CN110732041A - 一种脱细胞小口径血管支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的一种脱细胞小口径血管支架，具有这样的特征：充分的去除了血管上的细胞及核物质等抗原成分，较大程度降低其免疫排斥反应，使其具有良好的顺应性；较好的保留了小口径血管的细胞外基质成分；维持了血管组织原有的胶原纤维、弹性纤维等结构蛋白的构象和空间结构分布，使其力学特性及力学强度与脱细胞前相似；脱除细胞后形成的微观孔隙材料其合适的纤维孔隙提供了天然微环境，有利于宿主细胞的黏附生长及增殖迁移，且无细胞毒性；脱细胞后对材料进行改性，降低血栓形成，提高小口径血管支架的远期通畅率。本发明获得的脱细胞小口径血管支架具有良好的修复、生长及重构的作用。

Description

一种脱细胞小口径血管支架及其制备方法
技术领域
本发明属于组织工程管状材料领域，具体地，涉及一种脱细胞小口径血管支架的制备方法。
背景技术
血管疾病，尤其是动脉粥样硬化，是西方社会死亡率和发病率的主要原因之一，因此由合成聚合物包括多种人工材料包括涤纶(Dacron)和膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)制成的血管移植物在大中口径血管(直径＞6mm)的移植中得到应用，但高血栓形成率及移植后低的远期通畅率限制了这些材料用作小口径人工血管。
自体血管目前是血管旁路移植物材料的最佳选择，然而受限于自体可用血管的数量和血管病变进展，自身移植物的使用存在一些限制，包括来源、同质性、使用数量、使用长度、血管感染等难题。从再生医学的角度出发，自然衍生的生物材料形成的血管在未来小口径血管的应用中具有巨大潜能，其中包括了组织工程体外培养的血管、人源性血管及动物血管。
随着移植血管的免疫排斥反应及其他血管移植手术并发症的发生，有效的降低或减少移植血管的免疫原性具有重要的意义。优良的脱细胞方案能充分的去除了血管上的细胞及核物质等抗原成分，较大程度上降低其免疫排斥反应，使其具有良好的顺应性和生物相容性。目前可用的脱细胞方法受限较多，如脱细胞后细胞外基质成分和力学性能的改变。良好的脱细胞方案，要求细胞与胞核物质完整清除，以降低免疫原性，同时要求最大程度减小组织损伤以保持天然细胞外基质结构，以便维持力学性能。已有的脱细胞方案包括利用物理、化学、酶处理等方法，先将胞膜、核膜溶解，再将胞质与核质溶解，最后将残余细胞成分清除。然而，其中许多方案需要较为严格的反应条件，如高盐，蛋白酶与核酸酶，强酸强碱等，这些条件均影响脱细胞组织的力学完整性以及再内皮化的能力。另外，脱细胞过程中所用溶剂可能残留在脱细胞血管组织中，将在移植后导致严重的炎症反应。因此寻找温和的脱细胞方法，有效地去除残留的核物质成分、试剂残留的同时最大限度维持小口径血管的力学性能，对于制备理想的小口径工程血管具有重大的意义。
发明内容
本发明为解决炎症免疫排斥、脱细胞方案对力学性能的改变及再细胞化的问题提供了一种脱细胞小口径血管支架的制备方法。
一种脱细胞小口径血管支架的制备方法，包括获取小口径血管；将获取的小口径血管进行预处理，化学除垢剂处理，特殊的酶处理，漂洗处理，材料改性处理，整个操作处于无菌条件下进行。
所述的小口径血管的预处理，包括对于获取的血管，小心剔除小口径血管周围的脂肪和结缔组织，并且不损伤血管外膜。
所述的联合化学除垢剂处理，可以是：
(1)将小口径血管置于含有CHAPS化学除垢剂的0.9％(v/v)生理盐水或PBS缓冲液中，缓冲液中的成分还包括NaCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、1％青霉素和链霉素，在15-40℃恒温摇床上处理10-50h。
具体的，将上述处理后的所述小口径血管置于500ml0.9％(v/v)生理盐水或0.01MPBS缓冲液中，在15-40℃恒温摇床上处理2-15h，每个1-3小时，更换新的缓冲液。
(2)将小口径血管置于含有SDS化学除垢剂的0.9％(v/v)生理盐水或PBS缓冲液中，缓冲液中的成分还包括NaCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、1％青霉素和链霉素，在15-40℃恒温摇床上处理10-50h。
