ES2628441T3 - Productos vasculares acelulares - Google Patents

Abstract

Un método de preparación de un tejido vascular xenogénico acelular natural, comprendiendo el método la obtención de un vaso sanguíneo donante adecuado y sometiéndolo a las siguientes etapas metodológicas: (i) una incubación previa al tratamiento con ácido etilendiaminotetraacético 200 mM (EDTA) durante al menos 24 horas a aproximadamente 4ºC; (ii) un lavado de desinfección; (iii) al menos dos ciclos de una incubación con un regulador hipotónico y un detergente aniónico; (iv) un tratamiento de nucleasa; (v) un lavado hipertónico; y (vi) un proceso terminal de esterilización.

Description

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DESCRIPCION

Productos vasculares acelulares

Esta invencion se refiere a matrices xenogenicas acelulares y en particular a productos vasculares de diametro pequeno y medio tales como arterias acelulares que son ffsicamente compatibles y no inmunogenicas. La invencion incluye, entre otros, los usos de los productos acelulares particularmente en la cirugfa de derivacion vascular y los metodos para la elaboracion de las matrices vasculares acelulares.

Antecedentes

La activacion del complemento es un potente mediador e indicador de diagnostico de inflamacion y rechazo en trasplantes de organos solidos. Mecanicamente, una serie de moleculas efectoras en la cascada del complemento median funciones proinflamatorias que pueden explicar la quimiotaxis y la activacion de celulas del sistema inmune innato, tales como granulocitos y monocitos. Simultaneamente, muchos de estos mismos mediadores del complemento activan e interrumpen la interfaz de la celula endotelial entre el receptor y el trasplante, ademas, el complemento puede estimular los linfocitos B y T del sistema inmune adaptativo. El complemento tambien participa en la eliminacion no inflamatoria de las celulas apoptoticas. Por lo tanto, la cascada del complemento puede ser activada por multiples mecanismos y diversos componentes del complemento pueden modular la respuesta a los trasplantes en diferentes direcciones.

Hasta la fecha, ningun ensayo de xenotrasplante ha tenido un exito completo debido a los muchos obstaculos que surgen de la respuesta del sistema inmune del receptor. Esta respuesta, que es generalmente mas extrema que en los alotrasplantes, finalmente da como resultado el rechazo del xenoinjerto. Existen varios tipos de rechazo de un xenoinjerto: rechazo hiperagudo y rechazo vascular agudo que se deben a la respuesta del sistema inmune humoral y al rechazo celular, y al rechazo cronico que se basa en la inmunidad celular.

El rechazo hiperagudo esta mediado por la union de anticuerpos naturales xenorreactivos (XNA) al endotelio del donante que provoca la activacion del sistema del complemento humano, el objetivo principal de los epftopos XNA es el epftopo a-gal (gala1-3galp1-(3)4glcnac-r) que esta abundantemente presente en glicoftpidos y glicoprotemas de mamfteros no primates y monos del nuevo mundo debido a la glicosilacion por la enzima a1,3galactosiltransferasa (a1,3 gt). En humanos, simios y monos del viejo mundo, este epftopo esta ausente porque el gen a1,3gt se inactivo en primates ancestrales del viejo mundo. En cambio, los seres humanos, los simios y los monos del viejo mundo producen el anticuerpo anti-gal, que interactua espedficamente con los epftopos a-gal y que constituye el 1% de las inmunoglobulinas circulantes. La respuesta inmune debida a los epftopos a-gal es un factor importante en el fracaso de un trasplante xenogenico de organos y tejidos. La eliminacion de la interaccion entre los anticuerpos anti-gal naturales y los epftopos a-gal en los xenoinjertos es un requisito previo para el exito de los xenoinjertos en seres humanos. Anti-gal ha funcionado como una barrera inmunologica, que evita el trasplante de organos de cerdo en los seres humanos, porque anti-gal se une a los epftopos a-gal expresados en las celulas de cerdo. Se conoce a partir de la tecnica anterior como generar cerdos modificados geneticamente para inactivar a-1,3 que carecen de epftopos a-gal que ha dado como resultado la eliminacion parcial de esta barrera inmunologica y por lo tanto vencer parcialmente el rechazo hiperagudo, sin embargo, la produccion transgenica de cerdos es costosa y consume mucho tiempo. Ademas, todavfa se expresan niveles bajos, pero potencialmente significativos de gal-a(1,3)gal en los tejidos de animales modificados geneticamente para inactivar a1,3gt, lo que indica que esta implicada otra glicosiltransferasa en la smtesis de este epftopo (Milland y colaboradores, Immunol. Cell Biol 2005, 83, 687-693). Tambien se sabe de la tecnica anterior que la a-galactosidasa de granos de cafe verde y la a-galactosidasa humana recombinante pueden eliminar epftopos a-gal de la superficie celular de tejidos tales como la valvula aortica porcina y el tejido pericardico, pero los tratamientos enzimaticos tienen limitaciones no solo sobre la rentabilidad, sino que tambien puede afectar la histoarquitectura del tejido y dejar residuos enzimaticos indeseables. Con el fin de superar el rechazo hiperagudo tambien se sabe que se inhibe la cascada del complemento del receptor mediante el uso del factor de veneno cobra (que agota C3), el receptor del complemento soluble tipo 1, los anticuerpos anti-C5 o el inhibidor C1 (C1-INH). Las desventajas de este enfoque incluyen la toxicidad del factor de veneno de cobra, y lo mas importante, estos tratamientos privanan al individuo de un sistema de complemento funcional. En cuanto al rechazo vascular agudo, este tipo de rechazo se produce en xenoinjertos discordantes dentro de 2 a 3 dfas, si se evita el rechazo hiperagudo. El proceso es mucho mas complejo que el rechazo hiperagudo y actualmente no se entiende completamente, sin embargo, si se evita el rechazo vascular hiperagudo y agudo, es posible la supervivencia del xenoinjerto a pesar de la presencia de XNA circulantes. El injerto recibe una pausa del rechazo humoral cuando se interrumpe la cascada del complemento, se eliminan los anticuerpos circulantes, o se cambia su funcion o se produce un cambio en la expresion de los anrtgenos de superficie en el injerto. Esto permite que el xenoinjerto sobrerregule y eventualmente exprese genes protectores.

Por lo tanto, es deseable que las matrices vasculares xenogenicas acelulares no activen el complemento. Tambien es deseable que las matrices vasculares xenogenicas acelulares esten desprovistas de componentes antigenicos y especialmente epftopos a-gal con el fin de mitigar las reacciones inflamatorias mediadas por anticuerpos. Tambien es deseable proporcionar un metodo alternativo y mas rentable de preparar productos vasculares de diametro pequeno y medio para la cirugfa de desviacion. Tambien es deseable proporcionar matrices vasculares xenogenicas acelulares para el trasplante que carezcan de residuos enzimaticos de a-galactosidasa residual.

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Breve resumen de la divulgacion

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un producto como se define en la reivindicacion 7, que comprende

una matriz de tejido vascular xenogenico acelular natural que tiene al menos una reduccion del 80% en el contenido de ADN en comparacion con una matriz de tejido vascular de control sin tratar, estando el producto sustancialmente libre de epftopos capaces de reaccionar con anticuerpos humanos preformados y tambien sin la capacidad de activar sustancialmente el complemento.

La referencia en la presente memoria descriptiva a "sin la capacidad de activar sustancialmente el complemento" indica que el producto de la invencion tiene aproximadamente el mismo nivel de activacion del complemento que las arterias femorales humanas frescas en un ensayo de activacion del complemento.

El tejido vascular xenogenico acelular esta sustancialmente exento de epftopos a-gal.

La referencia en la presente memoria a "sustancialmente libre de epftopos capaces de reaccionar con anticuerpos humanos preformados" indica que el producto de la presente invencion tiene aproximadamente el mismo nivel de epftopos a-gal que las arterias femorales humanas frescas o acelulares.

Preferiblemente, la matriz de tejido vascular xenogenico acelular puede tener una reduccion en el contenido de ADN en comparacion con una matriz de tejido vascular no tratado o natural de control de por lo menos el 80% o mas, es decir, puede tener una reduccion de cualquier numero entero mayor que 80% y como maximo del 100%.

Preferentemente, el tejido vascular es de origen porcino o bovino. Preferiblemente, el tejido vascular derivado de porcino es un vaso sangumeo de diametro pequeno o medio y mas preferiblemente es o bien una arteria iftaca externa porcina (EIA) o una arteria carotida interna porcina (ICA).

Se apreciara que el tejido vascular tambien puede derivarse de otras especies de mamferos tales como, y sin limitacion, ovinos o llamas, especies aviares grandes (por ejemplo, avestruz) y especies marsupiales grandes (por ejemplo, canguro).

Se apreciara que el tejido vascular puede ser tambien un vaso sangumeo de gran diametro, por ejemplo, aorta de porcino o de bovino.

La referencia aqm a vasos sangumeos de "diametro pequeno" es un termino aceptado en la tecnica y se refiere a vasos sangumeos con un diametro interior o interno de menos de 6 mm, mientras que "diametro medio" se refiere a vasos sangumeos que tienen un diametro interior o interno de entre 6 a 15 mm y "diametro grande" se refiere a vasos sangumeos que tienen un diametro interior o interno de alrededor de 25 mm.

En las realizaciones de la invencion en las que la matriz de tejido vascular xenogenico acelular se deriva de bovinos, el tejido vascular se selecciona del grupo que comprende arteria carotida, arteria mamaria interna, arteria toracica interna, vena mesenterica y vena yugular.

Preferentemente, el tejido vascular xenogenico acelular tiene un contenido de colageno, glicosaminoglicano y elastina equivalente o no sustancialmente diferente en comparacion con tejido fresco o no tratado.

