JP2020533019A - 制御可能なイントロンを用いる発現調節 - Google Patents
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Abstract
Description
1) XBP-1 mRNAのIRE-1スプライシング
タンパク質フォールディング需要の増加からの、又はERプロセスの化学的阻害によるERストレスは、シャペロンBiPの解離を経て、ER膜貫通タンパク質IRE1により検出される。このBiPの解離は、タンパク質のオリゴマー化及びリン酸化を可能にすることによりIRE1を活性化し、それにより、ER内腔に面しているRNアーゼドメインが露出される。その後、RNアーゼドメインは、スプライソソーム非依存性様式でXBP-1 mRNAからの非標準イントロンの除去を触媒する。非ストレス条件下で、XBP-1 mRNAは、スプライシングされない(XBP1u(翻訳された場合、非機能性タンパク質である261アミノ酸のORFを形成する))。しかしながら、ERストレスが検出された場合、XBP1uは、IRE1 RNアーゼによりスプライシングされて、機能性376アミノ酸タンパク質をコードするXBP1sを形成する。この機能性タンパク質、XBP1は、シャペロン、ジスルフィドイソメラーゼ、及びリン脂質生合成に関与する酵素等のタンパク質ホメオスタシスに関与するいくつかの遺伝子の発現を調節する転写因子であり、特定の配列、ERストレス応答エレメント(ERSE)又はアンフォールディング型タンパク質応答エレメント(UPRE)と結合し、遺伝子発現を増強することにより、これらのプロセスを制御する。したがって、遺伝子発現の調節は、IRE1によるXBP1uからのmRNAイントロンの除去である。非常に類似した系が、非哺乳類の真核細胞において機能している。
2) ATF6
活性化転写因子(ATF6)ATF6は、そのタンパク質の細胞質領域に転写因子ドメインを有する2型膜貫通タンパク質であり、不活性前駆体として合成され、BiP/GRP78との会合によりER内に保持される。ストレス条件に応答して、ATF6は解離し、ゴルジ体へ輸送され、ゴルジ体において、プロセシングが起きて、転写因子ドメインを放出する。その後、このドメインは、核へ輸送され、その核において、それは、ERSE及びUPREと結合して、タンパク質ホメオスタシスに関与する遺伝子の発現を増強することができる。
3) 二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼ(PERK)
PERKは、ER内腔ストレスセンサー及び細胞質プロテインキナーゼドメインを含有する1型ER膜貫通タンパク質である。PERKは、ERストレスに応答して活性化され、真核生物開始因子(elF2a)をリン酸化によって不活性化することにより、哺乳類細胞のERにおける正常タンパク質翻訳を阻害する。
- イントロンは、イントロンの下流で(すなわち、3'方向で)フレームシフトを生じる可能性がある。これは、典型的には、イントロンの切除可能な配列が3ヌクレオチド長の倍数ではない場合に生じる。そのようなフレームシフトは、停止コドンの導入を生じる場合が多く、その結果として、切り詰められたタンパク質を生じる。他の場合では、それは単に、イントロンの下流のコードされたアミノ酸配列における全面的な変更を単純に生じ得る。
- タンパク質の機能に対して破壊的であるアミノ酸が、翻訳されたタンパク質に存在することになる、コード配列の導入。この場合、イントロンの下流のアミノ酸配列は変更されないが、スプライシングされていない型において、翻訳されたタンパク質に存在するだろう、イントロンによりコードされたアミノ酸配列が、タンパク質の機能を破壊する。
- イントロン配列における停止コドンの導入。この場合、イントロン自体が、停止コドンを含む可能性があり、その結果として、翻訳の中途での終了、及び切り詰められたタンパク質の産生を生じるだろう。
- CACUCAGACUACGUGCACCU(配列番号1);
- CACUCAGACUACGUGCUCCU(配列番号2);
- CACUCAGACUACGUGCCCCU(配列番号3);
- CACUCAGACUACGUGCGCCU(配列番号4);及び
- CACUCAGACUAUGUGCACCU(配列番号5)。
- CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CNG(配列番号8);
- CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCUCCUCUG/CNG(配列番号9);
- CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCCCCUCUG/CNG(配列番号10);
- CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCGCCUCUG/CNG(配列番号11);及び
- CNG/CAGCACUCAGACUAUGUGCACCUCUG/CNG(配列番号12)。
- CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号7);
- CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCUCCUCUG/CUGC(配列番号13);
- CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCCCCUCUG/CUGC(配列番号14);
- CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCGCCUCUG/CUGC(配列番号15);及び
- CAG/CAGCACUCAGACUAUGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号16)。
-Yn-CNG/CNG-A-Zn-
ただし、Aは0ヌクレオチドから3ヌクレオチドまで(好ましくは1ヌクレオチド又は2ヌクレオチド)の長さを有し、/は切断部位を表し、Yn及びZnは、反対方向に読み取られるとき、ヌクレオチド配列において相補的であり、それゆえに、ハイブリダイズして、ステムループ構造のステムを形成することができる配列を表す。Yn及びZnは、好ましくは3ヌクレオチド長から10ヌクレオチド長まで、より好ましくは4ヌクレオチド長から8ヌクレオチド長までである。
-Zn-CNG/CNG[CG]-A-Yn-、ただし、その構成要素は上記と同じ意味をもつ。この場合、Aは、好ましくは、0ヌクレオチド、1ヌクレオチド、又は2ヌクレオチドの長さを有する。
- TGACGTG(ATF6コンセンサス配列)、
- TGACGTGCT(上記のバリアント)
- TGACGTG[TG](UPRE部位として知られている)、
- CCAAT-N9-CCACG(ERSE1部位として知られている)(配列番号18)、及び
- ATTGG-N-CCACG(ERSE2部位として知られている)(配列番号19)。
を含む。この配列はUPRE部位の6つのタンデムコピーを含む。
TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTを含む。この配列は、UPRE部位の6つのコピーを含み、それぞれが、20ヌクレオチドの間隔を置いて配置されている。
AGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGAT
を有する。
TGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTGGTACCGTCGACGATATCGGATCCAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATCGCCACC
を含み得る。
ーの非限定的例であり、特に、それらは、リポソームを、不活性化HIV又はインフルエンザウイルスと組み合わせている(Yamadaら、2003)。別の例は、陽イオン性脂質と混合されたウイルスベクターを包含する。
a) 本発明による合成核酸発現構築物を含む真核細胞集団を供給する工程;
b) アンフォールディング型タンパク質応答を誘導し、それにより、制御可能なイントロンからの切除可能な配列のスプライシングを誘導するように前記細胞集団を処理する工程;
c) 発現産物の産生のための適切な条件下で前記細胞集団をインキュベートする工程;及び
d) 前記細胞集団から前記発現産物を単離する工程
を含む、発現産物を産生するための方法を提供する。
・ジチオスレイトール(DTT) - この作用物質はタンパク質のジスルフィド架橋を低下させる。変性したタンパク質はER内に蓄積された。
・ツニカマイシン - この作用物質はN結合型グリコシル化を阻害する。
・ブレフェルジンA - これは、アンフォールディング型タンパク質応答の誘導剤として一般的に用いられる。
・タプシガルジン - この作用物質は、筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ(SERCA)の阻害によりER Ca2+枯渇をもたらす。
・2-デオキシグルコース
・A23187(CAS番号 52665-69-7)
・ボルテゾミブ(Velcade)
・クエルセチン
・UPRが誘導されるように細胞における脂質バランスを乱す作用物質、例えば、飽和脂肪酸(例えば、パルミチン酸) - すなわち、脂質誘発型ERストレス応答/UPRを誘導する作用物質。
CNG/CNGCACUCAGACUACGUGCACCUCNG/CNGC(配列番号6)、
CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号7)、又は
- 本発明による核酸発現構築物を含む薬学的組成物を含む遺伝子治療ベクターを対象に導入して、その結果、前記遺伝子治療ベクターが前記核酸発現構築物を前記対象の標的細胞へ送達する工程であって、前記核酸発現構築物が、治療用発現産物をコードする配列を含む、工程;及び
- 治療的有効量の機能性治療用発現産物を対象の標的細胞において発現する工程。
