CN117205373B

CN117205373B - 一种胶原支架及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117205373B
Application number: CN202311475012.5A
Authority: CN
Inventors: 董群; 任恒飞; 戴斌; 张伟
Original assignee: Dubu Wuqi Biomedical Technology Jiangsu Co ltd
Current assignee: Dubu Wuqi Biomedical Technology Jiangsu Co ltd
Priority date: 2023-11-08
Filing date: 2023-11-08
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2043-11-08
Also published as: CN117205373A

Abstract

本发明公开了一种胶原支架及其制备方法和应用。本发明设计全新的胶原支架的制备方法，利用各步骤协同配合，对胶原支架中水凝胶的交联程度以及孔隙进行调节，获得尺寸更均一的胶原微粒，且胶原微粒表面有特殊的微观形貌，有利于细胞的黏附生长，且组织修复效果显著提升。

Description

一种胶原支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种胶原支架及其制备方法和应用。

背景技术

人体组织器官受损后，常常无法自行完全修复。例如，皮肤是人体最大的器官，也是人体的第一道防线，临床上严重皮肤损伤无法自行愈合；神经系统特别是脊髓损伤后大量的神经元和轴突丧失，并且会引起一系列病理变化，包括血管系统分解、水肿，持久炎症反应、瘢痕形成等，由于大量抑制性分子的产生和胶质瘢痕的沉积导致损伤部位形成不利于再生的微环境，从而造成神经干细胞主要分化成胶质细胞，阻断轴突再生，导致脊髓损伤治疗仍然是世界性医学难题。组织工程治疗被认为是组织器官损伤修复最具潜力的治疗手段，这其中支架材料是关键环节之一。胶原支架材料具有良好的生物相容性和生物安全性，此外，可注射胶原支架具有原位注射使用方便、可填充不规则形状、并可以负载细胞和生长因子等优势，越来越受到人们的重视。

如CN110478532A公开了一种可注射原位生孔水凝胶体系及其制备方法和用途，所述可注射原位生孔水凝胶体系以可注射水凝胶作为连续基底相，分离的活细胞和镁金属颗粒分布于连续基底相中，所述可注射水凝胶为水凝胶的前驱体或者预聚物，通过交联后可形成水凝胶，可在凝胶包载活细胞同时制孔，将水凝胶的可注射性和多孔结构良好结合，对于腔隙性、手术难操作、不规则缺损组织的修复有重要意义。

然而，可注射水凝胶在临床应用中仍存在一些挑战，包括注射材料由于生物相容性差易引起炎症反应、材料植入体内后降解速度快难以与组织再生速度匹配以及促进组织再生的能力不足等等。

综上所述，开发更接近于天然软组织微环境、能够调控细胞行为和功能的新型水凝胶材料，进而促进组织损伤修复效果，对于组织器官损伤修复治疗具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种胶原支架及其制备方法和应用，开发更接近于天然软组织微环境的新型胶原支架，提高组织损伤修复效果。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种胶原支架的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）取动物组织，切除脂肪后依次进行无水乙醇浸泡处理和正己烷浸泡处理；

（2）取步骤（1）处理后肌腱组织，使用碱溶液进行浸泡处理；所述碱溶液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液或氢氧化钙溶液中的任意一种或至少两种的组合；所述碱溶液中还含有胶原酶抑制剂，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合；

（3）取步骤（2）得到的产物，利用脱细胞溶液进行浸泡处理；

所述脱细胞溶液含有表面活性剂和胶原酶抑制剂；所述表面活性剂包括吐温、十二烷基氨基丙酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚或烷基酚聚氧乙烯醚中的任意一种或至少两种的组合；例如可以是吐温，吐温和十二烷基氨基丙酸钠的组合、十二烷基氨基丙酸钠和烷基酚聚氧乙烯醚的组合，吐温、聚乙二醇辛基苯基醚和烷基酚聚氧乙烯醚的组合等，优选为吐温和十二烷基氨基丙酸钠的组合，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合；例如可以是乙酰半胱胺酸，乙酰半胱胺酸和青霉胺的组合，甲孕酮和强力霉素的组合，乙酰半胱胺酸、依地酸二钠和甲孕酮的组合等，优选为乙酰半胱胺酸和青霉胺的组合；

