JP2016533823A - 動物脱細胞化組織マトリックス材料を製造するための方法及びその製造された組織マトリックス材料 - Google Patents

Abstract

動物脱細胞化組織マトリックス材料を製造するための方法及びその製造された組織マトリックス材料である。該方法で製造された組織マトリックス材料は、組織細胞外マトリックスの既存の基本的なステント構造を保持し、動物組織におけるヒトの免疫学的拒絶反応を引き起こす抗原を効果的に除去する。該方法で製造された動物の真皮マトリックスは、自然な真皮組織マトリックスの生物学的整合性を保持し、病変、損傷組織の修復のために使用することができる。【選択図】図４

Description

本発明は生物組織処理及び組織マトリックス材料製造技術分野に関し、具体的に動物脱細胞化組織マトリックス材料を製造するための方法及びその製造された脱細胞化組織マトリックス材料に関する。

ヒトは多くの動物組織器官の細胞外マトリックスと大きな類似性及び相同性を持つ。同種異系又は異種異系組織器官を脱細胞化して製造した生物マトリックス材料は、臨床医学においてヒトの組織修復に確実に用いられている。脱細胞化された組織器官マトリックスも幅広く各種の組織試験及び再生医学研究に適用され、例えば動物組織器官の既存細胞成分を除去し、インビトロでヒトの細胞で三次元構造を有する組織器官マトリックスを再び細胞化、機能化させ、最終的にヒトに移植可能な組織器官を製造する。

組織器官マトリックスは各種の複雑な構造タンパク質と機能タンパク質からなる三次元構造であり、且つ多くの活性を持つ他の複合物を含有する。主な成分は、コラーゲン繊維、糖タンパク質、ムチン等を含み、他の成分はグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン）等の糖類、幾つかの脂質及び成長因子を含む。良好な組織器官マトリックスは適切な生体力学的強度を有し、宿主に植え込んだ後、マトリックス材料は初期の生体力学的サポートを提供し、宿主細胞と互いに作用することにより、細胞の行為（例えば接着、移動、増殖及び分化）を調整し、宿主細胞の内殖に伴って、組織器官マトリックス自体は徐々に分解して新たな組織に転化する。

従来、世界中で、ほぼ３０種の組織器官から派生されたマトリックス材料は組織修復及び再生の各種臨床医療に適用されている。これらの製品の組織器官原料はヒト及び複数種の哺乳動物の組織からのものであり、血管、心臓弁膜、靭帯、神経、皮膚、小腸粘膜、前胃、心嚢、腹膜、腱及び膀胱等を含む。

組織器官マトリックスを製造するためのプロセスは非常に複雑であり、組織器官の収集、保存、洗浄、消毒、脱細胞化、抗原性の低下、ウイルス不活化及び端末滅菌等の過程を含む。従来の組織器官マトリックスを製造するための方法は複数種あり、脱細胞化の作用原理に応じて物理、化学、酵素学等の方法に分けられる。最も一般的に使用されている脱細胞化方法は物理処理及び化学処理を結合した方法である。撹拌又は超音波、機械マッサージ又は加圧、凍結及び解凍で細胞膜を破壊し、細胞成分を放出し、後の化学洗浄剤による脱細胞化洗浄に利便性を与えることを含む。物理的方法自体は、一般的に完全な脱細胞化を実現するのに十分ではない。酵素学処理方法、例えば幾つかのトリプシンは、組織細胞外マトリックスの緊張の度合いを調整し、細胞表面と組織細胞外マトリックスの接触を切断することができる。異なるプロセス及び方法に応じて、細胞除去効率及び組織器官マトリックスへの影響又は損害も異なる。組織器官の収集、保存、洗浄、消毒及び脱細胞化処理プロセスは、方法自体が組織器官マトリックスに損害を直接にもたらすとともに、後の加工過程にも影響を与える。各項の処理は異なる程度に影響を与えて組織器官マトリックスの生化学的組成、三次元構造の超微細構造及び生物力学的特性を変化させ、これらの変化は、宿主の植え込んだマトリックス材料に対する反応に影響を与える。臨床前動物試験及びヒト臨床応用証拠から分かるように、各種の組織器官マトリックス製品同士は、組織修復及び再生性能の面で差が大きく、製造過程での組織器官マトリックス特性の変化は各種製品の臨床効果の差をもたらす主な要因の一つである。

本発明は従来技術に存在する上記欠陥に対して、動物脱細胞化組織マトリックス材料を製造するための方法を提供する。

該方法は、
動物組織原料を収集し、血液及び他の汚れを洗浄し、長さ、幅及び高さが所望のサイズである組織材料に切断し、低温保存するステップ１、
緩慢解凍し、ゲンタマイシンを含有する生理食塩水で再水和するステップ２、
組織材料を中程度の塩基性溶液で消毒滅菌し、滅菌精製水ですすぎ、ｐＨを中性に調整するステップ３、
脱細胞化し、洗浄するステップ４、
動物組織のＤＮＡ成分を分解し、生理食塩水ですすぐステップ５、
動物組織α−Ｇａｌ抗原を分解し、高濃度塩化ナトリウム溶液ですすぎ、生理食塩水ですすぐステップ６、
ウイルスを不活化し、リン酸緩衝液ですすぐステップ７、
無菌袋詰め、密封するステップ８、
端末滅菌処理を行うステップ９、を含む。

該方法では、酵素学方法で細胞成分を除去し、α−Ｇａｌ抗原を除去してステントの柔軟性を向上させる。

本発明の実施形態では、ステップ１における動物組織原料は、皮膚、真皮、動脈、静脈、胃、軟骨、半月板、小腸、大腸、横隔膜、腱、靭帯、神経組織、膀胱、尿道及び尿管から選ばれる。

本発明の好適な実施形態では、ステップ１における血液及び他の汚れの洗浄は、純水を採用し、物理的方法又は超音波で洗浄を行う。

組織マトリックス材料を製造するプロセス方法では、豚の真皮原料の低温保存のステップに係り、降温及び昇温の速度が非常に重要なパラメータである。降温昇温の速度が速すぎる又は組織間に均一ではないと、組織局所領域に小さな亀裂が発生する恐れがあり、使用する際に組織マトリックスが容易に裂ける。

本発明の実施形態では、ステップ１における組織材料は、好ましくは、１．０摂氏度／分以下である平均速度で−４０摂氏度以下に降温して保存し、より好ましくは、降温速度が０．５摂氏度／分である。ステップ２における低温保存される組織材料は５〜１２摂氏度の環境下で緩慢解凍し、昇温が速すぎることによる組織亀裂の発生を回避する。氷が全部に溶化した後、ステップ２における融解された組織材料を１リットルあたりにゲンタマイシンが１００ミリグラム含まれる生理食塩水に３〜６時間再水和する。

本発明の好適な実施形態では、ステップ１における低温保存が長期保存であり、その方法は、豚の真皮材料を、面積がやや大きい綿のガーゼ、紙、プラスチックフィルム、ナイロンネット又は他の布織物の保護層に平らに置き、真皮と前記保護層を多層同心巻に巻き、又は真皮と保護層が交替する多層包装形態を形成し、ビニール袋に入れ、密封後、−８０又は−４０摂氏度の冷凍庫に入れて保存する。

本発明の製造方法では、豚の真皮原料の初期消毒滅菌に係る。従来の方法は、次亜塩素酸ナトリウム、過酢酸、オキシドール、ヨウ素溶液及び高濃度水酸化ナトリウム（ｐＨが１３以上）を使用することを含む。これらの溶液で処理した後、組織マトリックスは異なる程度に破壊され、特に水酸化ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム及びヨウ素溶液からの影響がより大きい。

従来の方法の原料消毒及び滅菌技術と違って、本発明の実施形態では、ステップ３に記載の中程度の塩基性溶液はｐＨが１０．５〜１１．５である炭酸水素ナトリウム又は水酸化ナトリウム又は濃度が０．１％である水酸化アンモニア溶液であり、前記消毒滅菌方法は再水和後の組織材料を前記中程度の塩基性溶液に浸漬し、ゆっくり揺れて２４〜４８時間浸漬し、組織マトリックスの損害を回避する。

本発明の実施形態では、ステップ４に記載の脱細胞化方法は、消毒滅菌してすすいだ後の組織材料を、濃度が２．０ミリモルである塩化カルシウム、濃度が２．０ミリモルである塩化マグネシウム及びゲンタマイシンが１００ミリグラム／リットルの生理食塩水において、室温で先に１〜３時間すすぎ、次にディスパーゼ溶液を加えて細胞を溶離する。

