KR20120116322A

KR20120116322A - 포유류의 연골조직에서 유래한 생체이식재

Info

Publication number: KR20120116322A
Application number: KR1020110107351A
Authority: KR
Inventors: 황호찬; 강계원; 김진영; 안재형; 최다미
Original assignee: 한스바이오메드 주식회사
Priority date: 2011-04-12
Filing date: 2011-10-20
Publication date: 2012-10-22
Also published as: CN103491988B; JP2014505569A; CN103491988A; KR101269618B1; JP5763790B2

Abstract

본 발명은 포유류의 연골조직에서 유래한 생체이식재에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생체이식재는 다단계의 처리공정을 통해 항원성, 병원체 및 세포독성을 생체이식시 부작용의 위험이 현저하게 낮으며, 인간이 아닌 동물(포유류)의 연골조직을 이용하므로 그 수득과 공급이 원활하고 생체이식에 적용 시 비용이 저렴하면서도 안전하다는 장점이 있다.

Description

포유류의 연골조직에서 유래한 생체이식재 {Graft materials derived from mammalian cartilage}

본 발명은 포유류의 연골조직에서 유래한 생체이식재에 관한 것이다.

손상된 연골의 치료 또는 성형외과 분야에서 연골의 이식은 널리 이용되어 왔다. 특히 코성형이 날로 활성화됨에 따라 융비술이 증가하고 있다. 여기에는 수십 년 동안 자가 연골을 비롯한 여러 종류의 이식물들이 사용되어 왔다. 그 중에서도 고어텍스(Gore-tex)나 실리콘 같은 이물성형 이식편들은 다루기가 쉽고 수술 시간이 절약되며 공여부의 이환율을 없애는 장점이 있다. 이종의 물질을 이용한 관련분야의 선행문헌으로는 한국공개특허 2011-0012807 (인공연골대치물) 및 2011-0097662 (관절연골 재생용 지지체 및 이의 제조 방법)이 공개되어 있다.

그러나, 장기간의 추적관찰에서 이물감, 감염, 통증, 이식물의 탈출 및 가동성 등의 부작용이 보고되어 왔다. 또한 자가 이식물은 완벽한 생체 적합성에 따라 부작용이 드물어 만족스러운 수술결과를 얻을 수 있음에도 불구하고 공여부 이환율의 증가, 환자 선택의 제한성, 수술시간의 연장, 많은 양의 채취가 제한사항으로 지적되어 왔다.

위와 같은 자가 연골의 문제를 극복하기 위한 대안으로써 부족할 때 동종(allograft)이나 이종의 동물(xenograft)로부터 연골조직을 공급받는 방법이 있다. 이 경우에는 이식재와 함께 바이러스 등이 전이될 위험이 가장 큰 제약이나 현재 전 세계의 조직은행(Tissue Bank)에서 공여자의 바이러스 감염여부를 선별검사한 후, 감염되지 않은 선택된 조직만을 가공처리하는 공정을 통해 이를 해결하고 있다. 이러한 종류의 동종 연골이식재는 1972년부터 정형외과, 성형외과, 안과, 부인과 및 비뇨기과의 수술에서 사용되고 있으며, 이물성형 이식편과는 달리 비첨수술을 위한 별도의 자가연골 채취가 필요하지 않은 점이 가장 큰 장점이다.

그러나, 인체의 연골조직을 이용하므로 역시 다량의 수급이 어려우며, 동종간의 이식이므로 병원체의 전이에 의한 위험성이 항상 존재한다는 점, 그리고 이식을 위해 제조된 최종제품의 가격이 매우 고가라는 점이 단점으로 지적되고 있다.

