WO2015027727A1 - 一种制备动物脱细胞组织基质材料的方法及其制备的组织基质材料 - Google Patents

一种制备动物脱细胞组织基质材料的方法及其制备的组织基质材料 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the field of biological tissue processing and tissue matrix material preparation technology, and in particular to a method for preparing an animal acellular tissue matrix material and a prepared acellular tissue matrix material. Background technique
  • Biomatrix materials made from allogeneic or xenogeneic tissue and organ decellularization have been successfully used in clinical medical tissue repair and repair.
  • Decellularized tissue and organ matrix is also widely used in various tissue engineering experiments and regenerative medicine research, such as removing the original cellular components of animal tissues and organs, and recellularizing the tissue organ matrix with three-dimensional framework structure by human cells in vitro. Functionalized, the final production can be transplanted into the tissues and organs of the human body.
  • the tissue organ matrix is a three-dimensional framework composed of various complex structural proteins and functional proteins, and contains many other complexes that are active.
  • the main components include collagen fibers, glycoproteins, sticky proteins, etc.
  • Other ingredients include sugars such as aminodextran (hyaluronic acid, chondroitin sulfate), some lipids and growth factors.
  • Good tissue organ matrices have suitable biomechanical strength. Upon implantation into the host, the matrix material provides initial biomechanical support to regulate cell behavior (such as adhesion, migration, proliferation, and differentiation) by interacting with host cells. As the host cells grow in, the tissue matrix itself gradually degrades and transforms into new tissue.
  • tissue and organ materials are derived from human and various mammalian tissues, including blood vessels, heart valves, ligaments, nerves, skin, intestinal mucosa, anterior stomach, pericardium, peritoneum, tendons and bladder.
  • the process of preparing tissue and organ matrix is very complicated, including the process of tissue organ harvesting, preservation, cleaning, disinfection, decellularization, antigenicity reduction, virus inactivation and terminal sterilization.
  • There are various methods for preparing tissue and organ matrix and according to the principle of decellularization, it can be divided into physical, chemical, enzymatic ultrasonic, mechanical massage or pressurization, freezing and thawing to destroy the cell membrane, and release the cellular components. It is more conducive to the subsequent decellularization of chemical detergents.
  • Physical methods are generally not sufficient to achieve complete decellularization. Enzymatic treatments, such as certain trypsin, can regulate the tightness of the extracellular matrix of the tissue and sever the connection between the cell surface and the extracellular matrix of the tissue.
  • tissue and substrate matrices are also different using different processes and methods.
  • the collection, preservation, cleaning, disinfection and decellularization of tissues and organs, in addition to the direct damage to the tissue and substrate matrix, will also affect the subsequent processing.
  • Each treatment will affect the biochemical composition of the tissue and organ matrix, the ultrastructural and biomechanical properties of the three-dimensional framework, which will affect the host's response to the implanted matrix material.
  • Preclinical animal experiments and human clinical application evidence show that there are great differences in tissue repair and regeneration performance between various tissue and substrate products.
  • the changes in tissue and substrate properties during preparation are the most common differences in clinical effects of various products.
  • the present invention is directed to the above-discussed deficiencies in the prior art, and in one aspect provides a method of preparing an animal decellularized matrix material comprising the steps of:
  • tissue material is disinfected and sterilized in a moderately alkaline solution, rinsed with sterile pure water, and the pH is adjusted to neutral;
  • enzymatic methods are used to remove cellular components, remove alpha-Gal antigen, and enhance stent flexibility.
  • the animal tissue material in step 1 is selected from the group consisting of skin, dermis, arteries, veins, stomach, cartilage, meniscus, small intestine, large intestine, diaphragm, tendon, ligament, nerve tissue, bladder, urethra and ureter .
  • the blood and other soils are washed with pure water in step 1, Washing is done using physical methods or ultrasound.
  • a step of cryopreservation of the porcine dermal material is involved, wherein the rate of temperature drop and temperature rise is a very important parameter. If the temperature is lowered too fast or the tissue is uneven, it may cause micro-cracks in the local area of the tissue, and the tissue matrix is easily torn when used.
  • the tissue material in step 1 is preferably stored at an average rate of no more than 1.0 degrees Celsius per minute to -40 degrees Celsius or less, more preferably 0.5 degrees Celsius per minute.
  • the tissue material stored at a low temperature is slowly thawed at a temperature of 5 to 12 degrees Celsius to avoid cracks in the tissue due to excessive temperature rise. After the ice is completely dissolved, the thawed tissue material in step 2 is rehydrated for 3 to 6 hours in physiological saline containing 100 mg of gentamicin per liter.
  • the cryopreservation in step 1 is long-term preservation by placing the pig dermal material flat on a slightly larger area of cotton gauze, paper, plastic film, nylon mesh or other fabric protection.
  • the dermis and the above protective layer are rolled into a multi-layer concentric roll or a multi-layered package form in which the dermis and the protective layer are alternately placed, placed in a plastic bag, sealed and placed in a -80 or -40 ° C. freezer.
  • initial sterilization sterilization of pig dermal raw materials is involved.
  • Existing methods include the use of sodium hypochlorite, peracetic acid, hydrogen peroxide, iodine solutions and high concentrations of sodium hydroxide (pH 13 or higher). After treatment with these solutions, the tissue matrix is damaged to varying degrees, especially sodium hydroxide, sodium hypochlorite and breaking solutions.
  • the moderately alkaline solution described in the step 3 is sodium hydrogencarbonate or sodium hydroxide having a pH of 10.5 to 11.5 or an ammonia hydroxide solution having a concentration of 0.1%, and the sterilization is performed.
  • the method is to soak the tissue material after rehydration in the above moderate alkaline solution, and slowly soak for 24 to 48 hours to avoid damage of the tissue matrix.
  • the decellularization method described in the step 4 is a sterilization and rinsing of the tissue material at 2.0 mmol of calcium chloride, 2.0 mmol of magnesium chloride, and 100 mg of G. grandis per liter.
  • the physiological saline solution was rinsed at room temperature for 1 to 3 hours, and then the cells were eluted by adding a dispase solution.
  • the dispase solution is a neutral dispersion enzyme solution containing 1-20 mmol of calcium chloride, 1-20 mmol of magnesium chloride and 50-400 units of dispase per liter.