好適な実施形態では、前記ディスパーゼ溶液は中性ディスパーゼ溶液であり、１リットルあたりに１〜２０ミリモルの塩化カルシウム、１〜２０ミリモルの塩化マグネシウム及び５０〜４００単位のディスパーゼが含有され、前記ディスパーゼ溶液で細胞を溶離する方法は、組織材料を前記ディスパーゼ溶液に浸漬し、３７摂氏度でゆっくり揺れて２４〜３６時間浸漬することである。好ましくは、１リットルあたりの中性ディスパーゼ溶液に２．０ミリモルの塩化カルシウム、２．０ミリモルの塩化マグネシウム及び１００〜２００単位のディスパーゼが含有される。

本発明の好適な実施形態では、ステップ４において脱細胞化を完了した後、洗浄ステップを行う。前記洗浄は第１の洗浄剤による洗浄及び第２の洗浄剤による洗浄を含み、前記第１の洗浄剤溶液はヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝溶液（ｐＨが７．０〜８．０である）に溶解された０．５％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルであり、洗浄方法は組織材料を第１の洗浄剤溶液に浸漬し、３７摂氏度でゆっくり揺れて１２〜１８時間浸漬することである。前記第２の洗浄剤溶液はリン酸緩衝溶液（ｐＨが７．２〜７．８である）に溶解された１．０％のデオキシコール酸ナトリウム溶液であり、洗浄方法は組織材料を第２の洗浄剤溶液に浸漬し、室温でゆっくり揺れて２４〜３６時間浸漬することである。同時に、本発明は他の適切な洗浄剤、例えばTween 20、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール及び３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸等を採用してもよい。

本発明の実施形態では、第１の洗浄剤及び第２の洗浄剤に浸漬した後、ステップ５を行う前に、２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝溶液（ｐＨが７．０〜８．０の間である）を採用して、室温で３回すすぎ、毎回２〜４時間である。

動物組織ＤＮＡが存在するため、組織マトリックスをヒトに植え込んだ後、炎症反応を起こしやすい。ヒト及びオナガザル科の以外、他の哺乳動物の体内にいずれもα−１，３−ガラクトース残基［Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌ］の二糖末端の糖タンパク質又は糖エステルからなるα−Ｇａｌ抗原が含有される。豚組織におけるα−Ｇａｌ抗原は免疫学的拒絶反応を起こす。炎症反応及び拒絶反応を解消又は克服する方法の１つは特異性酵素処理で動物組織マトリックスにおけるＤＮＡ及びα−Ｇａｌ抗原を除去することである。

本発明の実施形態では、ステップ５に記載の、動物組織のＤＮＡ成分を分解することは、デオキシリボヌクレアーゼ溶液を加えることで完了され、前記デオキシリボヌクレアーゼ溶液の処方は１００ｍＭ／リットルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨが７．２である）に濃度が２．０ミリモルである塩化カルシウム、濃度が２．０ミリモルである塩化マグネシウム及び５０００酵素単位のデオキシリボヌクレアーゼを加えることであり、動物組織ＤＮＡを分解除去する方法は、組織材料を前記デオキシリボヌクレアーゼ溶液に浸漬し、３７摂氏度でゆっくり揺れて１８〜２８時間処理し、次に生理食塩水に入れて室温で２回すすぎ、毎回１〜３時間であることである。

本発明の実施形態では、ステップ６に記載の、動物組織α−Ｇａｌ抗原を分解することは、α−ガラクトシダーゼ溶液を加えることにより完了されたものであり、前記α−ガラクトシダーゼ溶液の処方は、１０ｍＭ／リットルのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝溶液（ｐＨが７．０〜８．０の間である）に２．０ｍＭの塩化カルシウム、２．０ｍＭの塩化マグネシウム及び４００ＧＡＬＵ単位のα−ガラクトシダーゼを加えることであり、動物組織α−Ｇａｌ抗原を分解する方法は、組織材料を前記α−ガラクトシダーゼ溶液に浸漬し、３７摂氏度でゆっくり揺れて２４〜３６時間洗浄する。

ヒトに移植可能な組織マトリックスを製造する場合、各種酵素の残存を除去する必要がある。上記目的を達するために、本発明の実施形態では、塩析法で洗浄を行い、ステップ６に記載の高濃度塩化ナトリウム溶液は２〜５％の塩化ナトリウム溶液であり、すすぐ方法は組織材料を前記塩化ナトリウム溶液に浸漬し、室温で２回洗浄し、毎回２〜４時間であることである。より好適な実施形態では、高濃度塩化ナトリウム溶液は３％の塩化ナトリウム溶液が好ましい。また、塩化ナトリウム溶液は他の中性塩溶液、例えば塩化カリウム、塩化マグネシウム及び塩化リチウム等で代替してもよい。

製品の安全性を更に向上させるために、本発明の好適な実施形態では、ウイルス不活化処理に更に係り、ステップ（７）に記載のウイルス不活性化試薬はオキシドール及び過酢酸であり、方法は、組織材料を０．０１〜０．１０％のオキシドール、０．０５〜０．５０％の酢酸及び０．０５〜０．５０％の過酢酸が含有される溶液に浸漬し、室温でゆっくり揺れて２〜３時間洗浄することである。より好適な実施形態では、 ０．０２％のオキシドール、０．１５％の酢酸及び０．１０％の過酢酸を含有する溶液でウイルスを不活化し、２〜３時間でウイルスの数を１０の６乗以上減少することができる。オキシドール、酢酸及び過酢酸の濃度は細菌の数に応じて変化し、増加又は減少することができる。

本発明の実施形態では、ステップ７においてウイルスを不活化した後、室温で、中性リン酸緩衝液で３回すすぎ、毎回２〜４時間であり、オキシドール、酢酸及び過酢酸の残存を除去する。

組織製品の端末滅菌処理は、常に組織材料への破壊が最も大きいステップの１つである。従って、本発明の実施形態では、ステップ９では低温放射で処理を行う。本発明の好適な実施形態では、−４０摂氏度の条件で、１０〜５０ｋＧｙのガンマ線で製品の端末滅菌処理を行い、組織材料への破壊を大幅に減少させる。好適な実施形態では、放射線量は組織マトリックスにおける細菌の数に応じて変化し、増加又は減少する。より好適な実施形態では、２０〜３０ｋＧｙのガンマ線で製品の端末滅菌処理を行う。

代替の実施形態では、放射による端末滅菌方法の以外、本発明は組織マトリックスを凍結乾燥し、エチレンオキシド気体で滅菌を行うこともできる。

本発明の好適な実施形態では、ステップ４（酵素による脱細胞化）、ステップ５（酵素によるＤＮＡ分解）及びステップ６（酵素によるα−１，３−ガラクトース残基抗原の分解）の順序は実際の必要に応じて調整して変更することができる。例えば、まずα−１，３−ガラクトース残基抗原を分解し、次に動物ＤＮＡ成分を脱細胞化して分解してよく、又はまず動物ＤＮＡを分解し、続いて抗原を分解し、最終的に脱細胞化処理を行ってもよい。

また、代替の実施形態では、遺伝子工学で改良されたα−Ｇａｌ抗原なしの動物を選択した場合、デオキシリボヌクレアーゼを使用すればよい。同時に、細胞外マトリックスのタンパク質加水分解への悪作用を減少させるために、処理する場合、ディスパーゼの濃度、温度及び時間をモニタリングして最適化させる。プロセスでは、特定の酵素抑制剤、例えばエチレンジアミン四酢酸を加えてもよく、それによってディスパーゼの活性を抑制する。

本発明は更に、本発明の上記方法で製造された動物脱細胞化組織マトリックス材料に関し、採用された動物真皮原料は基底膜を持つ真皮を含んでよく、基底膜を除去した真皮を含んでもよい。

本発明に係る脱細胞化組織マトリックス材料を製造するための方法では、一連の動物皮膚組織処理及び組織器官マトリックス製造のステップ及び複数の生物化学溶液及び処方に関する。前記ステップ及び溶液で製造された真皮組織マトリックス材料は、組織細胞外マトリックスの既存の基本的なステント構造、主な生物化学成分及び生体力学的強度を保持し、動物組織におけるヒトの免疫学的拒絶反応を引き起こす抗原を効果的に除去し、組織マトリックスの柔軟性、ドレープ性及び創傷面整合性を改良し、製造された動物真皮マトリックスはヒトの皮膚に類似し、組織マトリックスにおけるコラーゲン及び他のタンパク質の架橋、分解又は変性を起こすことなく、脱細胞化された組織真皮は自然な真皮組織マトリックスの生物学的整合性を保持する。

