JP5396071B2 - 細胞の増殖を抑制する方法 - Google Patents
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Description
前記標的細胞に任意のタンパク質をコードする領域を含むDNAを導入する工程、及び
前記DNAを導入した標的細胞において、前記DNAにコードされたタンパク質を発現させる工程を含み、
前記DNAの領域は、三塩基連鎖を含み、及び
前記三塩基連鎖は、前記タンパク質を構成する少なくとも一部の種類のアミノ酸を規定するコドンから選ばれ、かつ前記標的細胞における使用頻度が0.2以下である少なくとも一部のコドンに相補的である、
前記方法が提供される。
標的細胞に、インターフェロン制御因子遺伝子のプロモーター、インターフェロン遺伝子プロモーター、インターフェロン応答プロモーター若しくはファージショックプロテイン(psp)プロモーター、及び任意のタンパク質をコードする領域を含むDNAを導入して、形質転換体を得る工程を含み、
前記DNAの領域は、三塩基連鎖を含み、及び
前記三塩基連鎖は、前記タンパク質を構成する少なくとも一部の種類のアミノ酸を規定するコドンから選ばれ、かつ前記標的細胞における使用頻度が0.2以下である少なくとも一部のコドンに相補的である、
前記方法が提供される。
前記DNAの領域は、三塩基連鎖を含み、及び
前記三塩基連鎖は、前記タンパク質を構成する少なくとも一部の種類のアミノ酸を規定するコドンから選ばれ、かつ前記標的細胞における使用頻度が0.2以下である少なくとも一部のコドンに相補的である、
前記ベクターが提供される。
前記DNAの領域は、三塩基連鎖を含み、及び
前記三塩基連鎖は、前記タンパク質を構成する少なくとも一部の種類のアミノ酸を規定するコドンから選ばれ、かつ前記標的細胞における使用頻度が0.2以下である少なくとも一部のコドンに相補的である、
前記ベクターが提供される。
本願発明者らは、標的細胞において、外来タンパク質を発現することにより細胞増殖が抑制されるという事象について鋭意研究を進めた。その中で、本願発明者らは、標的細胞において使用頻度の低いコドンを含むmRNAによってコードされる任意のタンパク質を発現することにより、標的細胞の増殖を抑制することができることを見出した。これは、上記任意のタンパク質の発現により、標的細胞における使用頻度の低いコドンに対応するtRNAを独占し、該使用頻度の低いコドンを含むmRNAによってコードされる細胞増殖等の生物活動に関連するタンパク質の発現を抑制することができるからだと、本願発明者らは予測している。
培養後の細胞を遠心分離(8,000 rpm、1分、4℃)し、次いでPBS緩衝液(75 mMのリン酸ナトリウム、67 mMのNaCl(pH7.4))で洗浄し、次いでPBS緩衝液に懸濁したものをGFP測定用サンプルとする。GFP発現量は、Becton Dickinson FACSCaliburフローサイトメトリーを使って30,000個の細胞により測定する。
ウイルス溶液は、ウイルス及び細胞を含む培養液から非溶解細胞を遠心分離(8,000rpm、10分、4℃)により除去した後、孔径0.2μmのメンブレンフィルターで濾過し、調製する。ウイルス溶液にウイルスに適した宿主細胞を混合し、次いで混合した液をウイルスの生育に適した固体培地に塗沫し、さらに適当な固体培地を重層して、ウイルス及び宿主細胞に適した温度で培養する。培養後、プラーク形成数(pfu)を測定し、ウイルス濃度を算出する。
(1)使用菌株、ファージ、薬品およびプラスミド構築
人工GFP遺伝子、lgfpとhgfpは、gfpmut3遺伝子のアミノ酸配列を元に、コドン使用頻度データベース(Nakamura, Y., Gojobori, T. & Ikemura, T., (2000), Nucleic Acids Res. 28, 292)に基づき遺伝子配列を設計し、GenScript社(Piscataway、NJ、USA)に依頼し合成した。それぞれ、lgfpとhgfpのDNAシーケンスは、登録番号AB304879とAB30487で、DDBJ datebaseに登録されている。欠失変異遺伝子lgfpΔ1、lgfpΔ2とlgfpΔ3は、それぞれlgfp遺伝子のN末端から75%、50%と25%の長さを有し、PCRによってlgfp遺伝子を鋳型として増幅し、取得した。