KR100468821B1 - 사람의전사조절매개체유전자,이유전자의생성물및이유전자에의해형질전환된균주 - Google Patents

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Abstract

본 발명에는 전사활성화에 필수적인 역할을 하며, 그 염기서열이 하기 서열1로 되어 있는 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)와 이 유전자의 생성물인 전사조절 매개체 단백질 (hMed6) 및 이 유전자에 의해 형질전환된 균주가 개시되어 있다.
[서열 1]

Description

사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6), 이 유전자의 생성물 (hMed6p) 및 이 유전자에 의해 형질전환된 균주
본 발명은 전사조절에 필요한 매개체 (mediator)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)과 이 유전자의 생성물인 전사조절 매개체 단백질 (hMed6p) 및 이 유전자에 의해 형질전환된 균주에 관한 것이다.
유전자발현의 조절은 정상적인 개체의 발생과 조직 발달의 주요 조절수단이 될 뿐만아니라, 세균이나 바이러스 감염에 대한 면역반응과 같이, 외부 환경변화에 대해 동식물이 나타내는 반응작용의 주요 조절수단이 되기도 한다. 유전자발현이 정상적으로 조절되지 못하는 경우, 기형발생, 암세포로의 전이, 면역결핍, 생체호르몬에 의한 항상성 유실과 같은 심각한 질병이 유발될 수 있다. 예를 들면, 세포의 분화나 사멸을 조절하는 유전자들이 비정상적으로 발현하는 경우 암이 발생할 수 있고, 세균감염시 주 사망요인이 되는 패혈증 (endotoxic shock)은 세균에 대해 숙주의 면역체계가 관련유전자를 과잉발현시킴으로써 일어나는 것으로 밝혀졌다. 그외에도, 단순히 세포의 비정상적 생리현상에 의해 발생되는 것으로 생각되었던 당뇨병이나 뇌졸중의 근본원인도 인슐린, 콜레스테롤의 수용체나 이들의 대사에 관련된 효소들의 비정상적 발현에 의한 것으로 밝혀졌고, 신경계 및 정신계 질환의 주요 원인도 유전자발현의 조절실패에 있다는 견해가 보편화되어 있다.
현재, 이러한 질병의 치료를 위하여 사용되는 방법으로는, 문제 유전자의 발현 자체를 조절함으로써 그 원인을 제거하는 직접적인 방법보다는, 부절적한 유전자발현으로 인해 야기된 유해한 세포반응을 억제 또는 중화시키는 간접적 치료방법이 주로 사용되고 있다. 그러나, 간접적인 치료방법은 근본적인 치료라기보다는 단지 질병의 악화를 막거나 질병의 증상이 나타나는 것을 막는 수동적인 방법이라는 점에서 한계가 있다. 최근에는 사이토카인이나 그 수용체와 같이 유전자 활성화의 전단계 물질을 조절함으로써 직접적인 치료효과를 얻으려는 연구가 시도되고 있기는 하지만, 목표유전자 뿐아니라 다른 많은 유전자들의 발현도 영향을 받게 되어 심각한 부작용을 수반하는 경우가 많다. 그러므로 유전자의 발현조절기작을 규명하고, 여기서 얻은 지식을 응용하여 특정 유전자에 대해 인위적으로 그 발현을 조절하는 방법이 질병의 새로운 치료방법으로서 주목을 받고 있다. 유전자발현 조절방법은 상기와 같은 의학적 목적 이외에도 산업적으로도 이용될 수 있는데, 예를 들어, 동식물이나 효모를 이용하여 생물질을 생산하는데 있어서 유전자의 발현을 조절함으로써 생산효율을 증가시킬 수 있다.
현재까지 밝혀진 생체내에서의 유전자발현 조절방법중에서도, 전사의 효율을 조절하는 방법이 유전자발현의 초기 단계인 전사과정을 조절한다는 점에서 효율적인 방법이라고 할 수 있다. 전사조절과 관련하여, 전사효소, 전사인자, 활성화제/억제제 (activator/repressor) 등의 트랜스적 작용 요소 (trans-acting factor)들과 인핸서 (enhancer)와 프로모터 (promoter) 등의 시스적 작용 요소(cis-element)에 관한 연구가 상당히 많이 이루어졌으며, 그 결과 전사에 필요한 효소와 인자들이 순수분리되고 그 기능이 상당한 수준으로 밝혀졌다. 그러나, 순수 분리된 전술한 효소나 인자만을 시험관내에서 재조합시킨 것만으로는 전사가 이루어지지 않는 경우가 발견됨으로써, 이러한 전사를 조절하기 위해서는 또 다른 인자가 필요한 것으로 밝혀졌다. 이것이 바로 전사활성화 매개체인데, 매개체가 발견됨으로써 활성화제가 어떠한 방법으로 전사기구 (transcription machinery)를 조정하는 지를 밝힐 수 있는 길이 열리게 되었다.
전술한 전사조절 매개체 이외에, 전사조절신호를 전사효소에 전달해 주는 중간인자로서 다음과 같은 2종류가 더 확인되었다: (1) TATA-결합 단백질 (TBP)와 결합하여 TFIID를 형성하는 TAFII (Verrijzer, C.P., and R. Tjian, (1996), Trends Biochem. Sci. 21: 338-341 참조), 및 (2) 사람의 USA (upstream stimu1atory activity) (Kaiser, K., and M. Meisterernst, (1995), Trends Biochem. Sci., 21: 342-345 참조) 포유동물의 CBP/P300 (Janknecht, R., and T. Hunter, (1996), Nature, 383: 22-23 참조), 이스트의 ADA 복합체 (Horiuchi, J., N. Silverman, G.A. Marcus, and L. Guarente, (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 1203-1209 참조) 및 HMG 단백질 (Paull, T.T., M. Carey, and R.C. Johnson, Genes Dev. 10: 2769-2781 참조)과 같은 보조활성화제 (co-activator)가 바로 그것들이다. 이러한 중간조절인자는 서로 다른 기작을 이용하여 전사활성화를 조절하므로 이들 각각에 대한 연구가 종합적인 전사조절기작 연구에 필수적이다. 이들 중 전사매개체가 가장 중요한 역할을 하고 있는데, 전사조절 매개체의 존재는 스
Figure pat00027
칭 (squelching) 분석에 의해 처음으로 알려지게 되었다. 즉, 하나의 활성화제를 첨가하면 다른 활성화제에 의한 전사의 자극이 방해를 받게 되는 사실로부터, 하나의 공통된 표적에 대해 두 개의 활성화제가 경쟁을 하고 있다는 것을 알게되었다 (F1anagan, P.M., R.J.d. Kelleher, M.H. Sayre, H. Tschochner, and R.D. Kornberg, (1991) Nature 350: 436-438 참조). 스
Figure pat00028
칭 현상은 전사 활성화제의 활성화 영역에 대해 특이적으로 나타나며, 부분적으로 정제된 이스트 단백질 단편을 첨가하는 경우에는 구제될 수 있으나 기본적인 전사기구의 공지된 성분을 첨가하는 경우에는 구제될 수가 없다. 이러한 사실은, 기본적인 전사에 필요한 단백질과는 구별되지만 전사 활성화에 필수적인 역할을 하는 전사조절 매개체라고 하는 새로운 개념의 활성화제가 존재한다는 것을 시사하는 것이며, 실제로 이스트의 전사조절 매개체 활성 분석을 통해 RNA 폴리머라제II와 물리적으로 결합되어 있는 매개복합체가 분리되었다 (Kim, Y.-J., S. Bjorklund, Y. Li, M.H. Sayre, and R.D. Kornberg, (1994), Cell, 77: 599-608 참조). 매개복합체는 약 20개의 폴리펩티드를 포함하고 있는데, 그 중에는 Srb2p, Srb4p, Srb5p, Srb6p, Gal11p, Rgr1p 및 Sin4p와 같은 것들이 있으며, 이들은 각각 별도의 유전학적 연구를 통해 전사 조절제로 작용한다는 사실이 밝혀졌다.
