CN113274552A - 缓释抗菌型脱细胞基质生物材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种缓释抗菌型脱细胞基质生物材料及其制备方法，其中，制备方法包括：步骤S1，提供生物组织，并对所述生物组织进行脱细胞和病毒灭活处理；步骤S2，对处理后的所述生物组织进行等离子体处理，以对所述生物组织的表面进行改性，得到脱细胞基质；步骤S3，将所述脱细胞基质浸渍在缓释抗菌水溶液中，所述缓释抗菌水溶液中含有有机缓释介质和抗菌剂以及弱酸，以便所述有机缓释介质负载在所述脱细胞基质表面且所述抗菌剂负载在所述有机缓释介质表面，所述弱酸为稀醋酸、稀盐酸或稀乳酸，浓度为0.01～1mol/L；步骤S4，将浸渍后的所述脱细胞基质取出，并经真空冷冻干燥和灭菌后，得到所述缓释抗菌型脱细胞基质生物材料。

Description

缓释抗菌型脱细胞基质生物材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种缓释抗菌型脱细胞基质生物材料及其制备方法。
背景技术
脱细胞基质生物材料的研究是组织功能领域的一项重要突破，相比于传统不可吸收高分子材料，脱细胞基质生物材料植入体内后充当临时组织支架，伴随着补片材料的降解，宿主细胞浸润其中并产生自体胶原纤维。这样的内源性组织重塑过程可实现早期局部快速再血管化、吞噬细胞早期进入，细菌生物膜难以形成，因此具备一定的耐受感染性。
但不可否认的是，脱细胞基质生物材料仅是部分耐受感染而不是抗感染，其自身并没有抗微生物活性，非交联脱细胞基质生物材料在感染环境中能被细菌分泌的胶原酶消化而快速崩解。因此，脱细胞基质生物材料亟需提升抗感染性。
针对该问题，CN102014790A和CN101623518A分别公开了利用纳米银、银离子等抗菌金属粒子浸润脱细胞基质生物材料，以提高生物补片抗感染性的方法。体外抗菌实验和动物实验结果表明可降低脱细胞基质生物材料感染率，提高污染创面修复成功率。这一改良生物补片抗感染效果令人满意，但由于抗菌成分仅为吸附至材料网状结构，结合较为松散，在植入后短时间内释放大量抗菌成分，致使修复区后期抗菌效果较差。
另外，Zhou等(Ann Surg.May 2011；253(5):1033-1041)将纳米银与猪小肠粘膜脱细胞基质进行混合，显示出良好的主动抗菌效果。但由于其采用混合法，因此纳米银与猪小肠粘膜脱细胞基质结合不够紧密，在较短时间内会释放大量纳米银，使得后期的抗菌效果有限，需要进一步改进。
对生物医学材料进行改性可使其获得某种特殊性能，例如抗菌性等。目前常用的改性方法为化学交联法。CN103751844A公开了一种抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质制备方法及其应用。该发明以京尼平、多巴胺和纳米银处理的猪小肠粘膜脱细胞基质制备抗菌抗降解生物材料，多巴胺具有粘滞性，可通过化学键的作用将抗菌成分绑定至胶原纤维支架，实验证实其抗降解性能和抗菌性能均相对于天然的猪小肠粘膜脱细胞基质显著增强，且能够在高应力部位组织修复中应用。但是，该方法得到的脱细胞基质生物材料相较于非交联材料在应用于受污染的表面时，显著提高修复区感染率，这可能是由于交联会缩小材料的孔隙，过小的孔隙不利于细胞侵入实现早期血管化，且易于细菌定植，形成细菌生物膜。
因此，有必要开发出一种能够释放速率可控、抗菌效果好、且能够应用于受污染表面的抗菌生物材料及其制备方法。
发明内容
与其他改性方法比较，等离子技术有工艺简单、操作简便、易于控制、对环境无污染等优点，因此等离子技术在生物医学材料的应用越来越广泛。本发明人等经研究发现：等离子体在软组织材料、人血管系统材料、医用膜材料、组织引导材料、生物传感器材料、骨修复和替换材料、齿科材料等生物材料表面改性中的应用是切实可行的。例如，在血管组织工程材料改性方面，利用CF4等离子体处理可获得氟化表面或类似聚四氟乙烯的表面；表面引入的含氟基团又可用Ar等离子体可控地去除，由此可获得一系列不同湿润性的表面，适用于用作特定场合的生物医用材料。另外，用全氟烃等离子体处理聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，研究其表面湿润性的变化对生物相容性的影响，发现处理后膜吸附白蛋白的保留时间延长，增加了其抗凝血性，且等离子体修饰无毒、无不良反应。
本发明人等在上述研究的基础上，完成了本发明。