図１は組織スライスの分析図である。 Ａは新鮮な豚の真皮のＨＥ染色スライスである。 Ｂは処理後の真皮マトリックスのＨＥ染色スライスである。 Ｃは新鮮な豚の真皮α−１，３ガラクトース残基抗原免疫化学的染色スライスである。 Ｄは処理後の真皮マトリックスα−１，３ガラクトース残基抗原免疫化学的染色スライスである。 図２は組織スライスの分析図である。 Ａ、Ｂ、ＣはＩ型コラーゲン免疫化学的染色スライスである。 Ｄ、Ｅ、ＦはＩＩＩ型コラーゲン免疫化学的染色スライスである。 Ａ、Ｄはネガティブ染色である。 Ｂ、Ｅは未処理の新鮮な豚の真皮ポジティブ染色である。 Ｃ、Ｆは処理後の組織真皮マトリックスである。 図３は脱細胞化組織マトリックスを端末ガンマ線の放射で滅菌した後、抗コラゲナーゼ加水分解の特性図である。 図４は脱細胞化組織マトリックスをラット皮下に植え込んだ２週間後、宿主細胞が成長して入り新血管が形成したＨＥ染色図である。

以下、実施例を参照しながら本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定するためのものではない。なお、当業者にとって、本発明の趣旨から逸脱しない場合、いくつかの改良及び修飾を行うことができ、これらの改良及び修飾はいずれも本発明の保護範囲に属すべきである。

実施例１：動物脱細胞化組織マトリックス材料の製造及び性能検出
１、製造
（１）組織器官の収集及び保存
屠殺されたばかりの豚の体から新鮮な豚皮を収集し、４摂氏度の冷蔵庫に一時保存する。機械で脱毛した後、豚皮から厚さが約１．０ミリメートルである真皮を取り、マイナス２０摂氏度で凍結保存する。

（２）脱細胞化
真皮を解凍した後、まず生理食塩水で２回洗浄し、毎回が３０分間である。洗浄後の豚の真皮を１リットルあたりに１００ミリグラムのゲンタマイシンが含有される塩水溶液に浸漬し、溶液に濃度が２．０ミリモルである塩化カルシウム、濃度が２．０ミリモルである塩化マグネシウム及び１リットルあたりに１５０単位である中性ディスパーゼを更に加え、３７摂氏度で２４時間処理する。

（３）洗浄
ゲンタマイシンで浸漬した後、０．５％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル溶液で真皮を１６時間洗浄する。脱細胞化して洗浄した後、まず生理食塩水で２回洗浄し、毎回が１２０分間である。

（４）ＤＮＡの分解及びα−１，３ガラクトース残基抗原の除去
１リットルあたりの溶液に濃度が２．０ミリモルである塩化カルシウム、濃度が２．０ミリモルである塩化マグネシウム、５０００単位のデオキシリボヌクレアーゼ及び２粒のグラクソスミスクライン製ビーノ（α−ガラクトシダーゼを含む）を更に加え、室温で２０時間処理する。

（５）ウイルスの不活化
洗浄後、０．０２％のオキシドール、０．１５％の酢酸及び０．１０％の過酢酸を含有する溶液で殺菌及びウイルス不活化を２時間行う。

（６）洗浄及び保存
最終的に滅菌生理食塩水でポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル及び酵素の残存がなくなるまで洗浄する。処理済みの真皮マトリックスを６％のグリセリン溶液に一時保存する。

２、性能検出
測定した結果、材料の引っ張り強度が１５．０±３．６メガパスカル（Ｎ＝２４）であり、縫合糸強度が５６±１３ニュートン（Ｎ＝２４）であり、湿重量１００グラムあたりの真皮マトリックスに２４．２±２．９グラムの真皮の乾燥材料（Ｎ＝１５）が含有される。示差走査熱量計の分析により、組織マトリックス材料の最初の変性温度が５８．０±０．４摂氏度（Ｎ＝５）であり、エンタルピー値が乾燥重量１グラムあたり６１．６±２．１ジュール（Ｎ＝５）であり、真皮原料における自然な状態の真皮マトリックスと明らかな差がなく、プロセス全体の真皮マトリックスの特性への明らかな変化及び損害がない。組織スライスを分析した結果は、具体的に図１に示すように、細胞成分（例えばデオキシリボ核酸ＤＮＡ）及びマトリックスにおけるα−１，３ガラクトース残基抗原を完全に除去したことを示した。Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲン免疫化学的染色分析の結果は、具体的に図２に示すように、処理プロセスの真皮マトリックスにおけるコラーゲンへの損害がないことも示した。

実施例２：真皮の洗浄及び消毒の適切な条件の確定
豚の体から新鮮な真皮を収集し、新鮮な豚の真皮をそれぞれ３７摂氏度でｐＨが１０．６、１１．５及び１１．８である水酸化ナトリウム溶液において処理する。１キログラムあたりの豚皮に対して４リットルの水酸化ナトリウム溶液を使用し、リン酸緩衝液を対照とする。２４時間後、１ミリリットルあたりの溶液でのコロニー形成単位を測定する。リン酸緩衝液には１０．３±１．３対数コロニー形成単位（ＬｏｇＣＦＵ）（Ｎ＝３）が含有され、ｐＨが１０．６、１１．５及び１１．８である溶液において、対数コロニー形成単位はそれぞれ２．１±０．１、０及び０である。以上から分かるように、中程度の塩基性溶液の消毒及び殺菌作用は著しい。示差走査熱量計で分析した結果は、ｐＨが１１．５以上であると、組織マトリックスを損傷し、組織マトリックスにおけるタンパク質の安定性が著しく低下することを示した。高ｐＨの組織マトリックスへの損傷は、組織マトリックスの不可逆的な吸水膨潤及び硬化にも反映される。本実施例は、真皮の洗浄及び消毒の適切な条件がｐＨを１０．５〜１１．５の間に調整することであると確定した。

実施例３：動物脱細胞化組織マトリックス材料の製造及び性能検出
１、製造
（１）組織器官の収集及び保存
屠殺されたばかりの豚の体から新鮮な豚皮を収集し、４摂氏度の冷蔵庫に一時保存する。機械で脱毛した後、豚皮から厚さが約１．０ミリメートルである真皮を取る。

（２）収集及び洗浄
厚さが１．０ミリメートルである豚の真皮を収集して洗浄した後（実施例１を参照）、マイナス８０摂氏度の冷凍庫に一時貯蔵する。

（３）脱細胞化
解凍後、５ｍＭのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸溶液（ｐＨが７．４である）で洗浄し、２．０ｍＭの塩化カルシウム及び０．２単位／ミリリットルの中性ディスパーゼを加えた後、３７摂氏度で１８時間処理する。

（４）洗浄
１．０％のデオキシコール酸ナトリウム溶液で、３７摂氏度で２０時間洗浄する。

（５）ＤＮＡ及びα−１，３ガラクトース残基抗原の分解
滅菌生理食塩水で１２０分間洗浄した後、１リットルあたりの溶液に２．０ｍＭの塩化カルシウム及び２．０ｍＭの塩化マグネシウム、４０００単位の組換えデオキシリボヌクレアーゼ及び２００ＧＡＬＵ単位のグリーンコーヒー豆の種子から抽出されたα−ガラクトシダーゼを更に加え、３７摂氏度で２４時間処理する。

（６）ウイルスの不活化
滅菌生理食塩水で洗浄した後、０．０５％のオキシドール、０．３０％の酢酸及び０．２０％の過酢酸で２時間殺菌する。

（７）洗浄
滅菌生理食塩水でデオキシコール酸ナトリウム、組換えデオキシリボヌクレアーゼ及びα−ガラクトシダーゼの残存がなくなるまで洗浄する。

（８）端末滅菌処理
処理済みの真皮マトリックスを１２％のグリセリンを含有する滅菌生理食塩水溶液に保存し、２５ｋＧｙのガンマ線で滅菌する。

２、性能検出
ＯＯ型プローブ付きの硬さ計で測定した結果は、未処理の豚の真皮の柔軟度が４０±８．６（Ｎ＝２４）であり、脱細胞化された豚の真皮の柔軟度が１３．０±４．０（Ｎ＝２５）であり、ヒトの真皮の柔軟度が１４．２±６．１（Ｎ＝４０）であることを示した。未処理の豚の真皮（遥かに硬い）に対して、脱細胞化処理済みの豚の真皮マトリックスの柔軟度とヒトの真皮組織は統計上で明らかな差がないことを示した。本発明の方法が組織マトリックスの柔軟性、ドレープ性及び創傷面整合性を改良したことを示した。

