CN101011604A - 同种异体血管脱细胞支架的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同种异体血管脱细胞支架的制备方法。本发明主要技术步骤在于取新西兰大白兔腹主动脉，表面活性剂Triton X－100提取细胞膜的脂质成份，胰蛋白酶进行消化处理，核酸酶DNAse、RNAse降解细胞中的各种DNA、RNA成分，得兔腹主动脉脱细胞血管支架。解决了过去利用自体血管来源有限，绝大多数手术根本无法进行及人工血管特别是直径小于4～6mm的人工血管近、远期通畅率低下，无法保证临床使用的缺陷。本发明利用同种异体材料结构相似的特性，组织相容性更好，有利于手术和术后恢复，且制备方法大大简化，效率高，其力学性能更适合手术；而且移植后引起宿主的细胞免疫反应低，术后通畅率高，提供物理强度和张力，是一种很有前景的血管代用品。

Description

同种异体血管脱细胞支架的制备方法

技术领域

本发明涉及一种血管脱细胞支架的制备方法，特别涉及一种同种异体血管脱细胞支架的制备方法。

背景技术

动脉缺血性疾病以动脉硬化性血管疾病为主要代表，是导致死亡的重要病因。

在本发明之前，动脉旁路术是治疗动脉硬化性血管疾病的主要方法之一，即用自体血管或人工血管作为移植材料进行旁路手术。而目前，可以利用的自体血管来源有限，绝大多数手术根本无法进行；人工血管，特别是直径小于4～6mm的人工血管近、远期通畅率低下，无法保证临床使用。

发明内容

本发明的目的就是要克服上述缺陷，研制一种同种异体血管脱细胞支架的制备方法。

本发明的技术方案是：

同种异体血管脱细胞支架的制备方法，其主要技术步骤在于

(1)取新西兰大白兔腹主动脉；

(2)采用表面活性剂Triton X-100提取细胞膜的脂质成份；

(3)采用胰蛋白酶进行消化处理；

(4)再采用核酸酶DNAse、RNAse降解细胞中的各种DNA、RNA成分；

(5)得兔腹主动脉脱细胞血管支架。

本发明的优点和效果在于利用同种异体血管作为原材料，利用同种异体材料结构相似的特性，使其组织相容性更好，有利于手术和术后恢复；并使其制备方法大大简化，效率高；脱细胞血管与受体血管有着极其相似的强度和顺应性，其力学性能更适合手术；而且移植后引起宿主的细胞免疫反应低，术后通畅率高。同种异体血管脱细胞支架是一种很有前景的血管代用品，将同种异体血管经过特殊处理将实质细胞去除，保留相对完整的细胞外骨架结构，主要作用是提供物理强度和张力。

具体如下：

(1)良好的组织相容性及生物可降解性；

(2)良好的细胞界面，利于细胞黏附、增殖及分泌细胞外基质；

(3)具有三维空间结构，有利于营养物质和代谢产物的交换；

(4)具有一定的强度和可塑性。

附图说明

图1——新鲜兔腹主动脉示意图。

图2——兔腹主动脉脱细胞血管支架示意图。

图3——脱细胞组纤维网架结构完整示意图(内皮细胞、平滑肌细胞消失HE染色(×100))。

图4——脱细胞组胶原纤维示意图(连续性完好，无中断、消失Masson染色(×100))。

图5——脱细胞组弹力纤维示意图(连续性完好VG染色(×200))。

图6——脱细胞组扫描电镜示意图(未见细胞及其碎片成分(×1000))。

图7——脱细胞组扫描电镜示意图(见弹力纤维卷曲呈波浪状，排列整齐、致密，无断裂(×3000))。

图8——脱细胞组透射电镜示意图(未见细胞及其碎片成分(×6000))。

图9——对照组内皮细胞及平滑肌细胞高度表达MHCI示意图(阳性反应见于血管内膜和中膜，呈细胞形态分布，免疫组化(×100))

