CN101474426B - 一种脱除血管组织内细胞的血管基质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脱除血管组织内细胞成分的血管基质及其制备方法。本发明提供了一种方法，能够脱除血管组织内的细胞成分，并最大程度保护脱细胞基质的结构完整性。其步骤包括脱细胞、去除去垢剂和进行酶处理。本发明制备的血管脱细胞基质具有较好的力学强度和合适的孔隙率，细胞毒性低，并且能够成功种植细胞于脱细胞基质上，从而可为血管组织工程提供一个良好的组织支架。
Description
技术领域
本发明涉及一种脱除血管组织内细胞的血管基质及其制备方法。
背景技术
在心血管疾病的治疗中，动脉旁路手术是血管重建的主要方法。而很多患者因为合并血管疾病或血管做过手术等原因，无法找到合适的自体血管。人工血管在小口径血管疾病，如冠状动脉和膝下血管的治疗中，由于缺乏抗凝的内皮层，或人工血管的顺应性与自然血管不匹配将引起的内膜增生等原因，远期通畅率不理想。
将动物血管经脱细胞处理后，去除血管组织中引起排异反应的细胞成分，仅保留动物种属间保守性好的细胞外基质成分，再将自体细胞种植到脱细胞基质构建的支架上，并在生物反应器内进行培养，可以构建组织工程血管。
文献S.Kaushal，G.E.Amiel，K.J.Guleserian，O.M.Shapira，T.Perry，F.W.Sutherland，E.Rabkin，A.M.Moran，F.J.Schoen，A.Atala，S.Soker，J.Bischoff，and J.E.Mayer，Jr.，Functionalsmall-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo.Nat Med7(2001)1035-40给出了这样的方法，但该方法具有一个明显的缺陷：血管壁中的细胞成分无法脱除干净，在实际操作中，按照该文献的方法进行脱细胞处理后，HE染色和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)荧光染色都可以看到大量的细胞核，残留在脱细胞血管基质内的细胞碎片将会在宿主体内引起炎性反应或免疫排斥反应，最终将导致移植失败。
此外，尽管该文献提到血管在脱细胞处理前经过胰酶处理，但并未公开具体的胰酶的处理方法。不仅未说明酶的浓度和处理时间，甚至在附注的脱细胞方法decellularized graftpreparation中都未出现胰酶处理这一环节。该文章最后附注的具体的脱细胞方法是：
a)将新鲜获取的猪髂血管在蒸馏水中放置1h以除去血液成分。
b)将血管放入含1％Triton X-100和0.1％氢氧化铵的PBS(500ml)中，放置于机械震荡器中(120转/分钟)，于4℃条件下，进行脱细胞处理72h，每24h更换一次脱细胞液。
c)冲洗干净后，血管进行冻干及冷气消毒。
此方法有两对矛盾：
1、当彻底脱除血管内的细胞成分时，往往易破坏脱细胞基质构建的支架的强度，使血管不能耐受体内的压力条件；
2、脱细胞处理后，基质的孔隙率和孔径如果小，不利于植入体内后受体细胞的浸润和生长；但孔隙率和孔径大，也会降低基质的力学强度。
综上，在保证能够彻底脱除血管内的细胞成分的同时，又尽可能小地破坏脱细胞基质的力学强度，并且得到的较佳的脱细胞基质的孔隙率和孔径是本方法的两大技术难点。
因此，选择合适的脱除血管内细胞的条件，是解决以上问题的关键所在。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术方法的不足，并探索出文献方法中未公开的技术方法，选择合适的脱细胞条件，构建一种较为理想可行的小口径组织工程血管。即在保证能够彻底脱除血管内的细胞成分的同时，尽可能小地破坏脱细胞基质的力学强度，并且得到较佳的脱细胞基质的孔径。
本发明提供了一种能够脱除血管组织内的细胞成分，并最大程度保护脱细胞基质的结构完整性的脱细胞方法。