組織スライスを分析した結果により、製造された組織マトリックスにおけるα−１，３ガラクトース残基抗原を完全に除去し、陰性に染色し、抗原の表現がない。ＱｕａｎｔｉＴ−ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光染料法でＤＮＡ含有量を測定し、その結果は、１グラムあたりの新鮮な豚の真皮が約８４．０±１０．２マイクログラムのＤＮＡ（Ｎ＝３）を含有し、洗浄消毒後の１グラムあたりの豚の真皮が６２．９±９．５マイクログラムのＤＮＡ（Ｎ＝３）を含有し、脱細胞化処理及び洗浄後の１グラムあたりの組織マトリックスが１．９±１．１マイクログラムのＤＮＡ（Ｎ＝３）のみを含有し、動物ＤＮＡの含有量が平均で９７．７％減少したことを示した。示差走査熱量計で分析した結果は、組織マトリックス材料の最初の変性温度が５４．７±０．２摂氏度（Ｎ＝３）であり、エンタルピー値が乾燥重量１グラムあたり５９．５±３．１ジュール（Ｎ＝３）であることを示した。豚の真皮原料における自然な状態の真皮に比べて、最初の変性温度が３．３摂氏度のみ低下し、エンタルピー値の著しい差がなく、これは、製造過程全体（端末ガンマ線の放射による滅菌を含む）の組織マトリックスの特性への明らかな変化及び損害がないことを示した。

ヒドロキシプロリン法で組織マトリックスにおけるコラーゲンの含有量を測定し、端末ガンマ線の放射で滅菌された後の豚皮組織マトリックスは９１．０±３．０％（Ｎ＝６）のコラーゲンを含有する。Ｆａｓｔｉｎ染色法で弾性タンパク質の含有量を測定し、端末ガンマ線の放射で滅菌された後の組織マトリックスは０．９２±０．２１％（Ｎ＝６）の弾性タンパク質を含有し、未処理の豚の真皮材料に比べて、７１．４％低下した。

脱細胞化組織マトリックスの抗コラゲナーゼ加水分解の特性は、端末ガンマ線の放射で滅菌された後、本発明で製造された脱細胞化組織マトリックスにおけるコラーゲンの安定性を研究することに用いられる。製造された脱細胞化組織マトリックスを１ミリリットルあたりに５個のコラゲナーゼ単位が含まれるトリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン−塩酸溶液（１０ｍＭ、ｐＨが７．５である）に入れて、３７摂氏度で６４時間まで培養する。その結果は、具体的に図３に示すように、未処理の豚の真皮材料に比べて、本発明の方法で製造された脱細胞化組織マトリックスが端末ガンマ線の放射で滅菌された後、抗コラゲナーゼ加水分解の性能が変更していないことを示した。

本発明の方法で製造された脱細胞化組織マトリックスの再細胞化特性により、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｌｅｗｉｓ）を使用して動物評価実験を行った。ラット（（８匹）を麻酔した後、電気はさみで背中の毛を剃り、７０％のアルコールで手術部位を清拭し、背中の上下及び左右に単独の切開を行い、小さなポケットを形成し、その大きさが１×１センチのサンプル（〜１ミリメートルの厚さ）を収容すればよい。組織マトリックスサンプルを皮下に植え込む。手術後、ラットが痛みの症状を示す場合、ブプレノルフィン（０．０５ミリグラム／キログラム）で鎮痛する。２週間後ラットを致死させ、植え込んだ組織マトリックス材料を取り出し、１０％の中性ホルマリン溶液で固定する。組織スライス法を用いてラット宿主細胞の侵入及び血管成長を観察する。その結果、具体的に図４に示すように、２週間内に大量の宿主細胞が成長して組織マトリックス材料に侵入し、且つ新しい血管が生成し、有害反応が観察されなかった。

本発明は生物組織処理及び組織マトリックス材料製造技術分野に関するがこれに限られず、具体的に動物脱細胞化組織マトリックス材料を製造するための方法及びその製造された脱細胞化組織マトリックス材料に関するがこれに限られない。

ヒトは多くの動物組織器官の細胞外マトリックスと大きな類似性及び相同性を持つ。同種異系又は異種異系組織器官を脱細胞化して製造した生物マトリックス材料は、臨床医学においてヒトの組織修復に確実に用いられている。脱細胞化された組織器官マトリックスも幅広く各種の組織試験及び再生医学研究に適用され、例えば動物組織器官の既存細胞成分を除去し、インビトロでヒトの細胞で三次元構造を有する組織器官マトリックスを再び細胞化、機能化させ、最終的にヒトに移植可能な組織器官を製造する。

組織器官マトリックスは各種の複雑な構造タンパク質と機能タンパク質からなる三次元構造であり、且つ多くの活性を持つ他の複合物を含有する。主な成分は、コラーゲン繊維、糖タンパク質、ムチン等を含み、他の成分はグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン）等の糖類、幾つかの脂質及び成長因子を含む。良好な組織器官マトリックスは適切な生体力学的強度を有し、宿主に植え込んだ後、マトリックス材料は初期の生体力学的サポートを提供し、宿主細胞と互いに作用することにより、細胞の行為（例えば接着、移動、増殖及び分化）を調整し、宿主細胞の内殖に伴って、組織器官マトリックス自体は徐々に分解して新たな組織に転化する。

従来、世界中で、ほぼ３０種の組織器官から派生されたマトリックス材料は組織修復及び再生の各種臨床医療に適用されている。これらの製品の組織器官原料はヒト及び複数種の哺乳動物の組織からのものであり、血管、心臓弁膜、靭帯、神経、皮膚、小腸粘膜、前胃、心嚢、腹膜、腱及び膀胱等を含む。

組織器官マトリックスを製造するためのプロセスは非常に複雑であり、組織器官の収集、保存、洗浄、消毒、脱細胞化、抗原性の低下、ウイルス不活化及び端末滅菌等の過程を含む。従来の組織器官マトリックスを製造するための方法は複数種あり、脱細胞化の作用原理に応じて物理、化学、酵素学等の方法に分けられる。最も一般的に使用されている脱細胞化方法は物理処理及び化学処理を結合した方法である。撹拌又は超音波、機械マッサージ又は加圧、凍結及び解凍で細胞膜を破壊し、細胞成分を放出し、後の化学洗浄剤による脱細胞化洗浄に利便性を与えることを含む。物理的方法自体は、一般的に完全な脱細胞化を実現するのに十分ではない。酵素学処理方法、例えば幾つかのトリプシンは、組織細胞外マトリックスの緊張の度合いを調整し、細胞表面と組織細胞外マトリックスの接触を切断することができる。異なるプロセス及び方法に応じて、細胞除去効率及び組織器官マトリックスへの影響又は損害も異なる。組織器官の収集、保存、洗浄、消毒及び脱細胞化処理プロセスは、方法自体が組織器官マトリックスに損害を直接にもたらすとともに、後の加工過程にも影響を与える。各項の処理は異なる程度に影響を与えて組織器官マトリックスの生化学的組成、三次元構造の超微細構造及び生物力学的特性を変化させ、これらの変化は、宿主の植え込んだマトリックス材料に対する反応に影響を与える。臨床前動物試験及びヒト臨床応用証拠から分かるように、各種の組織器官マトリックス製品同士は、組織修復及び再生性能の面で差が大きく、製造過程での組織器官マトリックス特性の変化は各種製品の臨床効果の差をもたらす主な要因の一つである。

本発明は動物脱細胞化組織マトリックス材料を製造するための方法を提供する。

前記方法は、
動物組織原料を収集し、血液及び汚れを洗浄し、長さ、幅及び高さが所望のサイズである組織材料に切断し、低温保存するステップ（１）、
組織材料を解凍し、再水和する、例えば生理食塩水又はゲンタマイシンを含む生理食塩水又はその他の代替できる溶液で再水和するステップ（２）、
前記組織材料を中程度の塩基性溶液で消毒滅菌し、滅菌精製水ですすぎ、ｐＨを中性に調整するステップ（３）、
組織材料を脱細胞化し、洗浄するステップ（４）、
動物組織のＤＮＡ成分を分解し、生理食塩水ですすぐステップ（５）、
任意に、動物組織α−Ｇａｌ抗原を分解し、高濃度塩化ナトリウム溶液ですすぎ、生理食塩水ですすぐステップ（６）、
組織材料におけるウイルスを不活化し、すすぐ、例えばリン酸緩衝溶液又は生理食塩水ですすぐステップ（７）、
任意に、前記組織材料を無菌袋詰め、密封するステップ（８）、
任意に、前記組織材料を端末滅菌処理を行って、動物脱細胞化組織マトリックス材料を得るステップ（９）、を含む。