  • the method of eluting the cells by the dispase solution is to soak the tissue material in the dispase solution and slowly soak for 24 to 36 hours at 37 degrees Celsius.
  • the neutral dispase solution contains 2.0 mmol of calcium chloride, 2.0 mmol of magnesium chloride and 100 to 200 units of dispase per liter.
  • a washing step is performed after the decellularization is completed in step 4.
  • the washing comprises a first detergent washing and a second detergent washing, wherein the first detergent solution is 0.5% poly dissolved in a hydroxyethylpiperazine ethylsulfide acid buffer solution (pH 7.0 to 8.0) Ethylene glycol octyl phenyl ether, the cleaning method is to soak the tissue material in the first detergent solution, and slowly soak for 12-18 hours at 37 degrees Celsius.
  • the second detergent solution is a 1.0% sodium deoxycholate solution dissolved in a phosphate buffer solution (pH 7.2 ⁇ 7.8).
  • the cleaning method is to soak the tissue material in the two detergent solution, and slowly shake the soak at room temperature. ⁇ 36 hours.
  • detergents such as Tween-20, tert-octylphenoxy polyethylene ethoxyethanol and 3-[(3-cholesterosylpropyl)didecylamino] may also be used in the present invention.
  • tissue matrix Due to the presence of animal tissue DNA, tissue matrix is prone to inflammatory reactions after implantation in humans.
  • other mammals contain ⁇ -Gal consisting of glycoproteins or glycolipids at the disaccharide end of the ⁇ -1,3-galactose residue [Gala(l,3)Gal].
  • antigen The a-Gal antigen in pig tissue causes immune rejection.
  • One of the ways to eliminate or overcome inflammatory and rejection reactions is to use specific enzymatic treatment to remove DNA and a Gal antigen from animal tissue matrices.
  • the decomposing animal tissue DNA component described in the step 5 is completed by adding a deoxyribonuclease solution, and the deoxyribonuclease solution is formulated to be 100 mM trishydroxyl thiol per liter.
  • Aminoguanidine-hydrochloric acid buffer solution pH 7.2
  • the method of degrading animal tissue DNA is to soak the tissue material in The above deoxyribonuclease solution was slowly shaken at 37 ° C for 18 to 28 hours, and then rinsed twice with physiological saline for 1 to 3 hours.
  • the decomposing animal tissue ⁇ -Gal antigen described in the step 6 is completed by adding an ⁇ -galactosidase solution, and the formulation of the ⁇ -galactosidase solution is per liter. 10 mM hydroxyethylpiperazine ethanesulfonic acid buffer solution (between pH 7.0 and 8.0) was added with 2.0 mM calcium chloride, 2.0 mM magnesium chloride and 400 GALU units of ⁇ -galactosidase to decompose animal tissue a-Gal.
  • the antigen is obtained by soaking the tissue material in the above ⁇ -galactosidase solution and slowly shaking it at 37 ° C for 24 to 36 hours.
  • the salting-out method is selected for washing, and the high-concentration sodium chloride solution described in the step 6 is a 2-5% sodium chloride solution, and the rinsing method is a tissue material. Soak in the above sodium chloride solution and wash twice at room temperature for 2 to 4 hours each time.
  • the high concentration sodium chloride solution is preferably a 3% sodium chloride solution.
  • sodium chloride solution can also be replaced by other neutral salt solutions, such as potassium chloride, magnesium chloride and lithium chloride.
  • the invention relates to a virus inactivation treatment, wherein the virus inactivating reagent in the step (7) is hydrogen peroxide and peracetic acid by immersing the tissue material in the method.
  • the virus inactivating reagent in the step (7) is hydrogen peroxide and peracetic acid by immersing the tissue material in the method.
  • the virus is inactivated by containing 0.02% hydrogen peroxide, 0.15% acetic acid and 0.10% peroxyacetic acid, and the number of viruses can be reduced by 10 to 6 times in 2 to 3 hours.
  • the concentration of hydrogen peroxide, acetic acid and peracetic acid can vary with the number of bacteria and increase or decrease.
  • step 7 after the virus of step 7 is inactivated, it is rinsed three times with a neutral phosphoric acid buffer at room temperature for 2 to 4 hours to remove residual hydrogen peroxide, acetic acid and peracetic acid.
  • Terminal sterilization of tissue products is often one of the most disruptive steps to tissue material.
  • step 9 is treated with low temperature radiation.
  • the terminal sterilization of the product with 10-50 kGy gamma rays is carried out at -40 degrees Celsius, which greatly reduces the damage to the tissue material.
  • the amount of radiation agent is varied, increased or decreased depending on the amount of bacteria in the tissue matrix.
  • the terminal sterilization of the product is carried out using gamma rays of 20 to 30 kGy.
  • the present invention may also freeze the tissue matrix and sterilize it with ethylene oxide gas.
  • step 4 enzyme decellularization
  • step 5 enzyme breakdown of DNA
  • step 6 enzyme decomposition of alpha-1,3-galactose residue antigen
  • the sequence of step 4 (enzymatic decellularization), step 5 (enzymatic breakdown of DNA) and step 6 may be based on actual needs. Make adjustments and changes. For example, it is possible to first decompose the ⁇ -1,3-galactose residue antigen, then decellularize and decompose the animal DNA component; or first decompose the animal DNA, then decompose the antigen and finally decellularize.
  • DNase is used.
  • concentration, temperature and time of the dispase are monitored and optimized during the treatment.
  • a specific enzyme inhibitor such as ethylenediaminetetraacetic acid may also be added to inhibit the activity of the dispase.
  • Another aspect of the present invention also relates to an animal decellularized tissue matrix material prepared by the above method of the present invention, wherein the animal dermal raw material for use may include a dermis having a basement membrane, and may also include a dermis which removes the basement membrane.
  • the method of preparing a decellularized tissue matrix material of the present invention involves a series of steps of treating animal skin tissue and preparing a tissue organ substrate, and a plurality of biochemical solutions and formulations.
  • the dermal tissue matrix material prepared by the above steps and solution retains the original basic scaffold structure, main biochemical composition and biomechanical strength of the tissue extracellular matrix; effectively removes the immune rejection reaction in the animal tissue.
  • Antigen improved flexibility, drape and wound surface integration of tissue matrix, prepared animal dermal matrix similar to human skin, does not cause cross-linking, degradation or denaturation of collagen and other proteins in tissue matrix, decellularized tissue
  • the dermis retains the biological integrity of the natural dermal tissue matrix.
