determinar os níveis de um anticorpo aGal desacoplado após incubação com amostras de tecido. As amostras foram incubadas com 500 pl a 5% (p / v) de BSA em DPBS durante a noite a 4 °C, o BSA foi então disposto e cada um dos tubos foi lavado três vezes durante dois minutos com 500 pl de DPBS. Exatamente 100 mg de tecido foi pesado e finamente macerado e colocado em microtubos bloqueados com 1

21/34 ml de um anticorpo monoclonal anti-a-gal em diluente de anticorpo (0,37 mg.ml*¹) e deixado durante a noite a 4 °C sobre uma rotator. Os microtubos contendo o tecido foram centrifugados a 600 xg durante 15 minutos (ou 13000 rpm em microcentrífuga) e 750 pl de sobrenadante foi removido para microtubos frescos bloqueados para que um adicional de 750 pl de TBS de azida de BSA fosse adicionado e, em seguida, misturado e centrifugado a 600 xg durante 15 minutos. Mais 750 μΙ de sobrenadante foi removido e o sobrenadante testado quanto a anticorpos para α-Gal através de ELISA por adição de 50 μΙ de α-Gal BSA a 10 pg.m*¹ em DPBS em poços de placas de microtitulação Maxisorb durante a noite a 4 °C. Estes foram lavados 3x10 min usando 300 μΙ de DPBS Tween com agitação, e em cada uma das cavidades da placa de microtitulação Maxisorb revestida foi bloqueada com 250 μΙ a 5% (p / v) de BSA em DPBS durante a noite a 4 °C. Subsequentemente, cada poço foi lavado 3 x durante 30 min com 300 μΙ de DPBS Tween com agitação e 100 μΙ de amostras foram transferidos para poços relevantes de placa de microtitulação revestidas e bloqueadas. Estas foram, em seguida, incubadas à temperatura ambiente durante três horas, e posteriormente lavadas antes da adição de 50 μΙ de peroxidase de rábano silvestre secundária conjugada com anticorpo de coelho anticamundongo (1: 1000 de diluição). Esta foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente e posteriormente lavada antes da adição de 100 μΙ de solução de OPD e incubada durante 10 min à temperatura ambiente, no escuro. 50 μΙ a 3M de ácido sulfúrico foi adicionado a cada poço e as densidades ópticas foram medidas utilizando um espectrofotômetro de microplaca a 492 nm com um filtro de referência a 630 nm. Os valores de cada uma das amostras foram representados como uma média ± 95% de limites de confiança e qualquer diferença significativa determinada.

Ensaio de Hidroxiprolina.

Antes de realizar o ensaio de hidroxiprolina, as amostras foram liofilizadas para se obter um peso constante, antes de ser hidrolisadas através de incubação com ácido clorídrico a 6 M (HCL) durante 4 horas a 120 °C e neutralizadas com hidróxido de sódio (NaOH). O procedimento adotado foi

22/34 baseado no método descrito por Edwards e O'Brien [29]. As soluções de de padrão calibrador foram feitas utilizando trans-4-hidróxi-L-prolina (Sigma). Solução de ensaio (50 μΙ) foi adicionada aos poços de uma placa de fundo plano de 96 poços a qual 100 μΙ de solução oxidante (cloramina T hidrato, Sigma) foram adicionados e deixados durante 5 minutos com agitação suave. Reagente de Ehrlich (100 μΙ) foi então adicionado a cada poço. A placa foi então coberta e incubada a 60 °C em banho-maria durante 45 min antes da absorvência ser lida a 570 nm. A concentração de hidroxiprolina foi então determinada por interpolação a partir de uma curva padrão de hidroxiprolina.

Ensaio de Glicosaminoglicanos

A quantidade de açúcares sulfatados (GAGs) foi determinada através da ligação azul de dimetilmetileno (Enobakhare e outros, Anal.Biochem 243, 189, 1996; Farndale e outros, Biochim Biochys Acta, 883, 173, 1986). Resumidamente, as soluções de teste foram incubadas com a solução de azul de dimetilmetileno, e a absorvância lida a 525nm. A quantidade de GAGs foi calculada por interpolação de uma curva padrão preparada com sulfato de condroitina e de tampão de ensaio com fosfato (0,1 M de ortofosfato de di-hidrogênio de sódio, 0,1 M de ortofosfato de hidrogeno dissódico, pH 6,8) ao longo de uma faixa de concentrações.