該方法では、酵素学方法で細胞成分を除去し、α−Ｇａｌ抗原を除去してステントの柔軟性を向上させる。

本発明の実施形態では、ステップ（１）における動物組織原料は、皮膚、真皮、動脈、静脈、胃、軟骨、半月板、小腸、大腸、横隔膜、腱、靭帯、神経組織、膀胱、尿道及び尿管の中のいずれかの一種又は複数種から選ばれる。

本発明の実施形態では、ステップ（１）における血液及び汚れの洗浄は、純水を採用し、物理的方法又は超音波で洗浄を行う。

動物脱細胞化組織マトリックス材料を製造するプロセス方法では、組織原料の低温保存のステップに係り、降温及び昇温の速度が非常に重要なパラメータである。降温昇温の速度が速すぎる又は組織間に均一ではないと、組織局所領域に小さな亀裂が発生する恐れがあり、使用する際に組織マトリックスが容易に裂ける。

本発明の実施形態では、ステップ(１)における組織材料は、１．０摂氏度／分以下である平均速度で−４０摂氏度以下に降温して保存し、任意に、降温の平均速度が０．５摂氏度／分である。ステップ（２）における低温保存される組織材料は５摂氏度〜１２摂氏度の環境下で緩慢解凍し、昇温が速すぎることによる組織マトリックスの亀裂の発生を回避する。完全に解凍された後、ステップ（２）における融解された組織材料を１リットルあたりにゲンタマイシンが１００ミリグラム含まれる生理食塩水に３時間〜６時間再水和する。

本発明の好適な実施形態では、ステップ（１）における低温保存が長期保存であり、その方法は、組織材料を、前記組織材料より面積が大きい綿のガーゼ、紙、プラスチックフィルム、ナイロンネット又は他の布織物の保護層に平らに置き、前記組織材料と前記保護層を多層巻に巻き、又は組織材料と保護層が交替する多層包装形態を形成し、袋に入れ、密封後、−８０摂氏度又は−４０摂氏度の冷凍庫に入れて保存する。

本発明実施形態の製造方法では、組織材料の初期消毒滅菌に係る。従来の方法は、次亜塩素酸ナトリウム、過酢酸、オキシドール、ヨウ素溶液及び高濃度水酸化ナトリウム（ｐＨが１３以上）を使用することを含む。これらの溶液で処理した後、組織マトリックスは異なる程度に破壊され、特に水酸化ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム及びヨウ素溶液からの影響がより大きい。

従来の方法の組織材料消毒及び滅菌技術と違って、本発明の実施形態では、ステップ（３）に記載の中程度の塩基性溶液はｐＨが１０．５〜１１．５である炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム又は濃度が０．１％である水酸化アンモニア溶液であり、前記消毒滅菌方法は再水和後の組織材料を前記中程度の塩基性溶液に浸漬し、ゆっくり揺れて２４時間〜４８時間浸漬し、組織マトリックスの損害を回避する。

本発明の実施形態では、ステップ（４）に記載の脱細胞化方法は、消毒滅菌してすすいだ後の組織材料を、２．０mmol/Lの塩化カルシウム、２．０mmol/Lの塩化マグネシウム及び１００mg/Lのゲンタマイシンを含む生理食塩水において、室温で先に１時間〜３時間すすぎ、次にディスパーゼ溶液を加えて細胞を取り除く。

本発明の１つの実施形態では、前記ディスパーゼ溶液は中性ディスパーゼ溶液であり、それに１mmol/L〜２０mmol/Lの塩化カルシウム、１mmol/L〜２０mmol/Lの塩化マグネシウム及び５０単位/L〜４００単位/Lのディスパーゼが含有され、前記ディスパーゼ溶液で細胞を取り除く方法は、組織材料を前記中性ディスパーゼ溶液に浸漬し、例えば３７摂氏度でゆっくり揺れて２４時間〜３６時間浸漬することである。中性ディスパーゼ溶液は選択的に２．０mmol/Lの塩化カルシウム、２．０mmol/Lの塩化マグネシウム及び１００単位/L〜２００単位/Lのディスパーゼが含有される。

本発明の１つの実施形態では、ステップ（４）において脱細胞化を完了した後、洗浄ステップを行う。前記洗浄は第１の洗浄剤による洗浄及び/又は第２の洗浄剤による洗浄を含み、前記第１の洗浄剤溶液はポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルを０．５％の濃度でヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝溶液（ｐＨが７．０〜８．０である）に溶解されて調製したものであり、洗浄方法は組織材料を第１の洗浄剤溶液に浸漬し、例えば３７摂氏度でゆっくり揺れて１２時間〜１８時間浸漬することである。前記第２の洗浄剤溶液はデオキシコール酸ナトリウムを１．０％の濃度でリン酸緩衝溶液（ｐＨが７．２〜７．８である）に溶解されて調製したものであり、洗浄方法は組織材料を第２の洗浄剤溶液に浸漬し、室温でゆっくり揺れて２４時間〜３６時間浸漬することである。同時に、本発明実施形態は他の適切な洗浄剤、例えばTween 20、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール及び３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸等を採用してもよい。

本発明の実施形態では、第１の洗浄剤及び/又は第２の洗浄剤に浸漬洗浄した後、ステップ（５）を行う前に、２０mmol/Lのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝溶液（ｐＨが７．０〜８．０の間である）を採用して、室温で３回すすぎ、毎回２時間〜４時間である。

動物組織ＤＮＡが存在するため、組織マトリックスをヒトに植え込んだ後、炎症反応を起こしやすい。ヒト及びオナガザル科の以外、他の哺乳動物の体内にいずれもα−１，３−ガラクトース残基［Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌ］の二糖末端の糖タンパク質又は糖エステルからなるα−Ｇａｌ抗原が含有される。特に、豚組織におけるα−Ｇａｌ抗原は免疫学的拒絶反応を起こす。炎症反応及び拒絶反応を解消又は克服する方法の１つは特異性酵素処理で動物組織マトリックスにおけるＤＮＡ及びα−Ｇａｌ抗原を除去することである。

本発明の実施形態では、ステップ（５）に記載の、動物組織のＤＮＡ成分を分解することは、デオキシリボヌクレアーゼ溶液を加えることで完了され、前記デオキシリボヌクレアーゼ溶液は塩化カルシウムを２．０mmol/Lで、塩化マグネシウムを２．０mmol/Lで、及びデオキシリボヌクレアーゼを２００〜１００００酵素単位/Lで、選択的に５０００酵素単位/Lで、ｐＨが７．２である１００mmol/Lのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液加えることにより調製されたものであり、動物組織ＤＮＡを分解する方法は、組織材料を前記デオキシリボヌクレアーゼ溶液に浸漬し、例えば３７摂氏度でゆっくり揺れて１８時間〜２８時間処理し、次に生理食塩水に入れて室温で２回すすぎ、毎回１時間〜３時間であることである。

本発明の実施形態では、ステップ（６）に記載の、動物組織α−Ｇａｌ抗原を分解することは、α−ガラクトシダーゼ溶液を加えることにより完了されたものであり、前記α−ガラクトシダーゼ溶液は、塩化カルシウムを２．０mmol/Lで、、塩化マグネシウムを２．０mmol/Lで、及びα−ガラクトシダーゼを４００GALU単位/Lの量で、ｐＨが７．０〜８．０の間である１０mmol/Lのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝溶液に加えることにより調製されたものであり、動物組織α−Ｇａｌ抗原を分解する方法は、組織材料を前記α−ガラクトシダーゼ溶液に浸漬し、例えば３７摂氏度でゆっくり揺れて２４時間〜３６時間洗浄する。

ヒトに移植可能な組織マトリックスを製造する場合、各種酵素の残存を除去する必要がある。上記目的を達するために、本発明の実施形態では、塩析法で洗浄を行い、ステップ（６）に記載の高濃度塩化ナトリウム溶液は２wt％〜５wt％の塩化ナトリウム溶液であり、すすぐ方法は組織材料を前記塩化ナトリウム溶液に浸漬し、室温で２回洗浄し、毎回２時間〜４時間であることである。１つの実施形態では、高濃度塩化ナトリウム溶液は３wt％の塩化ナトリウム溶液であってもよい。また、塩化ナトリウム溶液は他の中性塩溶液、例えば塩化カリウム、塩化マグネシウム及び塩化リチウム等で代替してもよい。