具体的，将上述处理后的所述小口径血管置于500ml0.9％(v/v)生理盐水或0.01MPBS缓冲液中，在15-40℃恒温摇床上处理2-15h，每隔1-3小时，更换新的缓冲液。
上述所涉及到的试剂均通过过滤方式进行除菌处理。
所述特殊的酶处理包括：将上述处理后的所述小口径血管置于含有生物酶或人血清或动物血清的0.9％(v/v)生理盐水或PBS缓冲液中，0.9％(v/v)生理盐水或PBS缓冲液成分中含1％的青霉素和链霉素，在25-40℃恒温摇床处理10-50h。
具体的，所述特殊的酶处理包括：将处理后的小口径血管置于含有5％-30％(v/v)生物酶或人血清或相应动物血清的0.9％(v/v)生理盐水或0.01M PBS缓冲液中，0.9％(v/v)生理盐水或0.01M PBS缓冲液中还包括1％(v/v)的青霉素和链霉素，在25-40℃恒温摇床处理10-50h。
所述漂洗处理包括：将处理后的小口径血管置于漂洗液中，所述漂洗液为0.9％(v/v)生理盐水或0.01M PBS缓冲液，在15-40℃恒温摇床处理5-15h，每1-2h更换漂洗液，摇晃速度均匀缓慢。
具体的，所述漂洗处理包括：将上述处理后的所述小口径血管置于500ml0.9％(v/v)生理盐水或0.01M PBS缓冲液中，在15-40℃恒温摇床上处理2-6h，每隔1-2小时，更换新的缓冲液，最后置于含有抗生素的0.9％(v/v)生理盐水及PBS中保存备用。
所述的材料改性处理包含对脱细胞之后的小口径组织工程血管进行肝素接枝、内皮化修饰、基因修饰。
上文提及的所述的CHAPS缓冲液中的成分包括0.01％-0.5％CHAPS、0.1-2mmol/LNaCl、5-50mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、1％青霉素和链霉素。
上文提及的所述的0.9％(v/v)生理盐水的成分包括0.09％NaCl、1％青霉素和链霉素。
上文提及的所述的0.01M PBS缓冲液的成分包括KH2PO42mM、Na2HPO48mM、NaCl136mM、KCL 2.6mM、PH调至7.4，含1％青霉素和链霉素。
上文提及的所述的SDS缓冲液中的成分包括0.01％-0.25％SDS、0.1-2mmol/LNaCl、5-50mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、1％青霉素和链霉素。
上文提及的所述血清溶液，根据血管的不同来源使用不同的血清试剂，其成分包括含2％-15％血清的0.9％(v/v)生理盐水或0.01M PBS缓冲液、1％青霉素和链霉素。
上述步骤在超净台和温度可调的无菌生化培养箱中进行，以确保操作过程的无菌性。
本发明提供了上述方案制备得到的脱细胞小口径血管支架。
本发明具有的优点和效果是：小口径血管相比于大中口径血管，因为管腔小，不容易脱去血管内壁及内层细胞，同时更容易残留洗脱的化学试剂，因此对于小口径血管脱细胞的方式一般需要较为严格的反应条件，如高盐，蛋白酶与核酸酶，强酸强碱等，这将影响脱细胞血管组织的力学性能以及再内皮化的能力。本发明采用联合化学除垢剂的方法，通过较温和的方式，在脱除细胞的同时基本不改变小口径血管的细胞外基质成分、结构及力学性能。进一步的优化是，本发明中采用了天然生物酶，其中富含核酸酶，其参与DNA/RNA降解，能够有效的减少细胞破碎后弥散残留的核物质及抗原成分，很大程度上降低了脱细胞小口径血管的免疫原性，同时，其中也富含生长因子及细胞连接、生长、增殖所必须的其他重要物质，经血清处理过的小口径血管，在植入体内后或在再细胞化的过程中，更有利于宿主细胞的黏附生长及增殖迁移。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图；
图1是本发明一种脱细胞小口径血管支架制备方法及检测的流程图。
图2是本发明小口径血管支架脱细胞前后的对比示意图。
图3是本发明中小口径人脐动脉血管脱细胞前后的HE染色结果图。
图4是本发明中小口径人脐动脉血管脱细胞前后的DNA定量实验结果。
图5是本发明中小口径人脐动脉血管脱细胞前后的扫描电镜图片。
图6是本发明中小口径人脐动脉血管脱细胞前后的胶原纤维及弹性纤维的染色结果图。
图7是本发明中小口径人脐动脉血管脱细胞前后的力学性能。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的内容具体实施方式作进一步说明，所举实例只用于解释本发明，并非限定非发明的使用范围。