EXEMPLO 1

ICA e EIA porcina tratada fixada com formalina foi secionado em pm e corada com hematoxilina e eosina (Figura 2). Quando dois ciclos de tampão hipotônico e SDS foram usados não havia evidência de células residuais e resíduos celulares (Figura 2). Além disso, a histoarquitetura de matriz parecia ter permanecido intacta após tratamento. Seções de ICA e EIA porcina tratada fixada com formalina foram coradas quanto à presença de DNA de cadeia dupla, utilizando DAPI, ICA e EIA porcino fresco foram utilizados como controles positivos (Figura 3). A coloração revelou falta de DNA de cadeia dupla e as células dentro da matriz comparado com o tecido de controle fresco (Figura 3). Quando o tempo de exposição foi aumentado por um fator de dez nenhuma fluorescência foi aparente como resultado da presença de DNA de cadeia dupla e, por conseguinte, das células.

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EXEMPLO 2

É desejável que as matrizes acelulares xenogênicas sejam desprovidas de um epitopo de α-Gal se ela for utilizada clinicamente, a fim de atenuar as reações inflamatórias mediadas pelo anticorpo. Por conseguinte, é necessário desenvolver um método fiável para detectar a sua presença no interior dos vasos acelulares. Amostras de EIA frescas e acelulares porcinas (dois ciclos SDS) foram fixadas em formalina, embebidas em parafina e secionados em 5 pm. Seções de EIA fresco e acelular porcino foram marcadas durante a presença do epitopo de α-Gal utilizando um anticorpo monoclonal IgM (Alexis 801 -090, clone M86, diluição de 1:10). Um kit Dako Envision foi usado para visualizar o anticorpo primário (Figura 4). Os resultados demonstraram a presença do epitopo de α-Gal seguinte a de-celularização. Houve também um elevado grau de coloração de fundo, o que estava ausente quando um anticorpo de controle de isotipo IgM foi utilizado para marcar as amostras. Outras experiências mostraram que o tecido fresco demonstrou boa marcação positiva com o anticorpo monoclonal IgM (dados não mostrados), e que o anticorpo purificado parecia produzir uma maior especificidade de rotulagem em comparação com a preparação em bruto (dados não mostrados). A rotulagem demonstrou uma redução no conteúdo de α-Gal quando tampão hipertônico foi usado em conjunto com uma lavagem de 200 mM de EDTA realizada a 4 °C durante 24 horas (Figuras 5). Não havia nenhuma diferença nos níveis de um conteúdo de α-Gal, quando os ciclos crescentes de tampão hipertônico foram utilizados. Portanto uma incubação de 24 horas em tampão hipertônico a 37 °C, foi adotada para remover o epitopo α-Gal de matrizes acelulares, em conjunto com uma lavagem inicial com 200 mM de EDTA realizada a 4 °C durante 24 horas. Para o de tecido subsequente, protocolo de de-celularização na Figura 1 foi adotada.

EXEMPLO 3

A fim de determinar se houve um α-Gal residual presente dentro dos vasos acelulares era importante determinar a especificidade da rotulagem do anticorpo. Amostras de EIA fresco e acelulares e ICA, juntamente com EIA e ICA nova e acelular tratada com α-galactosidase foram marcadas

24/34 para as presenças de o epitopo α-Gal utilizando um anticorpo monoclonal IgM (Alexis ALX-801 -090) clone M86 e visualizado utilizando o kit Dako Envision. Três preparações diferentes do anticorpo foram utilizadas: (i) o anticorpo purificado (1: 4 de diluição - 0,39 mg.ml·¹) (ii) anticorpo purificado adsorvido utilizando BSA e (iii) o anticorpo purificado adsorvido usando a-Gal BSA. A Figura 6 mostra EIA acelular marcada utilizando um anticorpo monoclonal contra o epitopo de α-Gal, (A) purificado, adsorvido contra BSA (B) ou adsorvido contra α-Gal BSA (C) ou um controle do isotipo IgM (D) com a ampliação original x 100. Figura 7 mostra o mesmo, mas para ICA acelular.