Los niveles de colageno tfpicos de tejido de ICA no tratado fresco estan en el intervalo de 400-1000 pg/mg y mas preferiblemente en el intervalo de 600-800 pg/mg y para EIA estan en el intervalo de 200-1000 pg/mg y mas preferiblemente en el intervalo de 450-650 pg/mg. Tfpicamente, los niveles de glicosaminoglicanos de los tejidos frescos no tratados de ICA y EIA estan en el intervalo de 25-200 pg/mg y mas preferiblemente en el intervalo de 50-100 pg/mg.

Preferentemente, el tejido vascular xenogenico acelular tiene un valor equivalente o no significativamente diferente para los valores de la presion de rotura, retencion de la sutura, resistencia a la traccion final, dilatacion y fallo de baja velocidad de deformacion en comparacion con el tejido fresco o no tratado.

Tfpicamente, la presion de ruptura media del tejido de ICA y EIA no tratado fresco es superior a 3.000 mm de Hg, tfpicamente la retencion de sutura de tejido de ICA y EIA no tratado fresco esta en el intervalo de 1-5 N, tfpicamente el fallo de baja velocidad de deformacion de ICA y EIA no tratada fresca es la direccion axial esta en el intervalo de 2,5 a 6,5 MPa y mas preferiblemente esta en el intervalo de 3,5 a 5,5 MPa y en la direccion circunferencial esta en el intervalo de 1 a 6 MPa y mas preferiblemente esta en el intervalo de 2 a 5 MPa, tfpicamente la resistencia a la traccion final media de los tejidos de ICA y EIA no tratados frescos esta en el intervalo de 3 a 5 MPa.

Preferiblemente, una longitud tfpica de tejido vascular xenogenico acelular derivado de porcino es de hasta aproximadamente 30 cm y hasta aproximadamente 80 cm para tejido derivado de bovino.

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El tejido vascular xenogenico acelular de la presente invencion es una estructura natural, es dedr, no esta alterado geneticamente y esta sustancialmente exento de cualquier residuo de enzima a-galactosidasa. Ademas, tiene ventajosamente aproximadamente las mismas propiedades bioqmmicas y mecanicas que el tejido fresco o no tratado de modo que actua como un tejido fresco o no tratado mientras que sea eficazmente antigenicamente inerte. En consecuencia, es un producto candidato ideal para el trasplante y mediante cirugfa de reemplazo de derivacion. Preferiblemente, el tejido vascular xenogenico acelular comprende ademas un recubrimiento, siendo proporcionado el recubrimiento por un material adecuado revestido sobre una o ambas de una superficie interna (lumen) o la superficie externa de la misma. Esta realizacion de la invencion es de particular utilidad para injertos vasculares.

Preferentemente, se selecciona el material de recubrimiento para mejorar la permeabilidad del vaso, o para ayudar/ restablecer el lumen del vaso o el revestimiento endotelial en la superficie interior del lumen del vaso.

Preferiblemente, el recubrimiento es un recubrimiento luminal y el material de recubrimiento se selecciona del grupo que comprende: anticoagulantes tales como heparina, inhibidores de pentasacaridos sinteticos, inhibidores directos de trombina, antagonistas de vitamina K, inhibidores del Factor Xa, plata, colageno IV, elastina, glicoprotemas tales como laminina o fibronectina, glicosaminoglicanos tales como hialuronano, sulfato de condroitina y peptidos sinteticos o naturales o mezclas de los mismos.

Preferiblemente, el tejido vascular xenogenico acelular puede sembrarse con una poblacion unica o mixta de celulas sembradas sobre el mismo o en el, siendo seleccionada la poblacion celular de acuerdo con un sitio de trasplante y siendo seleccionada del grupo que comprende celulas epiteliales tales como celulas endoteliales, mesoteliales o celulas de musculo liso, FIBROBLASTOS, celulas madre pluripotentes y multipotentes tales como celulas madre adultas autologas y alogenicas, celulas madre hematopoyeticas, mesenquimales, neuronales, endoteliales y embrionarias.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invencion, se proporciona un metodo de preparacion de un tejido vascular xenogenico acelular natural, comprendiendo el metodo la obtencion de un vaso sangumeo de reemplazo adecuado y someterlo a las siguientes etapas metodologicas:

(i) una incubacion previa al tratamiento con acido etilendiaminotetraacetico 200 mM (EDTA) durante al menos 24 horas a aproximadamente 4 grados Celsius;

(ii) un lavado de desinfeccion;

(iii) al menos dos ciclos de una incubacion con un regulador hipotonico y un detergente anionico;

(iv) un tratamiento de nucleasa;

(v) un lavado hipertonico; y

(vi) un proceso terminal de esterilizacion.

Preferiblemente, las etapas (i) y (ii) pueden realizarse en orden inverso, de hecho, las etapas de la presente invencion no estan restringidas al orden dado anteriormente y no pretenden limitar el alcance de la invencion.

La incubacion previa al tratamiento con EDTA se realiza en una solucion reguladora hipertonica tal como por ejemplo un TRIS 50 mM, NaCl 1,5 M y EDTA 200 mM en tal regulador hipertonico a alrededor de 4°C durante al menos 24 horas. La solucion hipertonica tiene un pH aproximadamente fisiologico que es muy ligeramente alcalino y esta aproximadamente a un pH de entre 7,2 a 7,4.

Preferentemente, el primer lavado desinfectante de la etapa (ii) comprende un lavado en una solucion reguladora hipotonica que comprende vancomicina, gentamicina y polimixina, un penodo de lavado adecuado es de aproximadamente 30 minutos a una temperatura de aproximadamente 37°C.

Preferiblemente, la etapa de incubacion hipotonica de la etapa (iii) comprende una primera incubacion con un regulador hipotonico que comprende tipicamente TRIS 10 mM y posteriormente con un regulador hipotonico que comprende adicionalmente EDTA 2,7 mM, 10 KIU/mL de aprotinina. Las condiciones de incubacion estan tfpicamente entre 24 y 56 horas a aproximadamente 4°C. Para una incubacion adicional, el regulador hipotonico comprende adicionalmente un detergente anionico tal como SDS a aproximadamente una concentracion de 0,1% (p/v), durante esta parte de la incubacion la temperatura es de aproximadamente 37°C. Este ciclo de incubaciones puede repetirse una o mas veces.

Preferiblemente, el tejido puede ser lavado repetidamente en solucion salina regulada con fosfato de Dulbecco antes de someter el tejido al tratamiento con nucleasa de la etapa (iv). El tratamiento con nuclease comprende tfpicamente una incubacion durante aproximadamente 3 horas a 37°C en una solucion de nuclease que comprende TRIS 50 mM, 50 U/mL de ADNasa y 1 U/mL de ARNasa. El tejido se lava luego repetidamente antes de la etapa (v).

Preferiblemente, la incubacion hipertonica de la etapa (v) comprende una incubacion durante aproximadamente 24 horas a 37°C en TRIS 50 mM, NaCl 1,5 M. El tejido se lava repetidamente antes de la etapa (vi).

Preferiblemente, el procedimiento de esterilizacion terminal proporciona un aclaramiento viral y una reduccion de la carga biologica para el tejido vascular xenogenico acelular antes del almacenamiento o trasplante en un receptor.

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La etapa de esterilizacion terminal puede realizarse idealmente mediante uno o mas de los siguientes procedimientos, por ejemplo: incorporacion o recubrimiento de agentes antimicrobianos tales como antibioticos, defensinas y metales tales como Ag+2; tratamiento con un agente de entrecruzamiento tal como glutaraldehftdo, carbodiimidas; tratamiento con agentes esterilizantes tales como acido peracetico, oxido de etileno, oxido de propileno e hidroxido sodico, irradiacion, por ejemplo, con radiacion y o haces de electrones y tratamiento con CO2 supercrftico.

La etapa de esterilizacion puede ser, por ejemplo, un segundo lavado de desinfeccion que comprende una etapa que comprende una incubacion con acido peracetico a una concentracion de aproximadamente 0,1% v/v durante aproximadamente 4 horas a 37°C. El tejido se puede lavar posteriormente con una solucion de limpieza terminal adecuada tal como solucion salina regulada con fosfato de Dulbecco.

Preferiblemente, el metodo incluye ademas la etapa de recubrir una superficie interna y/o externa de cualquier tejido vascular xenogenico acelular natural con un agente de recubrimiento como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Preferiblemente, el metodo incluye ademas la etapa de siembra del tejido vascular xenogenico acelular natural con una poblacion de celulas unica o mixta como se ha descrito anteriormente.

Los tejidos vasculares tales como las arterias son efectivamente tubulares y por lo tanto es muy diffcil asegurar que las superficies internas del lumen arterial sean suficientemente tratadas para eliminar los epftopos capaces de reaccionar con anticuerpos humanos preformados y epftopos capaces de activar el complemento. En una realizacion de la invencion, el tejido vascular puede ser perfundido con medios fluidos que se mueven continuamente. Ademas, o alternativamente, el tejido vascular tambien puede distenderse durante las etapas de preparacion e incubacion, con el fin de adelgazar las paredes del tejido vascular para favorecer la penetracion de los diversos fluidos. Los inventores han demostrado que la metodologfa de la presente invencion da como resultado un tratamiento exitoso incluso para superficies internas.

De acuerdo con aun un aspecto adicional de la invencion, se proporciona un producto que comprende un producto de tejido de matriz de tejido vascular xenogenico acelular natural que puede ser obtenido por los metodos de la invencion para su uso como tejido de trasplante.

Preferiblemente, el producto de tejido de trasplante es para uso en cirugfa de derivacion y especialmente cirugfa de derivacion coronaria y de extremidades, tambien es para uso de acceso vascular por ejemplo acceso AV.

Las realizaciones de la invencion que utilizan tejido vascular derivado de bovinos son de particular utilidad en la cirugfa de derivacion de extremidades y como medio de acceso vascular debido a que la longitud del material vascular esta en el intervalo de hasta 80 cm de longitud.

Breve descripcion de los dibujos

A continuacion, se describen adicionalmente realizaciones de la invencion con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo del protocolo de descelularizacion para producir tejido acelular.