製品の安全性を向上させるために、本発明の実施形態では、前記方法はウイルス不活化処理に更に係り、ステップ（７）に利用されるウイルス不活性化試薬はオキシドール及び過酢酸であり、方法は、組織材料を０．０１wt％〜０．１０wt％のオキシドール、０．０５wt％〜０．５０wt％の酢酸及び０．０５wt％〜０．５０wt％の過酢酸が含有される溶液に浸漬し、室温でゆっくり揺れて２時間〜３時間洗浄することである。本発明の他の実施形態では、 ０．０２wt％のオキシドール、０．１５wt％の酢酸及び０．１０wt％の過酢酸を含有する溶液でウイルスを不活化し、２時間〜３時間でウイルスの数を１０の６乗以上減少することができる。オキシドール、酢酸及び過酢酸の濃度は細菌の数に応じて変化することができる。

本発明の実施形態では、ステップ（７）においてウイルスを不活化した後、室温で、中性リン酸緩衝液で３回すすぎ、毎回２〜４時間であり、オキシドール、酢酸及び過酢酸の残存を除去する。

組織製品の端末滅菌処理は、常に組織材料への破壊が最も大きいステップの１つである。従って、本発明の実施形態では、ステップ（９）では低温放射で処理を行う。本発明のもう１つの実施形態では、−４０摂氏度の条件で、１０ｋＧｙ〜５０ｋＧｙのガンマ線で組織材料の端末滅菌処理を行い、組織材料への破壊を大幅に減少させる。本発明のある実施形態では、放射線量は組織マトリックスにおける細菌の数に応じて変化する。本発明のもう１つの実施形態では、２０ｋＧｙ〜３０ｋＧｙのガンマ線で組織材料の端末滅菌処理を行う。

本発明の代替の実施形態では、放射による端末滅菌方法の以外、前記方法は組織マトリックスを凍結乾燥し、エチレンオキシド気体で滅菌を行うこともできる。

本発明のある実施形態では、ステップ（４）（酵素による脱細胞化）、ステップ（５）（酵素によるＤＮＡ分解）及びステップ（６）（酵素によるα−１，３−ガラクトース残基抗原の分解）の順序は実際の必要に応じて調整して変更することができる。例えば、まずα−１，３−ガラクトース残基抗原を分解し、次に動物ＤＮＡ成分を脱細胞化して分解してよく、又はまず動物ＤＮＡを分解し、続いてα−１，３−ガラクトース残基抗原を分解し、最終的に脱細胞化処理を行ってもよい。

また、本発明の代替の実施形態では、遺伝子工学で改良されたα−Ｇａｌ抗原なしの動物を選択した場合、ステップ（６）を行う必要はなく、ステップ（７）を行えばよい。同時に、細胞外マトリックスのタンパク質加水分解への悪作用を減少させるために、処理する場合、ディスパーゼの濃度、温度及び時間をモニタリングして最適化させる。プロセスでは、特定の酵素抑制剤、例えばエチレンジアミン四酢酸を加えてもよく、それによってディスパーゼの活性を抑制する。

本発明は更に、本発明実施形態の上記方法で製造された動物脱細胞化組織マトリックス材料に関し、
本発明のもう１つの実施形態において、前記動物脱細胞化組織マトリックス材料は、動物組織原料として基底膜を持つ真皮、又は基底膜を除去した真皮を含んだもので作製される。

本発明実施形態に係る脱細胞化組織マトリックス材料を製造するための方法では、一連の動物皮膚組織処理及び組織器官マトリックス製造のステップ及び複数の生物化学溶液及びその処方に関する。前記ステップ及び溶液で製造された動物脱細胞化組織マトリックス材料は、組織細胞外マトリックスの既存の基本的なステント構造、主な生物化学成分及び生体力学的強度を保持し、動物組織におけるヒトの免疫学的拒絶反応を引き起こす抗原を効果的に除去し、組織マトリックスの柔軟性、ドレープ性及び創傷面整合性を改良し、製造された動物動物脱細胞化マトリックス材料はヒトの皮膚に類似し、組織マトリックスにおけるコラーゲン及び他のタンパク質の架橋、分解又は変性を起こすことなく、該動物脱細胞化された組織真皮は自然な真皮組織マトリックスの生物学的整合性を保持する。

図１は組織スライスの分析図である。 Ａは新鮮な豚の真皮のＨＥ染色スライスである。 Ｂは処理後の真皮マトリックスのＨＥ染色スライスである。 Ｃは新鮮な豚の真皮α−１，３ガラクトース残基抗原免疫化学的染色スライスである。 Ｄは処理後の真皮マトリックスα−１，３ガラクトース残基抗原免疫化学的染色スライスである。 図２は組織スライスの分析図である。 Ａ、Ｂ、ＣはＩ型コラーゲン免疫化学的染色スライスである。 Ｄ、Ｅ、ＦはＩＩＩ型コラーゲン免疫化学的染色スライスである。 Ａ、Ｄはネガティブ染色である。 Ｂ、Ｅは未処理の新鮮な豚の真皮ポジティブ染色である。 Ｃ、Ｆは処理後の組織真皮マトリックスである。 図３は脱細胞化組織マトリックス材料を端末ガンマ線の放射で滅菌した後、抗コラゲナーゼ加水分解の特性図である。 図４は脱細胞化組織マトリックス材料をラット皮下に植え込んだ２週間後、宿主細胞が成長して入り新血管が形成したＨＥ染色図である。

以下、実施例を参照しながら本発明実施形態を更に詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定するためのものではない。なお、当業者にとって、本発明の趣旨から逸脱しない場合、いくつかの改良及び修飾を行うことができ、これらの改良及び修飾はいずれも本発明の保護範囲に属すべきである。

実施例１：動物脱細胞化組織マトリックス材料の製造及び性能検出
１、製造
（１）組織器官の収集及び保存
屠殺されたばかりの豚の体から新鮮な豚皮を収集し、４摂氏度の冷蔵庫に一時保存する。機械で脱毛した後、豚皮から厚さが約１．０ミリメートルである真皮を取り、氷点下２０摂氏度で凍結保存する。

（２）脱細胞化
真皮を解凍した後、まず生理食塩水で２回洗浄し、毎回が３０分間である。洗浄後の豚の真皮を１リットルあたりに１００ミリグラムのゲンタマイシンが含有される生理塩水溶液に浸漬し、溶液に濃度が２．０ミリモル/リットルである塩化カルシウム、濃度が２．０ミリモル/リットルである塩化マグネシウム及び１リットルあたりに１５０単位である中性ディスパーゼを更に加え、３７摂氏度で２４時間処理する。

（３）洗浄
ゲンタマイシンで浸漬した後、０．５％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル溶液で真皮を１６時間洗浄する。脱細胞化して洗浄した後、まず生理食塩水で２回洗浄し、毎回が１２０分間である。

（４）ＤＮＡの分解及びα−１，３ガラクトース残基抗原の除去
１リットルあたりの溶液に濃度が２．０ミリモルである塩化カルシウム、濃度が２．０ミリモルである塩化マグネシウム、５０００単位のデオキシリボヌクレアーゼ及び２粒のグラクソスミスクライン製ビーノ（α−ガラクトシダーゼを含む）を更に加え、室温で２０時間処理する。

（５）ウイルスの不活化
洗浄後、０．０２％のオキシドール、０．１５％の酢酸及び０．１０％の過酢酸を含有する溶液で殺菌及びウイルス不活化を２時間行う。

（６）洗浄及び保存
最終的に滅菌生理食塩水でポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル及び酵素の残存がなくなるまで洗浄する。処理済みの真皮マトリックスを６％のグリセリン溶液に一時保存する。

２、性能検出
測定した結果、材料の引っ張り強度が１５．０±３．６メガパスカル（Ｎ＝２４）であり、縫合糸強度が５６±１３ニュートン（Ｎ＝２４）であり、湿重量１００グラムあたりの真皮マトリックスに２４．２±２．９グラムの真皮の乾燥材料（Ｎ＝１５）が含有される。
示差走査熱量計の分析により、組織マトリックス材料の最初の変性温度が５８．０±０．４摂氏度（Ｎ＝５）であり、エンタルピー値が乾燥重量１グラムあたり６１．６±２．１ジュール（Ｎ＝５）であり、真皮原料における自然な状態の真皮マトリックスと明らかな差がない。
プロセス全体の真皮マトリックスの特性への明らかな変化及び損害がない。組織スライスを分析した結果は、具体的に図１に示すように、細胞成分（例えばデオキシリボ核酸ＤＮＡ）及びマトリックスにおけるα−１，３ガラクトース残基抗原を完全に除去したことを示した。Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲン免疫化学的染色分析の結果は、具体的に図２に示すように、処理プロセスの真皮マトリックスにおけるコラーゲンへの損害がないことも示した。