本发明的目的在于提供一种生物相容性和抗菌效果强、释放速率可控的脱细胞基质生物材料。
本发明还提供一种具有上述脱细胞基质生物材料的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明第一方面实施例的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料，脱细胞基质上负载有缓释介质，且所述缓释介质连接有抗菌剂，其中，所述抗菌剂的负载量为2.5-5mg/cm2。
根据本发明的一些实施例，所述缓释介质为水溶性或弱酸环境下可溶解的有机缓释介质，所述弱酸为醋酸、盐酸、乳酸中的一种或多种，所述弱酸的浓度为0.01-1mol/L。
根据本发明的一些实施例，所述有机缓释介质为选自聚乙烯醇、壳聚糖、海藻酸钠、明胶中的一种或多种。
根据本发明的一些实施例，所述抗菌剂为纳米银、可溶性银化合物、纳米氧化锌、5-氯-2-(2',4'-二氯苯氧基)苯酚、双氯苯双胍己烷、抗生素、抗菌多肽中的一种或多种。
根据本发明的一些实施例，在所述脱细胞介质的表面还负载有稳定剂，所述稳定剂包括乙二醇以及聚乙二醇。
根据本发明第二方面实施例的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1，提供生物组织，并对所述生物组织进行脱细胞和病毒灭活处理；
步骤S2，对处理后的所述生物组织进行等离子体处理，以对所述生物组织的表面进行改性，得到脱细胞基质；
步骤S3，将所述脱细胞基质浸渍在缓释抗菌水溶液中，所述缓释抗菌水溶液中含有有机缓释介质和抗菌剂以及弱酸，所述弱酸为稀醋酸、稀盐酸或稀乳酸，浓度为0.01～1mol/L；
步骤S4，将浸渍后的所述脱细胞基质取出，并经真空冷冻干燥和灭菌后，得到所述缓释抗菌型脱细胞基质生物材料。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S1中，所述生物组织为来源于哺乳动物的空腔脏器粘膜下层、组织基底膜、真皮、心包、腹膜、胸膜或羊膜。
根据本发明的一些实施例，所述脱细胞通过物理法、化学法、生物法中的任一种方法进行脱细胞处理。
根据本发明的一些实施例，所述病毒灭活处理通过病毒灭活试剂进行，所述病毒灭活试剂为过氧乙酸、75％酒精、氢氧化钠中的一种或多种。
根据本发明的一些实施例，在进行所述等离子体处理前，还进行冷冻以及真空冷冻干燥处理，其中，所述冷冻的温度为-80～-20℃，冷冻时间为12～24h；所述真空冷冻干燥的真空度为5～20Pa，所述真空冷冻干燥的温度为-50～-20℃，时间为1-4小时。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，所述等离子体处理在气体环境中进行，所用气体为N2、O2、Ar、CO2中的一种或多种。
根据本发明的一些实施例，所述等离子体处理时所用气体为N2和O2混合的混合气体，N2和O2的混合比为1:1。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，所述等离子体处理的温度为0～30℃且时间为0.5～10min，压强为5～30Pa，放电功率为20～50W。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S3中，所述有机缓释介质为选自聚乙烯醇、壳聚糖、海藻酸钠、明胶中的一种或多种，所述有机缓释介质在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为5wt％以下。
根据本发明的一些实施例，所述抗菌剂为纳米银、可溶性银化合物纳米氧化锌、5-氯-2-(2',4'-二氯苯氧基)苯酚、双氯苯双胍己烷、抗生素、抗菌多肽中的一种或多种,所述抗菌剂在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为500ppm以下。
根据本发明的一些实施例，所述纳米氧化锌采用尿素均匀沉淀法制备得到，所述纳米氧化锌为球状结构，平均粒径为20-100nm。
根据本发明的一些实施例，在所述缓释抗菌水溶液中还含有稳定剂，所述稳定剂包括乙二醇以及聚乙二醇。