La Figura 2 muestra la carotida interna porcina (ICA) en las Figuras 2a-H y las arterias iftacas externas (EIA) en las Figuras I-L tratadas usando dos ciclos de regulador hipotonico y solucion SDS (1 mg.mL-1) y luego tenidas usando hematoxilina y eosina.

La Figura 3 muestra ICA porcina (C-D) y EIA (E-F) tratada usando dos ciclos de regulador hipotonico y solucion de SDS (1 mg.mL-1) y tenida usando DAPI. Se usaron ICA (A) y EIA (B) porcinas frescas como controles positivos.

La Figura 4 muestra EIA porcina fresca (C) y acelular tratada usando dos ciclos de regulador hipotonico y solucion de SDS (1 mg.mL'1), las Figuras D y E se marcan usando un anticuerpo monoclonal contra el epftopo a-Gal o un control de isotipo (F). Se uso piel porcina fresca como control positivo (A, B).

La Figura 5 muestra ICA acelular tratada usando EDTA 200 mM a 4°C (E-) y un ciclo de regulador hipertonico a 37°C y marcada usando un anticuerpo monoclonal contra el epftopo a-Gal. Las Figuras 5A, B, E y F se marcan con anticuerpo crudo, las Figuras C y G con 0,39 mg.mL-1 de anticuerpo purificado y las Figuras D y H con 0,16 mg.mL-1 de anticuerpo puro.

La Figura 6 muestra EIA acelular preparada de acuerdo con el protocolo de la Figura 1 y marcada usando un anticuerpo monoclonal contra el epftopo a-Gal, purificado (A), adsorbido contra BSA (B) o adsorbido contra BSA con a-Gal (C) o un control de isotipo de IgM (D).

La Figura 7 muestra ICA acelular marcada utilizando un anticuerpo monoclonal contra el epftopo a-Gal, purificado (A),

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adsorbido contra BSA (B) o adsorbido contra BSA con a-Gal (C) o un control de isotipo de IgM (D).

La Figura 8 muestra un ELISA para la deteccion de anticuerpos para el epftopo a-Gal despues de la adsorcion con vasos alogenicos frescos y acelulares, porcinos y humanos. Los datos se expresan como la media (n = 6) ± 95% de los lfmites de confianza. * representa una diferencia significativa como la determinada por ANOVA unidireccional y prueba T post hoc. ICA porcina fresca ICA; ICA acelular porcina AICA; arteria femoral comun CFA humana fresca; arteria femoral comun humana acelular ACFA; arteria ilfaca externa porcina fresca EIA; arteria ilfaca externa porcina acelular AEIA; controles sin tejido NTC.

La Figura 9 muestra el contenido de colageno, colageno desnaturalizado y de proteoglicano sulfatado de EIA porcina fresca y acelular (Figura 9A) e ICA (Figura 9B). Los datos se expresan como la media (n = 6) ± 95% de los lfmites de confianza.

La Figura 10 muestra celulas de rinon de hamster bebe cultivadas con adhesivo de contacto de cianoacrilato (A), gel de colageno (B, E), o EIA porcina acelular (C, F) e ICA (D, G) durante 48 horas, observadas usando microscopfa de contraste de fases y tenidas utilizando tintura de Giemsa.

La Figura 11 muestra celulas 3T3 murinas cultivadas con adhesivo de contacto de cianoacrilato (A), gel de colageno (B, E) o EIA porcina acelular (C, F) e ICA (D, G) durante 48 horas, observadas usando microscopfa de contraste de fases y tenidas utilizando tintura de Giemsa.

La Figura 12 muestra el contenido relativo de ATP de celulas 3T3 de raton incubadas con muestras de extracto de EIA porcina fresca o acelular (Figura 12B) e ICA (Figura 12A) o celulas de rinon de hamster bebe incubadas con muestras de extracto de EIA porcina fresca o acelular (Figura 12D) e ICA (Figura 12C) siendo cada muestra incubada con DMSO al 40% (v/v), que se utilizo como un control positivo para la citotoxicidad y DMEM como un control negativo para la citotoxicidad. Los datos se expresan como la media (n =6) ± 95% de los lfmites de confianza. * representa una diferencia significativa con el control de DMEM segun se determina mediante ANOVA unidireccional y prueba T post hoc.

La Figura 13 muestra la cuantificacion de ADN extrafdo de EIA y ICA porcina fresca y acelular, de arterias femorales comunes humanas frescas y acelulares (CFA), Surgisis, Permacol y CollaMend usando absorbancia a 260 nm. Los datos se expresan como la media (n = 3) ± 95% de los lfmites de confianza

La Figura 14 muestra ensayos de retencion de sutura de EIA e ICA porcina fresca y acelular. Los datos se expresan como la media (n = 6) ± 95% de los lfmites de confianza.

La Figura 15 muestra la prueba de dilatacion de ICA (A, B) y EIA (C, D) porcina fresca y acelular, los datos representan un cambio porcentual en el diametro de la rafz en funcion de la presion interna creciente. Eje X (A, C) o eje Y (C, D). Los datos se expresan como la media (n = 3) ± 95% de los lfmites de confianza, los datos han sido transformados con arcoseno para realizar un analisis estadfstico prospectivo y retrospectivo.

La Figura 16 muestra la resistencia a la traccion final circunferencial y axial de EIA (A) e ICA (B) porcina fresca y acelular. Los datos se expresan como la media (n = 6) ± 95% de los lfmites de confianza.

La Figura 17 muestra la pendiente de la fase circunferencial y axial del colageno de EIA (A) e ICA (B) porcina fresca y

acelular. Los datos se expresan como la media (n = 6) ± 95% de los lfmites de confianza.

La Figura 18 muestra la pendiente de la fase de elastina circunferencial y axial de EIA (A) e ICA (B) porcina fresca y acelular. Los datos se expresan como la media (n = 6) ± 95% de los lfmites de confianza.

La Figura 19 muestra ELISA para la deteccion de (a) C3a o (b) C5a despues de la reaccion de suero humano normal

con plastico de cultivo de tejido, PBS, BSA, BSA con a-Gal o zimosano. Los datos se expresan como la media (n = 6) ± 95% de los lfmites de confianza, * representa una diferencia significativa [en comparacion con el poliestireno], segun se determina mediante ANOVA unidireccional y la prueba T post hoc.

La Figura 20 muestra ELISA para la deteccion de (a) C3a o (b) C5a despues de la reaccion de suero humano normal con plastico de cultivo de tejido, PBS, BSA, BSA con a-Gal o zimosano o una gama de estructuras biologicas acelulares comercialmente disponibles (Surgisis, CollaMend, Permacol). Los datos se expresan como la media (n = 6) ± 95% de los lfmites de confianza, * representa una diferencia significativa [en comparacion con el poliestireno], segun se determina mediante ANOVA unidireccional y la prueba T post hoc. Pericardio, pericardio fresco porcino; ureter, ureter porcino fresco, ICA, ICA porcina fresca, EIA, arteria ilfaca externa porcina fresca, AICA, ICA porcina acelular, CFA, arterias femorales comunes humanas frescas, AP, pericardio acelular porcino, AU, ureter porcino acelular, AICA, arteria carotida interna acelular porcina, AEIA, arteria ilfaca externa porcina acelular, ACFA, arteria femoral comun humana acelular.

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A lo largo de la descripcion y reivindicaciones de esta memoria descriptiva, las palabras "comprende" y "contiene" y sus variaciones significan "incluyendo, pero no limitado a", y no pretenden (y no) excluyen otras fracciones, aditivos, componentes, numeros enteros o etapas. A lo largo de la descripcion y reivindicaciones de esta memoria descriptiva, el singular abarca el plural a menos que el contexto lo requiera de otro modo. En particular, cuando se utiliza el artfculo indefinido, la memoria descriptiva debe ser entendida contemplando tanto la pluralidad como la singularidad, a menos que el contexto lo exija de otro modo.

Los rasgos, numeros enteros, caractensticas, compuestos, fracciones qmmicas o grupos descritos junto con un aspecto particular, realizacion o ejemplo de la invencion deben ser entendidos como aplicables a cualquier otro aspecto, realizacion o ejemplo descrito en la presente memoria, a menos que sean incompatibles con la misma. Todas las caractensticas descritas en esta memoria descriptiva (incluyendo cualquiera de las reivindicaciones adjuntas, resumen y dibujos), y/o todas las etapas de cualquier metodo o procedimiento asf divulgado, se pueden combinar en cualquier combinacion, excepto las combinaciones donde al menos algunas de tales caractensticas y/o las etapas sean mutuamente excluyentes. La invencion no se limita a los detalles de ninguna de las realizaciones anteriores. La invencion se extiende a cualquier fresca combinacion, o cualquier combinacion novedosa, de las caractensticas descritas en esta memoria descriptiva (incluyendo cualquiera de las reivindicaciones, resumen y dibujos adjuntos), o a cualquier fresca combinacion o cualquier combinacion novedosa de las etapas de cualquier metodo o procedimiento asf divulgado.

La atencion del lector esta dirigida a todos los artfculos y documentos que se presentan al mismo tiempo que o con anterioridad a esta memoria descriptiva en relacion con esta solicitud y que estan abiertos a inspeccion publica con esta especificacion y se incorporan el contenido de todos estos artfculos y documentos en la presente memoria por referencia.

La presente invencion proporciona productos acelulares y metodos para su produccion. Se identificaron dos vasos particularmente adecuados, la arteria ilfaca interna y la arteria carotida interna porcinas y los estudios iniciales establecieron un protocolo capaz de eliminar todas las celulas y > 80% del ADN de los vasos, basandose en el uso de dos ciclos de regulador hipotonico a 4°C y 1 mg.ml-1 de SDS a 37°C, respectivamente. Los vasos descelularizados usando un unico ciclo de regulador hipotonico y solucion de SDS demostraron la presencia de celulas residuales y restos celulares cuando se tineron usando hematoxilina y eosina y DAPI. Por lo tanto, se eligieron dos ciclos de regulador hipotonico y SDS como procedimiento optimo de descelularizacion, ya que era capaz de producir en forma confiable vasos acelulares.