  • FIG. 1 Tissue section analysis diagram.
  • FIG. 1 Tissue section analysis chart.
  • A, B, C immunohistochemical staining of type I collagen
  • D, E, F type III collagen immunochemical staining sections
  • A, D negative dye
  • Figure 3 Characteristic map of anti-collagenase hydrolysis of acellular tissue matrix after terminal gamma radiation sterilization.
  • Figure 4 HE staining of host cell growth and neovascularization two weeks after subcutaneous implantation of acellular tissue matrix into rats. detailed description
  • Example 1 Preparation and performance test of animal acellular tissue-based shield material
  • Fresh pigskins were collected from pigs that had just been slaughtered and kept in a refrigerator at 4 degrees Celsius. After mechanical plucking, the pig skin is layered to a thickness of about 1.0 mm and stored frozen at minus 20 degrees Celsius.
  • the washed pig's dermis is soaked in a saline solution containing 100 mg of gentamicin per liter, and 2.0 millimoles of calcium chloride, 2.0 millimoles of magnesium chloride and 150 units of neutral dispase per liter are added to the solution. Treated at 37 degrees Celsius for 24 hours.
  • the dermis was washed with 0.5% polyethylene glycol octyl phenyl ether solution for 16 hours. After decellularization, rinse with physiological saline twice for 120 minutes each time.
  • the solution was sterilized and virus-inactivated for 2 hours with a solution containing 0.02% hydrogen peroxide, 0.15% acetic acid and 0.10% peroxyacetic acid.
  • Tissue section analysis showed that the cellular components (such as DNA) and the alpha-1,3 galactose residue in the matrix were removed cleanly, see Figure 1.
  • Immunochemical staining analysis of type I and type III collagen also showed that the treatment process did not damage collagen in the dermal matrix, as shown in Figure 2.
  • Example 2 Determination of suitable conditions for cleaning and disinfecting the dermis
  • Fresh dermis was collected from pigs and fresh porcine dermis was treated at 37 ° C and sodium hydroxide solutions with pH 10.6, 11.5 and 11.8, respectively. 4 liters of sodium hydroxide solution per kg of pig skin, using phosphate buffer as a control. After 24 hours, colony forming units per ml of solution were determined.
  • Fresh pigskins were collected from pigs that had just been slaughtered and kept in a refrigerator at 4 degrees Celsius. After mechanical plucking, the pigskins were layered to a thickness of about 1.0 mm.
  • the 1.0 mm thick pig dermis was temporarily stored in a minus 80 ° C. freezer after collection and washing (see Example 1).
  • the treated dermal matrix was stored in a sterile physiological saline solution containing 12% glycerol, and the bacteria were killed with 25 kGy of gamma rays.
  • the method of the present invention improves the flexibility, drape and wound surface integration properties of the tissue matrix.
  • Tissue section analysis showed that the ⁇ -1,3 galactose residue antigen in the produced tissue matrix was cleanly removed, stained negative, and free of antigen expression.
  • the elastin content was determined by Fastin staining.
  • the acellular tissue matrix is resistant to collagenase hydrolysis and can be used to study the stability of collagen in the decellularized tissue matrix prepared by the present invention after terminal gamma ray radiation sterilization.
  • the decellularized tissue matrix was prepared by placing it in a solution of 5 collagenase units per cc of trishydroxyl aminoguanidine-hydrochloric acid (10 mM, pH 7.5) and culturing at 37 ° C for up to 64 hours.
  • the results show that the performance of the anti-collagenase hydrolysis of the acellular tissue matrix prepared by the method of the present invention after terminal gamma-ray irradiation sterilization is not changed as compared with the untreated porcine dermal material, as specifically shown in Fig. 3.
  • the recellularization characteristics of the acellular tissue matrix prepared by the method of the present invention were subjected to animal evaluation experiments using rats (Rattus norvegicus Lewis). Rats ((8 cases) after anesthesia, shaved the back hair with electric scissors, wiped the surgical site with 70% alcohol, cut a separate incision on the back and left and left and right, forming a small pocket, sized to accommodate 1 X 1 cm
  • the sample ( ⁇ 1 mm thick) is suitable.
  • the tissue matrix sample is implanted subcutaneously. After the operation, if the rat shows signs of pain, the pain is relieved with buprenorphine (0.05 mg/kg).
  • the rats are sacrificed two weeks later.
  • the implanted tissue matrix material was removed and fixed with 10% neutral formalin solution. The tissue entry method was used to observe the rat host cell entry and blood vessel growth. The results showed that a large number of host cells grew into the tissue within two weeks.