本发明人经反复摸索，获得了合适的对动物血管进行脱细胞条件，尤其是找出了文献中未见的较为合适的胰酶浓度和胰酶处理时间和方法，获得了满意的结果。具体步骤如下：
步骤1)脱细胞
将动物血管放在蒸馏水中1h，再将血管放入含有1％TritonX-100和0.1％氨水的PBS中，4℃条件下振荡处理72h，每日更换脱细胞溶液，得到脱细胞血管基质；
步骤2)去除去垢剂
将步骤1)得到的脱细胞血管基质在PBS中，4℃条件下再振荡处理60～80h，以除去所述基质上残留的去垢剂；
步骤3)酶处理
将步骤2)得到的脱细胞血管基质放入含0.15％～0.35％胰蛋白酶(V/V)和0.01％～0.03％EDTA(V/V)的PBS中处理0.5～1.5h。
所述动物血管优选用猪髂动脉或猪颈动脉；
所述酶处理中优选浓度是0.2％～0.3％(V/V)胰蛋白酶-0.02％EDTA(V/V)
处理后的脱细胞血管可进行消毒，如可采用γ射线消毒，保存在4℃冰箱中。
本发明采用了文献中1％Triton X-100和0.1％氢氧化铵的脱细胞方法，针对该方法脱细胞不彻底的缺点，结合胰蛋白酶-EDTA，并对胰蛋白酶-EDTA的浓度和作用时间进行摸索，得出较为理想的浓度和作用时间。因为1％Triton X-100和0.1％氢氧化铵对细胞有毒性，虽然经过冲洗，但是很难将其完全清除，而且实验证实细胞种植后细胞贴附到管壁的数量少，因此将胰蛋白酶-EDTA处理放在1％Triton X-100和0.1％氢氧化铵处理之后，结果细胞能够大量种植到脱细胞基质的管腔面上。
经以下多项实验证实，本发明得到的脱细胞血管效果好，达到了发明的目的：
1、脱细胞基质鉴定
组织切片的HE和DAPI染色结果表明，经本发明的脱细胞方法处理后，猪猪髂动脉或颈动脉的细胞成分被完全清除。透射电镜结果也证实了细胞外基质内无细胞、细胞器以及磷脂细胞膜的残留(见图1D)。Masson三色法染色表明细胞外基质的主要成分：胶原和弹性蛋白结构保存完整(见图1C)。扫描电镜结果表明脱细胞腔面没有内皮细胞及其残余成分(见图1E)，横切面的扫描电镜可见脱细胞基质为疏松多孔结构脱除血管中的细胞成分(见图1F)，HE和DAPI染色已经透射电镜证实了脱细胞的效果(见图1A及图1B)。
2、孔隙率的检测
自然血管的孔隙率为72.51％，脱细胞基质的孔隙率为94.93％；自然血管的平均孔径为1.2μm，脱细胞处理后的平均孔径为14.2μm。本实验对比了未经脱细胞处理的自然血管以及用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA处理15min，1h，2h，3h和4h后的孔隙率(见表1)，结果发现经用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA处理1h的孔隙率最大，为94.93％，平均孔径14.2μm，增加0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化时间孔隙率反而下降，可能与脱细胞基质纤维结构塌陷有关。
3、力学检测
经过脱细胞处理后的细胞外血管基质的力学强度较新鲜犬髂动脉下降，其中脱细胞处理后的猪髂动脉的爆破强度为2975±680.53mmHg(n＝6)，自然血管的爆破强度为1675±283.95mmHg(n＝6)，t＝3.054，-P＝0.038。数据表明，经脱细胞处理后，血管的爆破强度仅略有下降。
4、细胞种植：
采用旋转法将骨髓间充质干细胞或内皮细胞种植到脱细胞基质的管腔面，以达到管腔面抗凝的目的。在相同的细胞种植密度和种植环境的条件下，比较不加用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA的文献提供的脱细胞方法和加用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA的本发明方法。