Rotulagem de anticorpo de tecido fresco demonstrou rotulagem positiva definida forte ao longo da matriz, o que poderia ser significativamente reduzida após tratamento com α-Galactosidase. Os resultados indicaram que o anticorpo purificado foi adicionalmente limpo, por absorção com BSA. O anticorpo purificado absorvido com BSA é específico para a-Gal dado que a absorção com α-Gal BSA totalmente ablou ligação ao tecido fresco. Além disso, houve α-Gal mínimo presente dentro do ICA acelular e EIA, a superfície luminal foi totalmente clara. Inspeção de perto de seções por microscopia revelou que qualquer rotulagem de fundo com o anticorpo BSA absorvido era mínima. O estudo demonstrou que a rotulagem de fundo não pode ser removida por tratamento com a-Galactosidase.

EXEMPLO 4

Um ensaio de adsorção de anticorpo semiquantitativo foi utilizado para estimar a quantidade de α-Gal presente em tecidos porcinos. Um teste de ELISA foi utilizado para quantificar o anticorpo anti-a-Gal não ligado presente seguinte a incubação com amostras de tecidos macerados. O controle negativo utilizado foi um tecido de não controle e nenhum dos dados indicou a existência de uma diferença significativa entre o não controle de tecido, vasos acelulares, e pele humana. Artérias femorais comuns alogênicas frescas e acelulares foram utilizadas como controles para este ensaio (Figura 8). O ensaio mostrou artérias femorais comuns frescas e acelulares como estando livres do epitopo α-Gal. Não houve diferença significativa na ligação de anticorpo de α-Gal ao EIA acelular porcino ou ICA em compara

25/34 ção com o controle de não tecido, ou artérias femorais comuns frescas alogênicas e acelulares (Figura 8). No entanto, houve uma diferença significativa entre o anticorpo ligado ao acelular em comparação com EIA fresco e ICA (Figura 8; ANOVA de uma via e teste T post hoc).

EXEMPLO 5

A fim de avaliar completamente os efeitos do protocolo de decelularização nas matrizes amostras de EIA fresco e acelulares e ICA (n = 6) foram ensaiadas para determinar os seus principais componentes. Para quantificar colágeno ácido amostras de tecido hidrolisado foram testadas para conteúdo de hidroxiprolina, seguindo o método de Edwars & 0' Biran (1980). O ensaio gerou uma relação linear entre uma curva padrão produzida usando trans-4-hidróxi-L-prolina e absorvância a 570 nm. Os valores de ensaio foram convertidos para pg.mg'¹ e os valores de hidroxiprolina foram convertidos ao colágeno pela multiplicação por 7,46. O conteúdo de colágeno de ICA fresco e acelular foi encontrado como sendo 795,2 pg.mg'¹ e 700,6 pg.mg'¹ respectivamente. O conteúdo de colágeno do EIA fresco e acelular foi 572,3 pg.mg'¹ e 547,3 pg.mg'¹, respectivamente. Os valores não foram significativamente diferentes (ANOVA one-way e teste T post hoc).

Para quantificar o conteúdo de ácido GAG amostras de tecido hidrolisadas foram ensaiadas para conteúdo de açúcar carboxilado sulfatado usando o corante azul de dimetileno (Farndale e outros 1986). O ensaio gerou uma relação linear entre uma curva padrão produzida usando sulfato de condroitina B e absorvância a 525 nm os valores de ensaio foram normalizados para a massa de amostra e expressos como pg.mg'¹. O conteúdo de GAG sulfatado de ICA fresco foi determinado como sendo 63,8 pg.mg'¹ em comparação com ICA acelular que foi 57,0 pg.mg'¹. O conteúdo de GAG de AIA fresco e acelular foi considerado 64,5 pg.mg'¹ e 54,7 pg.mg'¹, respectivamente. Os valores não foram significativamente diferentes (ANOVA oneway e teste T post hoc; Figuras 9A e 9B).

Conteúdo de colágeno desnaturado ou danificado foi avaliado através de digestão enzimática dos tecidos, utilizando α-quimotripsina, seguida de hidrólise ácida. Níveis de hidroxiprolina foram determinados e conver

26/34 tidos para o colágeno. O ensaio gerou uma relação linear entre uma curva padrão produzida usando trans-4-hidróxi-L-prolina e absorvância a 570 nm. O conteúdo de colágeno desnaturado de ICA fresco e acelular foi encontrado como sendo 30,8 pg.mg’¹ e 26,6 pg.mg’¹, respectivamente. O conteúdo de colágeno desnaturado de EIA fresco e acelular foi de 30,8 e 21 0,5 pg.mg’¹, respectivamente. Os valores não foram significativamente diferentes (ANOVA one-way e teste T post hoc; Figuras 9A e 9B).

