PL230894B1 - Sposób otrzymywania acelularnej skóry właściwej do przeszczepów tkankowych - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania acelularnej skóry właściwej do przeszczepów tkankowych. Sposób polega na tym, że fragment skóry umieszcza się w komorze z laminarnym przepływem powietrza o klasie czystości A w pomieszczeniu o klasie czystości B, gdzie jedną ze stron fragmentu skóry poddaje się trwałemu znakowaniu poprzez mechaniczne nacięcie, a do usunięcia naskórka z fragmentu skóry jako roztworu enzymu proteolitycznego zastosowano roztwór dispazy o stężeniu od 1 do 3 U/ml rozcieńczony w wodzie destylowanej, natomiast płukanie otrzymanej oznakowanej skóry właściwej prowadzi się w wodzie destylowanej, po czym dla usunięcia komórek z oznakowanej skóry właściwej, jako roztworu do ich usunięcia zawierającego trypsynę i EDTA, zastosowano 0,025 - 0,1% trypsyny rozpuszczonej w 0,1 - 0,5% roztworze EDTA w wodzie destylowanej.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania acelularnej skóry właściwej do przeszczepów tkankowych mający zastosowanie w medycynie regeneracyjnej, zwłaszcza w leczeniu rozległych ran oparzeniowych i uzupełnianiu tkanek miękkich.

Znaną metodą w leczeniu rozległych ran oparzeniowych pełnej grubości III⁰ jest stosowanie autologicznych wolnych przeszczepów skóry pośredniej grubości, jednakże głównym ograniczeniem tej metody jest niedostateczna ilość tzw. pól dawczych - zdrowej, nieuszkodzonej skóry, która mogłaby zostać wykorzystana jako przeszczep. Ponadto pola dawcze stanowią dodatkową, obciążającą organizm ranę i wymagają terapii przeciwbólowej, a gojąc się pozostawiają blizny. W związku z tym często stosuje się jako przeszczep pozbawione komórek substytuty skóry pełniące rolę rusztowania pobudzającego organizm do uruchomienia naturalnych mechanizmów regeneracyjno-naprawczych. Uzyskuje się je działając między innymi enzymami proteolitycznymi na allogeniczną skórę pochodzącą ze zwłok w celu usunięcia komórek. Usunięcie komórkowych komponentów może być prowadzone metodą chemiczną, enzymatyczną bądź mechaniczną i powoduje zminimalizowanie immunologicznie indukowanego procesu zapalnego oraz hamuje proces biodegradacji przeszczepionej bioprotezy. Do tej pory stosowane procedury usuwania komórek ze skóry właściwej w celu uzyskania acelularnej skóry wymagały stosowania długotrwałych, wieloetapowych procedur usuwania komórek. Dodatkowo, proponowane procesy, ze względu na wykorzystywanie w nim detergentów, wymagały przedłużonego czasu płukania otrzymanych pozbawionych komórek substytutów skóry. Ponadto opracowane w taki sposób bioprotezy wymagają końcowej sterylizacji. Przedsięwzięcia logistyczne związane z wykonaniem sterylizacji oraz okres karencji po jej wykonaniu w istotny sposób przedłużają czas produkcji. Ponadto należy podkreślić, że stosowanie jednoetapowej metody usuwania komórek z niewysterylizowanej uprzednio skóry właściwej było w wysokim stopniu nieskuteczne.