根据本发明的一些实施例，所述稳定剂为乙二醇与聚乙二醇的混合物，其中，所述乙二醇在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为2wt％～8wt％，所述聚乙二醇在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为0.05wt％～2wt％，所述聚乙二醇的平均分子量为2000-8000。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S3中，所述脱细胞基质与所述缓释抗菌水溶液的体积比为1：50-150，所述缓释抗菌水溶液保持在37±2℃的温度，浸渍时间为24～48h。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S4中，在进行真空冷冻干燥之前进行冷冻处理，所述冷冻的温度为-80～-20℃，冷冻时间为12～24h；所述真空冷冻干燥的真空度为5～20Pa，所述真空冷冻干燥的温度为-50～20℃且时间为1-4小时。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S4中，所述灭菌通过环氧乙烷和/或电离辐射进行灭菌。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S4中，进灭菌处理后的所述缓释抗菌型脱细胞基质生物材料保存在2～8℃医用冷藏箱内保存。
本发明的上述技术方案至少具有如下有益效果之一：
根据本发明实施例的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料的制备方法，在对生物组织进行脱细胞和病毒灭活处理后，还通过等离子体对生物组织进行表面处理，等离子体技术可在不损耗脱细胞基质优良性能的同时，引入活性基团，增加表面粗糙度；此外，用等离子体处理脱细胞基质，不仅可以有效、快捷的在其表面引入自由基，还可提高其生物相容性；此外，脱细胞基质本身具有复杂的网络结构，可吸附一定量的缓释抗菌剂；因此本发明中所述的脱细胞基质经等离子体处理后，缓释抗菌剂与脱细胞基质以化学键和物理作用力双重的方式结合，黏附力明显增强，且负载量显著增加；此外，脱细胞基质本身可降解，伴随材料本身的降解，缓释抗菌剂逐步释放；
进一步地，根据本发明实施例的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料，缓释介质作为脱细胞基质与抗菌剂之间的桥梁，通过调节缓释介质的用量即可控制抗菌剂的释放速率从而达到释放速率可控；其中，缓释介质既可以负载于脱细胞基质表面，也可能以化学键的方式与脱细胞基质结合；
进一步地，通过引入缓释介质，部分抗菌剂会负载在缓释介质表面，部分会被缓释介质包裹，随着缓释介质的溶解而释放，可以进一步控制抗菌剂的释放速率；
进一步地，根据本发明实施例提供的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料，未经化学交联处理，具有生物相容性好，可降解，同时长效抗菌，抗菌组分释放速率可控等优点，在组织修复治疗中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1所使用的生物组织在不同处理阶段后的粘片，其中，(a)示出了未经脱细胞处理的猪膀胱基质；(b)示出了经脱细胞处理后的猪膀胱基质；(c)示出了真空冷冻干燥后的猪膀胱基质；
图2为本发明实施例1中对猪膀胱基质进行真空冷冻干燥处理时的真空冷冻干燥曲线；
图3为本发明实施例1中制备的纳米氧化锌的SEM图像；
图4为猪膀胱基质的HE染色图片，其中(a)为未脱细胞处理的猪膀胱基质的HE染色结果；(b)为脱细胞处理后的猪膀胱基质的HE染色结果；
图5为抗菌剂负载量的测试结果；
图6为抗菌剂释放量随时间的变化曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面首先结合附图具体描述根据本发明实施例的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料的制备方法。
根据本发明实施例的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料及其制备方法，包括如下步骤：
步骤S1，提供生物组织，并对所述生物组织进行脱细胞和病毒灭活处理。
也就是说，在获取生物组织后，首先要对该生物组织进行脱细胞处理，并进行病毒灭活处理。
其中，作为生物组织，没有特殊限制，例如可以为来源于哺乳动物的空腔脏器粘膜下层、组织基底膜、真皮、心包、腹膜、胸膜或羊膜。