- TGACGTG(ATF6転写因子結合部位コンセンサス配列)、
- TGACGTGCT(上記のバリアント)、
- TGACGTG[TG](UPRE部位として知られている)、
- CCAAT-N9-CCACG(ERSE1部位として知られている)(配列番号18)、及び
- ATTGG-N-CCACG(ERSE2部位として知られている)(配列番号19)。
TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG(配列番号54)を含み、ただし、Sは、上記で定義されているような任意選択のスペーサー配列を表す。好ましくは、上記で定義されているようなスペーサー配列は、転写因子標的配列(TGACGTG)の少なくとも2つ、好ましくは全部の間に存在する。
TGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCT(配列番号20)を含む。
TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT(配列番号55)を含み、ただし、Sは、上記で定義されているような任意選択のスペーサー配列を表す。好ましくは、上記で定義されているようなスペーサー配列は、転写因子標的配列の少なくとも2つ、好ましくは全部の間に存在する。
TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCT(配列番号56)、又はそれと少なくとも50%同一、更により好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも85%、90%、95%、98%、若しくは99%同一である配列を含む。配列バリエーションは、転写因子標的配列、すなわち、配列TGACGTGCTを有するもの、ではない配列においてのみ存在することが非常に好ましい。配列バリエーションがスペーサー配列(すなわち、配列GATGATGCGTAGCTAGTAGT(配列番号61)を有するもの)にのみ存在することが一般的に好ましい。
TGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTGGTACCGTCGACGATATCGGATCCAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATCGCCACC(配列番号22)、又はそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも90%同一、更により好ましくはそれと少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である配列を含む。このUPR誘導性プロモーターは、CMV-MP最小プロモーターと作動可能に連結した配列番号20のUPR応答性シス制御性エレメントを含む。配列バリエーションは、転写因子標的配列、すなわち、配列TGACGTGCTを有するもの、でもなく、CMV-MP配列でもない、配列においてのみ存在することが非常に好ましい。
TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTGCAGTTAGCGTAGCTGAGGTACCGTCGACGATATCGGATCCAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGAT(配列番号57)、又はそれと少なくとも50%同一、更により好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも85%、90%、95%、98%、若しくは99%同一である配列を含む。このUPR誘導性プロモーターは、CMV-MP最小プロモーターと作動可能に連結した配列番号56のUPR応答性シス制御性エレメントを含む。配列バリエーションは、転写因子標的配列、すなわち、配列TGACGTGCTを有するもの、でもなく、CMV-MP配列でもない、配列においてのみ存在することが非常に好ましい。配列バリエーションがスペーサー配列(すなわち、配列GATGATGCGTAGCTAGTAGT(配列番号61)を有するもの)にのみ存在することが一般的に好ましい。
TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTGCAGTTAGCGTAGCTGAGGTACCGTCGACGATATCGGATCCTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAG(配列番号58)、又はそれと少なくとも50%同一、更により好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも85%、90%、95%、98%、若しくは99%同一である配列を含む。このUPR誘導性プロモーターは、MinTK最小プロモーターと作動可能に連結した配列番号56のUPR応答性シス制御性エレメントを含む。配列バリエーションは、転写因子標的配列、すなわち、配列TGACGTGCTを有するもの、でもなく、MinTK配列でもない、配列においてのみ存在することが非常に好ましい。配列バリエーションがスペーサー配列(すなわち、配列GATGATGCGTAGCTAGTAGT(配列番号61)を有するもの)にのみ存在することが一般的に好ましい。