Znany jest z amerykańskiego opisu patentowego US2015/0057751 acelularny przeszczep skórny, gdzie dla jego przygotowania tkankę skórną pobraną ze zwłok ludzkich lub z banku tkanek poddano działaniu enzymu proteolitycznego dispazy o stężeniu 1 U/ml, gdzie U-jednostka aktywności enzymów, ang. enzyme unit, następnie poddano mieszaniu w temperaturze 37°C przez 60-120 min. i wytrząsaniu w inkubatorze, a następnie trzykrotnie przemyto w wodzie destylowanej, dla oddzielenia naskórka od skóry właściwej. Otrzymaną skórę właściwą poddano działaniu 1% roztworowi Triton Χ-100 w temperaturze 30°C przez 100 min. w celu usunięcia komórek, a następnie dokonano nacięć o odpowiednich szerokościach, ułatwiających proces transplantacji, poprzez łatwiejszy przepływ krwi. W następnym etapie skórę właściwą poddano procesowi krioprezerwacji. Przed użyciem klinicznym skóry właściwej jej naroża zostały ścięte dla uzyskania gładkiej powierzchni skóry po transplantacji.

Znany jest z amerykańskiego opisu patentowego US20050186286 sposób otrzymywania acelularnej skóry właściwej, w którym jako materiał wyjściowy stosuje się pobrany fragment allogenicznej ludzkiej skóry. Z fragmentu przygotowanej skóry oddziela się naskórek od skóry właściwej poprzez zanurzenie go w roztworze enzymu proteolitycznego i inkubowaniu w nim przez okres od 3 do 4 godzin w temperaturze od 20°C do 37°C. Korzystnie w celu łatwego oddzielenia naskórka od skóry właściwej obróbkę wykonuje się poprzez zanurzenie fragmentu skóry w mieszanym roztworze zawierającym 0,25% wagowych trypsyny i 1 mM kwasu dietylotetraoctowego (EDTA) i inkubowaniu fragmentu skóry w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Ta obróbka pozwala na łatwe oddzielenie naskórka i skóry właściwej. Z uzyskanej w ten sposób skóry właściwej komórki są następnie usuwane za pomocą mieszanki roztworu zawierającego proteazę i środek powierzchniowo czynny.

Znany jest z chińskiego opisu zgłoszeniowego wynalazku CN102218162 sposób przygotowania homologicznej acelularnej matrycy skóry do przeszczepów tkankowych. Sposób obejmuje następujące etapy: usunięcie warstwy naskórkowej z fragmentu skóry, umieszczenie fragmentu oddzielonej warstwy skóry i wytrząsaniu go w hiperosmotycznych roztworach soli, usuwanie składników komórkowych umieszczonych na skórze właściwej w roztworze aseptycznej soli fizjologicznej dodecylosiarczanu sodu (SDS) w celu przeprowadzenia obróbki ultradźwiękowej aby rozbić komórki w celu uzyskania bezkomórkowej matrycy skóry. Po czym następuje etap płukania otrzymanej bezkomórkowej matrycy i umieszczenie jej w trypsynie w celu przeprowadzenia czyszczenia ultradźwiękowego, a następnie ponowne płukanie. Cały proces zakończony jest sterylizacją otrzymanej acelularnej matrycy skóry.

PL 230 894 Β1

Znany jest także z chińskiego opisu zgłoszeniowego wynalazku CN 105079880 sposób przygotowania heterogenicznej, biokompatybilnej, bezkomórkowej matrycy skóry. Sposób obejmuje podzielenie przygotowanego fragmentu skóry na skórę właściwą i naskórek, następnie ich separację i przeprowadzenie procesu usuwania komórek ze skóry właściwej, sieciowanie, dezaktywację wirusów, płukanie otrzymanej bezkomórkowej matrycy skóry oraz jej radiacyjną sterylizację. Bezkomórkowa matryca skóry otrzymana tym sposobem charakteryzuje się niską cytotoksycznością oraz wysoką biozgodnością.

Znany jest z europejskiego opisu patentowego WO 97/08295 sposób otrzymywania kompozytu skórnego, który dotyczy ponownego zasiedlenia otrzymanych wcześniej pozbawionych komórek matryc, które mogą być pochodzenia allogenicznego lub ksenogenicznego. Uzyskany produkt otrzymywany jest w jednoetapowej procedurze.