La marcacion de anticuerpos utilizando un anticuerpo monoclonal contra el epttopo a-Gal demostro que estaba presente dentro de las arterias ilfacas externas acelulares y de las arterias carotidas internas. La marcacion de anticuerpos se llevo a cabo utilizando muestras de tejido crioincluido, inclusion en cera de parafina fija con zinc y muestras incluidas en cera de parafina fijada con formalina. Comercialmente existe solamente un unico clon de anticuerpo de una sola fuente; este se suministra como una preparacion sin purificar. La preparacion sin purificar produjo consistentemente alta tincion de fondo en comparacion con el anticuerpo de control negativo de IgM. El anticuerpo se purifico usando una columna de union a IgM. El anticuerpo se dializo luego y se concentro utilizando dispositivos de filtro centnfugo. La marcacion utilizando el anticuerpo purificado demostro niveles de fondo significativamente reducidos en comparacion con la preparacion sin purificar. Las muestras crioincluidas produjeron la marcacion mas sensible y las muestras fijadas con formalina la marcacion mas debil. Por lo tanto, las muestras fijadas en parafina fijada con zinc se utilizaron como una tecnica estandar, ya que esto produjo una histologfa superior en comparacion con las muestras crioincluidas y un aumento de la sensibilidad sobre las muestras fijadas con formalina. Los niveles de a-Gal en toda la matriz eran sustancialmente mas bajos en comparacion con los tejidos de control frescos. Sin embargo, el epttopo era detectable. Se hicieron intentos para eliminar el epttopo a-Gal usando ciclos crecientes de regulador hipotonico y solucion de SDS. La marcacion con anticuerpos monoclonales demostro que no habfa una reduccion sustancial en los niveles de a-Gal cuando se usaron dos ciclos en comparacion con un solo ciclo.

El regulador hipotonico de dos ciclos y la solucion de SDS fallaron en la eliminacion de a-Gal de las matrices acelulares. Se planteo la hipotesis de que una etapa inicial para eliminar las celulas endoteliales de la superficie del lumen del vaso reducina la cantidad de a-Gal dentro de las matrices acelulares. Para ello, se utilizaron Verseno y diversas concentraciones de EDTA antes del proceso de descelularizacion para quelar cualquier ion metalico para ayudar a la liberacion de las celulas endoteliales del lumen del vaso. El tratamiento previo usando EDTA 200 mM a 4°C durante 25 horas resulto ser exitoso en la reduccion de los niveles de a-Gal con vasos acelulares; esto se incorporo en el proceso de descelularizacion de la presente invencion.

Se ha utilizado un tratamiento con regulador hipertonico (Tris 10 mM, cloruro de sodio 1,5 M, pH 7,4) despues de la descelularizacion, durante el proceso de descelularizacion para reducir aun mas los niveles de a-Gal presentes en los tejidos cardiovasculares acelulares. La marcacion adicional de anticuerpos demostro que un unico ciclo de regulador hipertonico a 37°C durante 24 horas en combinacion con tratamiento previo usando EDTA 200 mM a 4°C durante 24 horas con agitacion fue exitoso en la reduccion de los niveles de a-Gal con los vasos acelulares. Tambien mostro que no habfa mejona obvia en la reduccion de a-Gal con ciclos crecientes (hasta tres) de tratamiento con regulador hipertonico a 37°C.

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Con el fin de determinar si ha^a a-Gal residual en las matrices acelulares, era fundamental determinar la especificidad del anticuerpo. Esto se consiguio adsorbiendo el anticuerpo purificado usando BSA con a-Gal. La BSA tambien se incluyo como control. Despues de la adsorcion, el anticuerpo a-Gal se habna unido a la BSA con a-Gal y por lo tanto cortando su capacidad para unirse a cualquier epttopo a-Gal dentro del tejido que estaba siendo marcado. Por lo tanto, cualquier tincion utilizando esto podna considerarse como de fondo. La adsorcion usando BSA solo demostro que las interacciones protema:protema no afectanan la capacidad del anticuerpo para detectar el epftopo a-Gal. La comparacion de los datos obtenidos usando el anticuerpo absorbido con BSA y el anticuerpo absorbido con BSA con a- Gal con los tejidos descelularizados y los tejidos descelularizados tratados con a-galactosidasa indico que: la EIA acelular parecfa tener a-Gal residual que podna reducirse mas por el uso de la enzima. Esta tincion estaba en la matriz y no en la superficie de la mtima. La iCa acelular tema algunas tinciones muy debiles que no se podfan eliminar mediante el uso de a-galactosidasa. Los datos en general indicaron que habfa un mmimo de a-Gal en los vasos acelulares.

El ensayo de adsorcion de anticuerpos utilizo el mismo anticuerpo monoclonal. La ventaja de este ensayo es que se puede ensayar un volumen mucho mayor de material en comparacion con la inmunocitoqmmica que esta limitada a secciones muy delgadas. Ademas, el ensayo de adsorcion de anticuerpos produjo una evaluacion semicuantitativa de los niveles de a-Gal presentes en las diferentes muestras de tejido. Las muestras de vasos frescos demostraron los niveles mas altos de expresion de a-Gal. Se demostro que la EIA y la ICA porcinas frescas tratadas con a-galactosidasa estaban desprovistas de a-Gal (no diferente del control sin tejido), lo que indica que el ensayo fue exitoso. Las muestras de EIA e ICA acelulares demostraron niveles de a-Gal que no eran significativamente diferentes a los de la arteria femoral comun humana fresca y acelular, asf como tampoco al control sin tejido.

La evaluacion histologica demostro que la arquitectura de la matriz y la composicion de las muestras acelulares eran similares a las de los controles frescos. Las matrices acelulares mostraron una estructura abierta mas relajada en comparacion con los vasos porcinos frescos. No parecfa haber diferencias cualitativas en el contenido de GAG, colageno o de elastina de la ElA o ICA acelular en comparacion con los vasos frescos. Los resultados de los ensayos de hidroxiprolina, colageno desnaturalizado y glicosaminoglicano indicaron que el proceso de descelularizacion no condujo a la perdida de colageno o glicosaminoglicanos del tejido. Aunque el analisis bioqmmico cuantitativo proporciono informacion sobre el contenido de colageno y glicosaminoglicano de la matriz acelular, era limitado en cuanto que no fue posible evaluar la integridad estructural de los componentes. Por lo tanto, los niveles de colageno desnaturalizado se determinaron despues del tratamiento con a-quimotripsina, que es capaz de digerir el colageno degradado sin afectar al colageno nativo (Banket y colaboradores, 1997). Despues de la digestion, se ensayo el sobrenadante de tejido (que contema cualquier colageno degradado) para detectar la presencia de hidroxiprolina. Los resultados indicaron que no hubo un aumento significativo en la cantidad total de colageno desnaturalizado presente en EIA o ICA acelular en comparacion con los vasos frescos.

Las preocupaciones relativas a la presencia de SDS residual se abordaron mediante la cuantificacion de la concentracion de SDS dentro de cada una de las soluciones de descelularizacion utilizadas para producir EIA e ICA acelulares. El uso de SDS marcado en forma radiactiva (C14) demostro que habfa niveles extremadamente bajos de SDS presentes en las soluciones de lavado finales usadas en el proceso de descelularizacion.

La biocompatibilidad de las matrices acelulares se demostro utilizando los ensayos de citotoxicidad del extracto y de contacto. Cada ensayo utilizo dos lmeas celulares diferentes, celulas de rinon de hamster bebe y celulas 3T3 de raton. Los datos anteriores han demostrado la biocompatibilidad in vivo de las matrices tratadas con SDS y no fue necesario repetir esto usando EIA o ICA acelulares.

La cuantificacion de ADN usando una serie de ensayos diferentes indico que habfa una reduccion de mas del 90% en los niveles de ADN despues de la descelularizacion y estos valores eran significativamente mas bajos que la cantidad de ADN aislado de Surgisis. Los niveles de ADN aislados de EIA e ICA porcinas acelulares fueron comparables a los de Permacol y CollaMend. EIA e ICA acelulares conteman 0,014 pg.mg'1 y 0,019 pg.mg'1 respectivamente de ADN. Surgisis contema 0,119 pg.mg'1, Permacol 0,028 pg.mg'1 y CollaMend 0,017 pg.mg'1 de ADN. La PCR demostro que cualquier ADN residual era de piezas fragmentadas pequenas de ADN que no podfan ser amplificadas o ADN no codificante de 'basura'. La presencia de retrovirus endogenos porcinos es una preocupacion para cualquier injerto xenogenico derivado de porcino. A pesar de esto, practicamente no hay informacion sobre los efectos de tales virus en los seres humanos, el potencial de transmision o los niveles mmimos de seguridad. El numero de copias de PERV se determino usando PCR cuantitativa usando una sonda TaqMan. Los datos indicaron que el ADN de PERV estaba presente en todas las muestras de EIA e ICA porcinas acelulares, asf como fibroblastos dermicos humanos. Hubo una reduccion de seis unidades logantmicas en el numero de copias en CFA acelular en comparacion con la fresca y una reduccion de siete unidades logantmicas para ICA acelular. El numero de copias presente dentro de ICA y EIA acelulares era significativamente mas bajo que cualquiera de los productos comercialmente disponibles, ya que no hay niveles mmimos seguros establecidos de retrovirus endogenos porcinos comparado con productos comercialmente disponibles que es cntico. El ensayo no determina si el genoma completo de PERV esta presente o si es transcripcionalmente activo. Las propiedades biomecanicas y el cumplimiento de EIA y ICA porcino acelular se evaluaron mediante pruebas de presion de ruptura, pruebas de retencion de la sutura, prueba de dilatacion y prueba de falla de baja velocidad de deformacion. Es esencial que cualquier material de injerto tenga caractensticas biomecanicas

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similares a las arterias que estan reemplazando. No hubo cambios importantes en las propiedades de los vasos acelulares porcinos en comparacion con el tejido porcino fresco. No se observaron diferencias significativas entre las presiones de rotura de la EIA o ICA acelulares en comparacion con los vasos frescos. Los valores de presion de rotura fueron mucho mas altos que las presiones fisiologicas normales experimentadas en las arterias que estan en la region de 120 mm de Hg. Los resultados obtenidos para las arterias acelulares fueron comparables a las presiones de ruptura maximas de las arterias humanas (2.031-4.225 mm de Hg) y de la vena safena humana (1.680-2.273 mm de Hg), L'Heureux, N. y colaboradores, 2006).