きる発現レベルは、例えば、実施例8の方法論を用いて本質的に検出不可能であるものである。
a) 本発明による発現産物をコードする核酸配列と作動可能に連結したUPR誘導性プロモーターを含む合成核酸発現構築物を含む真核細胞集団を供給する工程;
b) アンフォールディング型タンパク質応答を誘導するように前記細胞集団を処理して、それにより前記UPR誘導性プロモーターから転写を誘導する工程;
c) 前記発現産物の産生についての最適な条件下で前記細胞集団をインキュベートする工程;及び
d) 前記細胞集団から前記発現産物を単離する工程。
A[CT]N{A}YR
で考慮すると、Aは、Aがその位置に常に見出されることを意味する; [CT]は、その位置においてCか又はTのいずれかを表す;Nはその位置において任意の塩基を表す;及び{A}は、A以外の任意の塩基がその位置に見出されることを意味する。Yは任意のピリミジンを表し、Rは任意のプリンを示す。
26bpの非通常イントロン(制御可能)は、スプライシング前、ナンセンスタンパク質をコードするXBP-1のmRNAに存在する。いったん小胞体(ER)ストレスがIRE1タンパク質によって感知されたならば、その非通常イントロンは、固有のスプライシング部位を介して除去され、その後、そのmRNAは再ライゲーションされて、XBP-1タンパク質を生成するように翻訳され得るmRNA転写産物を形成する。ERストレスは、多くの方法において、例えば、化学物質添加により、又は異種性タンパク質の発現により、誘導することができる。
IRE1に対するコンセンサススプライス認識部位配列:
CNG/CNG
5'部位: CCG/CAGC
3'部位: CUG/CAGC
切除されるイントロン配列(配列番号23):
cagcacucagacuacgugcaccucug
イントロンの挿入のために選択された領域は、スプライス認識部位との配列類似性によった。イントロンの挿入を可能にするために、CTCGからCTGGへの単一のサイレント変異のみが3'認識部位に必要とされた。
MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT
LVTTLTYGVQ CFSRYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL
VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA
DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSTQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI TLGMDELYK
- CMV-MP-GFP: EGFPのCMV-MP調節性発現
- SYNP-XBP-01: XBP1イントロンを有するEGFPのCMV-MP調節性発現
- Freestyle HEK293F、Invitrogen社カタログ番号: R790-07
- Freestyle CHO-S、Invitrogen社カタログ番号: R80007
- 細胞を製造会社の使用説明書に従って維持した。
- 細胞にMAX試薬(Invitrogen社カタログ番号: 16447100)を用いてトランスフェクションした。
- 40mlの細胞を、250mlのベント型Erlenmeyerフラスコ(Sigma-Aldrich社 CLS431144)中、37℃°、8%CO2において、100rpmで撹拌しながら、増殖させた。細胞を、製造会社の使用説明書に記載されているように播種した。
- トランスフェクションの1日前に、細胞を、血球計算器を用いて計数し、500,000細胞/mlに分けた。
- トランスフェクションの当日、細胞を24ウェルプレートにおいて500μlの適切な培地中100万細胞/mlで播種する。
- その後、0.625μgのDNA/ウェルを、10μlのOptiMem培地(Thermofisher社; 11058021)に加え、室温で5分間、インキュベートした。
- 同時に、0.625μlのMax試薬を、OptiMemの添加により10μlにし、室温で5分間、インキュベートした。
- このインキュベーション後、両方の混合物を、同じチューブに加え、室温で25〜30分間、インキュベートした。
- その後、DNA/Max試薬混合物(20μl/ウェル)を細胞へ直接、加え、細胞を、前に記載されているようにインキュベートした。
- その後、細胞を、24時間後、GFP蛍光について測定した。
- GFP構築物からのイントロンスプライシングを、2mM DTTの添加及び1時間後のGFP蛍光のモニタリングにより測定した。DTTは、ER内のジスルフィド結合の形成を阻止することによりERストレスを誘導する強い還元剤である。