EXEMPLO 6

O ensaio de citotoxicidade de contato foi utilizado para determinar o efeito das matrizes acelulares no crescimento das células, o que foi utilizado como uma primeira avaliação da biocompatibilidade. Pequenas amostras de EIA e ICA acelular porcino (n = 3) foram dissecadas assepticamente e aderidas ao centro de poços de placas de cultura de tecidos, utilizando gel de colágeno, uma suspensão de micoplasma livres de camundongo 3T3 ou o células de rim de hamster bebê foram adicionadas a cada poço e cultivadas durante 48 horas. Cada poço foi visualizado utilizando microscopia de contraste de fase e após fixação em formalina e coloração com colocração de Giemsa. O exame microscópico das placas de citotoxicidade de contato demonstrou que os fibroblastos de camundongo 3T3 (Figura 11) e células de rim de hamster bebê (Figura 10) cresceram até e em contato com o material acelular. Não ocorreram alterações evidentes na morfologia das células ou e lise de células foi anotada. Cola de cianoacrilato (controle positivo) demonstrou que provoca a lise das células. Colágeno sozinho (controle negativo) não mostrou sinais de citotoxicidade.

EXEMPLO 7

Amostras de EIA e ICA porcino fresco e de-celularizado foram maceradas e incubadas a uma concentração de 100 mg.ml'¹ de DMEM a 37 °C com agitação durante 72 horas, a fim de extrair quaisquer componentes solúveis. Este extrato foi incubado juntamente com uma monocamada de micoplasma livres de camundongo 3T3 e células de rim de hamster bebê durante 48 horas, após o que os níveis de ATP foram determinados utilizando o ensaio ATP-Lite-M comercialmente disponível (Perkin Elmer). Duas li27/34 nhagens de células diferentes foram usadas; células de camundongo 3T3 uma linhagem de célula fibroblástica e linhagem de célula de rim de hamster bebê uma linhagem de células epiteliais. Os resultados demonstraram não haver diferença significativa entre o conteúdo de ATP e, portanto, em relação a viabilidade das células de camundongo 3T3 incubadas com DMEM e extraídas de amostras de ICA acelular porcino (Figura 12A e 12B). Houve significante aumento na viabilidade das células quando as células de camundongo 3T3 foram incubadas com extratos de EIA acelular porcino (Figura 12B). Houve uma diferença significativa entre o conteúdo de ATP de células 3T3 incubadas com DMEM ou extratos acelulares em comparação com os extratos de tecido fresco (Figura 12A). Os níveis de ATP presentes dentro das células 3T3 cultivadas na presença de 40% (v / v) de DMSO foram significativamente menores do que qualquer uma das outras amostras testadas (Figura 12A e 12B). Houve um aumento significativo nos níveis de ATP de células de rim de hamster bebê cultivadas com extratos de acelular porcino EIA ou ICA comparação com DMEM (Figura 12C e 12D). Não houve diferença significativa entre o conteúdo de ATP das células de rim de hamster bebê incubadas com DMEM ou extratos acelulares em comparação com os extratos de tecido fresco (Figura 12C e 12D). Os níveis de ATP presentes dentro das células de rim de hamster bebê cultivadas na presença de 40% (v / v) de DMSO foram significativamente mais baixos do que qualquer uma das outras amostras testadas (Figura 12C e 12D).

EXEMPLO 8

O DNA foi isolado a partir de amostras (n = 3) de EIA fresco e acelular porcino e ICA utilizando um kit comercialmente disponível (Qiagen) e quantificado utilizando absorvância a 260 nm. Um certo número de produtos comercialmente disponíveis foram também incluídos na análise: Surgisis, Permacol e CollaMend. Os dados indicaram que houve uma redução maior do que 90% nos níveis de DNA seguintes a de-celularização. EIA acelular e ICA continham 0,014 pg.mg'¹ e 0,019 pg.mg'¹, respectivamente, do DNA (Figura 13). Surgisis continha 0,119 pg.mg'¹, Permacol 0028 pg.mg'¹ e CollaMend 0,017 pg.mg'¹ de DNA (Figura 13). EIA e ICA acelulares continham

28/34 quantidade significativamente menor de DNA do que Surgisis (Figura 13).