また、それぞれの人工欠失変異遺伝子のCAI値は下記URLのサイトを利用して計算した:http://www.evolvingcode.net/codon/cai/cai.php#146。細菌の実験に用いたすべてのプラスミドはpTAK、pIKEとpTSMb1プラスミド(J. J.コリンズ教授(ボストン大学、MA、USA)より寄贈された)を部品として、標準的なクローニング技術を用いて構築した(14, 29, 47)。pHGFP、pLGFP、pLGFPΔ1、pLGFPΔ2とpLGFPΔ3の各プラスミドは、pTAK132のPtrcプロモーターの下流に、それぞれhgfp(lgfp、lgfpΔ1、lgfpΔ2とlgfpΔ3を配置し、構築した。pYEG、pLGFP1とpLGFP2は、まずpYES2(インビトロゲン)のPGALプロモーターの下流にそれぞれyEGFP、lgfpとhgfp遺伝子を配置した後、PGAL-各gfp遺伝子-CYC1TT領域をPCRにより取得し、これをpAUR112(TAKARA)にクローニングし構築した。pLΔNGはpLGFPΔ1にpIKE107より切り出したtetR抑制gfpmut3領域を組み込んで構築した。またpHΔNGはhgfpのC末端から25%が欠失したhgfpΔ1をpLΔNGのlgfpΔ1と置き換えて構築した。また、pPALとpPAHはpLGFPとpHGFPのLacI-PL-Ptrc領域を大腸菌AK1よりPCRで取得したpspプロモーターと入れ替えることによって構築した。全てのPCRはPyrobest DNAポリメラーゼ(TAKARA)を用いた。E.coli MACH1(インビトロゲン;F-φ80(lacZ)、ΔM15、ΔlacX74、hsdR(rK-(mK+))、ΔrecA1398、endA1、tonA)は遺伝子のクローニングとGFP発現の実験に用いた。E.coli K-12 XL-10(Clontech;deoR、endA1、gyrA96、hsdR17(rk-m-k+)、recA1、relA1、supE44、thi-1、Δ(lacZYA-argF)U169、φ80δlacZ、ΔM15、F-λ-PN25/tetR、Placiq/laci、Spr)はrelA変異株としてのGFP発現による増殖の影響を調べる為に用いた。E.coli AK4は、AK1株から取得されたラムダ欠失変異株で、ファージ感染実験に用いた (Kobayashi, H. et al., (2004), Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 8414-8419)。ファージT4(NBRC20004)とT7(NBRC20007)は、NITE Biological Resource Centor(カズサ、日本)から購入した。ラムダファージ(NCIMB10451)、Phage f1(NCIMB13926)とMS2(NCIMB10108)は、National Collections Industrial, Food and Marine Bacteria(アバディーン、英国)から購入した。S.cerevisiae YPH499(MATa、his3-、Δ200、leu2-Δ1 lys2-801、trp1-、Δ1 ade2-101 ura3-52)は、真核生物におけるGFP 発現実験に使われた(Sikorski, R. S. & Herter, P., (1989), Genetics 122, 19-27)。なお、人工合成したgfp遺伝子と構築したすべてのプラスミドDNA配列は、Supplementary Informationに記載してある。
すべての大腸菌は、LB培地(Difco)にて37℃、160rpmで培養を行い、必要に応じて100g/mlのアンピシリン(SIGMA)を添加した。大腸菌の生育は、660nmにおける濁度(OD660)と生菌数(CFU)にて測定した。また、PtrcまたはPtetプロモーターからの発現を誘導する場合、IPTG(SIGMA)またはanhydrotetracycline(ACROS Organics)を培地に添加した。S. cerevisiaeは0.5g/mlのaureobasidin A(TAKARA)を含んでいるYPD培地(Difco)にて培養した。GFPの発現誘導時には1%のラフィノースと0.5g/mlのaureobasidin Aを含んでいるYPGalactose培地を用いて培養を行った。S. cerevisiaeは30℃、200rpmで振盪培養を行った。
