CN115960960A - 一种双启动子真核表达报告质粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双启动子真核表达报告质粒及其应用，属于细胞生物学技术领域。本发明构建了一种双启动子真核表达报告质粒，它是在双启动子真核表达载体pBudCE4.1的基础上插入hGLucN‑hGSDME融合蛋白的编码序列和hGLucC‑hGSDME融合蛋白的编码序列，能同时表达两种目标融合蛋白以用于检测细胞焦亡活性。本发明将该双启动子真核表达报告质粒成功应用到基于细胞焦亡诱导机制发挥抗肿瘤作用的药物的筛选中，通过对活性片段N‑GSDME寡聚的检测，评价药物的细胞焦亡诱导活性，建立了一种基于细胞焦亡机制的抗肿瘤活性成分筛选方法，为抗肿瘤药物的发现提供了新的技术方法。

Description

一种双启动子真核表达报告质粒及其应用

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种双启动子真核表达报告质粒，及其在细胞焦亡活性检测中的应用，特别是在基于GSDME依赖型焦亡诱导机制的抗肿瘤活性药物筛选中的应用。

背景技术

肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，我国恶性肿瘤的发生率及死亡率均较高。传统的化学药物治疗与手术、放疗等结合是治疗肿瘤的主要手段，虽然在一定程度上提高了多种恶性肿瘤的生存率，但依然存在副作用和耐药性等两方面的限制。因此，寻找新型、高效低毒的抗肿瘤药物仍面临巨大挑战。

细胞死亡是生命活动的重要过程，对维持机体内环境稳定至关重要。目前已知的细胞死亡方式有细胞坏死、细胞凋亡、细胞自噬、坏死性凋亡和细胞焦亡等。细胞焦亡(Pyroptosis)，又称细胞炎性坏死，是近些年新发现的一种程序性细胞死亡方式，其表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞发生焦亡时，质膜会出现破裂形成直径1～2nm的小孔，细胞渗透性肿胀，形成特征性囊泡，胞内物质如炎性因子、乳酸脱氢酶释放，进而激活机体的免疫反应。

细胞焦亡的发生依赖于半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)家族成员caspase-1/4/5/11的激活。caspase-1/4/5/11是一类促炎性半胱氨酸蛋白酶，是机体产生炎症反应和先天免疫反应的关键。GSDMD是Gasdermin家族的成员，在哺乳动物中高度保守，可分为两个结构域—C-末端结构域(C-GSDMD)和N-末端结构域(N-GSDMD)。静息条件下，C端可通过与N端结合而抑制其聚集。在促炎因素诱导焦亡发生的条件下，Pro-caspase-1/4/5/11被激活形成cleaved-caspase-1/4/5/11，它们可直接水解GSDMD形成C-GSDMD和N-GSDMD片段，而N-GSDMD作为活性片段可进一步自发发生聚合，进而导致焦亡反应的发生。近期研究报道表明，GSDME作为Gasdermin家族的一员，其所诱发的焦亡与化疗药发挥抗肿瘤活性有密切的关系。使用化疗药对一些表达GSDME的肿瘤细胞进行处理，细胞内的Pro-caspase-3被激活，产生的Cleaved-caspase-3可特异性切割GSDME形成N-GSDME端和C-GSDME端两部分，N-GSDME片段进一步结合形成寡聚体，识别并结合细胞膜上的磷脂类分子，在细胞膜上形成膜孔，导致细胞膜胀破并促进乳酸脱氢酶等内容物释放，导致肿瘤细胞发生焦亡。

蛋白片段互补分析(protein fragment complementation assay,PCA)技术因具有灵敏度高、可定量和高通量化的特点，成为研究体内蛋白质相互作用的重要方法。与其它研究方法相比，主要用于相互作用的蛋白质文库的构建、cDNA文库的构建、生物信号通路图的绘制、配体-受体相互作用研究以及药物高通量筛选等。其原理如下：