从图2种植细胞的血管移植物的形态学检测图中可看出，A是细胞旋转种植3h后血管移植物的H&E染色结果，种植的细胞分布在管腔面，细胞没有穿透过内弹力层(×200)。B是血管移植物在旋转种植MSCs后的腔面扫描电镜，表明细胞随机排列(×500)。
文献方法得到的脱细胞血管基质种植骨髓间充质干细胞或内皮细胞后，可看出种植到管腔面的细胞稀疏，且细胞呈近似球形，说明细胞活性差，见图3。
用本发明提供的脱细胞方法得到的血管基质种植骨髓间充质干细胞或内皮细胞后，可看出基质表面基本被种植的细胞覆盖，并且细胞伸展，表明细胞的活力强，见图4。
综上各实验结果表明，采用本发明的脱细胞方法制备的脱细胞基质能够脱除血管内的细胞成分，虽然力学强度略有下降，但其力学强度能够耐受体内血流压力的冲击，仍能满足使用要求，并且脱细胞基质的细胞毒性低，实验证实在消化1h时获得的脱细胞基质的孔隙率最大，适合于白体种子细胞的种植和长入，能够为血管组织工程提供一种理想的血管支架。
附图说明
图1是脱细胞血管基质的形态学检测图谱；
图中A是H&E染色表明细胞成分脱除(×200)。B，DAPI染色表明脱细胞基质内不含有细胞核(×200)。C，Masson染色表明脱细胞基质的弹性蛋白和胶原结构保存完整(×200)。D，透射电镜表明脱细胞基质内没有细胞成分(×4000)。E，脱细胞基质腔面的扫描电镜(×500)。F，脱细胞基质的横切面的扫描电镜(×350)；
图2是种植细胞的血管移植物的形态学检测图；
图中A是细胞旋转种植3h后血管移植物的H&E染色结果，B是血管移植物在旋转种植MSCs后的腔面扫描电镜；
图3是文献提供的脱细胞方法得到的血管基质种植骨髓间充质干细胞或内皮细胞后的管腔面；
图4是用本发明提供的脱细胞方法得到的血管基质种植骨髓间充质干细胞或内皮细胞后的管腔面。
具体实施方式
实施例1脱细胞血管基质的制备
1、实验材料：
1)血管：取自临近的屠宰场取新鲜屠宰的猪的髂动脉，直径约4-5mm，长度约5cm。
2)试剂：1％Triton X-100(Sigma)；0.1％氢氧化铵(Sigma)；PBS(GIBCO)；0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA(Sigma)；10％胎牛血清(FBS，GIBCO)；低糖-DMEM培养基(LG-DMEM，GIBCO)；
3)仪器：TS-100脱色摇床(北京宾达英创科技有限公司)；DK-8D型恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；LP-400分光光度计(法国)；S-4800扫描电镜(HITACHI，日本)；AutoPore IV 9510压汞仪(Micromeritics Instruments Inc.USA)Shimadzu AG-5000A(日本)；
2、实验方法：
血管取自临近的屠宰场取新鲜屠宰的猪的髂动脉，直径约4-5mm，长度约5cm，用无菌PBS(GIBCO)冲洗去除血液后，放入4℃冰盒中，迅速送回实验室进行处理。
1)脱细胞方法：
a)用蒸馏水浸泡1h，以裂解管腔内的血细胞，剥除外膜的疏松结缔组织，结扎动脉分支。
b)将血管放入含1％TritonX-100(Sigma)和0.1％氢氧化铵(Sigma)的PBS中，放置于脱色摇床上(30转/分钟)，于4℃条件下，进行脱细胞处理72h，每24h更换一次脱细胞液。将血管放入PBS中振荡冲洗72h，每24h更换一次PBS。
c)将血管放入到含0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA的PBS中，37℃水浴箱中处理1h。
d)将血管放入PBS中振荡冲洗1h。
e)脱细胞血管放入装有PBS的离心管中用γ射线消毒，消毒后的脱细胞血管保存在4℃冰箱中。
实施例2脱细胞血管基质的检测
1、组织学