이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 이식시 부작용의 위험이 현저하게 낮으면서도 수득이 용이하고, 비용이 저렴한 생체이식재를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 포유류에서 유래한 생체이식재의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 상기 방법으로 제조된 생체이식재를 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 포유류의 연골조직을 준비하는 단계; 상기 준비된 연골조직을 염화나트륨 고장액에 처리하는 단계; 상기 고장액에 처리된 연골조직을 바이러스 불활화 용액으로 처리하는 단계; 상기바이러스 불활화 용액으로 처리된 연골조직을 알카리 용액에 처리하는 단계; 상기 알카리 용액에 처리된 연골조직을 탈수처리 또는 냉동처리하는 단계; 및 상기 탈수처리 또는 냉동처리된 연골조직을 감마선으로 조사하는 단계를 포함하는 연골이식재의 제조방법이 제공될 수있다.

일 실시예에 따르면, 상기 포유류는 돼지, 사람, 말, 소, 개, 쥐로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 연골조직은 유리연골, 탄성연골 및 섬유연골로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 포유류의 연골조직을 준비하는 단계는 채취된 연골조직을 [아세톤 또는 메틸알코올] : 클로로포름 = 1 : 1 (v/v) 의 비율로 혼합된 용액에 48시간 동안 침지하여 탈지(defatting)시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 포유류의 연골조직은 돼지의 연골조직일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 돼지의 연골조직은 귀 연골조직(Elastic ear cartilage)또는 늑연골조직(rip cartilage)일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 고장액에 처리하는 단계는 연골조직에 초음파를 인가하면서 6~12% 염화나트륨 용액에 4~6시간 동안 침지하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면서, 상기 바이러스 불활화 용액을 처리하는 단계는 0.5~1.5% 과산화수소, 0.1~1.0%의 과초산계(Peracetic Acid), 70~99% 알코올, 및 0.001~3%의 차아염소산나트륨(NaOCl)을 포함하는 바이러스 불활화 용액에 30분~1시간 동안 침지하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 알카리 용액의 처리는 0.25~0.75M 수산화나트륨(NaOH)에 15~45분 동안 침지하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 탈수처리는 50%, 80% 및 100% 농도의 아세톤에 순차적으로 침지하거나, 무수알코올(absolute alcohol)에 침지하거나, 50%, 80% 농도의 아세톤에 순차적으로 침지한 다음 무수알코올에 침지하거나, 또는 0.1~1%의 항생제 및 90~99.9%의 글리세롤을 포함하는 용액에 연골이식재를 1차 침지한 다음 100% 글리세롤 용액으로 옮겨 2차 침지하는 것으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 냉동처리는 상기 알카리 용액에 처리된 연골조직을 -70℃에서 1~2시간 냉동시킨 후, 48~72시간 동안 동결건조시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 방법에 따라 제조된 연골이식재가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 생체이식재는 다단계의 처리공정을 통해 항원성, 병원체 및 세포독성을 제거하고 생물역학(biomechanics) 및 조직의 재구성능력에 영향을 끼치지 않고 모든 종류의 병원성이 비활성화된 상태로 제조된다. 인간이 아닌 동물(포유류)의 연골조직을 이용하므로 그 수득과 공급이 원활하고 생체이식재로 적용 시 비용이 저렴하다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 공정 처리 전의 돼지 귀 연골 조직을 여러 가지 염색약으로 염색하여 현미경으로 그 절단면을 관찰한 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 공정 처리 전의 돼지 늑연골 조직을 여러 가지 염색약으로 염색하여 현미경으로 그 절단면을 관찰한 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 공정 처리 후 최종적으로 제조된 돼지 귀 연골조직을 여러 가지 염색약으로 염색하여 현미경으로 그 절단면을 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 공정 처리 후 최종적으로 제조된 돼지 늑연골조직을 여러 가지 염색약으로 염색하여 현미경으로 그 절단면을 관찰한 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 공정처리 전후의 돼지 귀의 연골 조직 내에 존재하는 콜라겐, 케라탄황산을 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명에 따른 공정 처리 전후의 돼지 귀의 연골조직 내에 존재하는 피브로넥틴, 콘드로이틴황산을 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명에 따른 공정 처리 전후의 돼지 귀의 연골조직을 주사전자현미경(SEM)을 이용한 연골조직의 사진이다.
도 8은 본 발명에 따른 공정 처리 전후 돼지 귀의 연골조직의 화학적 구성을 나타내는 HPLC 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따라 아세톤 또는 글리세롤 처리시의 열적특성을 비교한 데이터이다.
도 10은 본 발명에 따라 탈수방법인 아세톤 또는 글리세롤 탈수 방법의 차이 따른 세포독성의 유무 및 최종 연골 이식재의 세포독성의 유무를 확인한 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따라 제조된 연골이식재의 생물학적 안전성을 평가하기 위하여 동물실험을 통해 이식시험하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 12는 본 발명에 따라 제조된 연골이식재의 생물학적 안전성을 평가하기 위하여 동물실험을 통해 이식시험을 시행한 후 조직을 적출하여 조직검사한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 포유류의 연골조직을 준비하는 단계; 상기 준비된 연골조직을 염화나트륨 고장액에 처리하는 단계; 상기 고장액에 처리된 연골조직을 바이러스 불활화 용액으로 처리하는 단계; 상기바이러스 불활화 용액으로 처리된 연골조직을 알카리 용액에 처리하는 단계; 상기 알카리 용액에 처리된 연골조직을 탈수처리 또는 냉동처리하는 단계; 및 상기 탈수처리 또는 냉동처리된 연골조직을 감마선으로 조사하는 단계를 포함하는 연골이식재의 제조방법이 제공된다.