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Abstract

一种制备动物脱细胞组织基质材料的方法及其制备的组织基质材料。采用该方法制备的组织基质材料保留了组织细胞外基质原有的基本支架结构，有效去除了动物组织中会引起人体免疫排异反应的抗原。采用该方法制备的动物真皮基质，保有天然真皮组织基质的生物完整性，可用于病变和缺省组织的修复修补。

Description

一种制备动物脱细胞组织基质材料的方法及其制备的组织基质材料 技术领域
本发明涉及生物组织处理和组织基质材料制备技术领域， 具体涉及制备动 物脱细胞组织基质材料的方法及其制备的脱细胞组织基质材料。 背景技术
人体和许多动物组织器官的细胞外基质有极大的相似性和同源性。 由同种 异体或异种异体组织器官脱细胞制成的生物基质材料， 已经成功地用于临床医 学人体组织修补和修复。 脱细胞的组织器官基质也广泛地应用于各种组织工程 试验和再生医学研究， 例如除去动物组织器官的原有细胞成分， 在体外通过人 体细胞使具有三维框架结构的组织器官基质再次细胞化和功能化， 最终生产可 移植到人体的组织器官。
组织器官基质是由各种复杂的结构蛋白质和功能蛋白质构成的三维立体框 架， 并含有许多有活性的其他复合物。 主要成分包括胶原纤维、 糖蛋白、 黏蛋 白等， 其他成分有氨基葡聚糖（透明质酸、 硫酸软骨素）等糖类、 一些脂质和 生长因子。 良好的组织器官基质具有合适的生物力学强度， 在植入宿主后， 基 质材料提供初始的生物力学支持， 通过与宿主细胞相互作用来调节细胞的行为 (如粘附， 迁移， 增殖和分化）， 随着宿主细胞的长入， 组织器官基质本身逐步 降解和转化成新的组织。
目前， 全世界有近三十种组织器官衍生而来的基质材料已被用在组织修复 和再生的各种临床医疗中。 这些产品的组织器官原料来自人类和多种哺乳动物 的组织， 包括血管， 心脏瓣膜， 韧带， 神经， 皮肤， 小肠黏膜， 前胃， 心包， 腹膜， 肌腱和膀胱等。
制备组织器官基质的工艺流程十分复杂， 包括组织器官的釆集、 保存、 清 洗、 消毒、 脱细胞、 降低抗原性、 病毒灭活和终端灭菌等过程。 现有的制备组 织器官基质的方法有多种， 根据其脱细胞的作用原理可分为物理、 化学、 酶学 超声波， 机械按摩或加压， 冻结和解冻来破坏细胞膜， 使细胞成分释放出来， 更利于后续的化学洗涤剂的脱细胞清洗。 物理方法本身一般不足以实现完全的 脱细胞。 酶学处理方法， 如某些胰蛋白酶， 可调节组织胞外基质的松紧度， 切 断细胞表面和组织胞外基质的联系。 使用不同的工艺流程和方法， 细胞去除效 率和对组织器官基质的影响或损伤也不一样。 组织器官的釆集、 保存、 清洗、 消毒和脱细胞处理工艺， 除了方法本身直接对组织器官基质的损伤外， 也还会 影响到随后的加工过程。 各项处理会不同程度地影响改变组织器官基质生物化 学组成成分， 三维立体框架的超微结构和生物力学性能， 这些改变会影响宿主 对植入基质材料的反应。 临床前动物试验和人类临床应用证据表明， 各种组织 器官基质产品之间在组织修复和再生性能方面的差异很大， 制备过程中组织器 官基质特性的改变是导致各种产品临床效果差异的最主要原因之一。 发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷， 一方面提供了一种制备动物脱细 胞组织基质材料的方法， 其包括如下步骤：
1、 收集动物组织原材料， 清洗血液和其它污垢， 切割成长、 宽和高为所需 规格尺寸的组织材料， 低温保存；
2、 緩慢解冻， 在含有庆大霉素的生理盐水中复水；
3、组织材料在中度碱性溶液中消毒灭菌，无菌纯水漂洗，酸碱度调到中性；
4、 脱细胞， 清洗；
5、 分解动物组织 DNA成分， 生理盐水漂洗；
6、 分解动物组织 α-Gal抗原， 高浓度氯化钠溶液漂洗， 生理盐水漂洗；
7、 病毒灭活， 磷酸緩冲液漂洗；
8、 无菌装袋， 密封；
9、 终端灭菌处理。
在该方法中， 釆用酶学方法去除细胞成分、 去除 α-Gal抗原和增进支架柔 韧性。
在本发明的实施方案中， 步骤 1中的动物组织原材料选自皮肤， 真皮， 动 脉， 静脉， 胃， 软骨， 半月板， 小肠， 大肠， 隔膜， 肌腱， 韧带， 神经组织， 膀胱， 尿道和输尿管。
在本发明优选的实施方案中， 步骤 1中清洗血液和其它污垢釆用纯净水， 使用物理方法或超声波进行洗涤。
在制备组织基质材料的工艺方法中， 涉及猪真皮原料低温保存的步骤， 其 中降温和升温的速度是非常重要的参数。 降升温的速度过快或组织间不均匀， 可导致组织局部地区出现微小裂痕， 使用时组织基质容易撕裂。
在本发明的实施方案中， 步骤 1中的组织材料优选在平均速率不大于每分 钟 1.0摄氏度降温至 -40摄氏度以下进行保存， 更加优选降温速度为每分钟 0.5 摄氏度。 步骤 2中低温保存的组织材料在 5 ~ 12摄氏度环境下緩慢解冻， 以避 免因升温过快导致组织产生裂痕。 待冰全部溶化后， 步骤 2中融化的组织材料 在每升含有 100毫克庆大霉素的生理盐水中复水 3 ~ 6小时。
在本发明一个优选的实施方案中， 步骤 1中的低温保存为长期保存， 其方 法是将猪真皮材料平放在一块面积稍大的棉纱布、 纸张、 塑料膜、 尼龙网或其 它布织品保护层上， 将真皮和上述保护层卷成一个多层同心卷或形成真皮和保 护层交替的多层包装形态， 放入塑料袋中， 密封后放入 -80或 -40摄氏度冻箱中 保存。
本发明的制备方法中， 涉及猪真皮原料的初始消毒灭菌。 现有的方法包括 使用次氯酸钠，过氧乙酸，双氧水，碘溶液和高浓度氢氧化钠（酸碱度 13以上 )。 这些溶液处理后， 组织基质受到不同程度上的破坏， 尤其是氢氧化钠、 次氯化 钠和破溶液的影响更大。
同已有方法中原材料消毒和灭菌技术不同。在本发明的实施方案中， 步骤 3 中所述的中度碱性溶液是酸碱度为 10.5— 11.5的碳酸氢钠或氢氧化钠或浓度为 0.1%的氢氧化氨溶液， 所述的消毒灭菌方法是将复水后的组织材料浸泡在上述 中度碱性溶液中， 緩慢摇动浸泡 24 ~ 48小时， 避免了组织基质的损伤。