전술한 전사조절 중간인자들 중에서 (1) TATA-결합 단백질 (TBP)와 결합하여 TFIID를 형성하는 TAFII (Trends Biochem. Sci. 21: 338-341 참조) (2) USA(upstream stimu1atory activity) 활성성분으로 분리된 PC4 단백질 (Henry, N. L., D. A. Bushnell, and R. D. Kornberg, (1996) J. Biol. Chem. 271: 21842-21847 참조), 및 (3) ADA 복합체와 같은 보조활성화제 (co-activator)들은 (Horiuchi, J., N. Silverman, G.A. Marcus, and L. Guarente, (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 1203-1209 참조) 각기 효모와 사람에게서 상동 유전자들이 밝혀져 있으며, 각 단백질의 기능도 효모에서 사람에 이르기까지 보존되어 있다는 것이 실험적으로 밝혀져 있다. 전사매개체를 포함하는 RNA 홀로-폴리머라제도 효모에서 처음으로 분리된 이래, 최근에 소와 사람에게서 유사한 홀로-폴리머라제 복합체가 부분적으로 정제되었으며 이들 단백질 복합체 내에 효모의 매개체 성분들인 Srb7p, Srb10p, Srb11p와 상동인 단백질들이 존재하고 있다는 것을 알아내었다 (Nature 380: 82-85 참조; Nature 381: 86-89 참조). 이러한 사실들로부터, 전사 중간조절인자들은 서로 다른 기작을 이용하여 전사활성화를 조절하며 거의 모두 종합적인 전사조절에 필수적이기 때문에 진화적으로 그 기능들이 잘 보존되어 있다는 결론을 얻을 수 있다.
본 발명자들은, 사카로마이세스 세레비지애로부터 추출한 전사매개체의 구성단백질 중 새로운 전사조절 매개체 단백질인 Med6p를 분리하여 그 기능에 대해 연구를 하는 과정에서, 이러한 전사조절 매개체 단백질을 코딩하는 MED6유전자와 상동성을 갖고 있는 사람의 전사활성화 매개체 유전자(hMED6)를 찾아냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 전사활성화에 필수적인 역할을 할 것이 확실시되는 사람의 전사조절 매개체 유전자와 이 유전자의 생성물인 전사조절 매개체 단백질 및 이 유전자에 의해 형질전환된 균주를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 전사조절을 매개하는 단백질을 코딩하는 유전자로서, 그 염기 서열이 하기 서열 1 또는 그 유도체로 되어 있는 사람의 전사조절 매개체 유전자 (본 발명자에 의해 hMED6라 명명됨)가 제공된다.
[서열 1]
상기 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)는 사카로마이세스 세레비지애로부터 추출된 전사조절 매개체 유전자 (MED6)와 30% 이상의 상동성을 가지고 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)의 생성물인 사람의 전사조절 매개체 단백질로서, 그 아미노산 서열이 하기 서열 2 또는 그 유도체로 되어 있는 사람의 전사조절 매개체 단백질 (hMed6p)에 의해 달성된다.
[서열 2]
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)에 의해 형질전환된 균주인 에스케리치아 콜라이 ECL1 (KCTC 0347BP)이 제공된다.
이때, 상기 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)의 벡터로는 플라스미드 p231995가 사용되며, 상기 에스케리치아 콜라이 ECL1에서 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)는 플라스미드 pT3T7D의 제한효소 자리 EcoR1과 Not1 사이에 삽입된 상태로 존재한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
전술한 바와 같이, 본 발명자들은 효모 (사카로마이세스 세레비지애)로부터 홀로-폴리머라제를 추출하고 이로부터 전사활성화를 조절하는 매개복합체의 구성 단백질 중 새로운 전사조절 매개체 단백질을 분리하였다. 이 전사조절 매개체 단백질의 아미노산 서열은 통상적으로 이용되는 생어 (Sanger) 방법을 이용하여 다음의 서열 3으로 되어 있음을 확인하였다.
[서열 3]
한편, 전사조절이 모든 생물체에서 이루어지는 과정이므로, 상기와 같은 효모의 전사조절 매개체 단백질과 유사한 작용을 하는 단백질이 사람에게도 존재할 것으로 예상하였다. 사람에게서 존재할 수 있는 전사조절 매개체 단백질을 찾아내기 위한 방법으로서, 상기 효모의 전사조절 매개체 유전자와 상동성을 갖는 유전자가 사람에게서 존재하는 지를 알아보기 위해 사람의 유전자 정보에 관한 컴퓨터 프로그램 (BLAST)을 이용하였다. 그 결과, 효모의 전사조절 매개체 유전자 (MED6)와 상당한 정도의 상동성을 가지고 있는, 본 발명에 따른 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)와 이 유전자의 생성물인 사람의 전사조절 매개체 단백질 (hMed6p)을 얻었다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 기재함으로써 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
먼저, 실시예에서 이용된 재료 및 분석방법 등에 대해 설명하기로 한다. 이와 관련하여, 먼저 효모의 전사조절 매개체 단백질 (Med6p)에 대해 그 기능을 확인하는 실험과 그 결과에 대해 상세히 설명하고, 사람의 전사조절 매개체 단백질(hMed6p)에 대해 설명하기로 한다.
1. 균주 및 플라스미드
실험용 효모 사카로마이세스 세레비지애 야생형 균주인 YPH500 (유전자형: MAT α, ade2-101, ura3-52, lys2-801, trp1-△63, his3-△200, leu2-△1, GAL+)과 실험에 이용한 pRS313, pRS316 플라스미드는 미국 스탠포드대학의 컨버그 교수(R.D. Kornberg)로부터 입수하였으며, 박테리아에서의 과잉발현을 위한 pET 플라스미드는 노바겐 (Novagen)사에서 구입하여 사용하였다. 또한, 사람의 전사조절 매개체 유전자의 벡터로 사용되는 플라스미드 p231995는 리서치 제네틱스사 (Research Genetics)로부터 구입하였으며, 형질전환을 위한 숙주 균주인, 플라스미드 pT3T7D를 가지고 있는 에스케리치아 콜라이 DH10B도 역시 리서치 제네틱스사로부터 구입하여 사용하였다.
2. 배지
효모 배양을 위한 완전배지 (YPD)의 조성은 글루코오스 (Difco 제품) 2중량%, 박토펩톤 (Difco 제품) 1중량%, 박토효모추출물 (Difco 제품) 1중량%로 되어 있으며, 또한, 에스케리치아 콜라이에 대해서는 앰피실린을 포함하는 LB 배지를 이용하였다.
3. RNA 제조 및 분석방법
생체내 특정 유전자의 전사량을 측정하기 위해, 사카로마이세스 세레비지애 야생형 MED6 (YCL10)과 MED6 돌연변이주 (YCL8)로부터 세포내 전체 RNA를 추출하는 실험을 실시하였다.
먼저, 효모 MED6 야생형 (YCL10)과 돌연변이주 (YCL8)를 30℃에서 적절한 배지를 이용하여 초기 대수기까지 성장시켜 (A600= 0.3 내지 0.4), 2 부분으로 나누어서 2.5시간 동안 각각 30℃와 37℃에서 성장시켰다. 통상의 방법에 따라 전체 RNA를 추출하여 260nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량하고, 이것들의 순도를 아가로 즈 겔상에서의 에티디움브로마이드 (EtBr) 염색을 통해 확인하였다.