（4）取步骤（3）处理后产物，超声状态下使用酶溶液浸泡；

所述酶溶液含有蛋白酶和核酸酶；

所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶溶液、中性蛋白酶溶液、1398蛋白酶溶液或组织蛋白酶中的一种或至少两种的组合；

所述核酸酶包括DNA酶和/或RNA酶；

（5）将步骤（4）处理后的体系使用醋酸溶液进行浸泡处理，进行透析，在超声状态下，再与碳酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐的混合溶液混合；

（6）将步骤（5）处理后的体系，进行冷冻干燥处理并粉碎研磨，得到所述胶原支架。

本发明中设计全新的胶原支架的制备方法，首先协同采用无水乙醇浸泡处理和正己烷浸泡处理动物组织，能够去除更多的脂肪；进行碱溶液浸泡处理，能够进一步提高化学脱脂的效率和脱细胞的效率，大大节省后续胶原支架的制备时间；超声状态下使用蛋白酶溶液浸泡，利用超声波的空化效应和机械剪切力使蛋白质分子内部的基团暴露出来，采用酶法去除杂蛋白、核酸和多糖等能引起免疫反应的物质，可以显著提高胶原蛋白提取率同时降低免疫原性，且方法温和不破坏胶原分子结构，保持胶原蛋白高活性，使制备得到的胶原支架诱导组织再生效果更好。采用醋酸溶液溶解胶原蛋白同时加入碳酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐混合进行反应，能够利用超声加快分子运动，促进快速交联，同时加入碳酸盐产生气泡，超声下气泡尺寸较小且均匀，能调控所形成胶原水凝胶孔隙，在此基础上，水凝胶冻干后再切碎研磨，能够获得小尺寸粒子（500 nm~50 μm），粒子具有特殊表面形貌，同时具有高活性、高安全性和易于注射（均匀）；最终制备得到利于细胞的黏附、增殖、分化，以及良好组织修复效果的胶原支架。

优选地，所述动物组织选自动物肌腱组织、动物肠道组织、动物皮肤组织或动物膀胱组织中的任意一种。

优选地，所述动物肌腱组织的制备方法包括：

取动物筋膜，使用水清洗，得到动物肌腱组织。

优选地，步骤（1）所述无水乙醇浸泡处理的时间为2~8 h，包括但不限于3 h、4 h、5h、6 h或7 h。

优选地，步骤（1）所述正己烷浸泡处理的时间为3~18 h，包括但不限于4、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h、12 h、15 h、16 h或17 h。

优选地，所述正己烷浸泡处理期间，每隔1~3 h更换一次正己烷。

优选地，所述正己烷浸泡处理后还包括水洗的步骤。

优选地，所述水洗的次数为8~15次（例如可以是9次、10次、11次、12次、13次或14次），每次清洗5~15 min（例如可以是6 min、7 min、8 min、9 min、12 min、13 min或14min）。

优选地，步骤（2）所述碱溶液的浓度为1~4 mol/L，包括但不限于1.2 mol/L、1.5mol/L、2 mol/L、2.5 mol/L、3 mol/L、3.5 mol/L、3.6 mol/L、3.8 mol/L或3.9 mol/L等等。

优选地，步骤（2）所述碱溶液中胶原酶抑制剂含量为0.1 wt%~1 wt%，包括但不限于0.2 wt%、0.3 wt%、0.4 wt%、0.5 wt%、0.6 wt%、0.7 wt%、0.8 wt%或0.9 wt%等等。

优选地，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，步骤（2）所述浸泡处理的温度为0~8℃，例如可以为1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃或7℃等，时间为3~10 h，4 h、5 h、6 h、7 h、8 h或9 h等。

优选地，步骤（2）所述浸泡处理后还包括水洗的步骤。

优选地，所述水洗的次数为10~18次（例如可以是11次、12次、15次、13次或17次），每次清洗5~15 min（例如可以是6 min、7 min、8 min、9 min、10 min、12 min、13 min或14min）。