En cuanto a la activacion y deteccion del complemento de C3a o C5a (Figura 20), los vasos acelulares producidos por los metodos de la presente invencion muestran una activacion insignificante en comparacion con los productos comercialmente disponibles y tambien de forma muy interesante, comparables con el ureter porcino preparado por los mismos metodos. Esto indica que ha habido un corte exitoso de epftopos antigenicos de los dos tejidos de vasos acelulares.

Los datos recogidos hasta la fecha demuestran que dos vasos acelulares esteriles pueden ser producidos en forma confiable usando un fresco protocolo de descelularizacion que da como resultado un vaso biocompatible que demuestra una reduccion > 90% (p/p) en el ADN, niveles mmimos de a-Gal y no es bioqmmica o biomecanicamente distinto de los vasos frescos. Ademas, los datos mostraron que el contenido de PERV de EIA e ICA acelulares era significativamente menor que los productos comercialmente disponibles que tienen un historial clmico probado de uso en pacientes.

Descelularizacion de las arterias ilfacas externas (EIA) y de las arterias carotidas internas (ICA) porcinas

Se prepararon vasos de EIA y ICA congelados de hasta 200 mm de longitud como se describe en la Figura 1 usando 200 mL de cada solucion, en donde cada solucion se precalienta a la temperatura apropiada antes del uso. Los vasos se colocan en recipientes esteriles individuales de 250 mL y todas las incubaciones se llevan a cabo con agitacion a 240 rpm con la excepcion de la etapa de la nucleasa que esta a 80 rpm. Como en la primera etapa, si la EIA y la ICA estan congeladas, el tejido se descongela a 37°C durante 20 minutos, despues se lava utilizando una solucion de desinfeccion que comprende vancomicina, sulfato de gentamicina y polimixina B durante 30 minutos a 37°C. La primera etapa de incubacion es un lavado usando EDTA 200 mM a 4°C durante 24 horas, seguido de un lavado usando regulador hipotonico (TRIS 10 mM, EDTA 2,7 Mm, aprotinina 10KIU/ ml) a 4°C durante 24 horas y un lavado usando SDS al 0,1% (p/v) en regulador hipotonico a 37°C durante 24 horas. Un lavado adicional usando regulador hipotonico a 4°C durante 24 horas es seguido por un lavado usando EDTA en DPBSa que contiene aprotinina durante entre 48-56 horas a 4°C y un lavado usando SDS al 0,1% (p/v) en regulador hipotonico a 37°C durante 24 horas. El tejido se lava luego tres veces usando DPBSa a 37°C durante 30 minutos cada vez y una solucion de nucleasa (TRIS 5 mM, 50 pg/mL de BSA, 50 U/ mL de ADNasa, 1 U/mL de ARNasa) a 37°C durante tres horas. El tejido se lava tres luego veces usando EDTA en DPBSa que contiene aprotinina a 37°C durante 30 minutos cada uno y un lavado adicional de incubacion usando solucion hipertonica durante 24 horas a 37°C y tres lavados adicionales usando EDTA en DPBSa que contiene aprotinina a 37°C durante 30 minutos cada vez. El tejido se esteriliza a continuacion utilizando una solucion de acido peracetico al 0,1% (v/v) durante cuatro horas a 27°C. A continuacion, se llevan a cabo las siguientes etapas en forma aseptica dentro de una cabina de seguridad de clase II, (i) se lavan tres veces usando EDTA en DPBSa que contiene aprotinina a 37°C durante 30 minutos cada vez (ii) se lavan con DPBSa a 4°C durante 24 horas. El tejido se almacena a continuacion en DPBSa a 4°C hasta que sea necesario.

Preparacion de tejido/histologfa

Las muestras de tejido se fijaron en formalina regulada neutra al 10% (v/v) y luego se deshidrataron y se incluyeron en cera de parafina. Se tomaron secciones seriadas y se uso tincion estandar de hematoxilina y eosina (H&E) (Bios Europe Ltd, Skelmersdale, RU) para evaluar la histoarquitectura del tejido y se uso tincion de elastina de Miller para evaluar el contenido de elastina. Los acidos nucleicos se tineron usando tincion DAPI (Sigma-Aldrich) y Hoechst 33258 (Sigma- Aldrich). Los anticuerpos monoclonales IgM contra el epftopo a-Gal se obtuvieron a traves de Alexis Biochemicals, San Diego, EE.UU. y se purificaron antes de su uso.

Ensayo de adsorcion de anticuerpo para a-Gal

Se utilizo ELISA para determinar los niveles de anticuerpo a-Gal no unido despues de la incubacion con muestras de tejido. Las muestras se incubaron con 500 pl de BSA al 5% (p/v) en DPBS durante la noche a 4°C, se dispuso entonces el BSA y cada tubo se lavo tres veces durante dos minutos usando 500 pl de DPBS. Se pesaron exactamente 100 mg de tejido y se maceraron finamente y se colocaron en microtubos bloqueados con 1 ml de anticuerpo monoclonal anti-a- gal en diluyente de anticuerpo (0,37 pg.mL-1) y se dejo durante la noche a 4°C en una centnfuga. Los microtubos que contienen tejido se centrifugaron a 600 x g durante 15 minutos (o 13.000 rpm en microcentnfuga) y se extrajeron 750 pL de sobrenadante a microtubos bloqueados frescos a los que se anadieron 750 pL de BSA en TBS-azida y luego se mezclaron y centrifugaron a 600 x g durante 15 minutos. Se extrajo otros 750 pL de sobrenadante y se analizo el sobrenadante para anticuerpo para a-Gal mediante ELISA anadiendo 50 pL de BSA con a-Gal a 10 pg.mL'1 en DPBS a los pozos de la placa de microtitulacion Maxisorb durante la noche a 4°C. Estos se lavaron 3 veces durante 10 min utilizando 300 pL de Tween en DPBS con agitacion y cada pozo de la placa de microtitulacion Maxisorb recubierta se bloqueo con 250 pL de BSA al 5% (p/v) en DPBS durante una noche a 4°C. Posteriormente, se lavo cada pozo 3 veces

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durante 30 min utilizando 300 pL de Tween de DPBS con agitacion y se transfirieron 100 pL de las muestras a los pozos relevantes de la placa de microtitulacion recubierta y bloqueada. Esto se incubo entonces a temperatura ambiente durante tres horas y se lavo adicionalmente antes de la adicion de 50 pl de anticuerpo secundario anti-raton de conejo conjugado con peroxidasa de rabano picante (dilucion 1:1000). Esto se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavo adicionalmente antes de anadir 100 pL de solucion de OPD e incubacion durante 10 min a temperatura ambiente, en la oscuridad. Se anadieron 50 pL de acido sulfurico 3 M a cada pozo y se midieron las densidades opticas usando un espectrofotometro de microplacas a 492 nm con un filtro de referencia a 630 nm. Los valores de cada muestra se graficaron como la media ± 95% de los ftmites de confianza y se determino cualquier diferencia significativa.

Ensayo de hidroxiprolina.

Antes de realizar el ensayo de hidroxiprolina, las muestras se liofilizaron hasta un peso constante antes de ser hidrolizadas mediante incubacion con acido clortftdrico 6 M (HCl) durante 4 ha 120°C y se neutralizaron usando hidroxido de sodio (NaOH). El procedimiento adoptado se baso en el metodo descrito por Edwards y O'Brien [29]. Se prepararon soluciones de calibracion estandar utilizando trans-4-hidroxi-L-prolina (Sigma). Se anadio solucion de ensayo (50 pL) a los pozos de una placa de 96 pozos de fondo plano a la que se anadieron 100 pL de solucion oxidante (hidrato de cloramina T, Sigma) y se dejo durante 5 min con agitacion suave. Se anadio entonces reactivo de Ehrlich (100 pL) a cada pozo. La placa se cubrio entonces y se incubo a 60°C en un bano de agua durante 45 min antes de leer la absorbancia a 570 nm. La concentracion de hidroxiprolina se determino despues por interpolacion a partir de una curva patron de hidroxiprolina.

Ensayo de glicosaminoglicano

La cantidad de azucares sulfatados (GAG) se determino mediante union a azul de dimetilmetileno (Enobakhare y colaboradores, Anal. Biochem, 243, 189, 1996, Farndale y colaboradores, Biochim, Biophys, Acta., 883, 173, 1986). En resumen, las soluciones de ensayo se incubaron con la solucion de azul de dimetilmetileno y se leyo la absorbancia a 525 nm. La cantidad de GAG se calculo por interpolacion a partir de una curva estandar preparada usando sulfato de condroitina y regulador de ensayo de fosfato (ortofosfato dihidrogeno de sodio 0,1 M, ortofosfato hidrogeno disodico 0,1 M, pH 6,8) en un intervalo de concentraciones.