将某些蛋白质分割成两个片段(如N端和C端)后，这两个片段各自都有活性，失去蛋白质原有的功能。但当它们足够靠近时，会发生特异性的非共价互补并重新组装成完整蛋白质，进而恢复蛋白质的活性。基于此，PCA技术选用特定的报告蛋白(reporterprotein)，将其合理地切割成两个片段(如N端和C端)，分别与另外两种目标蛋白质X和Y相连形成两个融合蛋白；目标蛋白X和Y发生相互作用，使得两个报告蛋白片段在目的蛋白的带动下相互靠近，互补并恢复报告蛋白的原有结构和活性，通过检测报告蛋白的活性即可判断目标蛋白间的相互作用情况。根据报告蛋白的种类，目前常用的PCA体系可以分为基于二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)的PCA、基于β-内酰胺酸(β-lactamase)的PCA、基于荧光蛋白的PCA又称为双分子荧光互补技术(Bi-molecular fluorescencecomplementation,BiFC)和基于荧光素酶的PCA。其中基于荧光素酶的PCA相比其它PCA技术具有高信噪比、可逆性和接近实时性的优点。

目前，现有的抗肿瘤活性药物筛选方法存在检测繁琐、检测周期长等问题。因此，开发一种新的基于靶向细胞焦亡的抗肿瘤药物筛选方法具有重要意义，可为抗肿瘤药物的筛选提供可靠的检测手段。

发明内容

发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种双启动子真核表达报告质粒，和基于细胞焦亡机制的抗肿瘤活性成分筛选方法。本发明将荧光素酶片段互补分析技术与细胞焦亡的执行蛋白GSDME相结合，构建了一种双启动子真核表达报告质粒，将两种融合蛋白经一个真核表达载体在细胞中共同表达，通过相对荧光素酶活性的量化和可视化比较，快速、高效地进行焦亡诱导抗肿瘤活性成分的筛选，解决了Western Blot等传统方法仅能检测细胞GSDME和N-GSDME蛋白水平变化但无法监测N-GSDME寡聚化的弊端，解决了目前存在的筛选方法检测繁琐、检测周期长的问题，为抗肿瘤药物的筛选提供了可靠的检测手段，具有良好的应用前景。

技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明基于荧光素酶蛋白质片段互补技术构建所述双启动子真核表达报告质粒。本发明对双启动子真核表达载体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的真核表达载体即可。

本发明提供了一种双启动子真核表达报告质粒，包含hGLucN-hGSDME融合蛋白的编码序列和hGLucC-hGSDME融合蛋白的编码序列，它是在双启动子真核表达载体pBudCE4.1的基础上构建而成的。pBudCE4.1大小为4.6kb，包含人类巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子和人类延伸因子1α亚基(EF-1α)共两个启动子，设计用于在哺乳动物细胞系中同时表达来自单个质粒的两个基因。利用该载体，hGLucN-hGSDME和hGLucC-hGSDME两种目标融合蛋白可以被高水平、组成型、独立地表达。

本发明中，一种双启动子真核表达报告质粒的构建方法，优选包括采用常规分子生物学技术将两端带有酶切位点序列的hGLucC-hGSDME基因序列和hGLucN-hGSDME基因序列依次克隆入pBudCE4.1的CMV多克隆位点和EF-1α多克隆位点，获得一个能同时表达两种融合蛋白的双启动子真核表达报告质粒。

所述hGLucN-hGSDME融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述hGLucN-hGSDME融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述hGLucC-hGSDME融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述hGLucC-hGSDME融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明提供了上述双启动子真核表达报告质粒在细胞焦亡活性检测中的应用。

本发明将焦亡执行蛋白Gasdermin E(GSDME)的人源化形式分别与Gaussia荧光素酶N端(hGLucN)和C端(hGLucC)连接，形成融合蛋白hGLucN-hGSDME和hGLucC-hGSDME，并能通过一个真核表达载体在细胞中同时表达。当细胞发生焦亡时，全长形式的GSDME被cleaved-caspase-3切割形成激活形式的N-GSDME，hGLucN-(N-GSDME)和hGLucC-(N-GSDME)由于缺乏C-GSDME的抑制而自发聚集，通过检测hGLucN与hGLucC重新折叠、恢复活性后产生的化学发光值，计算相对荧光素酶活性，可判断细胞焦亡活性。