在得到生物组织后，需要对生物组织进行脱细胞处理、病毒灭活处理。
其中，脱细胞可以通过物理法、化学法、生物法中的任一种方法进行脱细胞处理。
其中，所述物理法脱细胞主要涉及：冻融、超声、振荡和超临界流体处理；所述化学法脱细胞主要涉及：酸、碱、非离子型去污剂、离子型去污剂、高渗盐水和醇类等处理；所述生物法脱细胞主要涉及：酶和螯合剂等处理。
作为一种实施方式，所述生物组织的脱细胞工艺为：采用反复冻融法处理生物组织，然后在恒温水浴振荡器内，依次用1M高渗盐水处理2h，0.2％Triton X-100处理2h，0.4％NaOH处理2h。其中，恒温水浴振荡器的振荡速率例如可以为120rpm，水浴温度为37℃。
此外，所述病毒灭活处理可以通过病毒灭活试剂进行，所述病毒灭活试剂为过氧乙酸、75％酒精、氢氧化钠中的一种或多种。
作为一种实施方式，所述生物组织的病毒灭活工艺为：脱细胞处理后的生物组织在恒温水浴振荡器内，用0.1％过氧乙酸(PAA)处理2h，和/或用75％的酒精充分浸泡1h。同样地，恒温水浴振荡器的振荡速率例如可以为120rpm，水浴温度为37℃。
另外，所述生物组织在脱细胞和病毒灭活工艺处理后，优选地，通过无菌PBS缓冲溶液漂洗至无化学试剂残留，PBS缓冲溶液与生物组织的质量比为50～100:1，漂洗次数3～5次，单次漂洗时间10～30min。
另外，优选地，所述生物组织在PBS溶液漂洗后采用无菌水清洗，无菌水与生物组织的质量比为50～100:1，清洗次数4～7次，单次清洗时间10～30min。
步骤S2，对处理后的所述生物组织进行等离子体处理，以对所述生物组织的表面进行改性，得到脱细胞基质。
也就是说，在对生物组织进行脱细胞处理以及病毒灭活处理后，通过等离子体处理，对生物组织的表面进行改性。该等离子体处理工艺是对脱细胞基质材料的一种物理改性，不影响材料本身的网状结构和性能，且无毒无害，能有效改善抗菌剂在脱细胞基质上的附着力和负载量。
在进行所述等离子体处理前，还进行冷冻以及真空冷冻干燥处理，其中，所述冷冻的温度为-80～-20℃，冷冻时间为12～24h；所述真空冷冻干燥的真空度为5～20Pa，所述真空冷冻干燥的温度为-50～-20℃，时间为1-4小时。
在脱细胞处理后，将其进行冷冻，能够有效防止其在冻干过程中的收缩，从而可以保持脱细胞基质的网络结构，有利于提高负载量。作为一个具体示例，例如可以直接置于-20℃左右的保温箱中冷冻18个小时。
另外，作为真空冷冻干燥处理工艺，例如可以在冷冻保持一定时间后，分步进行阶梯式升温，即升温-保温-升温-保温等，直至室温-30℃左右。作为一个具体示例，例如，可以在冷冻后直接将其经1.5小时从室温逐渐降温至-45℃左右，并在此温度下保持3小时，此后，经1.5小时逐渐升温至0℃左右，并继续保持5小时，此后，经半小时逐渐升温至10℃，并保温5小时，然后，从10℃经半小时逐渐升温至30℃，并继续保温4小时，最后，从30℃经1小时逐渐降温至20℃。
在经过冷冻处理、真空冷冻干燥之后，即可对其进行等离子体处理以对表面进行改性。
等离子体是靠气体辉光放电产生的电离气体。等离子体中的高能粒子包括电子、光子、激发态粒子与自由基通过轰击或化学反应，使材料表面的C-C或C-H等键断裂，形成自由基。
等离子体技术可在不损耗脱细胞基质优良性能的同时，引入活性基团，增加表面粗糙度以提高负载量；此外，用等离子体处理脱细胞基质，不仅可以有效、快捷的在其表面引入自由基，还可提高其生物相容性。
此外，脱细胞基质本身具有复杂的网络结构，可吸附一定量的缓释介质、抗菌剂。由此，脱细胞基质经等离子体处理后，缓释介质、抗菌剂与脱细胞基质以化学键和物理作用力双重的方式结合，黏附力明显增强，且负载量显著增加。此外，脱细胞基质本身可降解，伴随材料本身的降解，缓释抗菌组分逐步释放。
另外，等离子体处理优选在气体环境中进行，所用气体例如可以为N2、O2、Ar、CO2中的一种或多种。
优选地，所述等离子体处理时所用气体为N2和O2混合的混合气体，N2和O2的混合比为1:1。
此外，等离子体处理的温度例如可以为0～30℃且时间为0.5～10min，压强为5～30Pa，放电功率为20～50W。
本发明中，等离子体处理工艺是关键步骤，该工艺是对脱细胞基质材料的一种物理改性，不影响材料本身的网状结构和性能，且无毒无害，能有效改善抗菌组分在生物材料上的附着力和负载量。