이 때, 상기 포유류의 연골조직은 돼지, 사람, 말, 소, 개, 쥐 등을 모두 포함하는 포유류의 유리연골, 탄성연골, 섬유연골을 지시하는 연골조직일 수 있으며, 바람직하게는 돼지의 연골조직일 수 있다. 보다 바람직하게는 돼지의 귀 연골조직(elastic ear cartilage) 또는 늑연골 조직(rip cartilage)일 수 있다.

또한, 상기 포유류의 연골조직을 준비하는 단계는 채취된 연골조직을 [아세톤 또는 메틸알코올] : 클로로포름 = 1 : 1 (v/v) 의 비율로 혼합된 용액에 24 내지 72 시간, 보다 바람직하게는 48시간 동안 침지하여 탈지(defatting)시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 탈지 단계를 더 포함할 경우 클로로포름-메탄올 추출법을 통해 조지방의 함량을 측정하였을 때, 돼지 늑연골조직의 조지방 함유량은 다음과 같이 측정되었다.

항목	분석결과		채취된 시료의 무게	시험방법
	탈지공정전	탈지공정후
조지방	3.4g	0.0g	100g	클로로포름-메탄올 추출법

일 실시예에 따르면, 상기 염화나트륨 고장액에 처리하는 단계에서는 초음파를 인가하면서 6~12% 염화나트륨(NaCl) 용액에 4~6시간 동안 연골조직을 침지할 수 있다. 염화나트륨의 농도가 6% 미만인 경우에는 연골조직 내 세포에 삼투압의 작용이 미미하여 세포에 대한 삼투적 파괴 효과가 약할 수 있으며, 12%를 초과할 경우에는 미처 용해되지 않은 염이 연골조직이나 용기에 침전될 수 있어 바람직하지 않다. 이 때, 초음파 처리는 연골조직 내부로 용액의 침투를 도울 수 있으며, 세포의 삼투파괴를 촉진할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 바이러스 불활화 용액을 처리하는 단계에서는 0.5~1.5% 과산화수소, 0.1~1.0% 과초산계, 70~99% 알코올, 및 0.001~3%의 차아염소산나트륨을 포함하는 바이러스 불활화 용액에 30분~1시간 동안 침지할 수 있다. 상기 바이러스 불활화 용액의 처리를 통해 각종 바이러스 입자, 프리온 입자 등의 병원체를 불활성화시킬 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 과초산계는 0.1~0.5%, 가장 바람직하게는 0.15~0.25%일 수 있다. 상기 바이러스 불활화 용액의 과산화수소가 0.5% 미만으로 처리될 경우에는 병원체의 불활성화 효과가 미비하여 바람직하지 않으며, 1.5%를 초과할 경우에는 연골조직을 손상시킬 수 있어 바람직하지 않다. 여기서, 알코올을 상기 범위인 95.5%를 초과하여 100% 가까운 조성비로 사용하게 될 경우에는 연골의 변성 초래 가능성 및 연골이 탈수되는 부작용이 발생할 수 있어 바람직하지 않다.