图10——脱细胞组MHCI示意图(脱细胞处理后，内皮细胞及平滑肌细胞均被除去，故无明显阳性反应，免疫组化(×200))。

图11——应力应变曲线示意图(n＝5)(脱细胞支架与正常生理血管顺应性无显著性差异)。

图12——最大断裂强度测试结果示意图(脱细胞支架与正常生理血管强度无显著性差异)。

图13——兔腹主动脉移植术后二组移植段通畅情况示意图(脱细胞支架组移植后通畅率明显大于正常生理血管组)。

图14——新鲜移植组血管内壁示意图(粗糙，局部血栓形成并机化，炎性细胞附着，扫描电镜(×600))。

图15——脱细胞血管支架组示意图(完全被内皮细胞覆盖，内皮细胞表面有微绒毛扫描电镜(×500))。

图16——动脉移植术后A、B二组兔腔静脉血T细胞CD⁴⁺/CD⁸⁺的比值示意图(移植后脱细胞支架组引起的细胞免疫反应远远小于正常生理血管组)。

图17——动脉移植术后A、B二组兔T细胞受体αβ(TCRαβ)的表达示意图(移植后脱细胞支架组引起的细胞免疫反应远远小于正常生理血管组)。

具体实施方式

取新西兰大白兔腹主动脉，长约1.0cm，质地柔软，顺应性好，如图1所示；在TBS4℃浸泡2h；其次，利用表面活性剂1％TritonX-100 4℃持续震荡12h，提取细胞膜的脂质成分，破坏细胞膜结构；再利用胰蛋白酶对同种异体血管进行消化处理，即0.125％胰蛋白酶在37℃消化12h，使部分组织降解，提高组织通透性，利于试剂进入细胞内部；然后用核酸酶DNAse、RNAse降解细胞中的各种DNA、RNA成分，即按1∶1比例用0.5mg/ml DNA酶和0.5mg/ml RNA酶37℃消化12h，TBS洗3次，达到彻底清除细胞的目的。这样的处理过的同种异体血管就可以用于动脉移植术使用，代替去除的动脉血管。

移植手术时，将新西兰大白兔盐酸氯胺酮全身麻醉，取腹部正中切口，游离肾下腹主动脉，按无菌原则及非接触技术横断肾下腹主动脉，剪下一段腹主动脉长约10mm，再将脱细胞血管支架以8/0国产聚丙烯线间置吻合到腹主动脉上。术后肝素1mg/kg肌注Bid×3d，青霉素20万u/d肌注3d。

下面是本发明制备的同种异体血管各项性能和特性的检测、分析。

一.脱细胞支架检测方法：

1、形态学检查

[1]光镜检查所有血管标本中性甲醛固定，石蜡包埋，5μm层厚切片，行HE、Masson、VG染色，光镜观察血管内皮细胞、平滑肌细胞的脱落情况，以及血管胶原纤维、弹力纤维连续性是否完好，有无中断、消失。

[2]扫描、透射电镜检查标本2％戊二醛固定，1％锇酸固定24小时后，梯度酒精脱水，临界点干燥喷金，观察弹力纤维、胶原纤维连续性情况，胶原纤维横纹是否消失，有无细胞结构或细胞碎片残留。

2、免疫组化染色

常规石蜡切片，片厚5μm，脱蜡至水，0.3％H₂O₂室温浸30min，TBS洗5min×3次，0.3％Triton X-100 37℃浸30min，TBS洗5min×3次。加正常羊血清，置切片于湿盒内37℃孵育30min，加(1∶100)鼠抗兔MHCl抗体，湿盒内4℃孵育72h。TBS洗5min×3次，加生物素标记的马抗鼠抗体(1∶100)，湿盒内37℃孵育1h。TBS洗5min×3次，加ABC复合物湿盒内37℃孵育1h。TBS洗5min×3次，DAB显色5min，蒸馏水终止显色，用明矾苏木精复染。脱水透明，中性树胶封片。

3、顺应性与生物力学实验

[1]径向应力应变实验：取脱细胞血管支架，裁剪成1.0cm×0.5cm大小相同的血管条，用生物力学测定仪给予单轴负荷，检测其在不同径向应力下的应变情况，并绘制径向应力应变曲线。

[2]最大断裂强度实验：剪取长为1.0cm的脱细胞血管支架，利用生物力学测定仪给予纵向拉力直到血管断裂，并记录断裂时的最大拉力指数。

4、脱细胞血管支架兔腹主动脉移植实验

[1]将新西兰大白兔盐酸氯胺酮全身麻醉，取腹部正中切口，游离肾下腹主动脉，按无菌原则及非接触技术横断肾下腹主动脉，剪下一段腹主动脉长约10mm，再将脱细胞血管支架以8/0国产聚丙烯线间置吻合到腹主动脉上。术后肝素1mg/kg肌注Bid×3d，青霉素20万u/d肌注3d。

[2]术后30d，取出移植段标本，观察脱细胞血管支架通畅情况，进行大体观察后处理固定以备光镜、扫描电镜、透射电镜检测。下腔静脉抽血加肝素抗凝行细胞免疫学检测，流式细胞仪测定兔血管移植术后T细胞亚群CD⁴⁺、CD⁸⁺以及T细胞受体TCRαβ随时间的改变。

结果评价：

1.大体标本：兔腹主动脉脱细胞血管支架较新鲜动脉，见图1；更为白色，半透明，质地柔软，顺应性良好，见图2。

2.残留细胞及基质纤维结构：HE染色显示脱细胞血管支架中未见细胞及其碎片成分，各层结构清晰可辨，纤维网架结构保持完整，原来内皮细胞、平滑肌细胞占据的地方变成纤维间的空白区，见图3；Masson、VG染色见血管胶原纤维、弹力纤维连续性完好，无明显中断、消失，见图4、图5。