优选地，通入目标气体前，可以先将真空先抽至10Pa及以下，并维持30分钟及以上，由此能进一步避免对生物材料本身的结构和性能的影响。
步骤S3，将所述脱细胞基质浸渍在缓释抗菌水溶液中，所述缓释抗菌水溶液中含有有机缓释介质和抗菌剂以及弱酸，所述弱酸为稀醋酸、稀盐酸或稀乳酸，浓度为0.01～1mol/L。
也就是说，对得到表面改性的脱细胞基质之后，将其浸渍在缓释抗菌水溶液中以在该脱细胞基质上负载缓释介质，并进而负载抗菌剂。其中，缓释介质有可能负载在脱细胞基质表面，也有可能以化学键的方式与脱细胞基质结合。
此外，部分抗菌剂会负载于缓释介质表面，部分抗菌剂会被缓释介质包裹，随着缓释介质的溶解而释放。
也就是说，在浸渍之后，可以脱细胞基质上负载有缓释介质，且所述缓释介质连接有抗菌剂。
考虑到脱细胞生物材料的具体应用环境，优选地，所述有机缓释介质为在水溶性或弱酸环境下可溶解的有机缓释介质选自聚乙烯醇、壳聚糖、海藻酸钠、明胶中的一种或多种，所述有机缓释介质在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为5wt％以下。
其中，聚乙烯醇，壳聚糖等物质作为性能优良的有机物，本身具有双键等活性基团，与脱细胞基质有很好的生物相容性，可作为抗菌组分的载体。此外，这些缓释介质微溶于水，可调节缓释介质的用量来控制缓释抗菌组分的溶解性能，从而使抗菌组分的释放速率可控。
其中，作为抗菌剂，例如可以为纳米银、可溶性银化合物、纳米氧化锌、5-氯-2-(2',4'-二氯苯氧基)苯酚、双氯苯双胍己烷、抗生素、抗菌多肽中的一种或多种，所述抗菌剂在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为500ppm以下。
进一步地，所述纳米氧化锌采用尿素均匀沉淀法制备得到，所述纳米氧化锌为球状结构，平均粒径为20-100nm。
具体而言，例如可以将Zn(NO3)2·6H2O与尿素混合，溶于去离子水中，搅拌加热回流一定时间，过滤洗涤干燥，最后经高温焙烧制得纳米氧化锌。
根据本发明的一个示例，其制备条件为：尿素∶Zn(NO3)2·6H2O的摩尔比为4.0，溶于100℃水中加热回流4h，于100℃干燥8h，并在500℃焙烧2h。
如图3所示，根据尿素均匀沉淀法制备得到的纳米氧化锌为球装颗粒，尺寸均一且分布均匀，平均粒径可以为50nm左右。
此外，在所述缓释抗菌水溶液中还可以含有稳定剂，所述稳定剂包括乙二醇以及聚乙二醇。
乙二醇为无色粘稠液体，其不仅具有良好的吸湿性，而且因其具有凝固点较低的特点，在缓释抗菌水溶液中加入适量的乙二醇便可以降低缓释抗菌溶液的冰点，增强缓释抗菌水溶液的稳定性。另外，聚乙二醇有很好的水溶性和粘滞性，且对酸碱稳定性好，在缓释抗菌水溶液中加入适量聚乙二醇有利于其在脱细胞基质上的固着。
进一步地，所述稳定剂为乙二醇与聚乙二醇的混合物，其中，所述乙二醇在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为2wt％～8wt％，所述聚乙二醇在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为0.05wt％～2wt％，所述聚乙二醇的平均分子量为2000-8000。
同时加入上述两种，既可以增加缓释抗菌水溶液的稳定性，同时又能够提高有机缓释介质在脱细胞基质上的固着，且乙二醇和聚乙二醇中富有大量的活性羟基基团，可通过化学键的作用将抗菌成分绑定至脱细胞基质材料上。
进一步地，所述步骤S3中，所述脱细胞基质与所述缓释抗菌水溶液的体积比为1：50-150，所述缓释抗菌水溶液保持在37±2℃的温度，浸渍时间为24～48h。
也就是说，在模拟体温条件下进行，以实现有机缓释介质、抗菌剂的负载。
作为缓释抗菌水溶液的具体制备方法，例如可以如下配制：
将有机缓释介质溶解在弱酸水溶液中，使其完全溶解，此后，向其中加入稳定剂，使其完全溶解，最后，向其中加入抗菌剂，分散均匀，得到所述缓释抗菌水溶液。
步骤S4，将浸渍后的所述脱细胞基质取出，并经真空冷冻干燥和灭菌后，得到所述缓释抗菌型脱细胞基质生物材料。
也就是说，在浸渍后将其取出，并经冷冻干燥和灭菌之后，即得到缓释抗菌型脱细胞基质生物材料。
其中，在进行真空冷冻干燥之前优选进行冷冻处理，所述冷冻的温度为-80～-20℃，冷冻时间为12～24h；所述真空冷冻干燥的真空度为5～20Pa，所述真空冷冻干燥的温度为-50～-20℃且时间为1-4小时。