在本发明的实施方案中， 步骤 4 中所述的脱细胞方法为经消毒灭菌和漂洗 后的组织材料在 2.0毫摩尔浓度氯化钙， 2.0毫摩尔浓度氯化镁和每升 100毫克 庆大霉素的生理盐水中在室温先漂洗 1 ~ 3小时，然后加入分散酶溶液洗脱细胞。
在一个优选的实施方案中， 所述的分散酶溶液是中性分散酶溶液，每升含 1 一 20毫摩尔的氯化钙， 1一 20毫摩尔氯化镁和 50— 400单位的分散酶， 所述分 散酶溶液洗脱细胞的方法是把组织材料浸泡在所述分散酶溶液中，在 37摄氏度 緩慢摇动浸泡 24 ~ 36小时。 中性分散酶溶液中更加优选每升含 2.0毫摩尔的氯 化钙， 2.0毫摩尔氯化镁和 100— 200单位的分散酶。 在本发明的一个优选实施方案中， 步骤 4中完成脱细胞之后， 进行清洗步 骤。 所述的清洗包括第一洗涤剂清洗和第二洗涤剂清洗， 所述第一洗涤剂溶液 是溶于羟乙基哌嗪乙硫横酸緩冲溶液（酸碱度 7.0 ~ 8.0 ) 中的 0.5%聚乙二醇辛 基苯基醚，清洗方法是把组织材料浸泡在第一洗涤剂溶液中，在 37摄氏度緩慢 摇动浸泡 12 ~ 18小时。所述第二洗涤剂溶液是溶于磷酸緩冲溶液（酸碱度 7.2 ~ 7.8 ) 中的 1.0%脱氧胆酸钠溶液， 清洗方法是把组织材料浸泡在二洗涤剂溶液 中， 在室温緩慢摇动浸泡 24 ~ 36小时。 同时， 本发明也可釆用其他合适的洗涤 剂， 如吐温 -20、叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇和 3-[(3-胆固醇氨丙基)二曱基 氨基] -1-丙磺酸等。
在本发明的实施方案中， 在第一洗涤剂和第二洗涤剂浸泡后， 在进行步骤 5之前， 釆用 20mM羟乙基哌嗪乙硫横酸緩冲溶液（酸碱度 7.0 ~ 8.0之间）在 室温下漂洗三次， 每次 2 ~ 4小时。
由于动物组织 DNA的存在， 组织基质在植入人体后容易引起炎症反应。 除人类和旧世纪猴外， 其它哺乳动物的体内都含有由 α-1,3-半乳糖残基 [Gala(l,3)Gal]的双糖末端的糖蛋白或糖脂组成的 α-Gal抗原。猪组织中的 a-Gal 抗原， 会引起免疫排斥反应。 消除或克服炎症反应和排斥反应的方法之一是使 用特异性的酶学处理去除动物组织基质中 DNA和 a Gal抗原。
在本发明的实施方案中， 步骤 5中所述的分解动物组织 DNA成分是通过 加入脱氧核糖核酸酶溶液完成的， 所述的脱氧核糖核酸酶溶液的配方是向每升 lOOmM的三羟曱基氨基曱烷-盐酸緩冲溶液（酸碱度 7.2 ) 中加入 2.0毫摩尔浓 度的氯化钙， 2.0毫摩尔浓度氯化镁和 5000酶单位脱氧核糖核酸酶， 降解去除 动物组织 DNA的方法是把组织材料浸泡在上述脱氧核糖核酸酶溶液中， 在 37 摄氏度緩慢摇动处理 18 ~ 28小时，然后用放入生理盐水在室温漂洗两次，每次 1 ~ 3小时。
在本发明的实施方案中， 步骤 6中所述的分解动物组织 α-Gal抗原是通过 加入 α-半乳糖苷酶溶液完成的， 所述的 α-半乳糖苷酶溶液的配方是向每升 10mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸緩冲溶液（酸碱度 7.0 ~ 8.0之间 ) 中加入 2.0mM 的氯化钙， 2.0mM氯化镁和 400GALU单位的 α-半乳糖苷酶，分解动物组织 a-Gal 抗原的方法是把组织材料浸泡在上述 α-半乳糖苷酶溶液中， 在 37摄氏度緩慢 摇洗 24 ~ 36小时。 在制备可移植到人体的组织基质时， 有必要去除各种酶的残留。 为达到上 述目的， 在本发明的实施方案中， 选用了盐析法进行清洗， 步骤 6中所述的高 浓度氯化钠溶液是 2— 5%的氯化钠溶液， 漂洗方法是把组织材料浸泡在上述氯 化钠溶液中，在室温清洗两次，每次 2 ~ 4小时。在一个更加优选的实施方案中， 高浓度氯化钠溶液优选 3%的氯化钠溶液。 此外， 氯化钠溶液也可用其它中性 盐溶液代替， 如氯化钾、 氯化镁和氯化锂等。
为了进一步增加产品的安全性， 在本发明的优选实施方案中， 还涉及病毒 灭活处理， 步骤（7 )中所述的病毒灭活试剂是双氧水和过氧乙酸， 方法是把组 织材料浸泡在含有 0.01 ~ 0.10%双氧水， 0.05 ~ 0.50%乙酸和 0.05 ~ 0.50%过氧乙 酸的溶液中， 在室温中緩慢摇洗 2 ~ 3 小时。 在更加优选的方案中， 选用含有 0.02%双氧水、 0.15%乙酸和 0.10%过氧乙酸灭活病毒， 2 ~ 3小时可以减少病毒 数目 10的 6次方以上。 双氧水、 乙酸和过氧乙酸的浓度可以随细菌数量改变， 增力口或减少。
在本发明的实施方案中， 在步骤 7的病毒灭活后， 在室温下用中性磷酸緩 冲液漂洗三次， 每次 2 ~ 4小时， 以去除双氧水、 乙酸和过氧乙酸的残留。
组织产品的终端灭菌处理，常常是对组织材料破坏最大的步骤之一。为此， 在本发明的实施方案中， 步骤 9中釆用了低温辐射进行处理。 在本发明优选的 实施方案中， 在 -40摄氏度条件下， 釆用 10—50kGy伽玛射线进行产品的终端 灭菌处理， 大大减少了对组织材料的破环。 在一些优选的实施方案中， 辐射剂 量根据组织基质中细菌数量进行改变， 增加或减少。 在一个更加优选的实施方 案中， 釆用 20 ~ 30kGy的伽玛射线进行产品的终端灭菌处理。
在一些替代性的实施方案中， 除辐射终端灭菌方法外， 本发明还可以将组 织基质冻干， 改用环氧乙烷气体进行灭菌。
在本发明的一些优选实施方案中，步骤 4(酶脱细胞）、步骤 5(酶分解 DNA ) 和步骤 6 (酶分解 α-1,3-半乳糖残基抗原）的先后顺序可以根据实际需要进行调 整变更。例如，可以先分解 α-1,3-半乳糖残基抗原，然后脱细胞和分解动物 DNA 成分； 或者先分解动物 DNA， 接着分解抗原和最后脱细胞处理。