优选地，步骤（3）所述脱细胞溶液中表面活性剂的浓度为0.1~5.5 wt%，包括但不限于0.2 wt%、0.3 wt%、0.5 wt%、0.8 wt%、1 wt%、1.5 wt%、2 wt%、2.5 wt%、3 wt%、3.5wt%、4 wt%、4.5 wt%、4.8 wt%、5 wt%、5.2 wt%或5.4 wt%，胶原酶抑制剂浓度为1~25 wt%，包括但不限于2 wt%、3 wt%、5 wt%、10 wt%、15 wt%、20 wt%、23 wt%或24 wt%。

优选地，步骤（3）所述浸泡处理的温度为1~15℃，例如可以是1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、10℃、12℃、13℃或14℃等，时间为4~10 h，例如可以是5 h、6 h、7 h、8 h或9h。

优选地，步骤（4）所述酶溶液含有蛋白酶和核酸酶；所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶溶液、中性蛋白酶溶液、1398蛋白酶溶液或组织蛋白酶中的一种或至少两种的组合；所述核酸酶包括DNA酶和/或RNA酶。所述酶溶液的浓度为0.1-10 wt%，例如可以是0.1w%、0.5w%、1w%、1.5w%、2w%、2.5w%、3w%、3.5w%、4w%、4.5w%、5w%、6w%、7w%、8w%、9w%、10w%等。

优选地，所述浸泡的温度为20-30℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等，所述浸泡的时间为0.5-10 h，例如可以是0.5h，1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h等。

优选地，步骤（5）所述醋酸水溶液的浓度为1%~25%(v/v)，包括但不限于2%(v/v)、5%(v/v)、8%(v/v)、10%(v/v)、13%(v/v)、15%(v/v)、20%(v/v)、22%(v/v)或25%(v/v)。

优选地，步骤（5）所述碳酸盐包括碳酸氢钠和/或碳酸氢钾。

优选地，步骤（5）所述碳酸盐的浓度为0.1~5 mol/L，包括但不限于0.2 mol/L、0.25 mol/L、0.3 mol/L、0.35 mol/L、0.4 mol/L或0.45 mol/L。

优选地，步骤（5）所述混合溶液中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）终浓度为0.5~1 mg/mL（例如可以是0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL或0.9 mg/mL等），N-羟基琥珀酰亚胺终浓度为0.25~0.5 mg/mL，包括但不限于0.26 mg/mL、0.27 mg/mL、0.28 mg/mL、0.29 mg/mL、0.3 mg/mL、0.32 mg/mL、0.35 mg/mL、0.38 mg/mL、0.4 mg/mL、0.45 mg/mL、0.48 mg/mL或0.49 mg/mL等。

优选地，步骤（5）所述浸泡处理的温度为15~30℃，例如可以是18℃、19℃、20℃或25℃等等，时间为4~10 h，例如可以是5 h、6 h、7 h、8 h或9 h；所述混合的温度为15~30℃，例如可以是18℃、19℃、20℃或25℃等等，时间为1~10 h，例如可以是2 h、3h、6 h、7 h、8 h或9 h等等。

优选地，步骤（5）所述透析的透析袋的截留分子量为10万~20万，透析外液为4~16℃的水，透析时间为5~7天，透析至透析外液的pH值达到6.8~7.2。

优选地，所述透析每天更换透析外液4~6次。

优选地，步骤（6）所述粉碎研磨后的颗粒的粒径为500 nm~50 μm。

优选地，步骤（6）还包括将粉碎研磨后的颗粒溶于溶液中的步骤，得到可注射胶原支架溶液，所述溶液包括磷酸盐缓冲液或生理盐水。

第二方面，本发明提供一种胶原支架，所述胶原支架由第一方面所述的胶原支架的制备方法制备得到。

第三方面，本发明提供第二方面所述的胶原支架在制备损伤修复产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明胶原支架的制备方法，能够保留胶原大分子结构和蛋白活性，并可以通过各步骤协同配合，制备出不同尺寸和特殊形貌的胶原粒子；