实施例1脱细胞人脐动脉支架制备方法
实验材料：人脐动脉
设备：超净台、摇床、无菌生化培养箱
具体培养方法包括以下步骤：
(1)脐动脉的获取：取健康状况佳、胎龄(38～42周)的新生儿脐带，脐带获取由产妇知情同意并自愿捐献(该研究方案获广东省人民医院伦理委员会批准)，长度4-6cm、直径2-3mm，以下操作均在超净台和生化培养箱无菌环境下进行操作；
(2)脐动脉的预处理：小心剥除脐动脉外围的结缔组织，避免损伤脐动脉的外膜，将分离的脐动脉置于无菌PBS适当冲洗，将残留的血液去除干净；
(3)脐动脉的脱细胞：将预处理之后的脐动脉置于500ml含0.05％CHAPS缓冲液(含0.1-2mmol/L NaCl、5-50mmol/L EDTA)中处理20h；然后置于500ml0.9％(v/v)生理盐水中漂洗1h，更换新的0.9％(v/v)生理盐水，重复漂洗5次；接着将上述处理后的脐动脉置于500ml含0.01％SDS缓冲液中处理20h；然后置于500ml0.9％(v/v)生理盐水中漂洗1h，更换新的0.9％(v/v)生理盐水，重复漂洗10次；
(4)血清处理：将脐动脉置于500ml含2％血清的0.01M PBS缓冲液中处理24h，然后置于500ml0.9％(v/v)生理盐水中漂洗1h，更换新的0.9％(v/v)生理盐水，重复漂洗10次，获得脱细胞的脐动脉血管支架；
(5)对照组为新鲜获取的脐动脉小心剥除其外围的结缔组织，避免损伤脐动脉的外膜，将分离的脐动脉置于无菌PBS中漂洗24h。
实施例2脱细胞人脐动脉血管支架的有效性评价
对脱细胞前后的人脐动脉进行HE染色
将本发明实施例制备的脱细胞脐动脉血管支架、和对照组未经化学除垢剂处理的脐动脉进行HE染色，具体步骤如下：将两组脐动脉浸入4％多聚甲醛中固定过夜，次日取出组织，用PBS洗2遍，15min/遍，用50％，70％，80％，90％，95％，100％，100％乙醇梯度脱水，接着浸入二甲苯中20min；然后将两组脐动脉充分浸入热熔的石蜡(54℃～56℃)，在模具中石蜡包埋组织，待其冷却石蜡凝固，取出包埋块，进行石蜡切片，切4mm，40℃水浴展片，防脱载玻片捞片后37℃过夜或60℃恒温箱烘烤2h，然后进行脱蜡和水化处理，将切片浸入二甲苯中5～10min，再转移至依次梯度乙醇(100％，100％，95％，90％，80％，75％)，最后放入蒸馏水中，清洗5min，清洗后可进行HE染色处理。实验结果如图3所示，HE染色使细胞核呈蓝色，胞浆及细胞外基质呈红色，与未使用化学除垢剂脱细胞的脐动脉相比，脱细胞后未见细胞和核物质的存在，细胞外基质保留的较完整。
对脱细胞前后的人脐动脉进行DNA定量
将本发明实施例制备的脱细胞脐动脉血管支架、和对照组未经化学除垢剂处理的脐动脉进行DNA定量，具体步骤如下：将脱细胞前后的脐动脉剪碎，置于真空低温干燥仪里玻璃管内，滤纸封口放入-80℃的真空低温干燥仪里干燥过夜(不同仪器具体时间不同)，称取10mg冻干粉(干重)于15ml离心管中，加入10ml木瓜酶缓冲液，60℃消化过夜，待消化完全后离心，取上清于96孔板中再与等体积quant-iT PicoGreen双链DNA反应液一起孵育；用多功能酶标仪以波长485nm的激发光和波长530nm的散射光测定荧光强度，以λDNA作标准参量。根据测量的吸光度分别计算脱细胞前后的脐动脉的DNA含量。实验结果如图4所示，与未使用化学除垢剂脱细胞的脐动脉相比，脱细胞后的DNA含量显著降低，几乎不含。
实施例3脱细胞人脐动脉血管支架的成分、结构检测
对脱细胞前后的人脐动脉进行扫描电镜
将本发明实施例制备的脱细胞脐动脉血管支架、和对照组未经化学除垢剂处理的脐动脉进行扫描电镜实验，具体步骤如下：将两组脐动脉在2.5％的戊二醛溶液中4℃固定4h，倒掉固定液，PBS漂洗样品，然后乙醇梯度脱水，乙酸异戊酯置换乙醇2次，将标本分别在-20℃、-40℃、-80℃冷冻12h，于冷冻干燥仪中干燥12h，制备好标本备用。利用扫描电镜观察前进行金属喷镀，为使样品导电，在样品表面喷一层厚度约100埃的金膜，处理好的样品在扫描电镜中观察。实验结果如图5所示，与未使用化学除垢剂脱细胞的脐动脉相比，脱细胞后的内皮细胞完全清除，仅保留了细胞外基质，纤维排列连续，形成合适的孔隙结构，脱细胞血管超微结构保持完整，对于细胞黏附生长及增殖迁移提供了有利基础。