一晩、37℃にて好気的に振盪培養した大腸菌培養液を、新しいアンピシリン含有LB培地に0.2%植菌し、振盪培養した。また、必要に応じて、IPTGまたはaTcを培地に添加した。大腸菌を遠心分離(8,000 rpm、1分、4℃)後、PBS緩衝液(75 mMのリン酸ナトリウム、67 mMのNaCl(pH7.4))で洗浄後、PBS緩衝液に懸濁し、GFP測定用サンプルとした。S.cerevisiaeは30℃、24時間aureobasidin Aを含んでいるYPD培地で好気的に培養した。集菌後、YPGalactose培地で二回洗浄し、aureobasidin Aおよびラフィノース含有YPGalactose培地にOD660の値がおよそ0.1になるように細胞を懸濁した。GFP測定用サンプルの調製は大腸菌に準じた。すべてのGFP発現データは、Becton Dickinson FACSCaliburフローサイトメトリーを使って30,000個の細胞より測定した。
10mlの大腸菌培養液より菌体を遠心分離(8,000rpm、5分、4℃)によって集菌し、脱イオン蒸留水(DDW)で洗浄後、0.3 mlのDDWに懸濁した。菌体を10%(v/v)のトルエンで処理した後、10μlの菌体懸濁液と100μlのp-Nitrophenylphosphate溶液(Wako Chemical USA)を混合し、3時間、37℃でALP反応を行った。405nmでの吸光度(A405)を測定し、ALP活性を算出した(Coleman, J. E., (1992), Annu Rev. Biophys. Biophys. Chem. 21, 441-483)。
ファージT7、T4とラムダファージの宿主として、E.coli JM2.300を用いた。また、ファージMS2とf1の宿主としてE. coli AK4を用いた。各ファージ溶液はファージ感染した培養液から非溶解菌体を遠心分離(8,000rpm、10分、4℃)により除去した後、孔径0.2μmのメンブレンフィルターで濾過し、調製を行った。LB(T4とT7)、LB + 0.2%マルトース(ラムダファージ)と1/4LB(f1とMS2)に0.8%の寒天を添加した軟寒天培地に各ファージと対応する宿主菌と混ぜて、LB寒天培地に重層し、37℃で培養後、プラーク形成数(pfu)を測定し、ファージ濃度を算出した。
(6)大腸菌の増殖抑制のための人工遺伝子の設計
毒性がなく大腸菌で発現が確認しやすいことからgfpmut3遺伝子(緑色蛍光蛋白質遺伝子;以下、gfpmut3と呼ぶ場合もある)をモチーフとして選択した(Cormack, B. P., Valdivia, R. H. & Falkow, S., (1996), Gene173. 33-38)。2つの人工遺伝子をgfpmut3遺伝子のアミノ酸配列に基づき合成した。一つは、最も低い使用頻度の低い同義コドン(低頻度コドン)で構成された遺伝子(lgfp)であり、低頻度コドンに対応するtRNAを独占することを狙った。もう一つは最も使用頻度の高いコドン(高頻度コドン)で構成された遺伝子(hgfp)で、lgfpの対照として用いた(表2、図2)。各コドンの使用頻度は、下記URL:http://www.kazusa.or.jp/codon/31における大腸菌W3110株のコドン使用データベースに基づいて計算された。
b)AA; Amino Acid
大腸菌のハウスキーピング遺伝子の一つ、アルカリホスファターゼ(ALP)活性に関してlgfp発現誘導の影響について検討した(Wilson, I. B., Dayan, J. & Cyr, K., (1964), J. Biol. Chem. 239, 4182-4185)。lgfp遺伝子を発現誘導させている大腸菌のALP活性のレベルは、大腸菌の増殖が停滞している間、わずかに増加した。3時間培養後では、lgfpの発現により対照に対して2.8%のALP活性に抑制されていた(図4)。細胞増殖停滞は、細胞内でALPと同様、種々のタンパク質合成の抑制によるものだと推察できる。lgfpからのGFP発現量は、2時間培養後でhgfpのおよそ3分の1、6時間培養後で、hgfpの半分だった(図5)。