具体的冷冻工艺和真空冷冻干燥工艺，可以参考上述在对脱细胞之后的生物组织进行处理的工艺，在此省略其详细说明。
进一步地，所述步骤S4中，所述灭菌通过环氧乙烷和/或电离辐射进行灭菌。
另外，进灭菌处理后的所述缓释抗菌型脱细胞基质生物材料，可以保存在2～8℃医用冷藏箱内保存备用。
根据本发明实施例的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料的制备方法，由于对脱细胞基质表面通过等离子体处理进行改性，在改性的表面通过有机缓释介质做桥梁进一步负载抗菌剂，制备得到的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料，不仅抗菌剂的负载量大，且生物相容性好、稳定、释放速率可控，能够适用于感染表面，且该制备方法工艺简单。
下面，通过实施例和对比例进一步详细说明根据本发明的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料及其制备方法。
实施例1
一、制备缓释抗菌型脱细胞基质生物材料
(A)生物组织及其处理
第一步：猪膀胱基质的剥离
1)购买的新鲜猪膀胱洗净后，快速冷冻，冷冻温度-20～-40℃，冷冻时间不低于24h。
取出冷冻的猪膀胱，置于常温自来水中浸泡解冻，浸泡时间1～2小时。
然后用自来水将里外冲洗干净。
2)分离膀胱周围的脂肪和筋膜组织。
3)将橡胶导管一端沿膀胱尿道口插入，并用扎带固定，导管另一端连接水龙头，通过导管缓慢向膀胱内注水，水的体积约700～1200mL，直至膀胱完全膨胀，血管清晰。
4)用手术刀和手术钳分离出猪膀胱基质。
5)将分离得到的猪膀胱基质放入烧杯内以纯水反复漂洗3次，每次5分钟，此时若再有少量的脂肪组织出现，以剪刀和镊子锐性剔除。
由此得到的猪膀胱基质约0.2mm厚，呈半透明状，可根据需要将其切成不同形状，如切成片状(见图1中(a)所示)。
第二步：脱细胞和病毒灭活处理
脱细胞和病毒灭活工艺结合物理和化学方法，全过程均在恒温水浴振荡器内进行，水浴温度37±2℃，振荡速度120rpm，化学试剂与基质的重量比为50:1。具体地，依次按照下述步骤脱细胞和病毒灭活。
用1M的高渗盐水处理第一步中得到的猪膀胱基质，水浴振荡2h；
用0.2％Triton X-100处理猪膀胱基质，水浴振荡2h；
用0.4％NaOH处理猪膀胱基质，水浴振荡2h；
用0.1％PAA处理猪膀胱基质，水浴振荡2h；
用PBS缓冲溶液漂洗，次数3次，单次漂洗时间10min；
用无菌水清洗，清洗次数4次，单次清洗时间10min；
由此得到的猪膀胱脱细胞组织厚约2mm(吸收大量水分)，呈半透明状(见图1中(b)所示)。
第三步：真空冷冻干燥
将得到的猪膀胱基质完全展开至于平面上，于-20℃下冷冻18h；
然后，置于冻干机内，按照图2所示的冻干曲线，在真空压力为10Pa下冻干。
由此得到的脱细胞基质厚约0.3mm，呈半透明状(见1中(c)所示)，完全干燥，可4℃下冷藏保存备用。
(B)：进行等离子体处理表面改性，得到脱细胞基质
将冻干的猪膀胱基质放入等离子体清洗机内，抽真空至5Pa及以下，维持30min；
打开进气阀门，通入高纯N2和高纯O2，进气比例1:1，使真空压力上升至20Pa，并稳定5min，温度4～10℃；
调节功率至30～50W，开始辉光放电处理，时间3min。
由此，得到表面改性的脱细胞基质，与上述第三步得到的真空冷冻干燥后的猪膀胱基质在外观上基本无差异。
(C)有机缓释介质以及抗菌剂的负载
第一步：纳米氧化锌的制备
作为抗菌剂，本实施例采用尿素均匀沉淀法自制得到的纳米氧化锌。
具体地，按Zn(NO3)2·6H2O：尿素摩尔比1:4称取Zn(NO3)2·6H2O与尿素，并混合，溶于100℃去离子水中，加热回流4小时，过滤洗涤，并于100℃干燥8h，此后在500℃焙烧2h，制得纳米氧化锌。
制备得到的纳米氧化锌的扫描电镜结果如图3所示。由图3可知，所得纳米氧化锌的形貌主要由球状颗粒组成，尺寸均一且分布均匀，平均粒径为50nm。采用该自制的纳米氧化锌，有利于提高最终所得生物材料的稳定性、且抗菌效果更稳定。
第二步：缓释抗菌溶液的制备
作为有机缓释介质，使用壳聚糖，作为稳定剂，使用乙二醇以及聚乙二醇。
称取壳聚糖至0.05mol/L醋酸溶液中，浓度为3wt％，使其完全溶解.
向壳聚糖溶液中加入乙二醇(浓度为5％)和聚乙二醇(Mn:4000，浓度为1％)，使其完全溶解.