Celem sposobu według wynalazku było opracowanie na drodze inżynierii tkankowej skutecznego, szybkiego i efektywnego sposobu otrzymywania substytutu skóry właściwej do przeszczepów tkankowych umożliwiającego zastosowanie nowych, skutecznych metod leczenia oparzeń.

Sposób według wynalazku polega na tym, że fragment skóry wysterylizowany radiacyjnie umieszcza się w komorze z laminarnym przepływem powietrza o klasie czystości A w pomieszczeniu o klasie czystości B, gdzie jedną ze stron fragmentu skóry poddaje się trwałemu znakowaniu poprzez mechaniczne nacięcie. Do usunięcia naskórka z fragmentu skóry jako roztworu enzymu proteolitycznego zastosowano roztwór dispazy o stężeniu od 1 do 3 U/ml rozcieńczony w wodzie destylowanej, gdzie U-jednostka aktywności enzymów, natomiast dla usunięcia komórek z oznakowanej skóry właściwej, jako roztworu do ich usunięcia, zastosowano 0,025-0,1% trypsyny rozpuszczonej w 0,1-0,5% roztworze kwasu dietylotetraoctowego w wodzie destylowanej.

Zasadniczą zaletą sposobu według wynalazku jest możliwość łatwego i szybkiego wykorzystania go w leczeniu oparzeń bez konieczności stosowania długotrwałych czynności przygotowawczych, a ponadto substytut skóry przeznaczony do leczenia oparzeń uzyskany tym sposobem charakteryzuje się brakiem cytotoksyczności, ścisłym dopasowaniem do pierwotnej ludzkiej skóry pod względem histologicznym i funkcjonalnym oraz zapewnia redukcję bliznowacenia i deformacji gojącej się rany.

Dzięki prowadzeniu sposobu otrzymywania acelularnej skóry właściwej do przeszczepów tkankowych w komorze z laminarnym przepływem powietrza o klasie czystości A w pomieszczeniu o klasie czystości B, po jego zakończeniu nie jest potrzebne przeprowadzenie długotrwałego procesu finalnej sterylizacji radiacyjnej.

Zastosowane w sposobie według wynalazku trwałego znakowania fragmentu skóry poprzez mechaniczne nacięcie umożliwia odróżnienie błony podstawnej i strony wewnętrznej pozbawionej komórek skóry właściwej dzięki czemu wyeliminowane zostało niebezpieczeństwo związane z niewłaściwym umieszczeniem acelularnej skóry w trakcie jej przeszczepiania do organizmu pacjenta. Ponadto znakowanie mechaniczne zamiast laserowego bądź chemicznego nie ma niekorzystnego wpływu na uzyskaną sposobem według wynalazku acelularną skórę właściwą, a ponadto zwiększa efektywność procesu leczenia.

Dodatkowo zastosowanie roztworu hipotonicznego zawierającego wodę destylowaną do usuwania komórek z oznakowanej skóry właściwej umożliwiło zwiększenie wydajności procesu dezintegracji komórek.

Ponadto dzięki temu, że proces usuwania komórek z ludzkiej skóry właściwej następował z uprzednio wysterylizowanej biostatycznej, allogenicznej skóry ludzkiej cały sposób w porównaniu z dotychczasowymi został istotnie przyspieszony i usprawniony. Molekularny mechanizm tego zjawiska nie został do tej pory wyjaśniony, natomiast znamiennym i udokumentowanym faktem naukowym jest, że zastosowanie procedury sterylizacji radiacyjnej wpływa w określony sposób na strukturę macierzy pozakomórkowej badanych materiałów tkankowych.

Przykład 1

W celu przeprowadzenia sposobu według wynalazku z Pracowni Hodowli Komórek i Tkanek In vitro z Bankiem Tkanek pobrany został uprzednio poddany sterylizacji radiacyjnej dawką 35 kGy allogeniczny, biostatyczny przeszczep skóry ludzkiej.