此外， 在一些替代的实施方案中， 如选用已用遗传工程改良的无 α-Gal抗 原的动物， 只需使用脱氧核糖核酸酶。 同时， 为了减少不利的对细胞外基质蛋 白水解的作用， 处理时对分散酶浓度， 温度和时间要加以监测和优化。 在工艺 流程中， 还可以加入特定的酶抑制剂， 例如用乙二胺四乙酸， 用以抑制分散酶 的活性。
本发明另一方面还涉及由本发明上述方法制备得到的动物脱细胞组织基质 材料， 其中釆用的动物真皮原材料可以包括带有基膜的真皮， 也可以包括除去 基膜的真皮。
在本发明制备脱细胞组织基质材料的方法中， 涉及一系列处理动物皮肤组 织和制备组织器官基质的步骤以及多项生物化学溶液及配方。 通过上述步骤和 溶液所制备得到的真皮组织基质材料， 保留了组织细胞外基质原有的基本支架 结构、 主要生物化学成分和生物力学强度； 有效去除了动物组织中会引起人体 免疫排异反应的抗原；改进了组织基质的柔韧性、悬垂性和伤口曲面整合性能， 制备的动物真皮基质同人体皮肤相近， 不会引起组织基质中胶原蛋白和其他蛋 白质交联、 降解或变性， 脱细胞的组织真皮保有天然真皮组织基质的生物完整 性。 附图说明
图 1: 组织切片分析图。
A: 新鲜猪真皮 HE染色切片；
B: 处理后真皮基质 HE染色切片；
C: 新鲜猪真皮 α -1,3半乳糖残基抗原免疫化学染色切片；
D: 处理后真皮基质 α -1,3半乳糖残基抗原免疫化学染色切片。
图 2: 组织切片分析图。
A,B,C: I型胶原蛋白免疫化学染色切片；
D,E,F: III型胶原蛋白免疫化学染色切片；
A,D: 负染；
Β,Ε: 未处理鲜猪真皮正染；
C,F: 处理后组织真皮基质。
图 3: 脱细胞组织基质在终端伽玛射线辐射灭菌后抗胶原蛋白酶水解的特 性图。
图 4: 脱细胞组织基质植入大鼠皮下两周后寄主细胞生长进入和新血管形 成的 HE染色图。 具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明， 旨在用于说明本发明而非 限定本发明。 应当指出， 对于本领域技术人员而言， 在不脱离本发明原理的前 提下， 还可以对本发明进行若干改进和修饰， 这些改进和修饰也同样落入本发 明的保护范围之内。 实施例 1 ： 动物脱细胞組织基盾材料的制备及性能检测
1、 制备
( 1 )组织器官的采集和保存
从刚屠宰的猪体身上收集新鲜猪皮， 临时保存在 4摄氏度的冰箱中。 机械 拔毛后， 取猪皮分层为约 1.0毫米厚真皮， 在负 20摄氏度冰冻保存。
( 2 )脱细胞
真皮解冻后， 先用生理盐水冲洗二次， 每次 30分钟。 冲洗后的猪真皮浸泡 在每升含 100毫克庆大霉素的盐水溶液中， 溶液中另加入 2.0毫摩尔浓度的氯 化钙， 2.0毫摩尔浓度氯化镁和每升 150单位的中性分散酶， 在 37摄氏度处理 24小时。
( 3 )清洗
庆大霉素浸泡后， 用 0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液清洗真皮 16小时。 脱细胞清洗后先用生理盐水冲洗二次， 每次 120分钟。
( 4 )分解 DNA和去除 α-1，3半乳糖残基抗原
每升溶液中再加入 2.0毫摩尔浓度的氯化钙， 2.0毫摩尔浓度氯化镁， 5000 单位脱氧核糖核酸酶和两粒葛兰素史克比诺药片 （含 α -半乳糖苷酶）， 在室温 中处理 20小时。
( 5 )病毒灭活
清洗后， 用含有 0.02%双氧水， 0.15%乙酸和 0.10%过氧乙酸的溶液杀菌和 病毒灭活 2小时。
( 6 )清洗和
最后用无菌生理盐水冲洗至无聚乙二醇辛基苯基醚和酶残留。 处理后的真 皮基质暂时保存在 6%的甘油溶液中。 2、 性能检测
测定表明， 材料的抗拉强度为 15.0 ± 3.6 兆帕斯卡（N=24 ); 缝线强度为 56 ± 13牛顿 （N=24 ); 每 100克湿重真皮基质中含有 24.2 ± 2.9克真皮干物质 材料（N=15 )。 差示扫描量热仪分析显示组织基质材料的起始变性温度为 58.0 ± 0.4摄氏度（N=5 )， 焓变值为每克干重 61.6 ± 2.1 焦耳（ N=5 )， 同真皮原材 料中自然态的真皮基质无明显差别， 整个工艺过程对真皮基质特性无明显改变 和损伤。组织切片分析表明细胞成分（如脱氧核糖核酸 DNA )和基质中的 α-1,3 半乳糖残基抗原去除的干净， 具体参见图 1。 I型和 III型胶原蛋白免疫化学染 色分析也显示处理工艺对真皮基质中胶原蛋白无损害， 具体参见图 2。 实施例 2： 清洗和消毒真皮的适宜条件的确定
从猪体身上收集新鲜真皮， 新鲜猪真皮分别在 37摄氏度和酸碱度为 10.6， 11.5和 11.8的氢氧化钠溶液中进行处理。 每公斤猪皮 4升氢氧化钠溶液， 以磷 酸緩冲液为对照。 24小时后， 测定每毫升溶液中的菌落形成单位。 磷酸緩冲液 中含有 10.3 ± 1.3对数菌落形成单位（LogCFU ) ( N=3 ); 酸碱度为 10.6， 11.5 和 11.8的溶液中， 对数菌落形成单位分别是 2.1 ± 0.1， 0和 0。 可见， 中度碱液的 消毒和杀菌作用明显。 用差示扫描量热仪分析表明， 酸碱度 11.5以上损害组织 基质， 组织基质中蛋白质的稳定性明显下降。 高酸碱度对组织基质的损坏还表 现在组织基质不可逆的吸涨和硬化。 本实施例确定了较为合适的清洗和消毒真 皮的条件是调整酸碱度到 10.5 ~ 11.5之间。 实施例 3 ： 动物脱细胞組织基盾材料的制备及性能检测
1、 制备
( 1 )组织器官的采集和保存
从刚屠宰的猪体身上收集新鲜猪皮， 临时保存在 4摄氏度的冰箱中。 机械 拔毛后， 取猪皮分层为约 1.0毫米厚真皮。
( 2 )收集和清洗
1.0毫米厚的猪真皮在收集清洗后（见实施例一），暂存于负 80摄氏度冻箱 中。
( 3 )脱细胞 解冻后用 5mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液（pH 7.4) 冲洗， 加入 2.0mM 氯化钙和每毫升 0.2单位的中性分散酶后， 在 37摄氏度处理 18小时。