方法：4％甲醛溶液固定，HE染色观察脱细胞基质的大体结构及细胞成分变化；Masson染色观察胶原纤维和弹性纤维结构变化；DAPI荧光染色观察细胞核；
结果见图1A-1C。
2、电镜观察
方法：透射电镜观察脱细胞基质的细胞成分和基质成分；扫描电镜观察管壁表面组织细胞结构变化。
结果见图1D～1F。组织切片的HE(图1A)和DAPI(图1B)染色结果表明，经1％TritonX-100，0.1％氨水和0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA顺序处理后，猪髂血管的细胞成分被完全清除。透射电镜结果也证实了细胞外基质内无细胞、细胞器以及磷脂细胞膜的残留(图1D)。Masson三色法染色表明细胞外基质的主要成分：胶原和弹性蛋白结构保存完整(图1C)。扫描电镜结果表明脱细胞腔面没有内皮细胞及其残余成分(图1E)，横切面的扫描电镜可见脱细胞基质为疏松多孔结构(图1F)。
3、孔隙率检测
方法：新鲜猪髂动脉及脱细胞血管基质标本(用1％Triton X-100和0.1％氢氧化铵的PBS脱细胞处理72h后，再分别用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA处理15min，1h，2h，3h和4h后脱细胞基质)经低压冻干后进行孔隙率检测。孔隙率测定采用Autopore IV 9510压汞仪，压力范围0.5Psia-6000Psia，低压测量孔径范围360-3.6um，高压测量最小孔径可达0.003um。
结果：自然血管和用1％Triton X-100和0.1％氢氧化铵的PBS脱细胞处理72h后，再分别用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA处理15min，1h，2h，3h和4h后脱细胞基质的孔隙率分别为72.51％，80.06％，94.93％，81.40％，77.13％和80.98％。其中自然血管的平均孔径为1.2μm，而用1％Triton X-100和0.1％氢氧化铵的PBS脱细胞处理72h后，再用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA处理1h后的脱细胞基质的平均孔径为14.2μm。
孔隙率检测数据见下表：
表1孔隙率检测结果比较
4、生物力学测定
方法：测定爆破强度：将组织标本连于爆破压测量表，游离端封闭，装置内充盈PBS液，室温下，调节加压螺栓以约5mmHg/s的速度压缩腔内液体，以压力表记录管道系统内增加的压力。在本组以天然猪动脉为阳性对照组。爆破压被定义为管型材料破裂前所达到的最高压力，表示材料对压力变化的耐受能力。
结果：经过脱细胞处理后的细胞外血管基质的爆破强度较新鲜犬髂动脉下降，其中脱细胞处理后的猪髂动脉的爆破强度为2975±680.53mmHg(n＝6)，自然血管的爆破强度为1675±283.95mmHg(n＝6)，t＝3.054，-P＝0.038。
5、细胞毒性试验
实验材料与方法：
方法参照《中华人民共和国国家标准》GB/T14233.2-2005第8部分-细胞毒性试验。
1)脱细胞基质浸提液的制备
将脱细胞基质按1cm2试样表面积加10ml浸提介质比例在37℃恒温箱中浸提24h。浸提介质是含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养液。配制成50％和100％浓度的脱细胞基质浸提液，备用。
2)实验细胞
细胞为L929细胞，培养液为含10％胎牛血清的DMEM。3d后细胞计数约4X104/L，备用。
3)浸提液实验(MTT法)
常规收集L929细胞，消化计数后分成3组，每组重复8孔，接种于96孔板内，每孔接种103细胞。先用含10％胎牛血清的DMEM培养24h，细胞贴壁后，弃去培养液，分别加入0(空白对照)、50％和100％PCLA浸提液。培养3天，采用MTT法测定各组570nm波长的吸光度(A)值在酶标仪上以570nm波长测定吸收值[D(λ)值]，取平均值。通过下面的公式计算相对增殖率(RGR)，RGR＝(实验组吸光度值/空白对照组吸光度值)X100％。