S1 뉴클레아제를 이용한 RNA 정량분석을 위해, 30㎍의 전체 RNA를 S1 뉴클레아제를 이용하여 분해하였다 (Cormack, B.P., K. Struhl, (1992), Cell, 69: 685-696 참조). 이렇게 하여 얻은 생성물을 10% 변성용 (denaturing) 폴리아크릴아미드겔상에서 분리한 다음 정량장치 (Phosphor- Imager and ImageQuant 소프트웨어, Molecu1ar Dynamics)를 이용하여 정량하였다. S1 뉴클레아제를 이용한 정량분석에 이용된 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
DED1: 5'-GCTAAAGAAG CTGCCACCGC CACGGCCACC GTTGTAGCCG C-3'(Chen, W., S. Tabor, and K. Struhl, (1987), Cell, 50: 1047-1055 참조);
HIS3: 5-GGTTTCATTT GTAATACGCT TTACTAGGGC TTTCTGCTCT GTCATCTTTG CCTTCGTTTA TCTTGCCTGC TCATTT-3' (바로 이전의 문헌과 동일한 문헌 참조);
TRP3: 5'-GGTAAAGGAA TCGTAGTTGT CAATTAAGAA CCTCATGCTT ACCTTAG-3'(Cormack, B.P., and K. Struhl, (1992), Cell, 69: 685-696 참조);
tRNAW: 5'-GGAATTTCCA AGATTTAATT GGAGTCGAAA GCTCGCCTTA-3' (바로 이전의 문헌과 문헌과 동일한 문헌 참조);
rRNA: 5'-TGCCAGTACC CACTTAGAAA GAAATAAAA ACAAATCGTT AGG-3'(바로 이전의 문헌과 문헌과 동일한 문헌 참조);
노던 분석을 위해서는, 각각의 샘플로부터 폴리(A)+RNA (1㎍)을 0.8% 아가로즈-포름알데히드 겔상에서 분리하여 니트란막 (Nytran membrane)으로 옮겨주었다. 이 막을 32P-표지된 안티센스 RNA로 프로우브 처리하였다 (Sambrook, J., E.F. Fritsch, T. Maniatis, (1989), Molecu1ar Cloning: a 1aboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, N.Y. 참조). 노던 분석을 위한 프로우브를 제조하기 위해, 이스트 유전자인 PYK1, MFα1, MATα1, MCM1, BAR1 및 MATα2의 코딩 영역을 PCR 방법으로 증폭시켜 pBlueScript II-Sk+(Stratagene)의 복수개의 클로닝 부위에 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드들을 적절한 제한효소로 분해하여 T7 또는 T3 RNA 폴리머라제 (Promega)에 의한 시험관내 전사시 주형으로서 이용하였다. 특이적으로 하이브리드된 신호를 전술한 바와 같은 정량장치를 사용하여 정량하였다. 필요한 경우에는, 막을 90℃ 증류수에 10분 동안 스트리핑하여 다른 프로우브와 재하이브리드시켰다. 프로우브 제조에 사용된 각각의 유전자의 PCR 단편은 다음과 같다:
PYK1: PYK1-1 프라이머 (XbaI 부위를 포함하는, 번역개시부위 +1 내지 +21)와 PYK1-2 프라이머 (EcoRI 부위를 포함하는, +1393 내지 +1412 영역)를 이용하여 ORF 영역을 포함하는 1.4kb (kilo base pair) DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.
MFα1: MFα1-1 프라이머 (XbaI 부위가 붙어 있는 +3 내지 +25)와 MFα1-2 프라이머 (EcoRI 부위를 가지고 있는 +478 내지 +498 영역)를 이용하여 508bp DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.
MATα1: MATα1-1 프라이머 (XbaI 부위가 붙어 있는 +7 내지 +27 영역)와 MATα1-2 프라이머 (EcoRI 부위를 가지고 있는 +507 내지 +528 영역)를 이용하여 537bp DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.
MAtα2: MATα2-1 프라이머 (XbaI 부위가 붙어 있는 +21 내지 +43)와 MATα2-2 프라이머 (EcoRI 부위를 가지고 있는 +611 내지 +633 영역)를 이용하여 624bp DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.
MCM1: MCM1-1 프라이머 (XbaI 부위가 붙어 있는 +6 내지 +28)와 MCM1-2 프라이머 (PstI 부위를 가지고 있는 +840 내지 +861 영역)를 이용하여 8708bp DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.
BAR1: BAR1-1 프라이머 (+51 내지 +72)와 BAR1-2 프라이머 (+1743 내지 +1764 영역)를 이용하여 1.6kb DNA를 PCR 방법으로 증폭시켰다.
4. 아미노산 서열 확인방법 및 염기 서열 확인방법
효모로부터 순수분리된 전사활성화 매개복합체를 SDS겔에 전개한 후 38kDa 크기의 단백질을 PVDF (polyvinylidenedifluoride) 막에 부착시키고 트립신으로 절단하여 단백질 절편을 HPLC로 순수분리한다. 분리된 단백질 절편에 대해 에드만 방법을 이용하여 아미노산 서열을 화인하였다 (Hwelett Packard G1005 Protein Sequencer 사용). 한편, 염기서열은 디데옥시뉴클레오티드를 이용한 표준 생거(Sanger) 방법에 따라 결정하였다.
< 실시예 1 >
1. 효모 야생형 전사조절 매개체 유전자 (MED6)의 분리
야생형의 효모로부터 순수분리된 홀로-폴리머라제로부터 38kDa 크기의 전사 조절 매개체 단백질을 순수분리하여, 그 아미노산 서열이 상기 서열1로 되어 있는 것을 확인하였다. 이 아미노산 서열과 컴퓨터 프로그램 (BLAST)을 이용하여 이 서열을 코딩하는 유전자를 효모의 게놈 데이터 은행으로부터 찾아내었다. 이 유전자를 분리하기 위해 PCR 방법을 이용하였으며, 이렇게 하여 분리한 유전자를 MED6라 명명하고 미국의 기탁기관 (Gen Bank, National Center for Biotechnology Information)에 기탁하였다 (1996년 11월 14일, genbank 수탁번호 U78080). 한편, 효모의 포자분석방법에 따라 실험한 결과 이 유전자는 세포의 생존에 필수적이라는 사실을 알아내었다.
2. 돌연변이 균주 (돌연변이 전사조절 매개체 유전자 med6에 의해 형질전환된 균주)의 제조
플라스미드 치환 (shuffling)을 위한 숙주 균주를 제조하기 위하여, 야생형 MED6 유전자를 포함하고 있는 URA3계 단일본 플라스미드 (pRS316)를 YPH500 (Matαade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-△63his3-△200 leu2-△1)에 도입하여 YCL3 균주를 만들었다. YCL3 균주의 염색체성 MED6 본의 오픈리딩프레임 (ORF: open reading frame)을 LEU2 유전자로 대치함으로써 YCL4 균주 [Matα ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-△63his3-△200 leu2-△1 med6L:LEU2 (MED6 on pRS316, URA3)])를 만들었다. MED6 유전자에 무작위적으로 이루어진 돌연변이를 가지고 있는 DNA 단편은 변형된 PCR 방법인 에러 유발성 (error-prone) 폴리머라제 체인 반응(polymerase chain reaction: PCR) 방법 (Leung, D.W., E. Chen, D.V. Goeddel, (1989), Technique, 1: 11-15 참조)에 따라 제조하였다. 약 250 염기쌍(bp)의 플랭킹 서열을 가지고 있는 MED6 유전자 단편들에 대해 PCR을 30회 (94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 60초) 실시하는 동안 Mn2+에 의해 유도되는 Taq 폴리머라제의 부정확성에 의해 돌연변이가 이루어졌다. PCR 반응에 사용된 재료는 다음과 같다: 100pmole씩의 올리고뉴클레오티드 [MED6-1 (5'-GGGGGAATT CTTGTGGCTAATCCGGGAAGG-3') 및 MED6-5(5'-GGGGAGATCTCTTC GTCGTCCTGATCAATCAAC-3')], 주형으로서 20ng의 플라스미드 pBS-MED6, 0.1 내지 0.2mM MnCl2, 2.5mM MgCl2, 0.25mM씩의 각각의 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTPs), 10mM Tris-HCl (pH 9.0), 50mM KCl, 0.1% Triton X-100 및 5유니트의 Taq 폴리머라제 (100㎕).
med6 돌연변이 라이브러리를 만들기 위해, 생체네 갭-리페어를 기본으로 하는 1단계공정 (single-step method)을 이용하였다 (Muhlrad, D., R. Hunter, R. Parker, (1992), Yeast, 8: 79-82 참조). 말단 부분에 약 250bp의 MED6 유전자 측쇄부위를 가지고 있는, 선형화된 HIS3계 CEN-ARS 플라스미드 (pRS313)를 이용하여 med6 돌연변이들인 PCR 생성물들을 주입함으로써 YCL4 균주를 형질전환시켰다. 그 결과, 모두 40,000개의 His+ 형질전환체를 분리하였는데, 그 중의 80% 이상이 선형화된 플라스미드와 돌연변이된 PCR 생성물들간의 동형 재조합으로 생긴 것이었다. 이들 40,000개의 형질전환체 중, 단지 10%만이 5-FOA (5-플루오로오로틴산) 선택법으로 야생형 MED6 유전자를 제거한 후에도 살아있었다. 5-FOA 내성 콜로니는 YPD 배지에서 생장하였고, 온도 감수성 (temperature sensitive: ts) 치사성을 나타내는 돌연변이를 분리하였다.
생존하는 med6 돌연변이 균주 중에서 온도 감수성 돌연변이를 분리하기 위하여 30℃와 37℃에서의 성장가능성에 대해 2,200개의 라이브러리 세포를 조사하였다. 이렇게 하여 37℃에서 성장에 결함이 있는 3종의 med6 돌연변이 균주를 분리하였다. 가장 뚜렷한 ts 표현형을 가진 돌연변이 균주 (YCL8)를 분리하여 이것을 후속의 분석에 이용하였다 (도 1a 참조).