Ejemplo 1

La ICA y la EIA porcinas tratadas fijadas con formalina se seccionaron hasta 5 pm y se tineron usando hematoxilina y eosina (Figura 2). Cuando se utilizaron dos ciclos de regulador hipotonico y sDs no hubo evidencia de celulas residuales o restos celulares (Figura 2). Ademas, la histoarquitectura de la matriz parecfa haber permanecido intacta despues del tratamiento. Las secciones de ICA y EIA de porcino tratadas fijadas con formalina se tineron para la presencia de ADN bicatenario usando DAPI, se utilizaron ICA y EIA porcinas frescas como controles positivos (Figura 3). La tincion demostro la falta de ADN bicatenario y de celulas dentro de la matriz en comparacion con el fresco tejido de control (Figura 3). Cuando el tiempo de exposicion se incremento en un factor de diez, no se observo fluorescencia como resultado de la presencia de aDn bicatenario y por lo tanto de celulas.

Ejemplo 2

Es deseable que las matrices xenogenicas acelulares esten desprovistas del epftopo a-Gal si se van a utilizar clrnicamente para mitigar las reacciones inflamatorias mediadas por anticuerpos. Por lo tanto, es necesario desarrollar un metodo confiable para detectar su presencia dentro de los vasos acelulares. Las muestras de EIA porcina fresca y acelular (dos ciclos de SDS) se fijaron con formalina, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 pm. Las secciones de EIA porcina fresca y acelular se marcaron para la presencia del epftopo a-Gal usando un anticuerpo monoclonal IgM (Alexis 801-090, clon M86, dilucion 1:10). Se utilizo el kit Dako Envision para visualizar el anticuerpo primario (Figura 4). Los resultados demostraron la presencia del epftopo a-Gal despues de la descelularizacion. Tambien habfa un alto grado de tincion de fondo; esto estaba ausente cuando se utilizo un anticuerpo de control del isotipo IgM para marcar las muestras. Otros experimentos mostraron que el tejido fresco demostro una buena marcacion positiva con el anticuerpo monoclonal IgM (datos no mostrados) y que el anticuerpo purificado parecfa producir una mayor especificidad de marcacion en comparacion con la preparacion sin purificar (datos no mostrados). La marcacion demostro una reduccion en el contenido de a-Gal cuando se uso regulador hipertonico junto con un lavado con EDTA 200 mM llevado a cabo a 4°C durante 24 horas (Figuras 5). No hubo diferencias en los niveles de contenido de a-Gal cuando se usaron ciclos crecientes de regulador hipertonico. Por lo tanto, se adopto una incubacion de 24 horas en regulador hipertonico a 37°C para separar el epftopo a-Gal de matrices acelulares junto con un lavado inicial de EDTA 200 mM llevado a cabo a 4°C durante 24 horas. Para la posterior descelularizacion tisular, se adopto el protocolo en la Figura 1.

Ejemplo 3

Con el fin de determinar si habfa a-Gal residual presente dentro de los vasos acelulares era importante determinar la especificidad de la marcacion del anticuerpo. Se marcaron muestras de EIA y ICA frescas y acelulares junto con EIA y ICA tratadas con a-galactosidasa, frescas y acelulares, para la presencia del epftopo a-Gal usando un clon M86 de

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anticuerpo monoclonal IgM (Alexis ALX - 801 - 090) y se visualizaron usando el Kit Dako Envision. Se usaron tres preparaciones diferentes del anticuerpo: (i) anticuerpo purificado (dilucion 1:4 - 0,39 mg.mL'1) (ii) anticuerpo purificado adsorbido usando BSA y (iii) anticuerpo purificado adsorbido usando BSA con a-Gal. La Figura 6 muestra la EIA acelular marcada usando un anticuerpo monoclonal contra el epttopo a-Gal, purificada (A), adsorbida contra BSA (B) o adsorbida contra BSA con a-Gal (C) o un control de isotipo de IgM (D) con un aumento original x 100. La Figura 7 muestra lo mismo, pero para ICA acelular

La marcacion de anticuerpos de tejido fresco demostro una fuerte marcacion positiva definida en toda la matriz; esto podna reducirse significativamente con el tratamiento con a-galactosidasa. Los resultados indicaron que el anticuerpo purificado fue "limpiado" adicionalmente por absorcion con BSA. El anticuerpo "purificado" absorbido con BSA es espedfico para a-Gal ya que la absorcion con BSA con a-Gal corto totalmente la union a tejido fresco. Ademas, habfa un mrnimo de a-Gal presente dentro de ICA y EIA acelulares, la superficie luminal estaba totalmente despejada. Una inspeccion cercana de las secciones por microscopfa revelo que cualquier marcacion de fondo con el anticuerpo absorbido por BSA era minima. El estudio demostro ademas que la marcacion de fondo no puede eliminarse mediante tratamiento con a-galactosidasa.

Ejemplo 4

Se uso un ensayo semicuantitativo de adsorcion de anticuerpos para estimar la cantidad de a-Gal presente en tejidos porcinos. Se utilizo un ELISA para cuantificar el anticuerpo anti-a-Gal no ligado presente despues de la incubacion con muestras de tejido macerado. El control negativo utilizado fue un control sin tejido y los datos indicaron que habfa una diferencia significativa entre el control sin tejido, los vasos acelulares y la piel humana. Se usaron arterias femorales comunes alogenicas frescas y acelulares como controles para este ensayo (Figura 8). El ensayo mostro que las arterias femorales comunes frescas y acelulares estaban libres del epftopo a-Gal. No hubo diferencias significativas en la union del anticuerpo a-Gal a EIA o ICA porcinas acelulares en comparacion con el control sin tejido, o las arterias femorales comunes alogenicas frescas y acelulares (Figura 8). Sin embargo, hubo una diferencia significativa entre el anticuerpo unido a EIA e ICA acelular comparado con fresco (Figura 8, ANOVA unidireccional y prueba T post hoc).

Ejemplo 5

Para evaluar completamente los efectos del protocolo de descelularizacion en las matrices, se ensayaron muestras de EIA y ICA frescas y acelulares (n = 6) para determinar sus componentes principales. Para cuantificar las muestras de tejido hidrolizadas con acido de colageno, se analizo el contenido de hidroxiprolina siguiendo el metodo de Edwars & O' Biran (1980). El ensayo genero una relacion lineal entre una curva estandar producida usando Trans-4-HIDROXIL-L- PROLINA y absorbancia a 570 nm. Los valores del ensayo se convirtieron en jg.mg'1 y los valores de hidroxiprolina se convirtieron en colageno mediante multiplicacion por 7,46. Se encontro que el contenido de colageno de la ICA fresca y acelular era de 795,2 jg.mg'1 y 700,6 jg.mg'1 respectivamente. El contenido de colageno de EIA fresco y acelular fue de 572,3 jg.mg'1 y 547,3 jg.mg'1, respectivamente. Los valores no fueron significativamente diferentes (ANOVA unidireccional y prueba T post hoc).

Para cuantificar el contenido de GAG, se ensayaron muestras de tejido hidrolizado con acido para determinar el contenido de azucar carboxilado sulfatado utilizando colorante azul de dimetileno (Farndale y colaboradores, 1986). El ensayo genero una relacion lineal entre una curva estandar producida utilizando sulfato de condroitina B y absorbancia a 525 nm, los valores del ensayo se normalizaron para la masa de la muestra y se expresaron como jg.mg'1. Se determino que el contenido de GAG sulfatado de ICA fresca era 63,8 jg.mg'1 en comparacion con el ICA acelular que era de 57,0 jg.mg'1. Se encontro que el contenido de GAG de EIA fresca y acelular era de 64,5 jg.mg'1 y 54,7 jg.mg'1 respectivamente. Los valores no fueron significativamente diferentes (ANOVA unidireccional y prueba T post hoc, Figuras 9A y 9B).

El contenido de colageno desnaturalizado o danado se evaluo usando digestion enzimatica de tejidos usando a- quimotripsina seguido de hidrolisis acida. Los niveles de hidroxiprolina se determinaron y se convirtieron en colageno. El ensayo genero una relacion lineal entre una curva estandar producida usando Trans-4-HIDROXIL-L-PROLINA y absorbancia a 570 nm. Se encontro que el contenido de colageno desnaturalizado de ICA fresca y acelular era de 30,8 jg.mg'1 y 26,6 jg.mg'1 respectivamente. El contenido de colageno desnaturalizado de EIA fresco y acelular fue de 30,8 y 21,5 jg.mg'1 respectivamente. Los valores no fueron significativamente diferentes (ANOVA unidireccional y prueba T post hoc, Figuras 9A y 9B).

Ejemplo 6

El ensayo de citotoxicidad de contacto se uso para determinar el efecto de las matrices acelulares sobre el crecimiento celular; esto se utilizo como una evaluacion preliminar de la biocompatibilidad. Se disecaron asepticamente muestras pequenas de EIA e ICA porcinas acelulares (n = 3) y se adhirieron al centro de los pozos de placas de cultivo de tejidos utilizando gel de colageno, se anadio una suspension de celulas de raton 3T3 libre o de rinon de hamster bebe libres de micoplasma a cada pozo y se cultivaron durante 48 horas. Cada pozo se observo usando microscopfa de contraste de fases y despues de fijacion con formalina y tincion usando tincion de Giemsa. El examen microscopico de las placas de citotoxicidad de contacto mostro que los fibroblastos 3T3 de raton (Figura 11) y las celulas de rinon de hamster bebe

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(Figura 10) crecieron y en contacto con material acelular. No se observaron cambios evidentes en la morfologfa celular ni en la lisis celular. El pegamento de cianoacrilato (control positivo) demostro causar lisis celular. El colageno solo (control negativo) no mostro signos de citotoxicidad.