本发明首次通过荧光素酶片段互补分析技术构建了一种双启动子真核表达报告质粒，建立了GSDME分子介导焦亡活性的检测方法，成功将其应用于细胞焦亡活性检测中，通过检测荧光素酶活性，计算相对荧光素酶活性可判断GSDME的激活情况，相对荧光素酶活性显著性越高，则表明细胞焦亡活性越好，为细胞焦亡活性检测提供了快速高效的技术方法。

本发明提供了上述双启动子真核表达报告质粒在基于GSDME依赖型焦亡诱导机制的抗肿瘤活性药物筛选中的应用。

本发明还提供了一种基于GSDME依赖型焦亡诱导机制的抗肿瘤活性药物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)将构建的双启动子真核表达报告质粒转染到肿瘤细胞，两种融合蛋白经一个真核表达载体在细胞中顺利稳定表达；

(2)将待筛选药物与肿瘤细胞共同孵育后，弃去上清；

(3)加入裂解液充分裂解细胞，收集细胞裂解液的上清液，加入底物腔肠素，检测化学发光值，根据荧光素酶活性检测试剂盒测定Gaussia荧光素酶的活性，计算相对荧光素酶活性，比较处理组与未处理组细胞的相对荧光素酶活性，观察是否呈显著变化，判断药物的细胞焦亡诱导活性，筛选基于细胞焦亡机制发挥抗肿瘤效应的活性成分。

优选地，所述肿瘤细胞为胰腺癌细胞。

本发明步骤(1)中所述转染优选为转染试剂瞬时转染。本发明对所述肿瘤细胞的种类没有特殊限制，例如PANC-1细胞。

本发明中，所述荧光素酶活性优选以细胞中每μg蛋白质的相对发光强度(RLU/μg)表示，相对荧光素酶活性(Percent of control)优选以公式[(F_T-F_B)/(F_C-F_B)]*100％表示。相对荧光素酶活性显著性越高，表示药物的焦亡诱导活性越好。

本发明提供了上述双启动子真核表达报告质粒在制备蛋白激活剂中的应用。所述蛋白激活剂优选为GSDME或caspase蛋白激活剂。

所述双启动子真核表达报告质粒能够用于但不限于GSDME蛋白激活剂的筛选。根据相对荧光素酶活性可直接判断GSDME蛋白激活情况，相对荧光素酶活性显著性越高，则GSDME蛋白激活形式越多，根据细胞焦亡发生机制，caspase家族细胞焦亡相关蛋白同时被激活。

本发明提供了所述双启动子真核表达报告质粒在焦亡抑制剂筛选中的应用。与细胞焦亡诱导剂判断依据相反，将已知焦亡诱导剂和待筛选抑制剂共处理，当待筛选抑制剂浓度或处理时间增加，荧光素酶活性显著性低于对照组，或相对荧光素酶活性显著低于100％，则可判断药物具有细胞焦亡的抑制作用。

有益效果：

(1)本发明将蛋白质片段互补分析技术和荧光素酶报告基因技术相结合，构建了一种双启动子真核表达报告质粒，同时包括hGLucN-hGSDME和hGLucC-hGSDME两种融合蛋白，两种融合蛋白经一个真核表达载体在细胞中顺利表达，解决了两种融合蛋白因在两种质粒中表达不稳定带来的差异性。

(2)本发明中两种融合蛋白经一个真核表达载体在肿瘤细胞中顺利表达，通过对活性端N-GSDME的寡聚进行检测，以相对荧光素酶活性直观表现细胞焦亡活性，解决了传统筛选方法操作繁琐、检测效率低的弊端，能快速、高效的筛选具有焦亡诱导作用的抗肿瘤药物。在抗腺癌药物筛选实验中，经过对FDA批准的抗癌药物库的筛选，本发明在106个化合物中发现了20个化合物表现出500％以上的相对荧光素酶活性，实现了基于细胞焦亡机制的抗肿瘤活性成分的筛选。