(4)清洗
用 1.0%的脱氧胆酸钠溶液在 37摄氏度清洗 20小时。
( 5 )分解 DNA和 α -1,3半乳糖残基抗原
用无菌生理盐水冲洗 120分钟后， 每升溶液中再加入 2.0mM的氯化钙和 2.0mM氯化镁， 4000单位重组脱氧核糖核酸酶和 200GALU单位绿色咖啡豆种 子中提取的 α-半乳糖苷酶， 在 37摄氏度处理 24小时。
(6)病毒灭活
无菌生理盐水清洗后， 用 0.05%双氧水， 0.30%乙酸和 0.20%过氧乙酸杀菌 2小时。
(7)清洗
用无菌生理盐水冲洗至无脱氧胆酸钠，重组脱氧核糖核酸酶和 α-半乳糖苷 酶残留。
(8)终端灭菌处理
处理后的真皮基质保存在含 12%甘油的无菌生理盐水溶液中，用 25kGy的 伽玛射线灭细菌。
2、 性能检测
经带有 00型探针的软硬度仪测定表明， 未经处理的猪真皮的柔软度为 40 ±8.6 (N=24)， 脱细胞猪真皮的柔软度为 13.0 ± 4.0 (N=25)， 人体真皮的柔软 度为 14.2±6.1 (N=40)。 表明相对于未经处理的猪真皮 （硬得多）， 脱细胞处 理后的猪真皮基质的柔软度同人体真皮组织在统计上无明显差异。 表面本发明 的方法改进了组织基质的柔韧性， 悬垂性和伤口曲面整合性能。
组织切片分析表明， 生产的组织基质中的 α -1,3半乳糖残基抗原已被干净 的去除， 染色成阴性， 无抗原的表达。 用 QuantiT-PicoGreen 荧光染料法测定 DNA含量， 结果表明新鲜猪真皮每克含有约 84.0士 10.2微克 DNA ( N=3 )， 清 洗消毒后的猪真皮每克含有 62.9士 9.5微克 DNA ( N=3 )， 脱细胞处理和清洗后 组织基质每克只含有 1.9士 1.1微克 DNA( N=3 )，动物 DNA含量平均减少 97.7%。 差示扫描量热仪分析显示组织基质材料的起始变性温度为 54.7 ±0.2摄氏度 ( N=3 )， 焓变值为每克干重 59.5士 3.1焦耳（ N=3 )。 同猪真皮原材料中自然态 的真皮比， 起始变性温度只下降 3.3摄氏度， 焓变值无明显差别， 说明整个制 备过程（包括终端伽玛射线辐射灭菌）对组织基质特性无明显改变和损伤。
用羟脯氨酸法测定组织基质中胶原蛋白的含量， 经终端伽玛射线辐射灭菌 后的猪皮组织基质含有 91.0 ± 3.0% ( N=6 ) 的胶原蛋白。 用 Fastin染色法测定 弹性蛋白含量，经终端伽玛射线辐射灭菌后的组织基质含有 0.92士 0.21%( N=6 ) 的弹性蛋白， 同未处理的猪真皮材料比， 下降了 71.4%。
脱细胞组织基质抗胶原蛋白酶水解的特性， 可用于研究在终端伽玛射线辐 射灭菌后， 本发明制备的脱细胞组织基质中胶原蛋白的稳定性。 制备脱细胞组 织基质放入每毫升含有 5 个胶原酶单位的三羟曱基氨基曱烷 -盐酸溶液中 （10 mM， 酸碱度 7.5 )， 在 37摄氏度中培养长达 64小时。 结果显示同未处理的猪 真皮材料比，用本发明方法制备的脱细胞组织基质在终端伽玛射线辐射灭菌后， 抗胶原蛋白酶水解的性能没有改变， 具体参见附图 3。
用本发明方法制备的脱细胞组织基质的再细胞化特性， 用大鼠 （Rattus norvegicus Lewis )做了动物评估实验。 大鼠（（ 8例 )麻醉后， 用电动剪刀剃去 背毛， 用 70 %的酒精擦拭手术部位， 在背面上下和左右切开个单独的切口， 形 成小口袋， 大小以容纳 1 X 1厘米的样品（ ~ 1毫米厚）为宜。 将组织基质样品 植入皮下。手术后，如果大鼠表现出疼痛的迹象，用丁丙诺啡（0.05毫克 /千克） 止痛。 两周后牺牲大鼠， 取出植入的组织基质材料， 用 10%中性福尔马林溶液 固定。 通过组织切片方法来观查大鼠寄主细胞进入和血管生长。 结果表明两周 内就有大量寄主细胞生长进入组织基质材料， 并开始产生新血管， 没有观查到 不良反应， 具体参见附图 4。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种制备动物脱细胞组织基质材料的方法， 其包括如下步骤：
( 1 )收集动物组织原材料， 清洗血液和其它污垢， 切割成长、 宽和高为所 需规格尺寸的组织材料， 低温保存；
(2)緩曼解冻， 在含有庆大霉素的生理盐水中复水；
(3)组织材料在中度碱性溶液中消毒灭菌， 无菌纯水漂洗， 酸碱度调到中 性；
(4)脱细胞， 清洗；
(5)分解动物组织 DNA成分， 生理盐水漂洗；
( 6 )分解动物组织 α-1,3-半乳糖残基抗原（ α-Gal抗原）， 高浓度氯化钠溶 液漂洗， 生理盐水漂洗；
(7) 病毒灭活， 磷酸緩冲液漂洗；
(8)无菌装袋， 密封；
(9)终端灭菌处理；
其特征在于， 釆用酶学方法去除细胞成分、 去除 α-Gal抗原和增进支架柔 韧性。
2、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（1) 中的动物组织原材料选自 皮肤， 真皮， 动脉， 静脉， 胃， 软骨， 半月板， 小肠， 大肠， 隔膜， 肌腱， 韧 带， 神经组织， 膀胱， 尿道和输尿管。
3、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（1) 中清洗血液和其它污垢釆 用纯净水， 使用物理方法或超声波进行洗涤。
4、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（1) 中的组织材料在平均速率 不大于每分钟 1.0摄氏度降温至 -40摄氏度以下进行保存，优选降温速度为每分 钟 0.5摄氏度。
5、根据权利要求 1所述的方法，其中步骤（ 1 )中的低温保存为长期保存， 其方法是将猪真皮材料平放在一块面积稍大的棉纱布、 纸张、 塑料膜、 尼龙网 或其它布织品保护层上， 将真皮和上述保护层卷成一个多层同心卷或形成真皮 和保护层交替的多层包装形态， 放入塑料袋中， 密封后放入 -80或 -40摄氏度冻 箱中保存。