Ejemplo 7

Se maceraron muestras de EIA e ICA porcinas frescas y descelularizadas y se incubaron a una concentracion de 100 |jg.mg-1 en DMEM a 37°C con agitacion durante 72 horas con el fin de extraer cualquier componente soluble. Este extracto se incubo junto con monocapas de celulas de rinon de raton 3T3 libres de micoplasma y celulas de rinon de hamster bebe durante 48 horas, despues de lo cual se determinaron los niveles de ATP utilizando el ensayo ATP-Lite-M comercialmente disponible (Perkin Elmer). Se usaron dos lmeas celulares diferentes; celulas de raton 3T3, una lmea celular fibroblastica y celulas de rinon de hamster bebe, una lmea de celulas epiteliales. Los resultados no demostraron una diferencia significativa entre el contenido relativo de ATP y, por lo tanto, la viabilidad de las celulas 3T3 de raton incubadas con DMEM y las muestras extrafdas de ICA porcina acelular (Figuras 12A y 12B). Hubo un aumento significativo en la viabilidad celular cuando las celulas 3T3 de raton se incubaron con extractos de EIA porcina acelular (Figura 12B). Hubo una diferencia significativa entre el contenido de ATP de celulas 3T3 incubadas con DMEM o extractos acelulares en comparacion con extractos de tejido fresco (Figura 12A). Los niveles de ATP presentes en las celulas 3T3 cultivadas en presencia de DMSO al 40% (v/v) fueron significativamente mas bajos que cualquiera de las otras muestras ensayadas (Figura 12A y 12B). Hubo un aumento significativo en los niveles de ATP de celulas de rinon de hamster bebe cultivadas con extractos de EIA o ICA porcinas acelulares en comparacion con DMEM (Figuras 12C y 12D). No hubo diferencia significativa entre el contenido de ATP de celulas de rinon de hamster bebe incubadas con DMEM o extractos acelulares en comparacion con extractos de tejido fresco (Figura 12C y 12D). Los niveles de ATP presentes en las celulas de rinon de hamster bebe cultivadas en presencia de DMSO al 40% (v/v) fueron significativamente mas bajos que cualquiera de las otras muestras probadas (Figura 12C y 12D).

Ejemplo 8

El ADN se aislo a partir de muestras (n = 3) de EIA e ICA porcinas frescas y acelulares usando un kit comercialmente disponible (Qiagen) y se cuantifico usando absorbancia a 260 nm. Tambien se incluyeron en el analisis una serie de productos comercialmente disponibles: Surgisis, Permacol y CollaMend. Los datos indicaron que habfa una reduccion de mas del 90% en los niveles de ADN despues de la descelularizacion. La EIA y la ICA acelular conteman 0,014 jg.mg-1 y 0,019 jg.mg-1 respectivamente de ADN (Figura 13). Surgisis contema 0,1l9 jg.mg-1, Permacol 0,028 jg.mg-1 y CollaMend 0,017 jg.mg-1 de ADN (Figura 13). La EIA y la ICA acelulares conteman una cantidad significativamente menor de ADN que Surgisis (Figura 13).

Ejemplo 9

Se llevo a cabo una PCR y una RT-PCR usando ADN extrafdo y ARN total. Se utilizaron cebadores contra GAPDH y TNFa para amplificar el ADN extrafdo de EIA e ICA frescas y acelulares. El colorante verde fluorescente se utilizo para detectar cualquier producto de PCR. La reaccion de PCR no detecto ningun producto GAPDH o TNFa en muestras de ADN extrafdo de EIA o ICA acelulares (Tabla 1). Por lo tanto, cualquier ADN presente era probable que fuera de fragmentos y ADN no codificante y, por lo tanto, no funcional, meramente para actividades de "mantenimiento".

La Tabla 1 muestra el numero de ciclos en los que se detectaron productos de PCR cuando se usaron cebadores contra ______________GAPDH y TNFa contra DNA aislado en una PCR verde syber.______________

Muestra

Cebador Valor de umbral Valor de Ct

EIA fresca

GAPDH 0,210 33,75

EIA acelular

GAPDH 0,210 Sin valor de ct

ICA acelular

GAPDH 0,210 Sin valor de ct

EIA fresca

NPC 0,210 Sin valor de ct

EIA acelular

NPC 0,210 Sin valor de ct

ICA acelular

NPC 0,210 Sin valor de ct

EIA fresca

TNFa 0,210 29,99

EIA acelular

TNFa 0,210 Sin valor de ct

ICA acelular

TNFa 0,210 Sin valor de ct

Control sin plantilla

GAPDH 0,210 Sin valor de ct

Control sin plantilla

TNFa 0,210 Sin valor de ct

Se llevo a cabo la deteccion de GAPDH (Tabla 2) y TNFa (Tabla 3) usando una reaccion de RT-PCR de dos etapas de ARN total extrafdo de EIA e ICA frescas y acelulares. El colorante fluorescente verde syber se utilizo para detectar cualquier producto de PCR. La reaccion de RT-PCR no detecto ningun producto de GAPDH o TNFa en muestras de ARN total extrafdo de EIA o ICA acelulares cuando se comparo con muestras frescas.

La Tabla 2 muestra el numero de ciclos en los que se detectaron productos de PCR cuando se usaron cebadores contra

GAPDH contra aRn aislado en una RT-PCR de dos etapas.

5

10

15

20

25

30

Muestra

Cebador Valor de umbral Valor de Ct

EIA fresca

GAPDH 0,212 47,03

EIA acelular

GAPDH 0,212 Sin valor de ct

ICA fresca

GAPDH 0,212 49,14

ICA acelular

GAPDH 0,212 Sin valor de ct

Control sin plantilla

GAPDH 0,212 Sin valor de ct

EIA fresca

Control sin cebador 0,212 Sin valor de ct

EIA acelular

Control sin cebador 0,212 Sin valor de ct

ICA fresca

Control sin cebador 0,212 Sin valor de ct

ICA acelular

Control sin cebador 0,212 Sin valor de ct

La Tabla 3 muestra el numero de ciclos en los que se detectaron productos de PCR cuando se usaron cebadores contra _______________TNFa contra ARN aislado en una RT-PCR de dos etapas.________________

Muestra

Cebador Valor de umbral Valor de Ct

EIA fresca

TNFa 0,123 37,52

EIA acelular

TNFa 0,123 Sin valor de ct

ICA fresca

TNFa 0,123 36,78

ICA acelular

TNFa 0,123 Sin valor de ct

Control sin plantilla

TNFa 0,123 Sin valor de ct

EIA fresca

Control sin cebador 0,123 Sin valor de ct

EIA acelular

Control sin cebador 0,123 Sin valor de ct

ICA fresca

Control sin cebador 0,123 Sin valor de ct

ICA acelular

Control sin cebador 0,123 Sin valor de ct

Ejemplo 10

La deteccion y cuantificacion de retrovirus endogenos porcinos se llevo a cabo utilizando PCR cuantitativa en tiempo real utilizando una sonda TaqMan. El ADN se aislo a partir de muestras (n = 3) de EIA e ICA porcinas frescas y acelulares usando un kit comercialmente disponible (Qiagen) y se cuantifico usando absorbancia a 260 nm. Tambien se incluyeron en el analisis una serie de productos comercialmente disponibles: Surgisis, Permacol y CollaMend. Tambien se aislo ADN a partir de fibroblastos dermicos humanos primarios obtenidos a partir de una fuente comercial.

La Tabla 4 muestra el numero de copias del genoma de PERV presente en el suero, EIA, ICA, Permacol, CollaMend, Surgisis y fibroblastos humanos primarios. Los datos representan la media (n = 3).

Muestra

Valor de Ct Copia No.

EIA fresca

22,54 4,52E+05

EIA acelular

36,76 2,54E-01

ICA fresca

23,94 2,61E+05

ICA acelular

38,21 8,32E-02

Permacol

32,14 5,92

CollaMend

35,21 13,46

Surgisis

31,02 2,54E+01

Fibroblastos

18,44 2,30E+01

NTC

Sin valor de ct N/A

Los datos indicaron que el ADN de PERV estaba presente en todas las muestras ensayadas (Tabla 4). Hubo una reduccion de seis unidades logantmicas en el numero de copias en CFA acelular en comparacion con ICA fresca y una reduccion de siete unidades logantmicas de ICA acelular. El numero de copias presentes dentro de ICA y EIA acelulares fue significativamente menor que cualquiera de los productos comercialmente disponibles (ANOVA unidireccional y prueba T post hoc). El ensayo no determina si esta presente el genoma completo de PERV o si es transcripcionalmente activo.

Ejemplo 11

Se ensayaron muestras de EIA e ICA porcinas frescas y acelulares (15 cm de longitud) para determinar su capacidad para soportar una presion creciente usando un aparejo de presion de ruptura disenado a la medida. La presion interna se aumento hasta un maximo de 3.750 mm de Hg para cada vaso. Se analizo la EIA porcina acelular que se habfa tratado usando acido peracetico al 0,1% (v/v) durante tres o cuatro horas para determinar si esta etapa tema un efecto perjudicial sobre la biomecanica de la matriz. Los resultados demostraron que no hay diferencia significativa entre las presiones maximas capaces de ser soportadas por EIA o ICA porcinas frescas o acelulares (datos no mostrados). Dos de las muestras frescas fallaron en la region de ligadura usando suturas y ninguna de las muestras acelulares fracaso como resultado de la colocacion o en los sitios de ligacion o union. La presion de ruptura media de la ICA acelular fue de 3.624 mm de HG en comparacion con 3.750 mm de HG para EIA acelular. No hubo diferencia significativa entre EIA acelular que se habfa tratado con acido peracetico al 0,1% (v/v) durante tres o cuatro horas.

5

10

15

20

25

30

35

40

Ejemplo 12

Se realizaron pruebas de retencion de sutura en EIA e ICA porcinas acelulares, se compararon los datos con muestras frescas. Se coloco una sola sutura en la muestra de tejido usando Proleno 4-0 y se aseguro usando un nudo triple. El ensayo se llevo a cabo utilizando sistemas de ensayo de modelos de mesa de la serie Instron 5860 a una velocidad de 10 mm.min'1. Los datos se presentaron como la fuerza maxima en Newtons; cada tejido fue capaz de soportar antes de retirar la sutura. No hubo diferencias significativas entre la maxima resistencia a la retencion de la sutura de EIA o ICA frescas en comparacion con las muestras acelulares (Figura 14).