発現誘導に用いるIPTGが1mM以下の場合、lgfpの発現による増殖抑制効果は認められなかった。また、15AとSC101複製起点を持つpLGFPプラスミドは、それぞれ10コピーまたは数コピー細胞内に存在するが、終濃度10mMのIPTGを添加しても増殖抑制効果を示さなかった(図17)。これらの結果は、lgfp遺伝子から翻訳されたタンパク質が大腸菌に有毒でないことを示した。RNAポリメラーゼ等の各種酵素の酵素反応を阻害する事はないので、4時間後からのCFU増加は菌体内tRNA含有量の増加に起因することが示唆された。
低頻度コドンに対応するtRNA不足によるペプチド合成の停止は、大腸菌にアミノ酸飢餓という偽信号を送る可能性がある。そして、生育阻害を引き起こすグアノシン5 3- bisdiphosphate(ppGpp)カスケードを活性化する可能性がある(Magnusson, L. U., Farewell, A. & Nystrom, T., (2005), Trends Microbiol. 13, 236-242)。そこで、ppGppの合成に必要なrelA遺伝子が欠失した大腸菌K-12 XL-10株を用いて、lgfp発現による生育阻害効果の検証を行った(図18)。検証は、pLGFPを有する大腸菌XL-10株を、アンピシリンを含むLB培地で、37℃で一晩好気的に培養し、次いで1:500で希釈した後に、10mM IPTGを含む(黒丸)、又はIPTGを含まない(白丸)LB培地を用いて37℃で再びインキュベートすることにより実施した。その結果、XL-10株においても、lgfpの発現により増殖が抑制された(図18)。lgfp遺伝子による増殖抑制は、ppGppネットワークとは関係なかった。このシステムは、飢餓信号を発しないか、飢餓信号のために必要なタンパク質合成の抑制が行われていると予想される。これらの結果は大腸菌において、低頻度コドンに対応するtRNAを独占し、遺伝子発現を阻害するということを示唆している。
真核生物と原核生物では遺伝子発現におけるmRNAの翻訳過程にほとんど差は認められない。したがって、低頻度コドンを多く含む本人工遺伝子の高発現による増殖抑制効果は、原核生物と同様に真核生物でも認められるだろうと考えた。真核生物のモデル生物の一つに酵母が挙げられ、また酵母には種々のホストベクター系が存在する(Sikorski, R. S. & Herter, P., (1989), Genetics 122, 19-27)。一方、lgfpとhgfpはS. cerevisiaeにおいて、それぞれ0.0492と0.0522と低いCAIを示した。S. cerevisiaeのベクターでaureobasidin A耐性遺伝子を持ち、ガラクトース誘導可能なプロモーターP-GALの制御下にlgfpとhgfpを配置し、プラスミドpYLGFP1とpYLGFP2を構築した。対照として、酵母において高使用頻度コドンで構築されたGFP遺伝子(yEGFP)をlgfpの代わりに配置したpYEGを構築した(Cormack, B. P. et al., (1997), Microbiology 143, 303-311)。人工合成したlgfpとhgfp遺伝子のCAIは、ほとんど同じ値だった。しかし、hgfpはS. cerevisiaeにおいて、lgfpより多種のレアコドンを含んでいた。そして、hgfpとlgfpの低頻度コドン含有比はちょうど大腸菌(表2)の場合と正反対となった。lgfp遺伝子は、頻度が0.15未満の低頻度コドンは2種類存在し、23個のグリシンコドン(GGG)と18個のロイシンコドン(CUA)だけだった。一方、hgfpには5種類の低頻度コドンが存在した。特に6個の低頻度アルギニンコドン(CGC)は、hgfp遺伝子(図6、矢印)の中間から終わりまで位置していた。Arg(CGC)のtRNAは、AGCコドンのtRNAから修飾酵素により合成される(Auxilien, S., Crain, P. F., Trewyn, R. W. & Grosjean, H. H., (1996), J. Mol. Biol. 262, 437-458)。各々のgfp発現の効果を検討するため、pYLGFP1、pYLGFP2またはpYEGを保持したS. cerevisiaeを、aureobasidin A(1μg/ml)含有YPGalactose培地(1%ラフィノース含有)を用いて30℃で培養を行った。