実施例２：真皮の洗浄及び消毒の適切な条件の確定
豚の体から新鮮な真皮を収集し、新鮮な豚の真皮をそれぞれ３７摂氏度でｐＨが１０．６、１１．５及び１１．８である水酸化ナトリウム溶液において処理する。１キログラムあたりの豚皮に対して４リットルの水酸化ナトリウム溶液を使用し、リン酸緩衝液を対照とする。２４時間後、１ミリリットルあたりの溶液でのコロニー形成単位を測定する。リン酸緩衝液には１０．３±１．３対数コロニー形成単位（ＬｏｇＣＦＵ）（Ｎ＝３）が含有され、ｐＨが１０．６、１１．５及び１１．８である溶液において、対数コロニー形成単位はそれぞれ２．１±０．１、０及び０である。以上から分かるように、中程度の塩基性溶液の消毒及び殺菌作用は著しい。
示差走査熱量計で分析した結果は、ｐＨが１１．５以上である塩基性溶液で洗浄すると、組織マトリックスを損傷し、組織マトリックスにおけるタンパク質の安定性が著しく低下することを示した。高ｐＨの組織マトリックスへの損傷は、組織マトリックスの不可逆的な吸水膨潤及び硬化にも反映される。本実施例は、真皮の洗浄及び消毒の適切な条件がｐＨを１０．５〜１１．５の間に調整することであると確定した。

実施例３：動物脱細胞化組織マトリックス材料の製造及び性能検出
１、製造
（１）組織器官の収集及び保存
屠殺されたばかりの豚の体から新鮮な豚皮を収集し、４摂氏度の冷蔵庫に一時保存する。機械で脱毛した後、豚皮から厚さが約１．０ミリメートルである真皮を取る。

（２）収集及び洗浄
厚さが１．０ミリメートルである豚の真皮を収集して洗浄した後（実施例１を参照）、氷点下８０摂氏度の冷凍庫に一時貯蔵する。

（３）脱細胞化
解凍後、５mmol/Lのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸溶液（ｐＨが７．４である）で洗浄し、２．０mmol/Lの塩化カルシウム及び２００単位／Lの中性ディスパーゼを加えた後、３７摂氏度で１８時間処理する。

（４）洗浄
１．０％のデオキシコール酸ナトリウム溶液で、３７摂氏度で２０時間洗浄する。

（５）ＤＮＡ及びα−１，３ガラクトース残基抗原の分解
滅菌生理食塩水で１２０分間洗浄した後、１リットルあたりの溶液に２．０ｍＭの塩化カルシウム及び２．０ｍＭの塩化マグネシウム、４０００単位の組換えデオキシリボヌクレアーゼ及び２００ＧＡＬＵ単位のグリーンコーヒー豆の種子から抽出されたα−ガラクトシダーゼを更に加え、３７摂氏度で２４時間処理する。

（６）ウイルスの不活化
滅菌生理食塩水で洗浄した後、０．０５％のオキシドール、０．３０％の酢酸及び０．２０％の過酢酸で２時間殺菌する。

（７）洗浄
滅菌生理食塩水でデオキシコール酸ナトリウム、組換えデオキシリボヌクレアーゼ及びα−ガラクトシダーゼの残存がなくなるまで洗浄する。

（８）端末滅菌処理
処理済みの真皮マトリックスを１２％のグリセリンを含有する滅菌生理食塩水溶液に保存し、２５ｋＧｙのガンマ線で滅菌する。

２、性能検出
ＯＯ型プローブ付きの硬さ計で測定した結果は、未処理の豚の真皮の柔軟度が４０±８．６（Ｎ＝２４）であり、脱細胞化された豚の真皮の柔軟度が１３．０±４．０（Ｎ＝２５）であり、ヒトの真皮の柔軟度が１４．２±６．１（Ｎ＝４０）であることを示した。未処理の豚の真皮（遥かに硬い）に対して、脱細胞化処理済みの豚の真皮マトリックスの柔軟度とヒトの真皮組織は統計上で明らかな差がないことを示した。本発明実施形態の方法が組織マトリックスの柔軟性、ドレープ性及び創傷面整合性を改良したことを示した。

組織スライスを分析した結果により、製造された組織マトリックスにおけるα−１，３ガラクトース残基抗原を完全に除去し、陰性に染色し、抗原の表現がない。ＱｕａｎｔｉＴ−ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光染料法でＤＮＡ含有量を測定し、その結果は、１グラムあたりの新鮮な豚の真皮が約８４．０±１０．２マイクログラムのＤＮＡ（Ｎ＝３）を含有し、洗浄消毒後の１グラムあたりの豚の真皮が６２．９±９．５マイクログラムのＤＮＡ（Ｎ＝３）を含有し、脱細胞化処理及び洗浄後の１グラムあたりの組織マトリックスが１．９±１．１マイクログラムのＤＮＡ（Ｎ＝３）のみを含有し、動物ＤＮＡの含有量が平均で９７．７％減少したことを示した。示差走査熱量計で分析した結果は、組織マトリックス材料の最初の変性温度が５４．７±０．２摂氏度（Ｎ＝３）であり、エンタルピー値が乾燥重量１グラムあたり５９．５±３．１ジュール（Ｎ＝３）であることを示した。豚の真皮原料における自然な状態の真皮に比べて、最初の変性温度が３．３摂氏度のみ低下し、エンタルピー値の著しい差がなく、これは、製造過程全体（端末ガンマ線の放射による滅菌を含む）の組織マトリックスの特性への明らかな変化及び損害がないことを示した。

ヒドロキシプロリン法で組織マトリックスにおけるコラーゲンの含有量を測定し、端末ガンマ線の放射で滅菌された後の豚皮組織マトリックスは９１．０±３．０％（Ｎ＝６）のコラーゲンを含有する。Ｆａｓｔｉｎ染色法で弾性タンパク質の含有量を測定し、端末ガンマ線の放射で滅菌された後の組織マトリックスは０．９２±０．２１％（Ｎ＝６）の弾性タンパク質を含有し、未処理の豚の真皮材料に比べて、７１．４％低下した。

脱細胞化組織マトリックス材料の抗コラゲナーゼ加水分解の特性は、端末ガンマ線の放射で滅菌された後、本発明実施例で製造された脱細胞化組織マトリックス材料におけるコラーゲンの安定性を研究することに用いられる。製造された脱細胞化組織マトリックス材料を１ミリリットルあたりに５個のコラゲナーゼ単位が含まれるトリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン−塩酸溶液（１０ｍＭ、ｐＨが７．５である）に入れて、３７摂氏度で６４時間まで培養する。その結果は、具体的に図３に示すように、未処理の豚の真皮材料に比べて、本発明実施例の方法で製造された脱細胞化組織マトリックスが端末ガンマ線の放射で滅菌された後、抗コラゲナーゼ加水分解の性能が変更していないことを示した。

本発明実施例の方法で製造された脱細胞化組織マトリックス材料の再細胞化特性により、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｌｅｗｉｓ）を使用して動物評価実験を行った。ラット８匹を麻酔した後、電気はさみで背中の毛を剃り、７０％のアルコールで手術部位を清拭し、背中の上下及び左右に単独の切開を行い、小さなポケットを形成し、その大きさが１×１センチのサンプル（約１ミリメートルの厚さ）を収容すればよい。脱細胞化組織マトリックス材料サンプルを皮下に植え込む。手術後、ラットが痛みの症状を示す場合、ブプレノルフィン（０．０５ミリグラム／キログラム）で鎮痛する。２週間後ラットを致死させ、植え込んだ脱細胞化組織マトリックス材料を取り出し、１０％の中性ホルマリン溶液で固定する。組織スライス法を用いてラット宿主細胞の侵入及び血管成長を観察する。その結果、具体的に図４に示すように、２週間内に大量の宿主細胞が成長して組織マトリックス材料に侵入し、且つ新しい血管が生成し、有害反応が観察されなかった。

なお、本発明の好適な実施形態を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されない。本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で、上記実施形態とは異なる種々の態様で実施することができる。本発明の精神と原則にある限り、行ったいずれの修正、等価置き換え、改善などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきである。

Claims (22)