向上述溶液中加入上述第一步制备得到的纳米氧化锌，浓度为500ppm，使其完全溶解。
第三步：缓释抗菌型脱细胞基质生物材料的制备
将上述(B)得到的改性脱细胞基质完全浸渍在上述(C)制备得到的缓释抗菌水溶液中，缓释抗菌溶液与脱细胞基质的体积比为50:1。
在37±2℃下自由基聚合反应24h。
将反应后的脱细胞基质用无菌水清洗后快速冷冻，冷冻温度-20℃，冷冻时间24h.
将冷冻后的脱细胞基质再次经真空冷冻干燥处理，真空度10Pa，冻干工艺曲线与上述相同，具体参考图2。
用钴60辐照灭菌，剂量25kGy。
灭菌后的脱细胞基质4℃下冷藏，备用。
由此制得缓释抗菌型脱细胞基质生物材料。
实施例2：
参照实施例1，缓释抗菌溶液中不加入稳定剂乙二醇和聚乙二醇，其它工艺完全一致。
实施例3：
参照实施例1，缓释抗菌溶液中不加入缓释介质，其它工艺完全一致。
对比例1：
参照实施例1，脱细胞基质不经等离子体处理，其它工艺完全一致。
对比例2：
参照实施例1，脱细胞基质不经等离子体处理，缓释抗菌溶液中不加任何稳定剂和缓释介质，其它工艺完全一致。
二、生物安全性及缓释性能测试
(A)细胞毒性测试：
根据GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价第5部分体外细胞毒性试验》中附录C(MTT细胞毒性试验)进行材料细胞毒性的验证，MTT法测定细胞增值率≥100％，材料的毒性为0级。
(B)HE染色
对于实施例1中的未脱细胞处理以及脱细胞处理后的猪膀胱基质，分别进行HE染色，结果如图4所示。由图4可知，对脱细胞后的猪膀胱基质进行组织病理学检测，HE染色结果显示基质脱细胞效果好，无细胞核残留，且纤维排列整齐，脱细胞试剂未影响组织的原始网络结构。
(C)病毒灭活测试
根据《动物源性医疗器械注册技术审查指导原则》，同时依据国药监[2002]160号和国食药监注[2008]7号文件规定，选择伪狂犬病毒(PRV)、水疱性啖病毒(VSV)、脊髓灰质炎病毒(PVI)和猪细小病毒(PPV)四种病毒对上述实施例1-3得到的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料进行病毒灭活测试，测试结果显示该制备工艺去除/灭活病毒的总降低系数为8logs，且PAA处理步骤的去除/灭活病毒的降低系数为5logs，病毒灭活工艺有效。
(D)抗菌组分负载量测试：
将上述各实施例以及对比例制备得到的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料裁剪至1cm×1cm大小，置于过量的酸性Ⅰ型胶原酶溶液10mL中，使材料完全溶解，然后采用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP)测定Zn2+浓度。
其结果如图5所示。
由图5可知，相比于对比例1-2而言，进行了低温等离子体处理的实施例1-3的负载量显著增加，说明低温等离子体处理能够对脱细胞基质表面进行有效改性，提高有机缓释介质的负载量，进而提高抗菌剂的负载量。此外，使用了稳定剂、有机缓释介质的实施例1，其释放量最高，而实施例2和3得到的释放量略低，说明稳定剂和有机缓释介质对于抗菌剂的负载均有不同程度的影响。
相对于此，未进行等离子体处理的对比例1-2，其负载量均显著低于实施例1-3。其中，既未进行等离子体处理也未加入稳定剂与有机缓释介质的对比例2，负载量仅仅只有实施例1的1/5。
另外，按单位面积来换算负载量的话，则实施例3的负载量大约为2.52mg/cm2，而实施例1的负载量高达4.06mg/cm2。相比于此，尤其对比例2，其负载量仅仅为约0.80mg/cm2。
(E)抗菌组分缓释性能测试：
将上述各实施例以及对比例制备得到的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料裁剪至1cm×1cm大小，然后置于琼脂糖培养皿中，培养14天，采用ICP测定Zn2+的释放量，从而得到抗菌组分释放量随时间的变化曲关系，结果示于图6。
由图6可知，实施例1具有很好的缓释性能，不加稳定剂的实施例2的缓释性能略低于实施例1，不添加有机缓释介质的实施例3的缓释性能略低于实施例2。相比于此，添加了稳定剂以及有机缓释介质但未进行等离子体处理的的对比例1，其负载量低，释放速率较快，而既未进行等离子体处理也未添加稳定剂以及有机缓释介质的对比例2，3天即已释放90％以上，而实施例1的在经过15天后其释放量也仅仅为约55％，其缓释效果得到极大提升。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (22)

1.一种缓释抗菌型脱细胞基质生物材料，其特征在于，脱细胞基质上负载有缓释介质，且所述缓释介质连接有抗菌剂，其中，所述抗菌剂的负载量为2.5-5mg/cm2。
2.根据权利要求1所述的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料，其特征在于，所述缓释介质为水溶性或弱酸环境下可溶解的有机缓释介质，所述弱酸为醋酸、盐酸、乳酸中的一种或多种，所述弱酸的浓度为0.01-1mol/L。
3.根据权利要求2所述的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料，其特征在于，所述有机缓释介质为选自聚乙烯醇、壳聚糖、海藻酸钠、明胶中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料，其特征在于，所述抗菌剂为纳米银、可溶性银化合物、纳米氧化锌、5-氯-2-(2',4'-二氯苯氧基)苯酚、双氯苯双胍己烷、抗生素、抗菌多肽中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的缓释抗菌型脱细胞基质生物材料，其特征在于，在所述脱细胞介质的表面还负载有稳定剂，所述稳定剂包括乙二醇以及聚乙二醇。