일 실시예에 따르면, 상기 알카리 용액의 처리는 0.25~0.75M 수산화나트륨(NaOH)에 15~45분 동안 침지하는 것일 수 있다. 이와 같은 알카리 용액 처리를 통해 연골 조직 내에 존재하거나 공정 중 투입될 가능성이 있는 바이러스를 불활성화할 수 있으며, 연골 조직 내의 연골 세포의 제거를 가능하게 한다. 상기 수산화나트륨이 0.25M 미만으로 처리될 경우, 이러한 바이러스의 불활화 및 세포의 제거에 필요한 화학반응이 충분히 일어나지 않아 바람직하지 않으며, 0.75M을 초과할 경우 연골조직을 손상시킬 수 있어 바람직하지 않다.

일 실시예에 따르면, 알카리 용액이 처리된 연골조직은 탈수처리 단계를 거치게 되는데, 상기 탈수처리는 50%, 80% 및 100% 농도의 아세톤에 순차적으로 침지하거나, 무수알코올(absolute alcohol)에 침지하거나, 50%, 80% 농도의 아세톤에 순차적으로 침지한 다음 무수알코올에 침지하거나, 또는 0.1~1%의 항생제 및 90~99.9%의 글리세롤을 포함하는 용액에 연골이식재를 1차 침지한 다음 100% 글리세롤 용액으로 옮겨 2차 침지하는 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 글리세롤로 연골이식재의 세포 내 수분을 치환시킨 경우에는 보존성이 향상되므로, 상기 방법 중 2가지 이상을 병행하여 사용할 수도 있다.

상기 탈수처리를 거치지 않고, 상기 알카리 용액이 처리된 연골조직을 세척 단계를 거쳐 바로 -20℃ 이하의 냉동상태에 보관할 수도 있다.

공정처리가 완료된 연골에 대하여 개별 포장 한 후 에틸렌 옥사이드 (EO) 가스 소독을 실시할 수 있다. 또는 공정처리가 완료된 연골에 대하여 10~60kGy, 보다 바람직하게는 10~30kGy 감마멸균 조사에 의하여 연골이식재의 멸균을 실시할 수 있다. 특히 30kGy 이상의 고준위 감마멸균을 실시할 때에는 멸균생리식염수에 연골이식재를 침지하여 감마멸균에 의한 단독처리 공정만을 실시하여 연골이식재를 제조할 수도 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

공정별 최적 조건의 확립

실시예 1. 최적 감마선량의 결정

돼지의 귀로부터 추출된 신선한 연골을 9% NaCl 용액에 5시간 동안 침지하고 초음파를 조사하였다. 이를 통해 연골세포가 제거되도록 하였다. 이 후 바이러스 불활화 용액으로서 1%의 과산화수소에 상기 조직을 침지시키고 45분 동안 교반하였다. 이 과정을 거치면서 바이러스 및 기타 병원체가 불활성화 되도록 하였다. 또한 알카리 용액으로서 0.5M 수산화나트륨(NaOH)에 30분간 침지하였다. 각 단계별 용액을 처리하기 전에 세척용액을 사용하여 전 단계의 처리용액이 잔류하지 않도록 완전히 세척하였다. 이 후 조직의 손상을 최소화하기 위하여 50%, 80% 및 100% 아세톤에 순차적으로 침지하여 탈수한 다음 포장용기에 밀봉하고 감마선을 조사하였다. 최적 감사선량을 결정하기 위하여 위의 단계를 통해 제조된 연골이식재에 대하여 5~30kGy범위에서 5kGy 단위로 감마선을 조사하였다. 감마선 조사에 따른 활성연골세포의 정도 및 기타 연골을 구성하는 물질의 양을 수치화하여 최적의 감마선 선량을 선택하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