個々の増殖度は24h培養後、培養液のOD660で測定した。その結果、pYLGFP2を保持するS. cerevisiaeのみ増殖抑制が認められた。その増殖抑制効果は大腸菌で観察されたpLGFPによる抑制効果より長い時間観察された(図7)。なお、GFPを発現誘導しないYPD培地では全ての形質転換体は培養24時間後に培地の濁度OD660が5.0以上になった(データ非公開)。酵母細胞内でのpYLGFP2のコピー数はおよそ10と報告されている(Sikorski, R. S. & Herter, P., (1989), Genetics122, 19-27)。その数は大腸菌において15A複製起点を持つプラスミドに等しい。しかしながら、pLGFPの複製起点をColE1から15Aに変えても、大腸菌においてlgfp発現による増殖抑制効果は認められなかった(図17)。S. cerevisiaeと大腸菌の増殖抑制効果の違いは、mRNAの半減期に依存していると考えられる。mRNAの平均的半減期は酵母が22分と長いが、大腸菌の2、3分と短い(Lodish, H. F. et al., (2004), Molecular Cell Biology., W H Freeman & Co, New York)。その結果、低頻度コドンで構成された人工GFP遺伝子のmRNAの細胞内濃度は、pYLGFP2の低いコピー数にもかかわらず高水準に維持されると予想される。pYLGFP2からGFPの発現量は、pYLGFP1またはpYEGより非常に低かった(図8)。真核細胞においても、翻訳効率が遺伝子のCAI値と相関すると報告されている(Blake, W. J., Kaern, M., Cantor, C. R. & Collins, J. J., (2003), Nature422, 633-637, Kellis, M., Birren, B. W. & Lander, E. C., (2004), Nature 428, 617-624)。lgfp遺伝子は、CAI値がyEGFPより非常に低いが、その発現量はほとんど同じだった(図8)。合成GFP遺伝子による翻訳効率と増殖抑制効果は、遺伝子のCAI値よりむしろ、低頻度コドンが多種含まれているかどうかに依存していた。本実験の結果、低頻度コドンを数多く含む遺伝子を発現させると、tRNAを独占し、その結果増殖抑制を示すという事例が、原核生物だけでなく、真核生物でも可能である事が示された。
大腸菌の増殖抑制の為に必要なlgfp遺伝子の長さについて検討を行った。lgfpのC末端よりそれぞれ25%、50%、75%を欠失した3つの欠失変異遺伝子lgfpΔ1、lgfpΔ2とlgfpΔ3を作成した。lgfp遺伝子と欠失変異遺伝子lgfpΔ1、lgfpΔ2とlgfpΔ3には、それぞれ111、83、59、36のレアコドン(分数0.15)が存在していた。プラスミドpLGFPのlgfpの位置にlgfpΔ1、lgfpΔ2とlgfpΔ3を配置し、プラスミドpLGFPΔ1、pLGFPΔ2とpLGFPΔ3を構築した。欠失lgfp変異遺伝子が発現しても、その生産物は蛍光を持っていなかった。lgfpを含む変異遺伝子を発現させた場合、lgfpとlgfpΔ1は大腸菌の増殖抑制を示した。しかし、lgfpΔ2とlgfpΔ3は何も影響を示さなかった(図9)。lgfp遺伝子のN末端からおよそ500 bpの長さが低頻度コドンを集め、増殖抑制効果を示すために必要だった。イソロイシンのレアコドンAUA、リジンコドンAAGとアスパラギンコドンAAUの各コドンは、pLGFPΔ1とpLGFPΔ2の間で減少していた(表2)。アスパラギンコドンAAUは、レアコドンではなかった。したがって、大腸菌の増殖抑制効果への寄与はほとんどないと考えられる。一方、イソロイシンのレアコドンAUAはゲノムから転写されるのではなく、メチオニンコドンAUGから酵素反応で合成される(Soma, A. et al., (2003), Mol. Cell 12, 689-698)。