6.一种缓释抗菌型脱细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，提供生物组织，并对所述生物组织进行脱细胞和病毒灭活处理；
步骤S2，对处理后的所述生物组织进行等离子体处理，以对所述生物组织的表面进行改性，得到脱细胞基质；
步骤S3，将所述脱细胞基质浸渍在缓释抗菌水溶液中，所述缓释抗菌水溶液中含有有机缓释介质和抗菌剂以及弱酸，所述弱酸为稀醋酸、稀盐酸或稀乳酸，浓度为0.01～1mol/L；
步骤S4，将浸渍后的所述脱细胞基质取出，并经真空冷冻干燥和灭菌后，得到所述缓释抗菌型脱细胞基质生物材料。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述生物组织为来源于哺乳动物的空腔脏器粘膜下层、组织基底膜、真皮、心包、腹膜、胸膜或羊膜。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述脱细胞通过物理法、化学法、生物法中的任一种方法进行脱细胞处理。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活处理通过病毒灭活试剂进行，所述病毒灭活试剂为过氧乙酸、75％酒精、氢氧化钠中的一种或多种。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，在进行所述等离子体处理前，还进行冷冻以及真空冷冻干燥处理，其中，所述冷冻的温度为-80～-20℃，冷冻时间为12～24h；所述真空冷冻干燥的真空度为5～20Pa，所述真空冷冻干燥的温度为-50～-20℃，时间为1-4小时。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述等离子体处理在气体环境中进行，所用气体为N2、O2、Ar、CO2中的一种或多种。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述等离子体处理时所用气体为N2和O2混合的混合气体，N2和O2的混合比为1:1。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述等离子体处理的温度为0～30℃且时间为0.5～10min，压强为5～30Pa，放电功率为20～50W。
14.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述有机缓释介质为选自聚乙烯醇、壳聚糖、海藻酸钠、明胶中的一种或多种，所述有机缓释介质在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为5wt％以下。
15.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述抗菌剂为纳米银、可溶性银化合物、纳米氧化锌、5-氯-2-(2',4'-二氯苯氧基)苯酚、双氯苯双胍己烷、抗生素、抗菌多肽中的一种或多种,所述抗菌剂在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为500ppm以下。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述纳米氧化锌采用尿素均匀沉淀法制备得到，所述纳米氧化锌为球状结构，平均粒径为20-100nm。
17.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述缓释抗菌水溶液中还含有稳定剂，所述稳定剂包括乙二醇以及聚乙二醇。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述乙二醇在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为2wt％～8wt％，所述聚乙二醇在所述缓释抗菌水溶液中的浓度为0.05wt％～2wt％，所述聚乙二醇的平均分子量为2000-8000。
19.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述脱细胞基质与所述缓释抗菌水溶液的体积比为1：50-150，所述缓释抗菌水溶液保持在37±2℃的温度，浸渍时间为24～48h。
20.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，在进行真空冷冻干燥之前进行冷冻处理，所述冷冻的温度为-80～-20℃，冷冻时间为12～24h；所述真空冷冻干燥的真空度为5～20Pa，所述真空冷冻干燥的温度为-50～-20℃且时间为1-4小时。
21.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述灭菌通过环氧乙烷和/或电离辐射进行灭菌。
22.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，进灭菌处理后的所述缓释抗菌型脱细胞基质生物材料保存在2～8℃医用冷藏箱内保存。
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