도 1a의 사진을 통해 알 수 있는 바와 같이, YCL8은 포도당 배지를 이용하는 경우 30℃에서는 정상적으로 성장하지만 37℃로 옮기면 2-4시간내에 성장이 중지된다. 이러한 비허용 온도에서, YCL8의 형태는 비정상적으로 되어 복수개의 버드를 가지고 있는 것으로 나타났다.
상기 돌연변이 균주는 전사조절 매개체 유전자와 관련하여, 염색체 DNA는 녹아웃 (knock-out) 되어 있고 돌연변이 매개체 유전자 med6가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드 pRS313-med6ts2를 포함한다. 이 균주는, 사카로마이세스 세레비지애 YCL8로서 1997년 7월 11일자로 대전광역시 소재의 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0348BP로 기탁되어 있다. 이때, pRS313 대신 pBluescript II SK+ (Stratagene)이나 pRS316이 이용될 수도 있다. 상기 형질전환된 균주에서, 돌연변이 매개체 유전자는 플라스미드 pRS313의 제한효소 자리 EcoRI과 BglII 사이에 삽입된 상태로 존재한다.
또한, med6 ts 유전자를 씨퀀싱한 결과 오픈리딩프레임에 10개의 뉴클레오티드가 변화된 것으로 나타났는데, 이로 인해 6개의 아미노산이 치환되어 있었다 (도 1b 참조: 도 1b에서 영문기호는 아미노산을 1개의 영문자로 표현하는 국제적인 명명법에 따른 것이다). 여기서, 야생형 MED6 유전자를 이용한 영역 교환 (domain swapping) 실험에 의해, 처음의 3개의 돌연변이가 ts 치사성과 관계가 있는 것으로 밝혀졌다.
3. MED6 유전자에 의해 형질전환된 균주의 제조
돌연변이 매개체 유전자 (med6)에 의해 형질전환된 상기 YCL8을 제조할 때 이용한 방법과 동일한 방법에 따라, MED6 유전자의 양측쇄부위가 250bp 정도 포함되도록 프라이머 (Med6-1과 Med6-5)를 제조하여 효모 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 결과 예상되는 대로의 1.3kb의 DNA 절편을 얻었다. 이 절편의 양말단에 존재하는 EcoRI과 BglII 제한효소자리를 이용하여, 이 절편을 pRS313 플라스미드의 EcoRI과 BglII 제한효소자리 사이에 삽입하여 다음과 같은 재조합 플라스미드 pRS313-MED6를 만들고, 전술한 바와 마찬가지 방법으로 YCL4로부터 pRS313-MED6를 포함하는 YCL10을 제조하였다. 이때, pRS313 대신 pBluescript II SK+ (Stratagene)이나 pRS316이 이용될 수도 있다. 즉, 전사조절 매개체 유전자와 관련하여 염색체 DNA는 녹아웃 (knock-out) 되어 있고 재조합 플라스미드 pRS313-MED6를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 YCL10은 1997년 7월 11일자로 대전광역시 소재의 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0349BP로 기탁되어 있다.
4. 단백질 정제
800g의 MED6 야생형 세포 [YCL10; Matα ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-△62 his3-△200 leu2-△1 med6::LEU2 (MED6 on pRS313, HIS3)]와 동일한 양의 med6 ts 돌연변이 세포 [YCL8; Matα ade2-101 ura3-52 lys2-801 trp1-△63 his3-△200 leu2-△1 med6:: LEU2 (med6 ts on pRS313, HIS3)]로부터 매개체-RNA 폴리머라제II 복합체를 분리 정제하였다. 이 과정에서 4종류의 크로마토그라피를 실시하였다: BioRex 70 (Bio-Rad), DEAE-세파로오스 FF (Pharmacia), Biogel-HTP 하이드록시아파타이트 (Bio-Rad) 및 MonoQ HR 10/10 (Pharmacia) (Kim, Y -U., S. Bjouklund, Y.Li, M.H.Sayre, R.D. Kornberg, (1994), Cell, 77: 599-608 참조). 홀로-폴리머라제는 MonoQ HR 10/10 칼럼으로부터 1M 아세트산칼륨을 용출용매로 이용하여 용출시켰고, 피크 형태로 나타난 분획 (0.5-0.7mg/ml)의 일부 (1㎕)를 이용하여 각각 전사분석하였다.
하기 실시예들은 전사조절 매개체 단백질의 기능분석을 위한 실험들에 관한 것이다.
< 실시예 2 >
본 실시예는 med6 ts 돌연변이의 RNA 폴리머라제 특이성을 알아보기 위해 이루어졌다.
Med6p는 매개체-RNA 폴리머라제II 복합체의 하나의 성분이므로, MED6의 기능은 RNA 폴리머라제II에 의한 전사로만 제한되는 것으로 보인다. 이러한 가능성을 조사하기 위하여, rRNA, DED1 및 tRNA 유전자 각각의 전사수준을 측정함으로써 RNA 폴리머라제I, II 및 III에 의한 전사에 med6 돌연변이가 미치는 영향을 조사하였다. (도 2a 참조). mRNA에 비해 비교적 반감기가 긴 rRNA와 tRNA의 경우에는, 이들의 전구체 형태에 대해 특이적인 프로우브를 이용하여 이들의 합성율을 측정하였다. 도 2a에 나타나 있는 바와 같이, 예상대로 rRNA와 tRNA 전구체의 수준은 비허용 온도에서 med6 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았고, DED1의 mRNA 수준도 영향을 받지 않았다. 따라서, med6 돌연변이가 특정 RNA 폴리머라제II에 의해 전사되는 유전자에만 영향을 준다는 가능성만이 남게 되었다. 그러므로, 아미노산 대사 (HIS3 및 TRP3) 및 탄소원 대사 (GAL1 및 PYK1)와 관련된 유전자의 전사 활성화 및 MED6자체에 대한 med6 ts 돌연변이의 영향을 조사하였다. med6 ts 돌연변이는 비허용 온도에서 GAL1의 전사를 활성화시키지 않았으며, PYK1 전사를 2-3배 감소시켰다. 그러나, med6 돌연변이 유전자는 TRP3 및 MED6의 전사에는 영향을 주지 않았다. 또한, 동일한 플라스미드에 med6와 HIS3 유전자를 모두 위치시키는 인위적인 조건변화로 인해 HIS3 전사체의 전체 수준이 돌연변이 세포에서 증가된다고 하더라도, HIS3의 활성화된 전사 (+13)에 대해 항상 이루어지는 전사 (+1)의 비가 med6 돌연변이에 의해 변경되지 않았다. 즉, med6 돌연변이는 RNA 폴리머라제II에 의해 전사되는 특정 유전자만의 전사 활성화에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
< 실시예 3 >
본 실시예는 med6 ts 유전자가 GAL1 및 SUC2 유전자의 전사조절에 미치는 영향을 알아보기 위해 이루어졌다.
통상의 방법에 따른 탄소원 이용성에 대한 실험을 실시한 결과, med6 ts 돌연변이가 GAL1의 전사를 활성화시키지 못하는 결함을 가지고 있는 것과 아울러, med6 ts 돌연변이 균주는 포도당 이외의 탄소원이 공급될 때 허용 온도에서조차도 야생형에 비해 성장속도가 2배 내지 3배 느린 것으로 나타났다. 이에 따라, med6 돌연변이가 SUC2 유전자의 전사에 미치는 영향에 대해서도 역시 조사해 보았다. S1 뉴클레아제를 이용한 분석실험 결과, med6 ts 돌연변이 균주가 비허용 온도에서 배양되는 경우 갈락토오스 배지에서의 GAL1 전사의 예상되는 활성화와 라피노오스 배지에서의 SUC2 전사의 탈억제가 완전히 저해되었다 (도 2b 참조). 이로부터, Med6p의 ts 활성이 GAL1, PYK1 및 SUC2의 전사 활성화에 주로 영향을 미친다는 것을 알수 있게 되었다.
< 실시예 4 >
본 실시예는 med6 돌연변이가 교배형 특이성 유전자에 미치는 영향을 알아보기 위해 이루어졌다.
탄소원 대사의 결함과 비정상적인 형태는, med6 돌연변이가 다른 전사조절매개체 돌연변이 유전자 (gal11, rgr1, sin4)와 공유하고 있는 일반적인 표현형이다. 그러므로, med6 ts 유전자가 교배 특이성 유전자의 전사에 있어서 결함을 나타내는 지를 조사하였다. 먼저, 할로 (성장저해) 분석을 이용하여 야생형과 med6 돌연변이 균주에 의해 만들어지는 α-인자의 양을 조사하였다. α-인자의 생산은 시험 균주 (MATa, sst1: 교배형 인자 α에 대해 초감수성을 나타내는 균주)의 성장저해영역의 크기를 통해 알 수 있다.