（2）本发明选择性地利用各步骤中的不同条件参数，所制得的胶原支架涵盖不同尺寸和形貌的粒子，使其能够用于引导不同组织再生；

（3）本发明制备的胶原支架，含有的胶原微粒，具有特殊的纳米结构形貌，能够调控细胞的增殖和干细胞分化，更好地引导组织生长，起到修复和再生的作用；

（4）本发明提供的方法，采用物理超声加速分子运动和促进蛋白质内部分子基团暴露，同时结合气泡的调控，使得胶原粒子表面有特殊形貌结构，去除杂质效果好，材料性质均一性显著，并显著缩短材料的制备时间，提高制备效率，也提高胶原支架的可注射性。

附图说明

图1为实施例1中胶原支架显微镜检测图；

图2为实施例1中胶原微粒扫描电镜检测图；

图3A为对比例3中胶原粒子扫描电镜检测图；

图3B为对比例3中胶原粒子局部区域的扫描电镜检测图；

图4A为对比例4中胶原粒子扫描电镜检测图；

图4B为对比例4中胶原粒子局部区域的扫描电镜检测图；

图5为测试例1中胶原支架与L929成纤维细胞共培养活/死染色图像（放大倍数10×）；

图6为实施例1、对比例3和对比例4中制备的胶原支架用于大鼠皮肤损伤修复结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。

实施例1

1、取牛筋膜，然后用去离子水清洗5次，得到牛肌腱组织；

2、取所述牛肌腱组织，先用无水乙醇浸泡5 h，然后用正己烷浸泡处理10 h（期间每隔2 h换液一次），然后用去离子水清洗10次，每次清洗10 min；

3、取完成步骤2的产物，先用浓度为1 M的KOH水溶液（含0.5 wt%的四环素）4℃浸泡处理3h，然后用去离子水清洗15次，每次清洗10 min；

4、取完成步骤3的产物于10℃下，在1 L脱细胞溶液中浸泡10 h，所述脱细胞溶液为2 wt % Tween-20、1 wt%的十二烷基氨基酸钠、5 wt%的乙酰半胱胺酸、3wt%的青霉胺的混合水溶液；

5、取完成步骤4的产物于20℃超声状态下，在1 L的酶溶液中浸泡6h；其中，所述酶溶液包括：3%的组织蛋白酶、1%的DNA酶和0.5%的RNA酶，余量为水；

6、将完成步骤5的产物，加入度为8%（v/v）醋酸水溶液，20℃浸泡10 h，然后搅拌9h；超声状态下20℃加入0.2 mol/L的NaHCO₃溶液、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-（3-二甲氨基丙基）-碳酰二亚胺盐酸盐（EDC），溶液中EDC终浓度为0.6mg/mL，NHS终浓度为0.3mg/mL，放置3 h；

7、将完成步骤6的产物装入透析袋（透析袋截留分子量为15万），透析外液为10℃去离子水，然后透析6天（每天换液5次），直至透析外液的pH值达到7.0；

8、完成步骤7后，取透析袋内的体系， -80℃下预冷冻1h，在真空（5Mpa真空度）冻干24 h，得到冻干后物质；

10、完成步骤9后，将所述冻干后物质粉碎研磨后，溶于磷酸盐缓冲液或生理盐水，得到可注射型胶原凝胶，即为制备的胶原支架。

用显微镜检测所制备胶原支架，结果如图1所示，结果表明可注射胶原支架中含有大量、尺寸均一的粒子；扫描电镜检测结果如图2所示，粒子尺寸在微米量级，粒子表面具有纳米尺度的结构形貌，适合促进细胞的黏附、增殖和分化，有利于组织的再生。