结果：细胞贴壁后换用50％和100％脱细胞基质浸提液培养三天的OD570分别为0.374±0.030和0.331±0.021，相对应的RGR为107％和95％，对应的细胞毒性为0级和1级。(见表2)
表2细胞毒性试验结果
| 分组 | OD570 | RGR |
| 空白对照 | 0.350±0.022 | 100％ |
| 50％浸提液 | 0.374±0.030 | 107％ |
| 100％浸提液 | 0.331±0.021 | 95％ |
6、细胞种植实验
方法：
1)实验细胞
细胞为从犬骨髓中分离培养的骨髓间充质干细胞，培养液为10％胎牛血清(FBS，GIBCOTM)、100U/ml青链霉素、100μg/ml链霉素的低糖DMEM培养基(LG-DMEM)，取2代的间充质干细胞用于细胞种植。
2)种植方法
消化细胞并用培养液重悬至3±0.5×106/mL，用注射器吸取1.5mL细胞悬液从培养室一端的三通注入到脱细胞基质管腔内。连接到低速旋转器上，转速为5-6转/小时，旋转3h。
3)细胞种植的检测
将种植细胞后的脱细胞基质用分别用10％甲醛或2.5％戊二醛固定，用于常规组织切片HE染色和扫描电镜检查。
结果：血管脱细胞基质在旋转种植后的组织切片可见细胞贴附在基质的管腔面生长，没有细胞浸润穿过内弹力层(图2A)。旋转种植3h后的扫描电镜结果可见基质的管腔面基本为种植的MSCs覆盖，部分细胞尚未伸展呈圆形，大部分的细胞尤其是与基质贴附的细胞已经伸展(图2B)。
Claims (6)
1.一种脱除血管内细胞的血管基质的制备方法，其特征在于步骤如下：
步骤1)脱细胞
将动物血管放在蒸馏水中1h，再将血管放入含有1％TritonX-100和0.1％氨水的PBS中，4℃条件下振荡处理72h，每日更换脱细胞溶液，得到脱细胞血管基质；
步骤2)去除去垢剂
将步骤1)得到的脱细胞血管基质在PBS中，4℃条件下再振荡处理60～80h，以除去所述基质上残留的去垢剂；
步骤3)酶处理
将步骤2)得到的脱细胞血管基质放入含0.15％～0.35％胰蛋白酶V/V和0.01％～0.03％EDTA V/V的PBS中处理0.5～1.5h。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述动物血管是猪髂动脉或猪颈动脉。
3.权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述胰蛋白酶浓度是0.2％～0.3％V/V，EDTA浓度是0.02％V/V。
4.权利要求1或2所述的制备方法，酶处理后的脱细胞血管基质用γ射线进行消毒后，保存在4℃冰箱中。
5.一种脱除血管内的细胞成分的血管基质，其特征是用权利要求1所述方法制备的。
6.权利要求5所述的脱除血管内的细胞成分的血管基质，其特征在于是用猪髂动脉或猪颈动脉制备的。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN1493262A (zh) * | 2003-09-02 | 2004-05-05 | 中国人民解放军第四军医大学口腔医学 | 含有血管结构的组织工程皮肤及其构建方法 |
| CN1644684A (zh) * | 2005-01-21 | 2005-07-27 | 周建业 | 异种心血管移植物的脱细胞方法 |
| CN101185775A (zh) * | 2007-12-27 | 2008-05-28 | 南京市儿童医院 | 猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法 |
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