Ejemplo 13

La intencion de este estudio fue cuantificar la expansion circunferencial y axial de EIA e ICA porcinas frescas y acelulares (n = 3). Los datos adquiridos durante la prueba de dilatacion incluyeron imagenes fijas de EIA e ICA porcinas frescas y acelulares en los intervalos de presion aplicados incrementalmente (n = 3). Todas las imagenes fueron analizadas en el software Image Pro Plus V 5.41. Se determino la dilatacion tanto en el eje X como en el Y. Los resultados se presentaron como un cambio porcentual en el diametro de la rafz como una funcion del aumento de la presion interna (Figuras 15A-D). Los datos demostraron dos resultados estadfsticamente significativos; la dilatacion de ICA acelular en el eje X (Figura 15A) fue significativamente mayor que la dilatacion de ICA fresca. Adicionalmente, la dilatacion de ICA porcina acelular fue mayor que la de ICA fresca en el eje Y (Figura 15B). Cada una de las otras curvas de dilatacion fue similar y no demostro diferencias significativas entre los tejidos frescos y acelulares (Figuras 15A-D).

Ejemplo 14

Las muestras de EIA e ICA porcinas frescas y acelulares se ensayaron utilizando sistemas de ensayo de un modelo de mesa de la serie Instron 5860 a una velocidad de 10 mm.min'1. Durante la baja tasa de deformacion para medir el fallo de la carrera del cabezal en mm, se registraron la respuesta del transductor de carga y el tiempo en ms durante la duracion de cada prueba. Las dimensiones de cada muestra de tejido se normalizaron y se registro el grosor usando un calibre de espesor antes del montaje en el equipo de ensayo. Cada ensayo se llevo a cabo tanto en las direcciones axial y circunferencial (n = 6). Los datos se analizaron utilizando Microsoft Excel y GraphPad Prisma y curvas de deformacion por esfuerzo producidas para cada muestra. Los siguientes parametros se determinaron usando los datos y las curvas de tension de deformacion: resistencia final a la traccion (N), colageno y modulo de elasticidad (MPa, Figuras 16, 17 y 18).

Los datos no demostraron diferencias significativas en las propiedades mecanicas de EIA o ICA acelulares cuando se compararon con tejidos frescos. Se encontro que la resistencia final media a la traccion de la ICA fresca era de 3,90 ± 0,64 MPa y 4,13 ± 1,00 MPa para las direcciones axial y circunferencial respectivamente. Los valores correspondientes para la ICA acelular fueron 3,92 ± 0,87 MPa y 4,82 ± 0,87 MPa. Los valores medios del resto de los parametros biomecanicos se enumeran en la Tabla 5. Los datos biomecanicos indicaron que el procedimiento de descelularizacion no provoco cambios significativos en el tejido.

La Tabla 5 muestra los parametros biomecanicos de la baja tasa de deformacion para medir el fallo de EIA e ICA porcinas frescas y acelulares. Los datos se expresan como la media (n = 6) ± 95% de los limites de confianza.

EI-E (GPa) Coll-E (GPa) aUTS (MPa) Espesor (mm)

EIA fresca

Circunferencial

Media

6,95 15,73 4,44 0,56

95% (L. de C.)

2,53 3,73 0,77 0,05

Axial

Media

2,99 9,39 3,30 0,46

95% (L. de C.)

0,70 2,19 0,94 0,06

EIA acelular

Circunferencial

Media

6,52 10,94 4,13 0,55

95% (L. de C.)

2,03 1,36 1,00 0,08

Axial

Media

2,34 9,05 2,95 0,48

95% (L. de C.)

0,25 2,3 1,04 0,07

ICA fresca

Circunferencial

Media

5,91 17,44 4,77 1,03

95% (L. de C.)

1,67 3,78 0,76 0,08

Axial

Media

3,30 11,95 3,90 1,11

95% (L. de C.)

1,46 3,08 0,64 0,04

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ICA acelular

Circunferencial

Media

5,36 13,97 4,82 1,03

95% (L. de C.)

0,46 3,09 0,87 0,13

Axial

Media

3,12 12,55 3,92 1,01

95% (L. de C.)

0,71 2,43 0,87 0,10

Ejemplo 15

Dado que extensas investigaciones han demostrado que los procedimientos desarrollados en esta invencion eliminan a- Gal medido por inmunocitoqmmica y ELISA semicuantitativa, se decidio someter el tejido a una prueba funcional adicional para determinar si los injertos arteriales porcinos acelulares activaran el complemento en suero humano. Los injertos arteriales generados por el proceso de descelularizacion se compararon con productos competidores comercialmente disponibles. Las muestras de cada biomaterial se incubaron en presencia de suero humano normal durante una hora a 37°C. El suero fue recogido y sometido a ELISA para determinar la presencia de C3a o C5a. Los resultados iniciales demostraron que zimosano [un control positivo] causo la activacion del complemento de suero humano normal cuando se comparo con un control negativo de PBS (Figura 20). Los resultados demostraron que a-Gal conjugado con BSA era capaz de iniciar la activacion del complemento en suero humano normal (Figura 19).

Los resultados de ELISA demostraron la produccion de C3a y C5a en suero humano normal en respuesta a tejidos porcinos frescos (Figura 20). Esto no se observo con suero que reacciono con tejidos humanos frescos o humanos acelulares porcinos. Cuando se hizo reaccionar el suero humano con Surgisis, se generaron C3a y C5a. Cuando se hizo reaccionar el suero humano con PermacolMR o CollaMendMR, no se observo aumento en C3a o C5a (Figura 21). Estos estudios proporcionan una fuerte evidencia de que las estructuras acelulares porcinas no contienen epttopos capaces de reaccionar con anticuerpos humanos preformados y complemento activador.

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   Reivindicaciones

   1. Un metodo de preparacion de un tejido vascular xenogenico acelular natural, comprendiendo el metodo la obtencion de un vaso sangumeo donante adecuado y sometiendolo a las siguientes etapas metodologicas:

   (i) una incubacion previa al tratamiento con acido etilendiaminotetraacetico 200 mM (EDTA) durante al menos 24 horas a aproximadamente 4°C;

   (ii) un lavado de desinfeccion;

   (iii) al menos dos ciclos de una incubacion con un regulador hipotonico y un detergente anionico;

   (iv) un tratamiento de nucleasa;

   (v) un lavado hipertonico; y

   (vi) un proceso terminal de esterilizacion.
2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que las etapas (i) y (ii) pueden invertirse antes de la etapa (iii).
3. 3. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el detergente anionico es dodecilsulfato de sodio (SDS).
4. 4. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el procedimiento de esterilizacion terminal proporciona un aclaramiento viral y una reduccion de la carga biologica.
5. 5. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que incluye ademas una etapa de recubrir una superficie interna y/o externa del tejido vascular xenogenico acelular natural con un material seleccionado del grupo que comprende anticoagulantes, inhibidores sinteticos de pentasacaridos, inhibidores directos de trombina, antagonistas de la vitamina K, inhibidores del Factor Xa, plata, colageno IV, elastina, glicoprotemas, glicosaminoglicanos y peptidos sinteticos o naturales o mezclas de los mismos.
6. 6. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que incluye ademas una etapa de siembra del tejido vascular xenogenico acelular natural con una poblacion unica o mixta de celulas seleccionadas del grupo que comprende celulas epiteliales, celulas de musculo liso, celulas madre pluripotentes y multipotentes y fibroblastos.
7. 7. Un producto obtenido por el metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende una matriz de tejido vascular xenogenico acelular natural que tiene al menos una reduccion del 80% en el contenido de ADN en comparacion con una matriz de tejido vascular de control sin tratar, estando el producto sustancialmente libre de epftopos capaces de reaccionar con anticuerpos humanos preformados y tambien sin la capacidad de activar sustancialmente el complemento.
8. 8. Un producto de acuerdo con la reivindicacion 7 que es o bien (i) arteria ilfaca externa de porcino (EIA) o una arteria carotida interna de porcino (ICA), o (ii) bovina y se selecciona del grupo que comprende el grupo que comprende arteria carotida, arteria mamaria interna, arteria toracica interna, vena mesenterica y vena yugular.
9. 9. Un producto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en el que el vaso sangumeo donante porcino tiene una longitud de hasta 30 cm y el vaso sangumeo del donante bovino tiene una longitud de hasta 80 cm.
10. 10. Un producto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que tiene una propiedad bioqmmica o biomecanica equivalente o no sustancialmente diferente seleccionada del grupo que comprende colageno, glicosaminoglicano, contenido de elastina, presion de ruptura, retencion de sutura, resistencia a la traccion final y baja tasa de deformacion en comparacion con los tejidos frescos o sin tratar.
11. 11. Un producto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que comprende ademas un recubrimiento, estando el recubrimiento provisto de un material adecuado revestido sobre una o ambas de una superficie interna (lumen) o su superficie externa, opcionalmente en el que el material de recubrimiento se selecciona del grupo que comprende anticoagulantes, inhibidores de pentasacaridos sinteticos, inhibidores directos de trombina, antagonistas de la vitamina K, inhibidores del Factor Xa, plata, colageno IV, elastina, glicoprotemas, glicosaminoglicanos y peptidos sinteticos o naturales o mezclas de los mismos.
12. 12. Un producto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 que se siembra sobre el mismo o en el mismo con una poblacion unica o mixta de celulas, opcionalmente en el que la poblacion celular se selecciona de acuerdo con un sitio de trasplante y se selecciona del grupo que comprende celulas epiteliales, celulas de musculo liso, celulas madre pluripotentes y multipotentes y fibroblastos.
13. 13. Un producto que comprende un producto de tejido de matriz de tejido vascular xenogenico acelular natural obtenido por el metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso como tejido de trasplante.
14. 14. Un producto de acuerdo con la reivindicacion 13 que es para uso en cirugfa de derivacion o en acceso vascular.