实施例2

本实施例制备胶原支架，包括以下步骤：

1、取牛筋膜，然后用去离子水清洗5次，得到牛肌腱组织；

2、取所述牛肌腱组织，先用无水乙醇浸泡2 h，然后用正己烷浸泡处理18 h（期间每隔2 h换液一次），然后用去离子水清洗8次，每次清洗15 min；

3、取完成步骤2的产物，先用浓度为4 M的KOH水溶液（含1wt%的四环素）0℃浸泡处理10 h，然后用去离子水清洗15次，每次清洗10 min；

4、取完成步骤3的产物于1℃下，在1 L脱细胞溶液中浸泡4 h，所述脱细胞溶液为5.5 wt % 烷基酚聚氧乙烯醚、0.5 wt%的四环素和0.5 wt%的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；

5、取完成步骤4的产物于30℃超声状态下，在1 L的酶溶液中浸泡12 h；其中，所述酶溶液包括：3%的组织蛋白酶、1%的DNA酶和0.5%的RNA酶，余量为水；

6、将完成步骤5的产物，加入浓度为25%（v/v）醋酸水溶液，20℃浸泡24 h，然后搅拌9 h；超声状态下加入0.1 mol/L的KHCO₃溶液、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳化二亚胺盐酸盐（EDC），溶液中EDC终浓度为0.5 mg/mL，NHS终浓度为0.25 mg/mL，放置3 h；

实施例3

本实施例制备胶原支架，包括以下步骤：

1、取牛筋膜，然后用去离子水清洗5次，得到牛肌腱组织；

2、取所述牛肌腱组织，先用无水乙醇浸泡8 h，然后用正己烷浸泡处理3 h（期间每隔2 h换液一次），然后用去离子水清洗8次，每次清洗15 min；

3、取完成步骤2的产物，先用浓度为1 M的NaOH水溶液（含0.1 wt%的四环素）8℃浸泡处理3 h，然后用去离子水清洗15次，每次清洗10 min；

4、取完成步骤3的产物于15℃下，在1 L脱细胞溶液中浸泡24 h，所述脱细胞溶液为0.1 wt% 十二烷基氨基丙酸钠、12 wt%的四环素和12 wt%的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；

5、取完成步骤4的产物于30℃超声状态下，在1 L的酶溶液中浸泡12 h；其中，所述酶溶液包括：5%的木瓜蛋白酶、3%的DNA酶和0.5%的RNA酶，余量为水；

6、将完成步骤5的产物，加入预冷的浓度为1%（v/v）醋酸水溶液，4℃浸泡24 h，然后4℃搅拌9 h；超声状态下4℃加入0.5 mol/L的KHCO₃溶液、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳化二亚胺盐酸盐（EDC），溶液中EDC终浓度为1 mg/mL，NHS终浓度为0.5 mg/mL，放置3 h；