附图说明

图1为融合蛋白hGLucC-hGSDME和融合蛋白hGLucN-hGSDME的氨基酸序列组成结构；氨基酸序列方向为从N端到C端；

图2为Western Blot检测融合蛋白hGLucN-hGSDME和融合蛋白hGLucC-hGSDME在293T细胞中的蛋白表达水平；

图3为不同浓度阳性化合物索拉非尼处理细胞后相对荧光素酶活性的变化；

图4为阳性化合物索拉非尼处理细胞不同时间后相对荧光素酶活性的变化；

图5为106个化合物细胞焦亡诱导抗肿瘤活性筛选的结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例中所用的材料、试剂，主要包括以下几种：索拉非尼(HY-10201)购买自MedChemExpress；定制的FDA批准的抗癌药物库购买自SelleckChem；

转染试剂(117-15)购买自Polyplus

Zeocin^TM选择性试剂(R25001)购买自Invitrogen；M-PER^TM哺乳动物蛋白提取试剂(78501)购买自Thermo Scientific；Renilla荧光素酶活性检测试剂盒(E2820)购买自Promega Corporation；BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009)购买自碧云天生物公司；KOD-Plus-201高保真性聚合酶购买自TOYOBO。

本发明实施例中，所述真核表达载体为pBudCE4.1，将hGLucN-hGSDME融合蛋白和hGLucC-hGSDME融合蛋白的编码序列共同插入pBudCE4.1中，获得pBudCE4.1-HA-hGLucC-hGSDME-Flag-hGLucN-hGSDME重组报告质粒(本发明中称为“双启动子真核表达报告质粒”)。

本发明采用人源化的Gaussia荧光素酶(humanized Gaussia Luciferase，hGLuc)作为报告基因，基于蛋白质片段互补技术将hGLuc分割成互补的两个片段hGLucN和hGLucC，将两片段分别与hGSDME连接，形成融合蛋白。将hGLucN-hGSDME融合蛋白和hGLucC-hGSDME融合蛋白的编码序列共同插入真核表达载体pBudCE4.1中，获得双启动子真核表达报告质粒。本发明提供的融合蛋白的报告基因包括但不限于hGLuc，也可以是其它荧光素酶报告基因，如萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,FLuc)、海肾荧光素酶(Renilla luciferase,RLuc)、高斯荧光素酶(Gaussia luciferase,GLuc)等。

在本发明中，所述hGLucN-GSDME融合蛋白为表位标签-柔性肽段-hGLucN-柔性肽段-hGSDME，hGLucN通过柔性肽段与GSDME的N端连接。hGLucN是包括荧光素酶hGLuc第18位至第110位的氨基酸序列；所述hGLucN-GSDME融合蛋白中表位标签为Flag，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示(DYKDDDDK)，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示(gattacaaggatgacgacgataag)。所述柔性肽段的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示(GGGGSGGGGS)，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示(ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcg)。

所述hGLucN-hGSDME融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示(MDYKDDDDKGGGGSGGGGSKPTENNEDFNIVAVASNFATTDLDADRGKLPGKKLPLEVLKEMEANARKAGCTRGCLICLSHIKCTPKMKKFIPGRCHTYEGDKESAQGGIGGGGGSGGGGSFAKATRNFLREVDADGDLIAVSNLNDSDKLQLLSLVTKKKRFWCWQRPKYQFLSLTLGDVLIEDQFPSPVVVESDFVKYEGKFANHVSGTLETALGKVKLNLGGSSRVESQSSFGTLRKQEVDLQQLIRDSAERTINLRNPVLQQVLEGRNEVLCVLTQKITTMQKCVISEHMQVEEKCGGIVGIQTKTVQVSATEDGNVTKDSNVVLEIPAATTIAYGVIELYVKLDGQFEFCLLRGKQGGFENKKRIDSVYLDPLVFREFAFIDMPDAAHGISSQDGPLSVLKQATLLLERNFHPFAELPEPQQTALSDIFQAVLFDDELLMVLEPVCDDLVSGLSPTVAVLGELKPRQQQDLVAFLQLVGCSLQGGCPGPEDAGSKQLFMTAYFLVSALAEMPDSAAALLGTCCKLQIIPTLCHLLRALSDDGVSDLEDPTLTPLKDTERFGIVQRLFASADISLERLKSSVKAVILKDSKVFPLLLCITLNGLCALGREHS*)。