감마선 조사 후 H&E 염색을 통해 활성화된 상태로 남아있는 연골세포를 상대적으로 비교 및 관찰하였다. 살아있는 연골세포는 체내 이식 후 항원으로 작용할 있으므로 이를 불활성화시키는 것은 무엇보다 중요하다. 이에 각 방사선량에 따른 샘플마다 연골세포의 형태가 유지되는 정도를 측정하여 연골세포의 형태가 가장 많이 유지된 경우를 5점 만점으로 배점하고 연골세포의 형태 유지 정도를 점수로 기록하였다. 그 결과, 25kGy와 30kGy 조건에서는 원래의 형태를 유지하고 있는 연골세포가 거의 관찰되지 않았다.

또한, MT(Masson's Trichrome) 염색과 VVG(Verhoeff-Van Gieson) 염색의 결과를 보면, 콜라켄 섬유와 탄성 섬유(elastic fiber)가 상당부분 유지되는 것으로 나타났다. Safranine O의 염색 결과를 통해 프로테오글리칸의 존재여부를 확인하고, Alcian blue 염색을 통해 점질다당류(GAGs)가 존재함을 알 수 있었다.

감마선량이 높아질수록 기질 내 연골세포의 제거와 불활화정도가 증가되는 것으로 나타났다. 표 2를 참조하면, 감마선량이 25kGy인 경우, 연골세포의 제거율이 가장 높으면서도 콜라겐, 프로테오 글리칸 GAGs 및 탄성섬유에 대한 보존율 또한 가장 높게 나타나 최적의 선량인 것으로 나타났다. 도 5 및 도 6은 감마선량이 25kGy일 때의 상기 염색약에 의한 결과를 나타내고 있다.

평가항목	5kGy	15kGy	25kGy	30kGy
연골세포의 형태 유지	5	4	1	1
콜라겐 섬유	4	4	4	3
프로테오글리칸	5	5	4	3
점다당질(GAGs)	5	5	4	4
탄성 섬유(Elastic fiber)	5	5	5	4

실시예 2. 탈수방법의 비교

제조된 연골조직은 아세톤 처리 또는 글리세롤을 이용하여 탈수할 수 있다. 글리세롤 처리 방법은 항생제를 약 0.11% 포함하는 글리세롤에 조직을 침지시킨 후, 이를 다시 99.9% 이상의 글리세롤에 옮겨 침지시킴으로써 조직 내의 수분을 글리세롤로 치환하는 방법이다.

도 9를 참조하면, 아세톤 및 글리세롤을 사용하여 탈수 후 최종 제품의 열적특성을 비교한 데이터가 나타나 있다. 도 9의 탈수방법에 따른 열적특성 변화 확인 결과, 아세톤 및 글리세롤을 열적특성으로 비교하였을 때, 아세톤의 유리전이 온도는 약 99도, 글리세롤은 약 96도로 유의적인 차이가 없음을 확인하였으며, 위의 결과를 바탕으로 아세톤 및 글리세롤의 열적특성은 샘플의 상태에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 또한, 도 10에는 상기 탈수방법에 따른 세포독성을 관찰한 결과가 나타나 있는데, 아세톤이나 글리세롤에 의한 탈수방법 모두 세포에 독성이 없는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명에 따른 연골이식재는 아세톤으로 탈수하여 방법 이외에도 글리세롤을 처리하여 탈수 및 보존하는 방법도 가능한 것으로 나타났다.

선택한 공정의 검증

실시예 3. 공정별 ECM 인자 확인

도 5와 도 6에 나타난 바와 같이, 신선한 돼지 귀 연골과 최종적으로 제조된 연골 이식재에 대하여 케라탄황산(Keratan Sulfate), 콜라겐 II, 피브로넥틴(Fibronectin), 콘드로이틴황산(Chondroitin sulfate)의 함량을 조사하였다. 그 결과 케라탄황산은 기질 전반에 걸쳐서 관찰되었으며, 콘드로이틴황산은 연골막 근처에서 주로 관찰되었다. 특히 콘드로이틴황산은 한 쪽 연골막 주변에 편중되어 나타나는 경향이 관찰되었다. 케라탄황산(Keratan Sulfate), 콜라겐 II, 피브로넥틴(Fibronectin), 콘드로이틴황산(Chondroitin sulfate)은 최종적으로 제조된 연골 이식재에서 잔류량이 다소 감소하는 경향은 있었으나 여전히 유지 및 보존되고 있음을 확인하였다.