1. 動物組織原料を収集し、血液及び他の汚れを洗浄し、長さ、幅及び高さが所望のサイズである組織材料に切断し、低温保存するステップ（１）、
   緩慢解凍し、ゲンタマイシンを含有する生理食塩水で再水和するステップ（２）、
   組織材料を中程度の塩基性溶液で消毒滅菌し、滅菌精製水ですすぎ、ｐＨを中性に調整するステップ（３）、
   脱細胞化し、洗浄するステップ（４）、
   動物組織のＤＮＡ成分を分解し、生理食塩水ですすぐステップ（５）、
   動物組織のα−１，３−ガラクトース残基抗原（α−Ｇａｌ抗原）を分解し、高濃度塩化ナトリウム溶液ですすぎ、生理食塩水ですすぐステップ（６）、
   ウイルスを不活化し、リン酸緩衝液ですすぐステップ（７）、
   無菌袋詰め、密封するステップ（８）、
   端末滅菌処理を行うステップ（９）、を含み、
   酵素学方法で細胞成分を除去し、α−Ｇａｌ抗原を除去してステントの柔軟性を向上させることを特徴とする動物脱細胞化組織マトリックス材料を製造するための方法。
2. ステップ（１）における動物組織原料は、皮膚、真皮、動脈、静脈、胃、軟骨、半月板、小腸、大腸、横隔膜、腱、靭帯、神経組織、膀胱、尿道及び尿管から選ばれる請求項１に記載の方法。
3. ステップ（１）における血液及び他の汚れの洗浄は純水を利用し、物理的方法又は超音波で洗浄を行う請求項１に記載の方法。
4. ステップ（１）における組織材料は、１．０摂氏度／分以下である平均速度で−４０摂氏度以下に降温して保存し、好ましくは降温速度が０．５摂氏度／分である請求項１に記載の方法。
5. ステップ（１）における低温保存が長期保存であり、その方法は、豚の真皮材料を、面積がやや大きい綿のガーゼ、紙、プラスチックフィルム、ナイロンネット又は他の布織物保護層に平らに置き、真皮と前記保護層を多層同心巻に巻き、又は真皮と保護層が交替する多層包装形態を形成し、ビニール袋に入れ、密封後、−８０又は−４０摂氏度の冷凍庫に入れて保存することである請求項１に記載の方法。
6. ステップ（２）における低温保存される組織材料は５〜１２摂氏度の環境下で緩慢解凍する請求項１に記載の方法。
7. ステップ（２）における融解された組織材料を１リットルあたりにゲンタマイシンが１００ミリグラム含まれる生理食塩水において再水和する請求項１に記載の方法。
8. ステップ（３）に記載の中程度の塩基性溶液は、ｐＨが１０．５〜１１．５である炭酸水素ナトリウム又は水酸化ナトリウム又は濃度が０．１％である水酸化アンモニア溶液であり、前記消毒滅菌方法は再水和後の組織材料を前記中程度の塩基性溶液に浸漬し、ゆっくり揺れて２４〜４８時間浸漬することである請求項１に記載の方法。
9. ステップ（４）に記載の脱細胞化方法は、消毒滅菌してすすいだ後の組織材料を、濃度が２．０ミリモルである塩化カルシウム、濃度が２．０ミリモルである塩化マグネシウム及びゲンタマイシンが１００ミリグラム／リットルである生理食塩水において、室温で先に１〜３時間すすぎ、次にディスパーゼ溶液を加えて細胞を溶離することである請求項１に記載の方法。
10. 前記ディスパーゼ溶液は中性ディスパーゼ溶液であり、１リットルあたりに１〜２０ミリモルの塩化カルシウム、１〜２０ミリモルの塩化マグネシウム及び５０〜４００単位のディスパーゼが含有され、前記ディスパーゼ溶液が細胞を溶離する方法は、組織材料を前記ディスパーゼ溶液に浸漬し、３７摂氏度でゆっくり揺れて２４〜３６時間浸漬し、好ましくは１リットルあたりの中性ディスパーゼ溶液に２．０ミリモルの塩化カルシウム、２．０ミリモルの塩化マグネシウム及び１００〜２００単位のディスパーゼが含有される請求項９に記載の方法。
11. ステップ（４）に記載の洗浄は、第１の洗浄剤による洗浄及び第２の洗浄剤による洗浄を含み、前記第１の洗浄剤溶液はヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝溶液（ｐＨが７．０〜８．０である）に溶解された０．５％のポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルであり、洗浄方法は組織材料を第１の洗浄剤溶液に浸漬し、３７摂氏度でゆっくり揺れて１２〜１８時間浸漬することであり、前記第２の洗浄剤溶液はリン酸緩衝溶液（ｐＨが７．２〜７．８である）に溶解された１．０％のデオキシコール酸ナトリウム溶液であり、洗浄方法は組織材料を第２の洗浄剤溶液に浸漬し、室温でゆっくり揺れて２４〜３６時間浸漬することである請求項１に記載の方法。
12. 第１の洗浄剤及び第２の洗浄剤に浸漬した後、ステップ（５）を行う前に、２０ｍＭのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝溶液（ｐＨが７．０〜８．０の間である）を用いて室温で３回すすぎ、毎回が２〜４時間である請求項１に記載の方法。
13. ステップ（５）に記載の、動物組織のＤＮＡ成分を分解することは、デオキシリボヌクレアーゼ溶液を加えることで完了され、前記デオキシリボヌクレアーゼ溶液の処方は１００ｍＭ／リットルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨが７．２である）に濃度が２．０ミリモルである塩化カルシウム、濃度が２．０ミリモルである塩化マグネシウム及び５０００酵素単位のデオキシリボヌクレアーゼを加えることであり、動物組織のＤＮＡを分解除去する方法は、組織材料を前記デオキシリボヌクレアーゼ溶液に浸漬し、３７摂氏度でゆっくり揺れて１８〜２８時間処理し、次に生理食塩水に入れて室温で２回すすぎ、毎回が１〜３時間である請求項１に記載の方法。
14. ステップ（６）に記載の、前記動物組織α−Ｇａｌ抗原を分解することは、α−ガラクトシダーゼ溶液を加えることにより完了され、前記α−ガラクトシダーゼ溶液の処方は、１０ｍＭ／リットルのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝溶液（ｐＨが７．０〜８．０の間である）に２．０ｍＭの塩化カルシウム、２．０ｍＭの塩化マグネシウム及び４００ＧＡＬＵ単位のα−ガラクトシダーゼを加えることであり、動物組織α−Ｇａｌ抗原を分解する方法は、組織材料を前記α−ガラクトシダーゼ溶液に浸漬し、３７摂氏度でゆっくり揺れて２４〜３６時間洗浄することである請求項１に記載の方法。
15. ステップ（６）に記載の高濃度塩化ナトリウム溶液は２〜５％の塩化ナトリウム溶液であり、すすぐ方法は組織材料を前記塩化ナトリウム溶液に浸漬し、室温で２回洗浄し、毎回が２〜４時間であり、高濃度塩化ナトリウム溶液は３％の塩化ナトリウム溶液が好ましい請求項１に記載の方法。
16. ステップ（７）に記載のウイルス不活化試薬はオキシドール及び過酢酸であり、方法は、組織材料を０．０１〜０．１０％のオキシドール、０．０５〜０．５０％の酢酸及び０．０５〜０．５０％の過酢酸を含有する溶液に浸漬し、室温でゆっくり揺れて２〜３時間洗浄することである請求項１に記載の方法。
17. ステップ（７）においてウイルスを不活化した後、室温で、中性リン酸緩衝液で毎回２〜４時間、３回すすぐことで、オキシドール、酢酸及び過酢酸の残存を除去する請求項１に記載の方法。
18. ステップ（９）に記載の端末滅菌処理は、低温ガンマ線放射又はエチレンオキシド気体で滅菌処理を行うことであり、ガンマ線の処理剤量は１０〜５０ｋＧｙが好ましい請求項１に記載の方法。
19. ステップ（４）、ステップ（５）及びステップ（６）の順序は実際の必要に応じて調整して変更することができる請求項１に記載の方法。
20. 遺伝子工学で改良されたα−Ｇａｌ抗原なしの動物組織原料を選択した場合、ステップ（６）を行う必要がなく、ステップ（７）を直接に行う請求項１に記載の方法。
21. 請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法で製造された動物脱細胞化組織マトリックス材料。
22. 利用された動物真皮原料は基底膜を持つ真皮及び基底膜を除去した真皮を含む請求項２１に記載の動物脱細胞化組織マトリックス材料。
    

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