8、完成步骤7后，取透析袋内的体系，收集沉淀；

9、完成步骤8后，取所述沉淀，-80℃下预冷冻1h，在真空（5Mpa真空度）冻干24 h，得到冻干后物质；

10、完成步骤9后，将所述冻干后物质粉碎研磨后，溶于磷酸盐缓冲液或生理盐水，得到浓度为3%（m/v）的注射型胶原凝胶，即为制备的胶原支架。

实施例4

本实施例与实施例1相比，区别仅在于将脱细胞溶液中2 wt% Tween-20和1 wt%十二烷基氨基丙酸钠替换为3 wt% Tween-20。

实施例5

本实施例与实施例1相比，区别仅在于将脱细胞溶液中2 wt% Tween-20和1 wt%十二烷基氨基丙酸钠替换为替换为3 wt% 十二烷基氨基丙酸钠。

实施例6

本实施例与实施例1相比，区别仅在于将脱细胞溶液中Tween-20替换为2 wt% 烷基酚聚氧乙烯醚。

实施例7

本实施例与实施例1相比，区别仅在于将脱细胞溶液中Tween-20和十二烷基氨基丙酸钠替换为3 wt%聚乙二醇辛基苯基醚。

实施例8

本实施例与实施例1相比，区别仅在于将脱细胞溶液中青霉胺和乙酰半胱胺酸替换为8 wt%乙酰半胱胺酸。

实施例9

本实施例与实施例1相比，区别仅在于将脱细胞溶液中青霉胺和乙酰半胱胺酸替换为8 wt%青霉胺。

实施例10

本实施例与实施例1相比，区别仅在于将脱细胞溶液中青霉胺和乙酰半胱胺酸替换为3 wt%依地酸二钠和5 wt%甲孕酮。

实施例11

本实施例与实施例1相比，区别仅在于将脱细胞溶液中青霉胺和乙酰半胱胺酸替换为3 wt%甲孕酮和5 wt%强力霉素。

对比例1

本对比例制备胶原支架，与实施例1相比，区别仅在于步骤1中将无水乙醇浸泡处理替换为等量正己烷浸泡处理。

对比例2

本对比例制备胶原支架，与实施例1相比，区别仅在于步骤1中将正己烷浸泡处理替换为等量无水乙醇浸泡处理。

对比例3

本对比例制备胶原支架，与实施例1相比，区别仅在于步骤6中将NaHCO₃溶液替换为等量的水溶液。

扫描电镜检测结果如图3所示，粒子表面无法形成实施例1制备的支架的纳米尺度的结构形貌，而是孔隙形貌。

对比例4

本对比例制备胶原支架，与实施例1相比，区别仅在于步骤6中直接正常加入NaHCO₃溶液，无超声使用。

扫描电镜检测结果如图4所示，粒子制备尺寸大，在毫米量级，且粒子表面无法形成实施例1制备的支架的纳米尺度的结构形貌，而是孔隙形貌。

测试例1

本测试例测试实施例和对比例制备的各胶原支架的细胞黏附特性。成纤维细胞是结缔组织最常见的细胞，可合成、分泌胶原纤维，塑造细胞外基质，因此在皮肤损伤的修复中起着关键作用。因此本测试中采用成纤维细胞来分析胶原支架性质变化对其影响。具体细胞与支架培养方法包括：取P1-P6代L929成纤维细胞，用移液枪吸取培养基，加入无菌PBS清洗3遍，每次5 min，随后使用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化，以消化液铺满培养皿为准，在显微镜下观察到细胞悬浮成球形之后中止消化，得到细胞悬液。再将所得的细胞悬液移入离心管中，设置参数25℃、350 rcf离心，时间为5 min。移去离心后离心管上层培养基，加入2 mL培养基重悬，取20 μL细胞悬液计数。稀释细胞悬液，最终细胞密度是5000/mL。分别取不同性质胶原支架放在48孔板中，向每个放置样品的孔中添加1 mL细胞悬液，以培养的时间（1、3、5、7天）对各孔板编号，随后转移到细胞培养箱静置培养。在第四天的时候对5、7号两个孔板进行换液。

对培养细胞进行活死染色，分析水凝胶生物相容性及对细胞影响，具体步骤如下：(1)分别在1、3、5、7天取出对应的孔板，移除培养基，用无菌D-PBS清洗三次，每次5 min；(2)每孔加入配制好的活死染色剂400 μL，常温下避光染色30 min；(3)染色完成后移除染色液，再用无菌D-PBS清洗三次，每次5 min，放在4℃避光保存，最后使用激光共聚焦显微镜观察细胞状态，表面含有特殊纳米结构的胶原支架（实施例1制备获得）的结果如图5所示，从1到7天成纤维细胞数量呈现不断增加的趋势，且死细胞很少，细胞形态完整清晰，说明L929成纤维细胞可以在本发明的胶原支架上生长和增殖。进一步地，从培养7天后成纤维数量对比结果（表1）可见，本发明制备的表面含有特殊纳米结构的胶原支架有利于细胞的增殖，而未采用本发明方法的对比例3和对比例4，无法制备出特定结构的胶原支架，而是具有孔隙形貌，细胞在其上生长和增殖效果较差。

表1

上述结果表明，本发明设计在在超声状态下将产物与碳酸盐、NHS和EDC混合，能够优化胶原支架的表面微观形貌和尺寸，有利于激活成纤维细胞胞内的信号转导，调控细胞的一系列行为和功能，促进细胞的生长、增殖。