교배형 인자 분석실험의 결과를 나타내는 도 3a을 참조하면, 야생형 균주(YCL4) 주위의 할로의 크기는 med6 ts 균주 (YCL8)의 경우에 비해 약 3배 크다. 이는 허용온도에서 조차도 med6 ts 돌연변이에 의한 α-인자의 생산이 감소되었다는 것을 의미하는 것이다.
또한, 손상된 α-인자의 생산이 적어도 부분적으로는 MFα1 (세포에서 대부분의 α-인자를 코딩함)의 전사활성화 결함에 의한 것인지를 알아 보기 위하여 MFα1 전사체의 수준을 측정하였다. 아울러, MFα1 전사에 대한 직접적인 영향과 간접적인 영향을 구별하기 위하여, MFα1의 전사 활성화제 (Matα1p)와 보조활성화제(Mcm1p)의 발현에 대해서도 조사하였다.
노던 블롯 분석 결과, MFα1의 전사는 제한 온도에서 성장된 med6 돌연변이 균주에서 실질적으로 감소된 반면, MATα1과 MCM1 전사체의 수준에는 영향이 없는 것으로 나타났다 (도 3b 참조). 그러므로, Med6p는 MFα1의 전사 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
교배형 특이성 유전자의 조절은 전사 활성화 뿐만아니라 전사 억제수준에서도 이루어진다. α-세포에서, BAR1과 같은 α-특이성 유전자의 전사는 억제제 복합체인 Matα2p-Mcm1p에 의해 저해된다. med6 돌연변이가 GAL1과 SUC2 전사의 억제에는 영향을 주지 않는다고 하더라도, 세 개의 전사조절 매개체 성분인 Gal11p, Rgr1p 및 Sin4p가 전사의 양성 및 음성 조절제로서 작용을 하는 것으로 밝혀졌기 때문에 BAR1의 전사 억제시 Med6p의 역할에 대해 조사하였다. 도 3b에 도시되어 있는 바와 같이, BAR1 전사체의 억제 정도가 높아지지 않고 비허용 온도에서 med6 돌연변이에 의해 오히려 약간 감소하였다. 이러한 결과는, med6 ts 유전자가 a-특이적 유전자인 BAR1의 전사억제에 영향을 주지 않는 것을 의미하는 것이다.
< 실시예 5 >
본 실시예는 med6 ts 돌연변이가 핵 추출물을 이용한 전사에 미치는 효과를 알아봄으로써 전사 활성화과 관련된 그 기능을 알아보기 위한 것이다.
전술한 생체내시험에서는, Med6p가 RNA 폴리머라제II에 의해 전사되는 몇몇 종류의 유전자에 대해 전사를 활성화시키는 작용을 하는 것으로 나타났다. 시험관내 시험에 있어서, 전사 활성화에 미치는 med6 ts 돌연변이의 효과를 조사하기 위해서 야생형과 med6 돌연변이 세포로부터 제조한 핵 추출물의 전사 활성을 조사하였다.
도 4a에 도시되어 있는 바와 같이, 야생형과 돌연변이 핵 추출물은 모두 25℃ (레인 1,2,6 및 7)에서 실험하는 경우에는 활성화된 전사 및 기본적 전사에 있어 비슷한 활성을 나타내었다. 25℃에서 전사반응을 개시하기에 앞서서 30-34℃에서 핵 추출물을 10분간 처리한 경우에는, 각각의 효소의 활성은 변화되지 않으면서 기본적인 전사와 활성화된 전사가 모두 점진적으로 감소되는 것으로 나타났다 (활성화 배수 (포스포이미저를 이용한 정량분석을 기준으로 함) 측정법에 따르면 14-16배). 그러나, 37℃에서 돌연변이 추출물을 전처리한 경우에는 기본적인 전사보다는 활성화된 전사가 크게 감소되었는데 (레인 10), 동일한 조건하에서 야생형 핵 추출물 (레인 5)에 의해서는 16배 활성화되는데 비해 단지 6배만 활성화되었다.
이러한 전사 결함이 med6 돌연변이에 의한 것인가를 확인하기 위해 재조합 Med6p (r-Med6p)가 med6 돌연변이 핵 추출물의 전사 결함을 구제할 수 있는 지를 조사하였다 (도 4b 참조). 야생형 핵 추출물에 r-Med6p를 첨가하는 경우, 핵 추출물이 37℃에서 예비배양이 되든 (레인 3, 4: 12배 활성화) 또는 되지 않든 (레인 1,2: 11배 활성화) 기본적 및 활성화된 전사에는 별다른 영향이 없었다. 그러나, 돌연변이를 r-Med6p와 예비배양하는 경우에는, 전사 활성화에 있어서의 온도 의존성 결함 (레인 4: 12배 활성화, 레인 8: 10배 활성화)과 기본적인 전사에 있어서의 온도 비의존성 결함이 야생형 추출물에서 얻은 결과 수준으로 구제되었다 (돌연변이의 홀로-폴리머라제가 허용 조건하에서도 야생형 효소에 비해 약간 낮은 전사 활성을 가지고 있었다) (도 7a 참조, 상세한 설명은 후술함). 이러한 상보적인 활성은 Med6p에 특이적인 것이다: 재조합 Srb5 단백질 (r-Srb5p)은, 동일한 분석방법으로 시험된 경우, 전사에 영향을 주지 않았다 (레인 7, 9: 5배 활성화). 그러므로, 핵 추출물을 이용하여 얻은 시험관내 실험 데이터는 Med6p의 온도 감수성 기능이 기본적인 전사보다는 전사 활성화에 필요하다는 생체내 실험결과를 강하게 지지하는 것이었다.
med6p가 전사에 어떤식으로 영향을 미치는 지를 알아보기 위하여, 복수본 플라스미드상에 존재하는 med6p를 med6p 돌연변이 세포에서 과잉발현시켰다. 그러나, med6 ts 유전자의 수가 증가되어도 돌연변이 세포에서 med6p의 수준은 증가되지 않았다. 그러므로, 돌연변이 세포의 ts 치사성은 억제되지 않았다. 이러한 결과는, med6p의 ts 돌연변이로 인해 홀로-폴리머라제와의 결합이 느슨하게 된다는 것을 시사하는 것인데, 결합이 느슨해지면 발현 수준에 관계 없이 돌연변이 med6p의 급속한 열화가 일어나게 된다.
< 실시예 6 >
본 실시예는 야생형과 med6 ts 돌연변이로부터 추출된 전사조절 매개체-RNA 폴리머라제II의 폴리펩티드 조성을 알아보기 위한 것이다.
먼저, med6 돌연변이만이 전사 활성화 결함과 관계가 있는 것인지를 알아내기 위하여, med6 돌연변이 균주로부터 전사조절 매개체-RNA 폴리머라제II 복합체(홀로-폴리머라제)를 분리하여 그것의 써브 유니트 조성을 분석하였다. 야생형과 돌연변이 균주로부터 이스트의 전체 세포 추출물을 Bio-Rex70, DEAE-세파로오스, 하이드록시아파타이트 및 MonoQ 칼럼을 이용한 크로마토그라피방법으로 분리하였다. 야생형과 돌연변이 홀로-폴리머라제는 칼럼 크로마토그라피 과정동안 비슷한 생화학적 특성을 가지고 있는 것으로 나타났다.
웨스턴 블롯 실험 결과, Med6p는 정제과정 동안 계속하여 다른 전사조절 매개체 성분들과 함께 이동하였다 (도 5a 참조). 마찬가지로, 돌연변이 Med6 단백질(med6p)도 또한 정제과정동안 다른 전사조절 매개체 써브유니트와 함께 분리되었다(도 5b 참조).
도 6a는 홀로-폴리머라제에 대한 면역블롯팅 분석결과를 나타내는 도면인데, 이를 위해 다음과 같은 방법으로 실험하였다. 친화성을 이용하여 분리 정제된 안티-Srb5 항체 (100㎍)를 단백질 A-아가로즈 (Sigma) 비드 (100㎕)와 접합시켰다. Srb5 항체 비드 (30㎕)를 50㎕의 홀로-폴리머라제 분획 (MonoQ 칼럼)과 함께 4℃에서 12시간 동안 배양한 다음 0.8M 아세트산칼륨을 포함하는 1ml의 완충용액 (IP [20mM Tris-Hcl (pH8.0), 0.1mM EDTA, 0.2% Nonidet P-40, 10% (v/v) 글리세롤])로 3회 세척하였다. 결합된 단백질을 5M 요소를 포함하는 30㎕의 완충용액 (IP)으로 2회 용출시켰다. 용출된 단백질을 실버 염색방법으로 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 발색시켰다.