EXEMPLO 9

PCR e RT-PCR foram realizadas utilizando DNA extraído e o RNA total. Iniciadores contra TNFa e GAPDH foram utilizados para amplificar o DNA extraído de EIA fresco e acelulares e ICA. O corante fluorescente Syber verde foi usado para detectar qualquer produto de PCR. A reação de PCR não detectou quaisquer produtos GAPDH ou TNFa em amostras de DNA extraídas de EIA acelular ou ICA (Tabela 1). Portanto, qualquer DNA presente era suscetível de ser fragmentos e não codificar e, portanto, DNA não funcional apenas para atividades de manutenção da casa.

A tabela 1 mostra o número do ciclo em que os produtos de PCR foram detectados quando iniciadores contra GAPDH e TNFa foram utilizados

contra o DNA isolado em um PCR verde Sy	ber.
Amostra	Iniciador	Valor limite	Valor Ct
EIA fresco	GAPDH	0,210	33,75
EIA acelular	GAPDH	0,210	Nenhum valor ct
ICA acelular	GAPDH	0,210	Nenhum valor ct
EIA fresco	NPC	0,210	Nenhum valor ct
EIA acelular	NPC	0,210	Nenhum valor ct
ICA acelular	NPC	0,210	Nenhum valor ct
EIA fresco	TNFa	0,210	29,99
EIA acelular	TNFa	0,210	Nenhum valor ct
ICA acelular	TNFa	0,210	Nenhum valor ct
Nenhum controle modelo	GAPDH	0,210	Nenhum valor ct
Nenhum controle modelo	TNFa	0,210	Nenhum valor ct

Detecção de GAPDH (Tabela 2) e TNFa (Tabela 3), foi realizada usando uma de duas etapas da reação de RT-PCR de RNA total extraído de EIA fresco e acelular e ICA. O corante fluorescente Syber verde foi usado para detectar qualquer produto de PCR. A reação de RT-PCR não detectou quaisquer produtos GAPDH ou TNFa em amostras de RNA total extraída de EIA acelular ou ICA quando comparadas com amostras frescas.

A Tabela 2 mostra o número do ciclo em que os produtos de

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PCR foram detectados quando iniciadores contra GAPDH foram usados contra RNA isolado em uma de duas etapas de RT-PCR.

Amostra	Iniciador	Valor Limite	Valor Ct
EIA fresco	GAPDH	0,212	47,03
EIA acelular	GAPDH	0,212	Nenhum valor ct
ICA fresco	GAPDH	0,212	49,14
ICA acelular	GAPDH	0,212	Nenhum valor ct
Nenhum controle modelo	GAPDH	0,212	Nenhum valor ct
EIA fresco	Nenhum controle de iniciador	O,212	Nenhum valor ct
EIA acelular	Nenhum controle de iniciador	0,212	Nenhum valor ct
ICA fresco	Nenhum controle de iniciador	0,212	Nenhum valor ct
ICA acelular	Nenhum controle de iniciador	0,212	Nenhum valor ct

A Tabela 3 apresenta o número de ciclos em que os produtos de

PCR foram detectados quando iniciadores contra TNFa foram utilizados con5 tra RNA isolado em uma de duas etapas de RT-PCR. ________________

Amostra	Iniciador	Valor Limite	Valor Ct
EIA fresco	TNFa	0,123	37,52
EIA acelular	TNFa	0,123	Nenhum valor ct
ICA fresco	TNFa	0,123	36,48
ICA acelular	TNFa	0,123	Nenhum valor ct
Nenhum controle modelo	TNFa	0,123	Nenhum valor ct
EIA fresco	Nenhum controle de iniciador	0,123	Nenhum valor ct
EIA acelular	Nenhum controle de iniciador	0,123	Nenhum valor ct
ICA fresco	Nenhum controle de iniciador	0,123	Nenhum valor ct
ICA acelular	Nenhum controle de iniciador	0,123	Nenhum valor ct

30/34

EXEMPLO 10

Detecção e quantificação de retrovirus endógenos porcinos foi realizado utilizando PCR em tempo real quantitativo utilizando uma sonda TaqMan. O DNA foi isolado a partir de amostras (n = 3) de EIA e ICA fresco e acelular porcino utilizando um kit comercialmente disponível (Qiagen) e quantificado utilizando absorvância a 260 nm. Um certo número de produtos comercialmente disponíveis foram também incluídos na análise: Surgisis, Permacol e CollaMend. O DNA foi também isolado a partir de fibroblastos dérmicos humanos primários obtidos a partir de uma fonte comercial.