所述hGLucN-hGSDME融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(atggattacaaggatgacgacgataagggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgaagcccaccgagaacaacgaagacttcaacatcgtggccgtggccagcaacttcgcgaccacggatctcgatgctgaccgcgggaagttgcccggcaagaagctgccgctggaggtgctcaaagagatggaagccaatgcccggaaagctggctgcaccaggggctgtctgatctgcctgtcccacatcaagtgcacgcccaagatgaagaagttcatcccaggacgctgccacacctacgaaggcgacaaagagtccgcacagggcggcataggcggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgtttgccaaagcaaccaggaattttcttagagaagttgatgctgatggtgacctgattgcagtatcaaatctgaatgactctgataagttacagcttctaagtctggtgacaaaaaagaagagattctggtgctggcagagacccaagtaccagtttttatccctcacccttggcgatgtactcatagaagaccaatttccgagtccagtggtcgtggagtcggactttgtgaaatacgagggcaagtttgcaaaccacgtgagtggaaccctggagactgcactggggaaggtcaagctgaacctggggggcagcagccgcgtagagagccagtcttcatttggaaccctgaggaagcaggaggtggatttgcagcagctcatcagagactctgccgagagaacaataaatctgagaaaccctgtgctccagcaggtgctggaaggaaggaatgaggtcctgtgcgttttgacacagaagatcacgacgatgcagaagtgtgtgatctctgagcacatgcaggtcgaggagaagtgtggtggcatcgtgggcatccagaccaagacggtgcaggtgtcagcgacggaggatgggaatgtcaccaaggactccaacgtggtgctggagatcccagctgccaccaccattgcctacggtgtcattgagttatacgtgaaactggacggccagttcgagttctgccttctccgagggaagcaaggtggcttcgagaacaagaagagaattgactctgtctacctggaccccctggtctttcgagagtttgcattcatagacatgccagatgctgcgcatgggatatcttcccaggatggaccattaagtgttttaaagcaagcgaccctgctcctggagaggaatttccatccatttgcggagctgcctgagccacaacagacagctttgagtgacatcttccaggcggtcctatttgatgatgaactactcatggtcctggaaccagtgtgcgatgacctggtcagcggcctctcgcccacagtggcggtgctgggggagctgaagccccggcagcagcaggaccttgtggccttcctgcagctggtggggtgcagcttacagggtgggtgtccgggccccgaggatgcaggcagcaagcagctgtttatgacagcctacttcttggtcagtgccctcgcagaaatgccagatagcgcagcagctctgctgggcacttgctgcaaactccagatcattcccacactgtgccacttgcttcgtgctctgtctgatgatggagtatctgatcttgaagacccaaccttgactcccctgaaagatacagaaaggtttgggattgtgcagcgcttgtttgcctcagctgacattagtctggagagactgaagtcatctgtgaaagctgtcattctgaaggactctaaagtcttcccactgcttctttgtataaccctgaatggactctgtgctttaggcagagaacattcatga)。

所述hGLucC-hGSDME融合蛋白中hGLucC是包括荧光素酶hGLuc第111位至第185位的氨基酸序列；所述hGLucC-hGSDME融合蛋白中表位标签为HA，其氨基酸序列如SEQ IDNo.9所示(YPYDVPDYA)，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示(tacccatacgatgttccagattacgct)。