그 결과, 야생형 Med6p에 대한 항체를 이용하여 돌연변이 홀로-폴리머라제 분획에서 측정된 med6p의 양은 야생형 분획의 Med6p 양의 단지 약 10-15%에 불과하였다 (도 6a 참조). 항Med6p 항체는 야생형 단백질과 돌연변이 Med6 재조합 단백질 모두에 대해 동일한 정도로 양호하게 가교반응을 나타내는 것으로부터, 돌연변이 분획의 med6p는 다른 전사조절 매개체 성분에 대해 1:1 비율 이하로 존재하는 것을 알 수 있었다. 돌연변이 핵 추출물에 있는 med6p의 전체 양도 또한 야생형 핵 추출물의 경우에 비해 약10-15% 정도인데, 이로부터 돌연변이 홀로-폴리머라제에 med6p가 적게 포함되어 있는 것이 정제과정중에서 돌연변이 단백질이 분해되기 때문만은 아니라는 것을 알 수 있다. 또한, med6p의 분해된 형태는 전체 정제 과정을 통해 다른 분획에서는 검출되지 않았다. 그러므로, 모든 med6p는 생체내에서 매개복합체와 결합된 형태로 존재하는 것으로 보인다.
돌연변이 med6p의 양이 감소되는 경우, 돌연변이 홀로-폴리머라제에 대한 다른 전사조절 매개체 성분들의 결합이 저해되는 지를 알아보기 위해 Srb5p에 대한 항체를 이용하여 야생형과 돌연변이 홀로-폴리머라제를 면역침전반응시키고, 그 반응에서 형성된 면역 복합체를 실버 염색법으로 분석하였다.
두 개의 홀로-폴리머라제의 폴리펩티드 조성은, 돌연변이 홀로-폴리머라제의 경우에 38kDa 폴리펩티드 양이 크게 감소된 것을 제외하고는 구별이 불가능하였다(도 6b 참조). 상기 38kDa 폴리펩티드는 Med6p에 대한 항체와 가교반응하였다. 홀로-폴리머라제의 면역침전실험 결과는, Med6p가 홀로-폴리머라제의 한 성분이며, 홀로-폴리머라제의 그 외의 성분은 돌연변이 홀로-폴리머라제에 결여되어 있지 않다는 것을 의미한다.
< 실시예 7 >
이전의 연구에 의하면, 전사조절 매개체-RNA 폴리머라제II 복합체 (홀로-폴리머라제)가 코어-RNA 폴리머라제II와는 구별되는, 기능상의 특징을 세가지 가지고 있다: (1)기본적인 전사의 자극 (5배 내지 10배), (2) 활성화 단백질에 대한 반응성 및 (3) TFIIH에 의한 Rpb1 CTD의 인산화율의 실질적인 증가 (10 내지 40배). 그러므로, 본 실시예는 시험관내에서의 전사 (즉, 시험관내에서 재조합된 시스템을 이용한 전사) 여부 및 CTD 인산화율을 알아보기 위한 것이다.
1. 재조합된 시험관내에서의 전사 실험
이스트 균주 YCL8과 YCL10으로부터 핵을 추출하였다 (Lue, N.F., and R.D. Kornberg, (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8839-8843 참조). 이 핵 추출물을 이용하여 시험관내 전사를 실시하였다 (Wang, Z., S. Buratowski, J.Q. Svejstrup, W.J. Feaver, X. Wu, R.D. Kornberg, T.F. Donahue, and E.C. Friedberg, (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 2288-2293 참조).
특이적인 전사 분석을 통해, med6p의 ts 활성을 알아보기 위하여 CTP와 UTP를 제외한 전사 반응의 모든 성분을 25℃ 또는 37℃에서 10분 동안 예비배양한 다음, 뉴클레오티드를 첨가하여 25℃에서 전사체를 연장시키는 반응을 실시하였다(도 7a 참조). 이 과정을 보다 상세히 설명하면, 먼저 야생형과 med6 ts 돌연변이 홀로-폴리머라제 (각각 700ng, MonoQ 분획)를 25℃ 또는 37℃에서 10분 동안 다른 보충물 (2개의 주형 (150ng씩의 pJJ470 및 pS(GCN4)2CG), 일반적인 전사인자들, 0.5mM ATP를 포함하며, Gal4VP16 활성화제는 포함 (30ng)하거나 또는 포함하지 않음)과 함께 예비배양하여 개시 복합체를 형성하였다. [α-32P]UTP (10μCi) 및 CTP를 첨가하고 25℃에서 30분 동안 계속 배양하였다. 개시 복합체 형성 후 결함을 조사하기 위하여, 개시기 (10분, 25℃) 후 열처리 (10분, 37℃)를 실시하고 남아 있는 뉴클레오티드를 첨가함으로써 전사반응 (30분, 25℃)을 개시하였다. 모든 전사 반응시 180mM 아세트산칼륨을 이용하였다. 반응을 50분 동안 계속시켰다. 반응 생성물을 정제하여 7% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하고 전술한 바와 같은 정량장치를 이용하여 정량하였다 (도 7a 참조).
그 결과, 기본적인 전사에 미치는 med6 ts 돌연변이의 효과에 있어서는, med6 돌연변이 홀로-폴리머라제의 활성이 야생형 홀로-폴리머라제 활성의 70% 인 것으로 나타났다 (도 7a, 레인 1, 6). 37℃에서 예비배양하는 경우에는 돌연변이 홀로-폴리머라제의 기본적인 전사 활성이 약간 감소되었다 (도 7a, 레인 3, 8: 2배 미만의 감소가 일정하게 관찰되었다).
한편, 전사 활성화시 명백한 온도-의존성 결함이 med6 돌연변이 홀로-폴리머라제로부터 관찰되었다. Gal4VP16의 존재하에 25℃에서 전사 반응물을 예비배양하는 경우에는 (도 7a, No) 돌연변이와 야생형 홀로-폴리머라아제 모두 GAL4 인핸서를 함유하는 주형으로부터의 전사를 40배 이상의 수준으로 특이적으로 활성화시켰다 (각각 43배 및 40배, 도 7a, 레인 2, 7). 그러나, 개시 복합체 형성과정에서 열처리 (10분, 37℃)를 실시하고 이어서 25℃에서 연장반응을 실시하는 경우에는 (도 7a, DI), med6 돌연변이 홀로-폴리머라제에 의한 전사 활성화가 감소되었다 (6배, 도7a, 레인 9). 동일한 조건하에서, 야생형 홀로-폴리머라제에 의한 전사 활성화는 단지 약간만 감소되었는데, 이는 아마도 열에 의한 효소들의 비특이적인 불활성화로 인한 것으로 보인다 (28배, 도 7a, 레인 4). 또한, 돌연변이 홀로-폴리머라제에 의한 잘못된 전사 활성화는, 그 결함이 r-Med6p에 의해 구제된다는 사실로부터, 돌연변이 med6p로부터 특이적으로 초래된 것임을 확인하였다. 열처리 과정 중 돌연변이 홀로-폴리머라제에 r-Med6p를 첨가한 경우에는, 그 활성이 야생형 홀로-폴리머라제 수준으로 회복되었다 (24배, 도 7a, 레인 10). 이러한 구제 활성은 Med6p 기능에 특이적인 것이다: r-Srb5p가 돌연변이 홀로-폴리머라제에 첨가된 경우에는 비슷한 효과가 나타나지 않았으며, r-Med6p가 야생형 홀로-폴리머라제에 첨가된 경우에는 전사가 아무런 영향을 받지 않았다.
개시 복합체의 형성되는 기간동안 돌연변이 홀로-폴리머라제를 열처리하는 경우에는 돌이킬 수 없는 결함이 야기된다고 하더라도, 개시 복합체 형성 후의 열처리는 돌연변이 특이적인 결함을 일으키지 않았다 (도 7a, AI); 돌연변이 홀로-폴리머라제는 전사를 활성화시키는데 있어서 야생형만큼 강력한 것으로 나타났다 (야생형:21배, 돌연변이 15배, 도 7a, 레인 5, 11). 그러므로, Med6p 활성은 초기의 전사 활성화에 필요하며, 일단 개시 복합체가 형성되면 온도-감수성 Med6p 기능이 없어도 된다고 할 수 있다.