실시예 4. 최종제품의 조직 검사-연골세포의 불활화 및 세포외 기질( ECM ) 인자의 유지 확인

상기 처리를 통해 처리된 최종 연골 이식재에 항원성을 유발할 수 있는 연골세포가 존재하는지, 기타 세포외 기질은 어느 정도로 유지되는지를 검증하기 위해 각각의 요소에 특이적인 염색약으로 조직검사를 실시하였다.

도 3 및 도 4를 참조하면, 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 통해 관찰한 결과, 최종 연골 이식재에서 살아있는 연골세포는 관찰되지 않았으며 기질 내의 모든 연골세포가 불활성화되어 있음을 확인할 수 있었다. 이는 도 1 및 도 2에 살아있는 연골세포가 관찰되는 것과는 대조적이다. 도 3 및 도 4에서MT(Masson's Trichrome)와 VVG(Verhoeff-Van Gieson) 염색의 결과를 보면, 콜라켄 섬유와 탄성 섬유(Elastic fiber)가 상당부분 유지되는 것으로 나타났다. 사프라닌 오(Safranine O) 염색 결과를 통해 프로테오글리칸의 존재여부 및 알시안블루(Alcian blue) 염색을 통해 점다당질(GAGs, Glycosaminoglycans)의 존재를 확인할 수 있었다.

실시예 7. 3차원의 다공성 구조 확인

최종 산물의 3차원적 구조를 전자현미경(SEM)으로 관찰하였다. 그 결과는 도 8에서 볼 수 있듯이, 원래의 연골 조직의 구조와 비교하여 다공성 구조 및 3차원적 구조가 손상 없이 잘 보존되어 있음을 알 수 있다.

실시예 8. 화학적 특성 확인

공정에 투입되지 않은 연골조직(붉은 선), 및 공정 처리중의 연골조직(파란 선) 및 최종산물(보라선)의 화학적 함량을 조사하였다. 도 9에서 볼 수 있듯이 각각의 샘플에서 동일한 피크가 나타나고 있어, 가공공정 및 멸균에 의해 원료의 특성이 변하지 않음을 나타내고 있다.

실시예 9. 생물학적 안전성 확인

7주령의 Sprague Dawley rat (SD-rat, male)을 입수하여 실험개체에 동물의 일반건강 상태 관찰 및 순화를 위하여 시험 전 1주간의 기간을 사육하였다. 이 후 평균체중에 도달하는 개체를 선별하여 시험을 실시하였다. Zoletile (20mg/kg)과 Xylazine (5mg/kg)을 근육 주사하여 마취를 유도한 후 척추를 기준으로 좌/우에 각각 가로 2cm를 절개하였다. 시험물질을 이식하기 위하여 근막과 진피를 분리하여 pocket을 만들고 0.5cm 크기로 미리 준비해둔 연골이식재를 근육 내 이식하였다. 이식재를 이식한 후 4-0 나일론(nylon)을 이용하여 단순결절봉합으로 결손부위를 봉합하였다. 이식시험 3개월 및 4개월 후 실험개체를 희생시켜 정상조직을 포함하여 이식부위를 적출하여 조직검사를 실시하였다.