所述hGLucC-hGSDME融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示(MYPYDVPDYAGGGGSGGGGSEAIVDIPEIPGFKDLEPMEQFIAQVDLCVDCTTGCLKGLANVQCSDLLKKWLPQRCATFASKIQGQVDKIKGAGGDGGGGSGGGGSFAKATRNFLREVDADGDLIAVSNLNDSDKLQLLSLVTKKKRFWCWQRPKYQFLSLTLGDVLIEDQFPSPVVVESDFVKYEGKFANHVSGTLETALGKVKLNLGGSSRVESQSSFGTLRKQEVDLQQLIRDSAERTINLRNPVLQQVLEGRNEVLCVLTQKITTMQKCVISEHMQVEEKCGGIVGIQTKTVQVSATEDGNVTKDSNVVLEIPAATTIAYGVIELYVKLDGQFEFCLLRGKQGGFENKKRIDSVYLDPLVFREFAFIDMPDAAHGISSQDGPLSVLKQATLLLERNFHPFAELPEPQQTALSDIFQAVLFDDELLMVLEPVCDDLVSGLSPTVAVLGELKPRQQQDLVAFLQLVGCSLQGGCPGPEDAGSKQLFMTAYFLVSALAEMPDSAAALLGTCCKLQIIPTLCHLLRALSDDGVSDLEDPTLTPLKDTERFGIVQRLFASADISLERLKSSVKAVILKDSKVFPLLLCITLNGLCALGREHS*)。

所述hGLucC-hGSDME融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示(atgtacccatacgatgttccagattacgctggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcggaggcgatcgtcgacattcctgagattcctgggttcaaggacttggagcccatggagcagttcatcgcacaggtcgatctgtgtgtggactgcacaactggctgcctcaaagggcttgccaacgtgcagtgttctgacctgctcaagaagtggctgccgcaacgctgtgcgacctttgccagcaagatccagggccaggtggacaagatcaagggggccggtggtgacggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgtttgccaaagcaaccaggaattttcttagagaagttgatgctgatggtgacctgattgcagtatcaaatctgaatgactctgataagttacagcttctaagtctggtgacaaaaaagaagagattctggtgctggcagagacccaagtaccagtttttatccctcacccttggcgatgtactcatagaagaccaatttccgagtccagtggtcgtggagtcggactttgtgaaatacgagggcaagtttgcaaaccacgtgagtggaaccctggagactgcactggggaaggtcaagctgaacctggggggcagcagccgcgtagagagccagtcttcatttggaaccctgaggaagcaggaggtggatttgcagcagctcatcagagactctgccgagagaacaataaatctgagaaaccctgtgctccagcaggtgctggaaggaaggaatgaggtcctgtgcgttttgacacagaagatcacgacgatgcagaagtgtgtgatctctgagcacatgcaggtcgaggagaagtgtggtggcatcgtgggcatccagaccaagacggtgcaggtgtcagcgacggaggatgggaatgtcaccaaggactccaacgtggtgctggagatcccagctgccaccaccattgcctacggtgtcattgagttatacgtgaaactggacggccagttcgagttctgccttctccgagggaagcaaggtggcttcgagaacaagaagagaattgactctgtctacctggaccccctggtctttcgagagtttgcattcatagacatgccagatgctgcgcatgggatatcttcccaggatggaccattaagtgttttaaagcaagcgaccctgctcctggagaggaatttccatccatttgcggagctgcctgagccacaacagacagctttgagtgacatcttccaggcggtcctatttgatgatgaactactcatggtcctggaaccagtgtgcgatgacctggtcagcggcctctcgcccacagtggcggtgctgggggagctgaagccccggcagcagcaggaccttgtggccttcctgcagctggtggggtgcagcttacagggtgggtgtccgggccccgaggatgcaggcagcaagcagctgtttatgacagcctacttcttggtcagtgccctcgcagaaatgccagatagcgcagcagctctgctgggcacttgctgcaaactccagatcattcccacactgtgccacttgcttcgtgctctgtctgatgatggagtatctgatcttgaagacccaaccttgactcccctgaaagatacagaaaggtttgggattgtgcagcgcttgtttgcctcagctgacattagtctggagagactgaagtcatctgtgaaagctgtcattctgaaggactctaaagtcttcccactgcttctttgtataaccctgaatggactctgtgctttaggcagagaacattcatga)。