A Tabela 4 mostra o número de cópias do genoma PERV presentes dentro de porcino, EIA, ICA, Permacol, CollaMend, Surgisis, e fibroblastos humanos primários. Os dados representam média (n = 3).

Amostra	Valor Ct	Cópia No.
EIA fresco	22,54	4,52 E+05
EIA acelular	36,76	2,54 E-01
ICA fresco	23,94	2,61 E+05
ICA acelular	38,21	8,32 E-02
Permacol	32,14	5,92
CollaMend	35,21	13,46
Surgisis	31,02	2,54 E+01
Fibroblastos	18,44	2,30 E+01
NTC	Nenhum valor ct	N/A

Os dados indicaram PERV DNA como estando presente em todas as amostras testadas (Tabela 4). Houve uma redução de seis log em número de cópias em CFA acelular quando comparado com fresco e uma redução de sete log para ICA acelular. O número de cópias presente dentro de ICA e EIA acelular foi significativamente mais baixo do que qualquer um dos produtos comercialmente disponíveis (ANOVA uma via e teste T post hoc). O ensaio não é determinante para o genoma inteiro PERV está presente ou se transcricionalmente ativo.

EXEMPLO 11

Amostras EIA e ICA fresco e acelular porcino (15 cm de compri

31/34 mento) foram testadas quanto à sua capacidade de suportar a pressão crescente usando um equipamento de pressão de explosão projetado. A pressão interna aumentou até um máximo de 3750 mmHg para cada frasco. EIA acelular porcino, que tinha sido tratado com 0,1% (v / v) de ácido peracético por três ou quatro horas, foi testado para determinar se esta etapa teve um efeito prejudicial sobre a biomecânica da matriz. Os resultados demonstraram que não houve qualquer diferença significativa entre as pressões máximas suscetíveis de ser suportadas pelo EIA ou ICA fresco ou açelular porcino (dados não mostrados). Duas das amostras frescas falharam na região de ligação com suturas e nenhuma das amostras acelulares falhou como resultado da criação ou na ligação ou locais de fixação. A pressão de estouro média da ICA açelular foi 3624 mmHg, em comparação com 3750 mmHg para EIA açelular. Não houve diferença significativa entre o EIA açelular, que tinha sido tratado com 0,1% (v / v) de ácido peracético por três ou quatro horas.

EXEMPLO 12

Testes de retenção da sutura foram realizados em EIA e ICA acelular porcino, os dados foram comparados com amostras frescas. Uma sutura única foi colocada dentro da amostra de tecido usando Prolene 4-0 e protegida usando um nó triplo. O teste foi realizado utilizando um sistema de testagem modelo de tabela em série Instron 5860, a uma velocidade de 10 mm.min'¹. Os dados foram apresentados como a força máxima em cada tecido Newton foi capaz de resistir antes da sutura ser removida. Não houve diferenças significativas entre a força máxima de retenção de sutura da EIA ou ICA fresco comparadas com amostras açelular (Figura 14).

EXEMPLO 13

A intenção deste estudo foi quantificar a expansão periférica e axial de EIA e ICA porcino açelular e fresco (n = 3). Os dados adquiridos durante o teste de dilatação incluiu ainda imagens de EIA e ICA porcino acelular e fresco nos intervalos de pressão de forma incrementai aplicados (n = 3). Todas as imagens foram analisadas em imagem de software pro plus 5,41 V. A dilatação em ambos os eixos X e Y foi determinada. Os resultados

32/34 foram apresentados como percentagem de alteração no diâmetro da raiz como uma função do aumento da pressão interna (Figuras 15A-D). Os dados demonstraram dois resultados estatisticamente significativos, a dilatação do ICA acelular no eixo X (Figura 15A) foi significativamente maior do que a dilatação do ICA fresco. Além disso, a dilatação do ICA acelular porcino foi maior do que a do ICA fresco no eixo Y (Figura 15B). Cada uma das curvas de dilatação foi semelhante e não demonstrou diferenças significativas entre os tecidos frescos e acelulares (Figurei 5A-D).