3개월째 조직검사 결과, 이식재의 주변에 이식시험에 대해 일반적으로 관찰되는 미약한 염증반응이 관찰되었으나, 관찰되는 염증세포의 세포핵(nucleus)이 활동적이지 않기 때문에 과도한 염증 반응이나 이물반응 없이 체내에 초기 이식 상태 그대로 존재함을 확인할 수 있었다. 4개월째 조직검사 역시 3개월과 유사한 양상을 나타내고 있었으며 미약한 염증반응을 연골이식재의 주변에서 관찰할 수 있었다. 이들은 이식재의 삽입에 의한 자연스러운 현상이며 미약한 염증 반응 이외 특이적인 조직병리학적 현상은 관찰되지 않았다. 또한 이식한 이식재 내부는 모두 불활성화된 연골세포가 변형 없이 그대로 존재하고 있었으며 기타 세포외 기질도 변형 없이 존재하고 있음을 확인하였다. 결과적으로 본 발명에서 개발하고자 하는 이종유래 연골이식재의 안전성을 동물실험을 통해 관찰할 수 있었다.

결국. 본 발명에 따른 생체이식재는 다단계의 처리공정을 통해 항원성, 병원체 및 세포독성을 제거하고 생물역학(biomechanics) 및 조직의 재구성능력에 영향을 끼치지 않고 모든 종류의 병원성이 비활성화된 상태로 제조된다. 인간이 아닌 동물(포유류)의 연골조직을 이용하므로 그 수득과 공급이 원활하고 생체이식재로 적용 시 비용이 저렴하다는 장점이 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

포유류의 연골조직을 준비하는 단계;
상기 준비된 연골조직을 염화나트륨 고장액에 처리하는 단계;
상기 고장액에 처리된 연골조직을 바이러스 불활화 용액으로 처리하는 단계;
상기바이러스 불활화 용액으로 처리된 연골조직을 알카리 용액에 처리하는 단계;
상기 알카리 용액에 처리된 연골조직을 탈수처리 또는 냉동처리하는 단계; 및
상기 탈수처리 또는 냉동처리된 연골조직을 감마선으로 조사하는 단계를 포함하는 연골이식재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 포유류는 돼지, 사람, 말, 소, 개, 쥐로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 연골이식재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 연골조직은 유리연골, 탄성연골 및 섬유연골로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 연골이식재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 포유류의 연골조직을 준비하는 단계는 채취된 연골조직을 [아세톤 또는 메틸알코올] : 클로로포름 = 1 : 1 (v/v) 의 비율로 혼합된 용액에 24~72시간 동안 침지하여 탈지(defatting)시키는 단계를 더 포함하는 연골이식재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 포유류의 연골조직은 돼지의 연골조직인 것을 특징으로 하는 연골이식재의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 돼지의 연골조직은 귀 연골조직(Elastic ear cartilage)또는 늑연골조직(rip cartilage)인 것을 특징으로 하는 연골 이식재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 고장액에 처리하는 단계는 연골조직에 초음파를 인가하면서 6~12% 염화나트륨 용액에 4~6시간 동안 침지하는 것을 특징으로 하는 연골이식재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 바이러스 불활화 용액을 처리하는 단계는 0.5~1.5% 과산화수소, 0.1~1.0%의 과초산계(Peracetic Acid), 70~99% 알코올, 및 0.001~3%의 차아염소산나트륨(NaOCl)을 포함하는 바이러스 불활화 용액에 30분~1시간 동안 침지하는 것을 특징으로 하는 연골이식재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 알카리 용액의 처리는 0.25~0.75M 수산화나트륨(NaOH)에 15~45분 동안 침지하는 것을 특징으로 하는 연골이식재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 탈수처리는 50%, 80% 및 100% 농도의 아세톤에 순차적으로 침지하거나, 무수알코올(absolute alcohol)에 침지하거나, 50%, 80% 농도의 아세톤에 순차적으로 침지한 다음 무수알코올에 침지하거나, 또는 0.1~1%의 항생제 및 90~99.9%의 글리세롤을 포함하는 용액에 연골이식재를 1차 침지한 다음 100% 글리세롤 용액으로 옮겨 2차 침지하는 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 연골이식재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 냉동처리는 상기 알카리 용액에 처리된 연골조직을 -70℃에서 1~2시간 냉동시킨 후, 48~72시간 동안 동결건조시키는 것인 연골이식재의 제조방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따라 제조된 연골이식재.