2. med6 돌연변이가 홀로-폴리머라제의 CTD 인산화에 미치는 영향
CTD 인산화는 초기단계에서 연장단계 (elongation step)로 옮겨갈 때 중요한 단계이며, CTD 인산화율이 높을수록 전사 활성이 높다는 것을 의미한다.
CTD 인산화 분석을 위해, TFIIH (40ng), 0.3μCi[r-32P]ATP를 포함하는 반응 혼합물과 다른 보충물을 코어- (100ng) 또는 홀로-폴리머라제 (300ng)에 첨가하여 열처리를 하거나 또는 하지 않은 채 반응 용적을 15㎕로 하여 25℃에서 30분 동안 배양하였다. 5㎕의 4×SDS-겔 로딩 완충용액을 첨가함으로써 반응을 중지시키고 7.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 분석하였다. 전사체와 32P-표지된 Rpb1을 전술한 정량장치를 이용하여 정량하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
먼저, 동일한 양의 폴리머라제 TFIIH에 의해 인산화되는 경우, 양쪽의 홀로-폴리머라제가 코어-폴리머라제에 비해 10배 이상 효율적으로 인산화되는데 (야생형 13배, 돌연변이 10배, 도 7b, 레인 2, 3), 이는 25℃에서의 인산화에 앞서 37℃에서 배양되는 지의 여부에 관계가 없이 나타났다 (야생형 22배, 돌연변이 14배, 도 7b, 레인 5, 7). 한편, 돌연변이 홀로-폴리머라제의 CTD 인산화율이 Med6p의 온도 감수성 활성과 무관하다고 하더라도, 동일한 조건하에서 야생형 홀로-폴리머라제의 경우에 비해 30% 정도 낮은 것으로 나타났는데, 이러한 결함은 r-Med6p를 첨가해도 구제되지 않는 것으로 보아 med6 돌연변이의 간접적인 효과때문인 것으로 보인다 (15배, 도 7b, 레인 8).
도 7c는 상기 전사 및 CTD 인산화율에 대한 실험결과를 그래프로서 나타낸 것이다. 즉, 야생형과 온도 감수성 돌연변이 각각에 있어서, 열처리여부와 열처리 시점이 전사와 CTD 인산화율에 미치는 영향에 대한 도 7b의 결과를 그래프로서 도식적으로 나타낸 것이다.
본 실시예를 통해 알 수 있는 것은, 매개복합체는 전사를 활성화시킬 뿐만아니라 기본적인 전사 및 RNA 폴리머라제II의 최대 써브유니트 (Rpb1에 의해 코딩됨)의 카르복시 말단 영역 (CTD)의 인산화를 촉진할 수 있다는 것이다. 전사조절 매개체, TFIIF와 코어-RNA 폴리머라제가 결합하면 RNA 폴리머라제II 홀로엔자임 (홀로-폴리머라제)을 형성하게 되는데, 이것은 RNA 폴리머라제II에 의한 시험관내의 전사 활성화시 충분하고도 필요한 조건으로 작용한다.
상기 실시예들을 통해 알 수 있는 바와 같이, 유전학적 관점에서 Med6p는 새로운 부류의 이스트 단백질인데, 활성화제-인핸서 어셈블리의 성분을 구성하는 것도 아니며, 기본적인 전사기구의 성분을 구성하는 것도 아니지만, 전사 활성화에 절대적으로 필요한 것이다. Med6p가 여러 가지 다양한 이스트 프로모터의 전사 활성화에 절대적으로 필요하다는 사실은, 생체내에서의 전사 활성화에 있어서 매개복합체가 매우 중요하며 특수한 작용을 한다는 것을 의미한다. 즉, 전사 활성화에 있어서 Med6p는 TAFII와 USA와 같은 다른 전사 보조인자와는 다른 의미를 갖는다. 즉, TAFII는 일반적인 전사 인자인 TBP와 결합하며, 광범위한 생화학적 연구 결과 전사 활성화와 프로모터 선택에 있어서의 그들의 필수적인 역할이 밝혀지기는 했지만, 최근 이스트를 이용하여 TAFII를 생체내 분석한 결과, TAFII가 세포의 생존에는 필요하지만 TAFII가 부족해도 대부분의 테스트된 프로모터의 전사에는 영향이 없는 것으로 나타났다. 그러므로, TAFII는 세포 사이클 조절 또는 세포 분화에 관련된 필수적인 유전자 써브셋의 전사에는 필요하지만 일반적인 전사 활성화에는 없어도 무방하다. USA라고 불리우는 또 다른 전사 보조인자는 PC4를 포함하여 여러 가지 독립적인 보조인자를 포함하고 있다. PC4는 기본 인자-활성화제 상호작용을 용이하게 해줌으로써 전사를 활성화시키는 것으로 보인다. 포유동물의 PC4의 이스트 호모로그(Tsp1p/Sub1p)의 기능을 분석한 결과, 이 단백질은 TFIIB와 상호작용하며, 전사 활성화를 촉진하지만 Med6p와는 다르며, 세포의 생존에도 필요하지 않은 것으로 나타났다.
TAFII와 Tsp1p/Sub1p에 반해, Med6p는 이스트에서 시험된 대부분의 프로모터의 전사 활성화에 필수적이다. 시험된 유전자 (GAL1, SUS2, PYK1, MFα1 및 HIS3)중에서 단지 HIS3 유전자의 전사 활성화만이 med6 유전자에 의해 영향을 받지 않았으며, 다른 유전자들의 전사 활성화는 유도되지 않은 수준으로 감소되었다.
MED6가 본 발명자들이 테스트한 대부분의 프로모터의 전사 활성화에 필요한 것으로 나타났으나, med6 ts 돌연변이는 모든 세포성 프로모터로부터의 전사 활성화에 영향을 주지는 않았다. med6 유전자에 의한 영향은 GAL4 및 MATα1에 의해 조절되는 유전자에 대해서는 확인이 되었으나, GCN4에 의해 조절되는 유전자에 대해서는 확인되지 않았다. 이러한 차이는 돌연변이의 유전자 특이성에 기인하는 것으로 밝혀졌다.
med6 유전자의 또 다른 놀랄만한 점은 유도되지 않았거나 억제된 전사가 아닌 활성화된 전사에만 영향을 준다는 것이다. 또한, 항상 구성적으로 발현되는 유전자의 전사나 높은 CTD-인산화율은 모두 홀로-폴리머라제의 기본적인 전사활성과 비례적인 관계가 있는데, med6 돌연변이에 의해서는 영향을 받지 않는다. 그러므로, RNA 폴리머라제II에 의한 일반적인 전사에 필요한 Srb 단백질과는 달리, Med6p는 활성화된 전사에만 필요하다는 점에서 독특하다. 한편, Rgr1p, Sin4p 및 Gal11P를 포함하여 또 다른 군의 전사조절 매개체는 전사 활성화 뿐만아니라 억제에도 관여한다. 전사조절 매개체의 여러 가지 기능 (기본적인 전사의 활성화, 억제 및 촉진)이 이루어지려면, 다른 종류의 전사조절 매개체 단백질이 필요한 것으로 보이는데, 이와 같은 사실은 매개복합체가 여러 가지 기능영역으로 구성되어 있다는 것을 의미하는 것이다.
< 실시예 8 >
본 실시예는 효모의 전사조절 매개체 유전자 (MED6)와 상동성을 나타내는 사람의 유전자를 찾아내기 위해 이루어졌다.
1. 사람의 전자조절 매개체 유전자 (hMED6)의 동정
효모의 전사조절 매개체 단백질 (Med6p)의 아미노산 서열과 컴퓨터 프로그램(BLAST)을 이용하여 이 단백질과 유사한 단백질이 사람의 EST-데이터 베이스에 존재하고 있는 지를 조사하였다. 그 결과 EST 클론번호 231995가 효모의 전사조절 매개체 단백질 (Med6p)와 유사한 부분을 가지고 있다는 것을 확인하고, 이 클론을 구입 (Research Genetics사)하여 그 염기 서열을 결정하고, 이 DNA에 의해 만들어지는 단백질의 아미노산 서열을 결정하였다. 이 아미노산 서열을 컴퓨터 프로그램(C1austalW)을 이용하여 효모의 전사조절 매개체 단백질 (Med6p)의 아미노산 서열과 비교한 결과, 양자간에 상당한 유사성이 있으며, 그 유사도가 30%를 상회한다는 것을 확인하였다 (도 8 참조).