EXEMPLO 14

Amostras de EIA e ICA porcino acelular e fresco foram testadas utilizando um sistema de teste de modelo de tabela em série Instron 5860, a uma velocidade de 10 mm.min’¹. Durante a falha de baixa velocidade de deformação testando o curso da cruzeta em mm, a resposta do transdutor de carregamento e o tempo em ms foram registrados durante a duração de cada teste. As dimensões de cada amostra de tecido foram padronizadas e a espessura registrados usando um medidor de espessura antes da montagem no dispositivo de ensaio. Cada teste foi realizado em ambas as direções axial e circunferencial (n = 6). Os dados foram analisados usando o Microsoft Excel e Prisma GraphPad e curvas de estresse de tensão produzidos para cada amostra os seguintes parâmetros foram determinados utilizando os dados e curvas de tensão de stress: resistência à tração (N), Colágeno e módulo de elasticidade ( MPa; Figuras 16, 17 e 18).

Os dados demonstraram não haver diferenças significativas nas propriedades mecânicas do EIA acelular ou ICA quando comparada com tecidos frescos. A resistência à tração média final de ICA fresco foi encontrado como sendo 3,90 ± 0,64 MPa e 4,13 ± 0,00 MPa para uma direções axial e circunferencial, respectivamente. Os valores correspondentes para ICA acelular foram 3,92 ± 0,87 MPa e 4,82 ± 0,87 MPa. Os meios de o resto dos parâmetros biomecânicos estão listados na Tabela 5. Os dados indicaram que os biomecânicas procedimento de de-celularização não causou alterações significativas no tecido.

A Tabela 5 mostra os parâmetros biomecânicos da taxa de de33/34 formação baixa a falha do teste EIA e ICA porcino acelular e fresco. Os dados são expressos como média (n = 6) ± 95% de limites de confiança.

	El-E (GPa)	Coll-E (GPa)	aUTS (MPa)	Espessura (mm)
EIA fresco
Circunferencial
Média	6,95	15,73	4,4	0,56
95% (C.L.)	2,53	3,73	0,77	0,05
Axial
Média	2,99	9,39	3,30	0,46
95% (C.L.)	0,70	2,19	0,94	0,06
EIA Acelular
Circunferencial
Média	6,52	10,94	4,13	0,55
95% (C.L)	2,03	1,36	1,00	0,08
Axial
Média	2,34	9,05	2,95	0,48
95%, (C.L.)	0,25	2,3	1,04	0,07
ICA fresco
Circunferencial
Média	5,91	17,44	4,77	1,03
95%, (C.L.)	1,67	3,78	0,76	0,08
Axial
Média	3,30	11,95	3,90	1,11
95% (C.L)	1,46	3,08	0,64	0,04
ICA fresco
Circunferencial
Média	5,36	13,97	4,82	1,03
95% (C.L.)	0,46	3,09	0,87	0,13
Axial
Média	3,12	12,55	3,92	1,01
95% (C.L)	0,71	2,43	0,87	0,10

EXEMPLO 15

Uma vez que extensas investigações têm demonstrado que os processos desenvolvidos na presente invenção removem α-Gal como medi

34/34 do por ELISA, imunocitoquímica e semiquantitativa, foi decidido submeter o tecido a mais um teste funcional para determinar se os enxertos arteriais acelulares porcinos iriam ativar o complemento no soro humano. Os enxertos arteriais gerados pelo processo de de-celularização foram comparados com os produtos concorrentes disponíveis comercialmente. Amostras de cada biomaterial foram incubadas na presença de soro humano normal, durante uma hora a 37 °C. O soro foi recolhido e sujeito a um ELISA para determinar a presença de C3a ou C5a. Os resultados iniciais mostraram que zymosan [um controle positivo] causou a ativação de complemento de soro humano normal, quando comparado com um controle negativo de PBS (Figura 20). Os resultados demonstraram que α-Gal conjugado com BSA foi capaz de iniciar a ativação de complemento no soro humano normal (Figura

19) .