lgfp遺伝子の発現によるALP発現抑制は、大腸菌で遺伝子発現の抑制を完全に示したわけではない(図4)。いくつかの未知の遺伝子ネットワークや細胞内の状態がphoレギュロンの発現を制御する可能性がある。したがって、転写後の遺伝子発現抑制(図10)を確かめるために、pLΔNGプラスミドを構築した。様々な使用頻度のコドンを含むと共に、検出容易なgfpmut3遺伝子をリポーター遺伝子として選択した。遺伝子gfpmut3とlgfpΔ1は、それぞれPtet(anhydrotetracycline(aTc)で誘導)とPtrc(IPTGで誘導)の下流に配置し、個々に独立して発現可能とした。また、対照として、lgfpΔ1の代わりにhgfpΔ1(N末端からlgfpΔ1と同じ長さに作成)を配置したプラスミドpHΔNGを構築した。pLΔNGのgfpmut3からのGFP発現は、終濃度100ng/ml のaTc添加後4時間培養時、およそ84.4だった。また、pLΔNGのlgfpΔ1を発現させた場合、大腸菌の増殖とともにGFP発現量を21.2まで抑制することが認められた(図11)。図11においては、GFP発現は培地にaTcを添加して誘導した。また、lgfpΔ1及びhgfpΔ1は、それぞれ最終濃度10mM IPTGを培地に添加して誘導した。欠失変異遺伝子lgfpΔ1およびhgfpΔ1の産物に蛍光は無かった。
本人工遺伝子による遺伝子発現抑制機構は、生物活動の新しい制御方法を提供できる。その一つに、非特異的なウイルス防御機構の構築があげられる。全てのウイルスはその増殖に宿主の遺伝子発現における翻訳段階を利用しているため、本遺伝子による影響が大きいと考えられた。大腸菌に種々のファージの増殖に対するlgfp発現の影響を調べた。対象ウイルスとして5種類の典型的なファージ、二本鎖DNAファージT4、T7、溶源化するλファージ、一本鎖DNA糸状ファージf1と一本鎖RNAファージMS2を選択した(Birge, E. A., (2000), Bacterial and Bacteriophage Genetics, Springer-Verlag, New York, ed. 4)。また、ファージホストとして利用する大腸菌K-12 JM2.300とAK-4株に対してもlgfp遺伝子の過剰発現は増殖阻害効果を示した(非公開データ)。大腸菌にT4またはT7ファージを感染させ、ファージの増殖と宿主大腸菌の溶菌について、lgfp高発現の影響を検討した。また、同じ宿主大腸菌にhgfpを高発現させて、lgfp遺伝子の対照とした。その結果、lgfpを高発現させた場合、それぞれのファージは20倍増殖したが、溶菌による濁度の減少は観察できなかった。一方、hgfpを高発現させた場合、ファージの増殖および宿主の溶菌を防ぐことはできなかった(図12)。図12の実験は以下の通りに実施した。
pHGFP(青)またはpLGFP(赤)を保持している大腸菌を、LB培地に終濃度10mMのIPTG(ソリッドシンボル)添加またはIPTG無添加(白抜きシンボル)で、30分間37℃で培養した。各々の培地の濁度OD660を0.4に調製した後、ファージT4(丸)(T7(三角形))を添加し、ファージ無添加(四角)を対照とした。添加したT4とT7の宿主細菌に対する比率(moi)は、0.088と0.0012であった。ファージを感染させない場合、pHGFPを保持した大腸菌とpLGFPを保持し、IPTGを添加せずlgfp遺伝子を誘導しなかった大腸菌の培養液は、2時間で定常期まで生育した(非公開データ)。各培養液のpfu(上のグラフ)とOD660(下のグラフ)を経時的に測定した。
pHGFPまたはpLGFPを保持している大腸菌JM2.300をラムダファージの宿主菌として用いた、また、pHGFPまたはpLGFPを保持している大腸菌AK4株をファージf1とMS2の宿主菌として用いた。培養条件およびファージ感染条件は(a)と同様の方法で行った。各ファージは、moi = 0.01の濃度で、培養液に添加した。各々のファージの増殖率を、37℃、4時間培養後のプラーク形成数から算出した。
Claims (15)
- 標的細胞の増殖を抑制する方法であって、
前記標的細胞に任意のタンパク質をコードする領域を含むDNAを導入する工程、及び
前記DNAを導入した標的細胞において、前記DNAにコードされたタンパク質を発現させる工程を含み、
前記DNAの領域は、三塩基連鎖を含み、及び
前記三塩基連鎖は、前記タンパク質を構成する少なくとも一部の種類のアミノ酸を規定するコドンから選ばれ、かつ前記標的細胞における使用頻度が0.2以下である少なくとも一部のコドンに相補的であり、