实施例1双启动子真核表达报告质粒的构建

为了构建重组质粒，本发明合成了hGLuc的第18-110个氨基酸序列和第111-185个氨基酸序列，分别与GSDME的5′端融合。GLuc的分泌信号序列被去除，以避免自然分泌到细胞外。

进一步修饰两个融合体的5'端，添加Flag标签或HA标签，以便于后续的免疫印迹检测。在标签和hGLuc片段之间、hGLuc片段和hGSDME之间插入相同的多肽链(Gly.Gly.Gly.Gly.Ser)₂的编码序列。图1为融合蛋白hGLucC-hGSDME和融合蛋白hGLucN-hGSDME的氨基酸序列组成结构；氨基酸序列方向为从N端到C端。融合蛋白hGLucN-GSDME的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。融合蛋白hGLucC-GSDME的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

通过PCR扩增两个目标片段，并用T4 DNA连接酶依次连接到真核表达载体pBudCE4.1。具体来说，HA-hGLucC-hGSDME片段用HindIII和BamHI限制性内切酶克隆到CMV多克隆位点，而Flag-hGLucN-hGSDME片段用NotI和KpnI限制性内切酶克隆到EF-1α多克隆位点。将连接体转化到感受态大肠杆菌中，挑取单克隆菌落在Luria-Bertani培养基中培养后进行DNA提取。在金唯智生物科技有限公司(中国，苏州)进行的限制性内切酶消化和Sanger测序验证了DNA序列的正确性。最终，获得了pBudCE4.1-HA-hGLucC-hGSDME-Flag-hGLucN-hGSDME重组报告质粒(即“双启动子真核表达报告质粒”，下文简称为pBudCE4.1-coexpression)，用于在哺乳动物细胞系中同时表达两个目的基因。

将不同量的pBudCE4.1-coexpression质粒转染至293T细胞，经常规细胞培养后，采用Western Blot方法检测细胞中两种融合蛋白的表达情况，以β-tubulin为对照蛋白(内参)。融合蛋白hGLucN-hGSDME和融合蛋白hGLucC-hGSDME分别采用anti-Flag、anti-HA抗体进行检测；野生型和融合型的GSDME采用anti-GSDME抗体进行整体检测；内参采用anti-tubulin抗体进行检测。

融合蛋白hGLucN-hGSDME和融合蛋白hGLucC-hGSDME在293T细胞中的表达结果如图2所示。从图中可以看出，双启动子真核表达报告质粒pBudCE4.1-coexpression能够顺利表达两种融合蛋白hGLucN-hGSDME及hGLucC-hGSDME，能被anti-Flag/anti-HA抗体特异性检测到目标条带，两种融合蛋白均能被anti-GSDME抗体检测到目标条带，目标条带分子量大小符合预期，说明所构建的质粒能够表达目标融合蛋白。

实施例2焦亡活性检测方法的建立

按照8000cells/100μL/孔的铺板密度将PANC-1细胞接种至96孔板中，贴壁培养24h后进行后续操作。将构建的双启动子真核表达报告质粒pBudCE4.1-coexpression按照200ng/孔的质粒用量转染进细胞中，同时质粒与转染试剂(Polyplus jetOPTIMUS)按照1:2的比例进行混合，转染24h后进行后续的实验操作。将细胞与阳性药物索拉非尼按指定浓度或指定时间在37℃培养箱中进行孵育。结束后弃去上清，用M-PER哺乳动物蛋白提取试剂(100μL/孔)裂解细胞。轻轻摇晃平板30min。收集细胞裂解液的上清液，用BCA蛋白测定法测定每个样品的总蛋白浓度。此外，将30μL样品和100μL Renilla Luciferase AssaySubstrate(1X)转移到96孔白色微孔板(Corning，NY，USA)后，立即在37℃的多模板读数器(EnVision 2105，PerkinElmer，USA)上测量发光信号。