Os resultados de ELISA demonstraram a produção de C3a e C5a em soro humano normal, em resposta a tecidos suínos frescos (Figura

20) . Isto não foi observado com o soro reagido com tecidos porcino acelular, humano acelular ou humano fresco. Quando soro humano foi reagido com Surgisis, C3a e C5a foram gerados. Quando soro humano foi reagido com Permacol® ou CollaMend, nenhum aumento de C3a ou C5a foi observado (Figura 21). Estes estudos proporcionam evidência forte de que os scaffolds suínos acelulares não contêm epitopos capazes de reagir com os anticorpos humanos pré-formados e complemento de ativação.

Claims (14)

1. Método de preparação de um tecido vascular xenogênico acelular natural, caracterizado pelo fato de que compreende obter um vaso sanguíneo de um doador apropriado e submetê-lo às seguintes etapas metodológicas:

(i) uma incubaçãopré-tratamento com 200mM de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) por pelo menos 24 horas a cerca de 4^o C;

(ii) uma primeira lavagem de desinfecção;

(iii) pelo menos dois ciclos de incubação com um tampão hipotônico e um detergente aniônico;

(iv) um tratamento com nuclease;

(v) uma lavagem hipertônica; e (vi) um processo de esterilização terminal.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas (i) e (ii) podem ser invertidas antes da etapa (iii).

3. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o detergente aniônico é o dodecil sulfato de sódio (SDS).

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o processo de esterilização terminal proporciona a depuração viral e uma redução da carga microbiana.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que adicionalmente inclui uma etapa de revestimento das superfícies interna e/ou externa do tecido vascular acelular xenogênico natural com um material selecionado do grupo que compreende anticoagulantes, inibidores pentassacarídeos sintéticos, inibidores direto da trombina, antagonistas da vitamina K, inibidores do fator Xa, prata, colágeno IV, elastina, glicoproteínas, glicosaminoglicanos e peptídeos sintéticos ou naturais ou misturadestes.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que adicionalmente inclui uma etapa de semear o tecido vascular acelular xenogênico natural com uma população única ou mista de células selecionadas do grupo que compreende células epiteliais,

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2/3 células musculares lisas, células tronco pluripotentes e multipotentes e fibroblastos.

7. Produto obtido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende uma matriz de tecido vascular xenogênico acelular natural que apresenta pelo menos uma redução de 80% no conteúdo de DNA em comparação com uma matriz de tecido vascular controle não tratada, sendo o produto substancialmente livre de epítopos capazes de reagir com os anticorpos humanos pré-formados e também sem a capacidade de substancialmente ativar o complemento.

8. Produto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é (uma artéria ilíaca externa de suíno (EIA) ou uma artéria carótida interna de suíno (ICA); ou (ii) bovino e é selecionado de um grupo que compreende a artéria carótida, artéria mamária interna, artéria torácica interna, veia mesentérica e veia jugular.

9. Produto de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o vaso sanguíneo de doador suíno é de até 30 cm de comprimento e o vaso sanguíneo de doador bovino é de até 80 cm de comprimento.

10. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a

9, caracterizado pelo fato de que tem propriedades bioquímicas ou biomecânicas equivalentes ou não substancialmente diferentes, selecionado de um grupo compreendendo colágeno, glicosaminoglicano, teor de elastina, pressão de estouro, retenção da sutura, resistência à tração e baixos valores de falha na taxa de tensão, em comparação com o tecido fresco ou não tratado.

11. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a

10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um revestimento, o revestimento sendo provido por um material adequado para revestir uma ou ambas as superfícies interna (lúmen) e externa do mesmo, opcionalmente em que o material de revestimento é selecionado do grupo que compreende anticoagulantes, inibidores pentassacarídeos sintéticos, inibidores direto da

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3/3 trombina, antagonistas da vitamina K, inibidores do fator Xa, prata, colágeno IV, elastina, glicoproteínas, glicosaminoglicanos e peptídeos sintéticos ou naturais ou misturadestes.

12. Produto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que é semeado com uma população única ou mista de células, opcionalmente em que a população de células é selecionada de acordo com o local do transplante e é selecionada do grupo que compreende as células epiteliais, células musculares lisas, células tronco pluripotentes e multipotentes e fibroblastos.

13. Produto, caracterizado pelo fato de que compreende um produto de tecido de matriz de tecido vascular acelular xenogênico natural obtido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para uso como um tecido para transplante.

14. Produto, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para uso na cirurgia de ponte ou de acesso vascular.

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