前記標的細胞が、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および植物からなる群より選択されるものの細胞である、
前記方法。 - 前記使用頻度が、0.15以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記三塩基連鎖のコドンが、1種類のアミノ酸について1種類のコドンである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記少なくとも一部の種類のアミノ酸が、アラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、及びバリンからなる群から選ばれる少なくとも3種のアミノ酸である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも一部の種類のアミノ酸が、アルギニン、ロイシン及びバリンである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記三塩基連鎖が、少なくとも80個の三塩基連鎖である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAが、インターフェロン制御因子遺伝子のプロモーター、インターフェロン遺伝子プロモーター、インターフェロン応答プロモーター若しくはファージショックプロテイン(psp)プロモーター、及び任意のタンパク質をコードする領域を含むDNAである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAが、ベクターに挿入されて前記標的細胞に導入される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- ウイルス耐性を有する形質転換体を作製する方法であって、
標的細胞に、インターフェロン制御因子遺伝子のプロモーター、インターフェロン遺伝子プロモーター、インターフェロン応答プロモーター若しくはファージショックプロテイン(psp)プロモーター、及び任意のタンパク質をコードする領域を含むDNAを導入して、形質転換体を得る工程を含み、
前記DNAの領域は、三塩基連鎖を含み、及び
前記三塩基連鎖は、前記タンパク質を構成する少なくとも一部の種類のアミノ酸を規定するコドンから選ばれ、かつ前記標的細胞における使用頻度が0.2以下である少なくとも一部のコドンに相補的である、
前記方法。 - 前記使用頻度が、0.15以下である、請求項9に記載の方法。
- 前記三塩基連鎖のコドンが、1種類のアミノ酸について1種類のコドンである、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記少なくとも一部の種類のアミノ酸が、アラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、及びバリンからなる群から選ばれる少なくとも3種のアミノ酸である、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも一部の種類のアミノ酸が、アルギニン、ロイシン及びバリンである、請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記三塩基連鎖が、少なくとも80個の三塩基連鎖である、請求項9〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 任意のタンパク質をコードする領域を含むDNAを発現可能な状態で含むベクター、又は
任意のタンパク質をコードする領域を含むDNAを挿入可能なベクターであって、
前記DNAの領域は、三塩基連鎖を含み、及び
前記三塩基連鎖は、前記タンパク質を構成する少なくとも一部の種類のアミノ酸を規定するコドンから選ばれ、かつ前記標的細胞における使用頻度が0.2以下である少なくとも一部のコドンに相補的であるベクターを有効成分として含むウイルスの増殖抑制剤又は増殖予防剤。
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