脱细胞组扫描电镜、透射电镜示动脉弹力纤维卷曲呈波浪状，排列整齐、致密，无断裂，胶原纤维连续性好，横纹存在。血管全层未见细胞及其碎片成分(图6，7，8)。孔径约为100～150μm×10～20μm。

3.免疫组化实验

内皮细胞及平滑肌细胞均可高度表达MHCl，如有细胞存在，MHCI即会有阳性表达。对照组正常兔血管内皮细胞及平滑肌细胞高度表达MHCI，阳性反应见于血管内膜和中膜，呈细胞形态分布，内皮细胞及平滑肌细胞均可高度表达MHCI，如有细胞存在，MHCI即会有阳性表达(图9)。脱细胞血管支架，内皮细胞及平滑肌细胞均被除去，故无明显阳性反应，免疫组化染色阴性(图10)。

4.顺应性与生物力学变化

[1]径向应力应变情况：用生物力学测定仪给予各组血管条单轴负荷，随着负荷的逐渐增加，脱细胞支架、正常生理血管的径向应力应变曲线相吻合，脱细胞支架组与正常生理血管组无显著性差异(P＞0.05)。说明脱细胞支架与正常生理血管有着极其相似的顺应性。绘制径向应力应变曲线，见图11。

[2]最大断裂强度：利用生物力学测定仪给予各组血管纵向拉力，直到血管断裂，发现脱细胞支架组与正常生理血管组无显著性差异(P＞0.05)，说明脱细胞支架与正常生理血管强度无显著性差异，见图12。

5.移植术后：

移植术后30d脱细胞支架组血管内壁光滑，管壁稍增厚，管腔狭窄部明显；新鲜动脉移植组有真性动脉瘤形成，管壁明显增厚，管腔明显狭窄，见图13。

术后30d：新鲜移植组血管内壁粗糙，局部血栓形成并机化，炎性细胞附着(图14)。脱细胞支架组内表面被膜样物质覆盖，可见大量内皮细胞，内皮细胞排列整齐，形状规则，表面有微绒毛，见图15。

6.T细胞亚群及TCR αβ检测

新鲜移植组(A组)、脱细胞支架组(B组)术后CD⁴⁺T细胞增多，在4w时达到最高，并持续高表达。CD⁸⁺T细胞数量减少，CD⁴⁺/CD⁸⁺比值在4w时达到最高，A、B组间有显著性差异(n＝4，P＜0.05)(图16)。而且T细胞表面的受体TCR αβ也在术后快速上调，变化趋势同CD⁴⁺/CD⁸⁺，亦表现出A、B组间有显著性差异(n＝4，P＜0.05)(图17)。说明移植后脱细胞支架组引起的细胞免疫反应远远小于正常生理血管组。

对于其他动物如利用人尸体血管、犬、猪等血管进行同种异体的移植手术等，其原理皆同上。

Claims (8)

1.同种异体血管脱细胞支架的制备方法，其步骤在于

(1)取新西兰大白兔腹主动脉；

(2)采用表面活性剂Triton X-100提取细胞膜的脂质成份；

(3)采用胰蛋白酶进行消化处理；

(4)再采用核酸酶DNAse、RNAse降解细胞中的各种DNA、RNA成分；

(5)得兔腹主动脉脱细胞血管支架。

2.根据权利要求1所述的同种异体血管脱细胞支架的制备方法，其特征在于步骤(1)中的新西兰大白兔腹主动脉在TBS溶液在4℃，浸泡。

3.根据权利要求1所述的同种异体血管脱细胞支架的制备方法，其特征在于步骤(2)中表面活性剂Triton X-100浓度为1％。

4.根据权利要求1或3所述的同种异体血管脱细胞支架的制备方法，其特征在于步骤(2)在4℃下持续震荡。

5.根据权利要求1所述的同种异体血管脱细胞支架的制备方法，其特征在于步骤(3)中胰蛋白酶浓度为0.125％。

6.根据权利要求1或5所述的同种异体血管脱细胞支架的制备方法，其特征在于步骤(3)中胰蛋白酶在37℃消化。

7.根据权利要求1所述的同种异体血管脱细胞支架的制备方法，其特征在于步骤(4)中核酸酶0.5mg/ml DNAse、0.5mg/ml RNAse，比例为1∶1。

8.根据权利要求1或7所述的同种异体血管脱细胞支架的制备方法，其特征在于步骤(4)中，核酸酶0.5mg/ml DNAse、0.5mg/ml RNAse在37℃消化，TBS洗3次。

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