测试例2

本测试例对各实施例和对比例制备的胶原支架中核酸含量、脂肪含量和标准胶原含量进行分析，结果如表2所示。

表2

由表1测试数据可知，由本发明制备方法制备得到的可注射胶原核酸含量在8 ng/mg以下，脂肪含量在0.4 wt%以下，标准胶原含量在97 wt%以上，无细胞毒性。此外，将实施例1与实施例4-7、8-11对比可知，表面活性剂优选为吐温和十二烷基氨基丙酸钠的组合，去脂肪和核酸效果最好；胶原蛋白酶优选为乙酰半胱胺酸和青霉胺的组合，更有利于保持胶原的活性；将实施例1与对比例1、2对比可知，仅单一使用乙醇或正己烷浸泡处理，导致去脂肪和去核酸效果差。

测试例3

本测试例测试实施例1和对比例1、2制备的各胶原支架的组织修复效果，具体方法包括：

采用8周龄的雌性SD大鼠（平均体重180g）作为实验鼠，具体的皮肤损伤模型构建步骤如下：（1）麻醉：首先采用异氟烷气体对大鼠进行麻醉；随后腹腔注射戊巴比妥钠麻醉液，待大鼠全身肌肉松弛仅保留呼吸时即麻醉完成。（2）手术：大鼠背部采用皮肤打孔器进行打孔，孔径10 mm，深度包括全层表皮和真皮，每只大鼠四孔；实验分为4组，每组5只大鼠，对照组为创伤后不进行处理，其余三组分别对应不同胶原支架，利用注射器注入等量支架材料到伤口部位，胶原支架组分别采用的是实施例1、对比例3、4制备的支架；手术完成后腹腔注射1 mL青霉素；（3）护理：手术后三天每天注射1 mL青霉素。此后不用做特殊护理；（4）皮肤损伤大鼠修复治疗14天后，进行取材并完成分析。

示例性展示修复结果如图6所示，对照组（a组）相比于另外其他支架组愈合速度最慢，而本发明实施例制备表面含有特殊纳米结构的胶原支架组（d组）表现出最快的伤口愈合速度。b组和c组分别对应对比例4和对比例3制备的胶原支架组。对修复14天后的伤口面积进行测量，分析伤口面积愈合情况。对修复后的组织取材进行Masson染色，计算胶原沉积百分比。实验结果如表3所示。可见，使用本发明特定方法制备的胶原支架，能够促进损伤部位胶原的形成，这有利于促进皮肤组织再生和增强新生组织拉伸强度，同时改善细胞外基质微环境，为受损部位的细胞提供更合适的生存环境，增强皮肤损伤修复效果。其中，含表面具有特殊纳米结构粒子的胶原支架显示出更优效果。

表3

测试例4

本测试例进行诱导神经细胞定向分化试验。

将实施例和对比例提供的胶原支架进行神经干细胞定向诱导分化测试，测试方法如下：将重悬于增殖培养基中的神经干细胞（NSC）按照6.4万细胞/cm²的密度接种在胶原支架上，12 h后，将增殖培养基置换为分化培养基，每3天换一次液，诱导分化6天后，通过细胞免疫荧光染色的方法对NSC的分化情况进行检测分析。分化培养基是以DMEM/F12为基础培养基，添加B27、丙酮酸钠、非必须氨基酸、1% FBS（Gibco）以及1 μM的全反式视黄酸（RA，Sigma）配置而成。将分化6天的NSC用PBS清洗三次后，使用4%的多聚甲醛固定，37℃，20min，使用0.8%的Triton X-100在细胞膜上打孔6分钟，并用5%的BSA 25℃封闭1 h，然后加入Tuj-1（神经元的标志性蛋白）（Sigma）的一抗，4℃过夜孵育，之后加入相应的二抗，20℃孵育40分钟，最后使用DAPI染核即可。激光共聚焦显微镜检测NSC的分化情况，检测神经元标志物（Tuj-1）在全部细胞中的比例含量，并进行统计学分析。