对脱细胞前后的人脐动脉进行Masson和EVG染色
将本发明实施例制备的脱细胞脐动脉血管支架、和对照组未经化学除垢剂处理的脐动脉进行Masson和EVG染色，具体步骤如下：将两组脐动脉浸入4％多聚甲醛中固定过夜，次日取出组织，用PBS洗2遍，15min/遍，用50％，70％，80％，90％，95％，100％，100％乙醇梯度脱水，接着浸入二甲苯中20min；然后将两组脐动脉充分浸入热熔的石蜡(54℃～56℃)，在模具中石蜡包埋组织，待其冷却石蜡凝固，取出包埋块，进行石蜡切片，切4mm，40℃水浴展片，防脱载玻片捞片后37℃过夜或60℃恒温箱烘烤2h，然后进行脱蜡和水化处理，将切片浸入二甲苯中5～10min，再转移至依次梯度乙醇(100％，100％，95％，90％，80％，75％)，最后放入蒸馏水中，清洗5min，清洗后可进行Masson和EVG染色处理。实验结果如图6所示，Masson染色除了使胞浆呈红色，细胞核呈黑蓝色外，还能将胶原纤维呈蓝色；EVG染色使弹性纤维和细胞核呈黑色，胶原纤维呈红色。脱细胞前后用Masson染色和EVG染色结果显示细胞外基质中的胶原纤维和弹性纤维在脱细胞血管中很好的保存下来。
实施例4脱细胞人脐动脉血管支架的力学性能检测
对脱细胞前后的人脐动脉进行拉力试验
将本发明实施例制备的脱细胞脐动脉血管支架、和对照组未经化学除垢剂处理的脐动脉进行拉力试验，具体步骤如下：将脱细胞前后的脐动脉沿纵轴剪开，将组织切片的两端按轴向固定在夹具上，使用Instron 5967进行力学分析。先进行三个拉伸循环预处理至15％应变，再开始正式测量，拉伸速度一直保持为10mm/min，拉直至断裂。在机械调试之前和测试期间，组织用PBS保持湿润。实验结果如图7所示，脱细胞前后的最大应力和最大应变无明显的统计学差异(P>0.05)。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种脱细胞小口径血管支架的制备方法，其特征在于，获取小口径血管；将获取的小口径血管进行预处理，化学除垢剂处理，特殊的酶处理，漂洗处理，材料改性处理，整个操作处于无菌条件下进行。
2.根据权利要求1所述的脱细胞小口径血管支架的制备方法，其特征在于，所述预处理步骤包括：剔除小口径血管周围的脂肪和结缔组织，并且不损伤血管外膜。
3.根据权利要求1所述的脱细胞小口径血管支架的制备方法，其特征在于，所述化学除垢剂处理包括：将预处理后的小口径血管置于含有化学除垢剂的0.9％(v/v)生理盐水或PBS缓冲液中，在15-40℃恒温摇床上处理10-50h。
4.根据权利要求3所述的脱细胞小口径血管支架的制备方法，其特征在于，所述化学除垢剂为CHAPS，或SDS，或Triton X-100、脱氧胆酸钠、胆酸钠、低渗/高渗Tris缓冲液、二巯基苏糖醇、聚乙二醇中的一种或两种及两种以上的联合。
5.根据权利要求4所述的脱细胞小口径血管支架的制备方法，其特征在于，所述化学除垢剂处理包括：将预处理后的小口径血管置于CHAPS缓冲液或SDS缓冲液中，在15-40℃恒温摇床处理10-50h，所述的CHAPS缓冲液或所述的SDS缓冲液成分中还包括0.1-2mmol/LNaCl、5-50mmol/L乙二胺四乙酸及1％(v/v)青霉素和链霉素。
6.根据权利要求1所述的脱细胞小口径血管支架的制备方法，其特征在于，所述特殊的酶处理包括：将处理后的小口径血管置于含有5％-30％(v/v)生物酶或人血清或相应动物血清的0.9％(v/v)生理盐水或0.01M PBS缓冲液中，0.9％(v/v)生理盐水或0.01M PBS缓冲液中还包括1％(v/v)的青霉素和链霉素，在25-40℃恒温摇床处理10-50h。
7.根据权利要求1所述的脱细胞小口径血管支架的制备方法，其特征在于，所述漂洗处理包括：将处理后的小口径血管置于漂洗液中，所述漂洗液为0.9％(v/v)生理盐水或0.01MPBS缓冲液，在15-40℃恒温摇床处理5-15h，每1-2h更换漂洗液，摇晃速度均匀缓慢。
8.根据权利要求1所述的脱细胞小口径血管支架的制备方法，其特征在于，所述的材料改性处理包含对脱细胞之后的小口径组织工程血管进行肝素接枝、内皮化修饰、基因修饰。
9.由权利要求1至8任一所述的制备方法获取的脱细胞小口径血管支架。
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