이와 같은 결과는 전사조절의 기능이 효모에서 사람에 이르기까지 보존되어 있으며 효모의 MED6 기능 분석을 통하여 밝혀낸 전사조절기작이 사람에서도 비슷하게 응용될 수 있다는 것을 의미하는 것이다. 따라서, 앞서 설명한 바와 같은, 효모의 Med6p를 이용한 실험 결과에 비추어 볼때, 상기 사람의 전사조절 매개체 단백질(hMed6p)은 전사조절과 관련하여 특히 기본전사기구의 활성화시 RNA 폴리머라제와 상호작용하여 전사의 초기 활성화단계를 조절하는 작용을 할 것으로 기대된다.
2. hMED6 유전자에 의한 형질전환균주 (KCTC 0347BP)의 제조방법
효모의 전사조절 매개체 유전자 MED6와 상동 유전자인 hMED6의 EST 클론인 플라스미드 p231995를 구입하고 (Research Genetics사), 그 염기 서열을 결정하여 이 클론이 hMED6 전체 유전자를 포함하고 있다는 것을 확인하였다. 이 플라스미드를 이용하여, 플라스미드 pT3T7D를 가지고 있는 에스케리치아 콜라이 DH10B를 형질 전환시켜 재조합균주인 에스케리치아 콜라이 ECL1을 제조하였다. 즉, 에스케리치아 콜라이 ECL1은, 사람의 전사조절 유전자 hMED6가 플라스미드 pT3T7D의 제한효소 자리 EcoRI과 NotI 사이에 삽입된 상태로 존재하는 것으로서, 1997년 7월 11일자로 대전광역시 소재의 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0347BP로 기탁되어 있다.
종래에는, 전사활성화의 조절이 전사 활성화제나 폴리머라제의 기능을 조절하므로써 이루어지는 것으로 알려져 있었으나, 실제 활성화제가 어떠한 방법으로 전사를 조절하는 지에 대해서는 밝혀진 바가 없었다. 또한, 활성화제나 일반 전사 인자에 속하지 않으면서, 전사활성화를 조절하는 것으로 알려진 단백질은 보고된 바가 없었다. 본 발명에서는, 효모로부터 MED6라는 유전자를 분리하고, 이 유전자가 전사활성화 매개체의 구성요소로서 일군의 특정한 유전자의 전사를 활성화시키는데 필수적이라는 사실로부터 전사조절에 관여하는 새로운 종류의 단백질을 제공할 수 있게 되었으며, 이와 유사한 사람의 전사조절 매개체 단백질 및 그 유전자도 제공할 수 있게 되었다. 또한, 사람의 경우에도 효모의 전사조절 매개체 유전자가 상당한 정도로 보존되고 있는 사실로부터, 효모의 전사조절 매개체 유전자가 가지고 있는 기능이 사람에게서도 비숫한 양상으로 발현되리라는 사실을 추측할 수 있게 되었다. 따라서, 즉, 사람의 경우에도 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)가 특정한 유전자들의 전사활성화에 절대적으로 필요하지만 모든 유전자의 전사활성화를 조절하는 것은 아닐 것이므로, 이들 특정 유전자들만 한정적으로 전사조절할 수 있는 방법의 개발이 가능하게 되었다. 따라서, 세포증식과 분화를 조절하는 유전자들을 찾아 기능을 분석함으로써 암의 발생기작을 밝히고 그 치료법을 개발하는데 이용될 수 있으며, 특정한 조직에만 한정적으로 유전자를 발현하게 하는 벡터의 개발로 유전자 치료의 특이성을 높이는 데도 이용될 수 있다. 또한, 전사조절 매개체의 조절기작을 밝힘으로써 인위적인 전사조절방법을 개발할 수 있으며, 유전병, 암, 면역이상 등의 질병치료 뿐만아니라 농축산물의 개량이나 병충해 방지, 발효에 관련된 유전자 조절을 통해 식품 및 의약품 등의 생산성 증가 등 그 응용분야가 매우 광범위하다.
도 1a 및 1b는 온도-감수성 치사성을 부여하는 med6 ts 유전자의 분리에 관한 실험 결과를 나타낸다. 도 1a는 비허용온도에서 med6 ts 돌연변이 균주의 성장 결함을 나타내는 도면으로서, MED6 야생형 (YCL10)과 온도-감수성 균주 (YCL8)를 합성 포도당 배지에 도말하여 허용온도 (30℃) 또는 비허용온도 (37℃)에서 2-3일간 배양한 결과를 나타내는 사진이고, 도 1b는 med6 ts 유전자가 오픈 리딩 프레임에 6개의 미스센스(missense) 돌연변이를 포함하고 있는 것을 나타내는 도면으로서, 영역 교환 실험에 이용된 BamHI 부위와 함께 돌연변이된 아미노산들과 그들의 위치를 나타내고 있다.
도 2a 및 2b는 med6 ts 돌연변이의 전사 결함을 생체내 실험으로 분석한 결과를 나타내는 도면으로서, 도 2a는 med6 ts 유전자가 전사에 미치는 영향을 다양한 유전자를 조사함으로써 알아 본 시험의 결과를 나타내는 사진이고, 도 2b는 GAL1과 SUC2 유전자의 전사에 미치는 med6 ts 돌연변이의 영향을 알아본 시험 결과를 나타내는 사진이다.
도 3a는 교배형 알파인자 생성량 정도를 비교 실험한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3b는 med6 ts 돌연변이가 알파인자 생산에 관여하는 유전자의 전사에 미치는 영향을 나타내는 겔 사진이다.
도 4a 및 4b는 야생형과 med6 ts 돌연변이주의 핵 추출물을 이용한 시험관내 전사실험의 결과를 나타내는 도면으로서, 도 4a는 med6 ts 돌연변이가 전사 활성화에 미치는 영향을 나타내는 도면이고, 도 4b는 재조합 Med6 단백질 (r-Med6p)을 첨가함으로써 돌연변이 핵 추출물에서의 전사 결함이 회복되는 것을 보여주는 도면이다.
도 5는 야생형과 돌연변이 Med6p가 정제과정 중 항상 다른 매개체 성분들과 함께 정제되는 결과를 나타내는 도면이다.
도 6a 및 6b는 야생형과 med6 ts 돌연변이 균주로부터 추출한 매개체-RNA 폴리머라제II 복합체의 폴리펩티드 조성을 나타내는 도면으로서, 도 6a는 홀로-폴리머라제에 대한 면역블롯팅 분석결과를 나타내는 도면이며, 도 6b는 홀로-폴리머라제의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 도면이다.
도 7a, 7b 및 7c는 재구성된 전사 시스템에서 야생형과 med6 ts 돌연변이 홀로-폴리머라제 활성을 비교해 놓은 도면과 CTD 인산화 반응 결과를 보여주는 도면으로서, 도 7a는 순수한 전사단백질들로만 재구성된 시험관내 전사에 미치는 med6 ts 돌연변이의 영향을 보여주는 도면이고, 도 7b는 med6 ts 돌연변이가 TFIIH에 의한 폴리머라제의 CTD 인산화에 미치는 영향을 나타내는 도면이며, 도 7c는 홀로-폴리머라제의 전사와 CTD 인산화의 실험결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 효모의 전사조절 매개체 유전자 (MED6)와 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)를 비교하기 위한 도면으로서, 블랙박스부분은 동일한 부분을 나타내고, 그레이박스부분은 유사한 아미노산 부분을 나타내며, 점선 부분은 "갭"을 나타낸다.

Claims (4)

  1. 염기 서열이 하기 서열 1로 되어 있는, 사람의 전사조절 매개체 유전자(hMED6).
    [서열 1]
  2. 제 1항 기재의 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)의 생성물인 사람의 전사조절 매개체 단백질로서, 그 아미노산 서열이 하기 서열 2로 되어 있는 사람의 전사조절 매개체 단백질 (hMed6p).
    [서열 2]
  3. 제 1항 기재의 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)에 의해 형질전환된 균주인 에스케리치아 콜라이 ECL1 (KCTC 0347BP).
  4. 제 3항에 있어서, 상기 사람의 전사조절 매개체 유전자 (hMED6)가 플라스미드 pT3T7D의 제한효소 자리 EcoRI과 NotI 사이에 삽입된 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 에스케리치아 콜라이 ECL1 (KCTC 0347BP).
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