Pobrany z Banku Tkanek biostatyczny przeszczep skóry ludzkiej, zapakowany w potrójne worki polipropylenowe, został umieszczony w śluzie materiałowej od strony „szarej”. Przeszczep wyjęto po stronie „białej” i usunięto zewnętrzny, trzeci worek. Następnie przeszczep przeniesiono do boxu hodowlanego o klasie czystości powietrza B, a potem usunięto środkowy, drugi worek, a przeszczep

PL 230 894 Β1 w aseptyczny sposób został umieszczony w uprzednio przygotowanej do pracy komorze z laminarnym przepływem powietrza o klasie czystości A umieszczonej w pomieszczeniu o klasie czystości B. Potem przeszczep skóry ludzkiej w postaci fragmentu skóry został wyjęty z wewnętrznego worka i umieszczony na szalce Petriego wypełnionej wodą destylowaną. Fragment skóry został dwukrotnie wypłukany, po czym ułożono go naskórkiem ku górze i poddano trwałemu znakowaniu poprzez mechaniczne nacięcie skalpelem górnej strony. Fragment skóry został nacięty na prawej krawędzi, wykonując większe nacięcie w okolicach dolnej krawędzi a mniejsze nacięcie w części bliższej krawędzi górnej. Dzięki zastosowanemu trwałemu oznakowaniu możliwe było ułożenie fragmentu skóry zawsze blaszką podstawną ku górze.

Następnie w celu usunięcia naskórka z tak oznakowanego fragmentu skóry wykorzystano roztwór enzymu proteolitycznego w postaci 1 U/ml roztworu dispazy rozcieńczonej w wodzie destylowanej. Fragment skóry został umieszczony w szalce Petriego i zalany 5 ml roztworu enzymu proteolitycznego dispaza o stężeniu 1 U/ml, a następnie inkubowano go w temperaturze 37°C przez 3 godziny.

Po etapie inkubacji w dispazie skóra właściwa została oddzielona od naskórka, który został zutylizowany. Uzyskany fragment skóry właściwej posiadający trwałe oznakowanie na jednej stronie wypłukano dwukrotnie w wodzie destylowanej w szalce Petriego. Następnie fragment skóry właściwej umieszczono w czystej szalce Petriego i zalano roztworem usuwającym komórki w postaci 0,1% roztworu trypsyny w 0,1% roztworze kwasu dietylotetraoctowego (EDTA) sporządzonym w wodzie destylowanej. Roztwór usuwający komórki uzyskano poprzez rozpuszczenie 0,1 g trypsyny oraz 0,1 ml 0,5 M EDTA w 100 ml wody destylowanej. Fragment skóry właściwej wstrząsano w roztworze usuwającym komórki przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Przyjęto użycie 10 ml roztworu usuwającego komórki z tkanek na 100 cm² skóry właściwej.

Po zakończonym procesie usuwaniu komórek z fragmentu acellularnej skóry właściwej przepłukano ją trzykrotnie w wodzie destylowanej, a następnie zamrożono w temperaturze - 80°C w celu przechowania tego fragmentu do przeprowadzenia przeszczepu tkankowego. Fragment tkanki przekazano do badań mikrobiologicznych.

Przykład 2

W celu przeprowadzenia sposobu według wynalazku z Pracowni Hodowli Komórek i Tkanek In vitro z Bankiem Tkanek pobrany został uprzednio poddany sterylizacji radiacyjnej dawką 35 kGy allogeniczny, biostatyczny przeszczep skóry ludzkiej.