荧光素酶活性以每μg蛋白的相对发光强度(RLU/μg)表示，相对荧光素酶活性(％)＝[(F_T-F_B)/(F_C-F_B)]*100％。其中F_B是转染了GSDME质粒并经DMSO处理的空白对照孔的RLU/μg值；F_C是转染了pBudCE4.1-coexpression并经DMSO处理的阴性对照孔的RLU/μg值；F_T是转染了pBudCE4.1-coexpression并经药物处理的给药孔的RLU/μg值。

图3是不同浓度阳性化合物索拉非尼处理细胞24h后相对荧光素酶活性的变化。图4是50μM阳性化合物索拉非尼处理细胞不同时间后相对荧光素酶活性的变化。实验表明，采用阳性化合物索拉非尼处理细胞，诱发细胞焦亡；随着转染重组质粒量的增加，索拉非尼处理后融合蛋白hGLucN-hGSDME和融合蛋白hGLucC-hGSDME在细胞中的表达量增加；不同浓度阳性化合物索拉非尼处理细胞后，相对荧光素酶活性呈浓度依赖性变化；索拉非尼处理细胞不同时间后，相对荧光素酶活性呈时间依赖性变化。在药物处理24h后，相对荧光素酶活性达到峰值，表明本发明构建的双启动子真核表达报告质粒可以用于细胞焦亡活性的检测。

实施例3基于GSDME依赖型焦亡诱导机制的抗肿瘤活性药物的筛选

利用实施例2中建立的焦亡活性检测方法，对FDA批准的106种抗肿瘤化合物的焦亡诱导活性进行评价。将双启动子真核表达报告质粒pBudCE4.1-coexpression转染入PANC-1细胞，转染后的PANC-1细胞分别用FDA批准的106种抗肿瘤化合物处理，处理24h后测定荧光素酶活性，按照公式计算相对荧光素酶活性。

各处理组细胞的相对荧光素酶活性结果如图5所示，经过对FDA批准的抗癌药物库的筛选，本发明在106个化合物中发现了20个化合物表现出500％以上的相对荧光素酶活性，实现了细胞焦亡诱导抗肿瘤活性药物的筛选。

通过上述抗癌药物筛选实验，发明人发现上述20个化合物能够激活caspase-3/GSDME途径而触发肿瘤细胞焦亡。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上做出各种改变。

Claims (8)

1.一种双启动子真核表达报告质粒，其特征在于，包含hGLucN-hGSDME融合蛋白的编码序列和hGLucC-hGSDME融合蛋白的编码序列，并且能同时表达这两种目标融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的双启动子真核表达报告质粒，其特征在于，所述hGLucN-hGSDME融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述hGLucN-hGSDME融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述hGLucC-hGSDME融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述hGLucC-hGSDME融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.权利要求1所述的双启动子真核表达报告质粒在细胞焦亡活性检测中的应用。

4.权利要求1所述的双启动子真核表达报告质粒在基于GSDME依赖型焦亡诱导机制的抗肿瘤活性药物筛选中的应用。

5.一种基于GSDME依赖型焦亡诱导机制的抗肿瘤活性药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将构建的双启动子真核表达报告质粒转染到肿瘤细胞，两种融合蛋白经一个真核表达载体在细胞中顺利表达；

(2)将待筛选药物与肿瘤细胞共同孵育后，弃去上清；

(3)加入裂解液充分裂解细胞，收集细胞裂解液的上清液，检测化学发光值，计算相对荧光素酶活性，比较处理组与未处理组细胞的相对荧光素酶活性，判断药物的细胞焦亡诱导活性，筛选通过细胞焦亡机制发挥抗肿瘤效应的药物。

6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为胰腺癌细胞。

7.权利要求1所述的双启动子真核表达报告质粒在制备GSDME蛋白激活剂中的应用。

8.权利要求1所述的双启动子真核表达报告质粒在焦亡抑制剂筛选中的应用。

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