神经元的比例结果如表4所示。

表4

由表4可知，本发明设计特定制备方法，只有粒子表面具有特殊的纳米量级结构形貌，才能够调控神经干细胞定向向神经元分化，有利于神经损伤修复治疗中促进神经再生，该支架在神经损伤修复应用中显示出潜力。此外，表面活性剂优选为吐温和十二烷基氨基丙酸钠的组合、胶原蛋白酶优选为乙酰半胱胺酸和青霉胺的组合以及同时进行乙醇或正己烷浸泡处理，更利于神经干细胞定向向神经元分化。

综上所述，本发明设计全新的胶原支架的制备方法，利用各步骤协同配合，对胶原支架的胶原含量、交联程度以及孔隙进行调节，获得胶原支架具有优化后的特殊微观孔隙，利于细胞的黏附生长，并能调控干细胞定向分化，具备良好组织修复效果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种胶原支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（2）取步骤（1）处理后动物组织，使用碱溶液进行浸泡处理；所述碱溶液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液或氢氧化钙溶液中的任意一种或至少两种的组合；所述碱溶液中还含有胶原酶抑制剂，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合；

取步骤（2）得到的产物，利用脱细胞溶液进行浸泡处理；

所述脱细胞溶液含有表面活性剂和胶原酶抑制剂；所述表面活性剂包括吐温、十二烷基氨基丙酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚或烷基酚聚氧乙烯醚中的任意一种或至少两种的组合；所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合；

取步骤（3）处理后产物，超声状态下使用酶溶液浸泡；

所述酶溶液含有蛋白酶和核酸酶；

所述核酸酶包括DNA酶和/或RNA酶；

步骤（5）所述醋酸水溶液的浓度为1%~25%(v/v)；

步骤（5）所述碳酸盐包括碳酸氢钠和/或碳酸氢钾；

步骤（5）所述混合溶液中1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐终浓度为0.5~1 mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺终浓度为0.25~0.5 mg/mL；

步骤（5）所述透析的透析袋的截留分子量为10万~20万，透析外液为4~16℃的水，透析时间为5~7天，透析至透析液的pH值达到6.8~7.2；

2.根据权利要求1所述的胶原支架的制备方法，其特征在于，所述动物组织选自动物肌腱组织、动物肠道组织、动物皮肤组织或动物膀胱组织中的任意一种；

所述动物肌腱组织的制备方法包括：

取动物筋膜，使用水清洗，得到动物肌腱组织。

3.根据权利要求1所述的胶原支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述无水乙醇浸泡处理的时间为2~8 h；

步骤（1）所述正己烷浸泡处理的时间为3~18 h；

所述正己烷浸泡处理后还包括水洗的步骤；

所述水洗的次数为8~15次，每次清洗5~15 min。

4.根据权利要求1所述的胶原支架的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述碱溶液的浓度为1~4 mol/L；

步骤（2）所述碱溶液中胶原酶抑制剂含量为0.1 wt%~1 wt%；

步骤（2）所述浸泡处理的温度为0~8℃，时间为3~10 h；

步骤（2）所述浸泡处理后还包括水洗的步骤；

所述水洗的次数为10~18次，每次清洗5~15 min。

5.根据权利要求1所述的胶原支架的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述浸泡处理的温度为1~15℃，时间为4~10 h。

6.根据权利要求1所述的胶原支架的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述酶溶液的浓度为0.1~10 wt%；

步骤（4）所述浸泡的温度为20~30℃，所述浸泡的时间为0.5~10 h。

7.根据权利要求1-6任一项所述的胶原支架的制备方法，其特征在于，步骤（6）所述粉碎研磨后的颗粒的粒径为500 nm~50 μm；

步骤（6）还包括将粉碎研磨后的颗粒溶于溶液中的步骤，得到可注射胶原支架溶液，所述溶液包括磷酸盐缓冲液或生理盐水。

8.一种胶原支架，其特征在于，所述胶原支架由权利要求1-7任一项所述的胶原支架的制备方法制备得到。

9.权利要求8所述的胶原支架在制备组织器官损伤修复产品中的应用。