Pobrany z Banku Tkanek biostatyczny przeszczep skóry ludzkiej, zapakowany w potrójne worki polipropylenowe, został umieszczony w śluzie materiałowej od strony „szarej”. Przeszczep wyjęto po stronie „białej” i usunięto zewnętrzny, trzeci worek. Następnie przeszczep przeniesiono do boxu hodowlanego o klasie czystości powietrza B, a potem usunięto środkowy, drugi worek, a przeszczep w aseptyczny sposób został umieszczony w uprzednio przygotowanej do pracy komorze z laminarnym przepływem powietrza o klasie czystości A umieszczonej w pomieszczeniu o klasie czystości B. Potem przeszczep skóry ludzkiej w postaci fragmentu skóry został wyjęty z wewnętrznego worka i umieszczony na szalce Petriego wypełnionej wodą destylowaną. Fragment skóry został dwukrotnie wypłukany, po czym ułożono go naskórkiem ku górze i poddano trwałemu znakowaniu poprzez mechaniczne nacięcie skalpelem górnej strony. Fragment skóry został nacięty na prawej krawędzi, wykonując większe nacięcie w okolicach dolnej krawędzi a mniejsze nacięcie w części bliższej krawędzi górnej. Dzięki zastosowanemu trwałemu oznakowaniu możliwe było ułożenie fragmentu skórnych zawsze blaszką podstawną ku górze.

Następnie w celu usunięcia naskórka z tak oznakowanego fragmentu skóry wykorzystano roztwór enzymu proteolitycznego w postaci roztworu dispazy rozcieńczonej w wodzie destylowanej o stężeniu 3 U/ml. Fragment skóry został umieszczony w szalce Petriego i zalany 5 ml roztworu enzymu proteolitycznego dispaza o stężeniu 3 U/ml, a następnie inkubowano go w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.

Po etapie inkubacji w dispazie skóra właściwa została oddzielona od naskórka, który został zutylizowany. Uzyskany fragment skóry właściwej posiadający trwałe oznakowanie na jednej stronie wypłukano dwukrotnie w wodzie destylowanej w szalce Petriego. Następnie fragment skóry właściwej umieszczono w czystej szalce Petriego i zalano roztworem usuwającym komórki w postaci 0,025% roztworu trypsyny w 0,5% roztworze kwasu dietylotetraoctowego (EDTA) sporządzonym w wodzie destylowanej.

Roztwór usuwający komórki uzyskano poprzez rozpuszczenie 0,025 g trypsyny oraz 0,5 ml 0.5 M EDTA w 100 ml wody destylowanej. Fragment skóry właściwej wstrząsano w roztworze usuwającym komórki przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Przyjęto użycie 10 ml roztworu usuwającego komórki z tkanek na 100 cm² skóry właściwej.

PL 230 894 Β1

Po zakończonym procesie usuwaniu komórek z fragmentu acelularnej skóry właściwej przepłukano ją trzykrotnie w wodzie destylowanej, a następnie zamrożono w temperaturze - 80°C w celu przechowania tego fragmentu do przeprowadzenia przeszczepu tkankowego. Fragment tkanki przekazano do badań mikrobiologicznych.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   1. Sposób otrzymywania acelularnej skóry właściwej do przeszczepów tkankowych, gdzie z fragmentu wysterylizowanej skóry usuwa się naskórek przy zastosowaniu roztworu dispazy i komórki przy zastosowaniu roztworu enzymu proteolitycznego dla otrzymania skóry właściwej, którą poddaje się płukaniu w wodzie destylowanej, znamienny tym, że fragment skóry wysterylizowany radiacyjnie umieszcza się w komorze z laminarnym przepływem powietrza o klasie czystości A w pomieszczeniu o klasie czystości B, gdzie jedną ze stron fragmentu skóry poddaje się trwałemu znakowaniu poprzez mechaniczne nacięcie, a do usunięcia naskórka z fragmentu skóry jako roztworu enzymu proteolitycznego zastosowano roztwór dispazy o stężeniu od 1 do 3 U/ml rozcieńczony w wodzie destylowanej, gdzie LJ-jednostka aktywności enzymów, natomiast dla usunięcia komórek z oznakowanej skóry właściwej, jako roztworu do ich usunięcia, zastosowano 0,025-0,1% trypsyny rozpuszczonej w 0,1-0,5% roztworze kwasu dietylotetraoctowego w wodzie destylowanej.