6、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（2 ) 中低温保存的组织材料在 5 ~ 12摄氏度环境下緩慢解冻。
7、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（2 ) 中融化的组织材料在每升 含有 100毫克庆大霉素的生理盐水中复水。
8、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（3 ) 中所述的中度碱性溶液是 酸碱度为 10.5— 11.5的碳酸氢钠或氢氧化钠或浓度为 0.1%的氢氧化氨溶液，所 述的消毒灭菌方法是将复水后的组织材料浸泡在上述中度碱性溶液中， 緩慢摇 动浸泡 24 ~ 48小时。
9、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（4 ) 中所述的脱细胞方法为经 消毒灭菌和漂洗后的组织材料在 2.0毫摩尔浓度氯化钙， 2.0毫摩尔浓度氯化镁 和每升 100毫克庆大霉素的生理盐水中在室温先漂洗 1 ~ 3小时，然后加入分散 酶溶液洗脱细胞。
10、 根据权利要求 9所述的方法， 其中所述的分散酶溶液是中性分散酶溶 液， 每升含 1一 20毫摩尔的氯化钙， 1一 20毫摩尔氯化镁和 50— 400单位的分 散酶，所述分散酶溶液洗脱细胞的方法是把组织材料浸泡在所述分散酶溶液中， 在 37摄氏度緩慢摇动浸泡 24 ~ 36小时， 中性^:酶溶液中优选每升含 2.0毫 摩尔的氯化钙， 2.0毫摩尔氯化镁和 100— 200单位的分散酶。
11、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（4 )中所述的清洗包括第一洗 涤剂清洗和第二洗涤剂清洗， 所述第一洗涤剂溶液是溶于羟乙基哌嗪乙硫横酸 緩冲溶液（酸碱度 7.0 ~ 8.0 ) 中的 0.5%聚乙二醇辛基苯基醚， 清洗方法是把组 织材料浸泡在第一洗涤剂溶液中， 在 37摄氏度緩慢摇动浸泡 12 ~ 18小时； 所 述第二洗涤剂溶液是溶于磷酸緩冲溶液（酸碱度 7.2 ~ 7.8 ) 中的 1.0%脱氧胆酸 钠溶液， 清洗方法是把组织材料浸泡在二洗涤剂溶液中， 在室温緩慢摇动浸泡
24 ~ 36小时。
12、根据权利要求 1所述的方法，其中在第一洗涤剂和第二洗涤剂浸泡后， 在进行步骤（ 5 )之前， 用 20mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸緩冲溶液（酸碱度 7.0 ~ 8.0之间 )在室温下漂洗三次， 每次 2 ~ 4小时。
13、 根据权利要求 1 所述的方法， 其中步骤（5 ) 中所述的分解动物组织 DNA成分是通过加入脱氧核糖核酸酶溶液完成的，所述的脱氧核糖核酸酶溶液 的配方是向每升 lOOmM的三羟曱基 曱烷-盐酸緩冲溶液（酸碱度 7.2 )中加 入 2.0毫摩尔浓度的氯化钙， 2.0毫摩尔浓度氯化镁和 5000酶单位脱氧核糖核 酸酶， 降解去除动物组织 DNA的方法是把组织材料浸泡在上述脱氧核糖核酸 酶溶液中， 在 37摄氏度緩慢摇动处理 18 ~ 28小时， 然后放入生理盐水在室温 漂洗两次， 每次 1 ~ 3小时。
14、根据权利要求 1所述的方法，其中步骤（6 )中所述的分解动物组织 a-Gal 抗原是通过加入 α-半乳糖苷酶溶液完成的， 所述的 α-半乳糖苷酶溶液的配方是 向每升 10mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸緩冲溶液（酸碱度 7.0 ~ 8.0之间）中加入 2.0mM的氯化钙， 2.0mM氯化镁和 400GALU单位的 α-半乳糖苷酶， 分解动物 组织 α-Gal抗原的方法是把组织材料浸泡在上述 α-半乳糖苷酶溶液中， 在 37 摄氏度緩慢摇洗 24 ~ 36小时。
15、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（6 )中所述的高浓度氯化钠溶 液是 2— 5%的氯化钠溶液， 漂洗方法是把组织材料浸泡在上述氯化钠溶液中， 在室温清洗两次， 每次 2 ~ 4小时， 高浓度氯化钠溶液优选 3%的氯化钠溶液。
16、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（7 )中所述的病毒灭活试剂是 双氧水和过氧乙酸， 方法是把组织材料浸泡在含有 0.01 ~ 0.10%双氧水， 0.05 - 0.50%乙酸和 0.05 ~ 0.50%过氧乙酸的溶液中， 在室温中緩曼摇洗 2 ~ 3小时。
17、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（7 )中病毒灭活后， 在室温下 用中性磷酸緩冲液漂洗三次， 每次 2 ~ 4小时， 以去除双氧水、 乙酸和过氧乙酸 的残留。
18、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（9 )中所述的终端灭菌处理是 釆用低温伽玛射线辐射或环氧乙烷气体进行灭菌处理， 伽玛射线的处理剂量优 选为 10—50kGy。
19、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（4 )、 步骤（5 )和步骤（6 ) 的先后顺序可以根据实际需要进行调整变更。
20、 根据权利要求 1所述的方法， 在选用已用遗传工程改良的无 α-Gal抗 原的动物组织原材料时， 无需进行第 （6 ) 步骤而直接进行第 （7 ) 步骤。
21、由权利要求 1-20中任一项所述的方法制备得到的动物脱细胞组织基质 材料。
22、根据权利要求 21所述的动物脱细胞组织基质材料，其中釆用的动物真 皮原材料包括带有基膜的真皮和除去基膜的真皮。
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