- 細胞溶解バッファーを、ルシフェラーゼアッセイ系(Promega社; E1500)から、滅菌水で5分の1に希釈することにより調製した。
- 細胞を900xgで5分間、ペレット化し、ルシフェラーゼキットからの細胞溶解バッファーの100μl/1×106細胞中に再懸濁した。
- その後、これを、溶解を起こすために室温で10〜15分間、インキュベートした。
- 細胞核及びデブリを900xgで5分間、採取した。
- 上清を、96ウェル黒色プレートへ最大100μl/試料で収集した。
- 上清をPBSで2分の1に希釈した(これは、GFPシグナルに影響を及ぼす、溶解バッファー由来のメルカプトエタノールを希釈することである;GFPシグナルは還元剤の存在下で減少する)。
- 試料を室温で5分間、インキュベートした。
- GFP蛍光を、プレートリーダーを用いて測定し、励起及び発光をそれぞれ、485nm及び520nmに設定した。
- GFP蛍光をまた、蛍光顕微鏡下で直接、可視化した。
SYNP-XBP-01実験
HEK293F実験:
- 24ウェルのトランスフェクションを上記のように設定した。各条件を2連/3連で実施した。
- トランスフェクションから24時間後、細胞を2mM DTTによるか又は同量の水でのモック処理によるかのいずれかで処理した。
- 細胞の処理から1時間後、GFP蛍光を上記のように測定した。
- GFP蛍光の対照プラスミドに対する比を、誘導の前と後で計算した。図1は3つの独立した実験の累積結果を示す。
CHO-S細胞を用いる実験を、HEK293F細胞について記載されているように同一方法で実施した。実験の結果は、図2a及び図2bに見ることができる。
ATF6は、ERストレスにより活性化される転写因子である。いったん活性化されたならば、この転写因子はERSE又はUPREと結合し、タンパク質ホメオスタシスの重要な構成要素の遺伝子転写を活性化する(Yoshidaら、Cell、107巻、881〜891頁、2001年12月28日参照)。
1) CMV最小プロモーター(CMV-MP)の上流の6×ATF6エレメント(配列TGACGTGCTを有する)及びEGFP;この構築物は、SYNP-ATF6-01と名付けられた(下記の配列番号30参照)。
2) CMV-MPの上流の6×ATF6エレメント及びXBP1イントロン挿入を有するEGFP;この構築物はSYNP-ATF6-02と名付けられた(下記の配列番31参照)。
- CMV-IE-GFP構築物を含有するpMA-RQ
- CMV-MP-GFP構築物を含有するpMA-RQ
- SYNP-ATF6-01構築物を含有するpMA-RQ
- SYNP-ATF6-02構築物を含有するpMA-RQ
24ウェルのトランスフェクションを上記のように設定した。各条件を2連/3連で実施した。トランスフェクションから24時間後、細胞を、UPRを誘導するために2mM DTTでの処理か、又は同量の水でのモック処理によるかのいずれかで処理した。細胞の処理から1時間後、3時間後、5時間後、及び24時間後、GFP蛍光を、前に論じられているように測定した。
この例の目的は、ERストレス応答が、以前に用いられるような化学的ERストレスの代替として(又はそれに加えて)、異種性タンパク質の産生により活性化され得るかどうかを決定することであった。SYNP-ATF6-01及びSYNP-ATF6-02からのGFP発現がAAV産生中に測定される実験を実施した。
いくつかの候補作用物質のUPRを誘導する能力を評価するために実験を実施した。これらの候補誘導剤のUPRを誘導する能力を、本質的に上記のような技術を用いて評価した。試験された追加の候補は、0.5mM パルミチン酸、1uM MF-43(2-メチル-5-(6-(4-(2-(トリフルオロメチル)フェノキシ)ピペリジン-1-イル)ピリダジン-3-イル)-1,3,4-チアジアゾール)(ステアロイル-CoAデサチュラーゼの阻害剤である)、及びこれらの両方の組合せ(同じ濃度のそれぞれが用いられた)であった。
- 40mlの細胞を、250mlのベント型Erlenmeyerフラスコ(Sigma-Aldrich社 CLS431144)中、37℃°、8%CO2において、100rpmで撹拌しながら、増殖させた。細胞を、製造会社の使用説明書に記載されているように播種した。
- トランスフェクションの1日前に、細胞を、血球計算器を用いて計数し、500,000細胞/mlに分けた。
- トランスフェクションの当日、細胞を24ウェルプレートにおいて500μlの適切な培地中100万細胞/mlで播種する。
- その後、0.625μgのDNA/ウェルを、10μlのOptiMem培地(Thermofisher社; 11058021)に加え、室温で5分間、インキュベートした。
- 同時に、0.625μlのMax試薬を、OptiMemの添加により10μlにし、室温で5分間、インキュベートした。
- このインキュベーション後、両方の混合物を、同じチューブに加え、室温で25〜30分間、インキュベートした。
- その後、DNA/Max試薬混合物(20μl/ウェル)を細胞へ直接、加え、細胞を、前に記載されているようにインキュベートした。
- その後、細胞を、24時間後、GFP蛍光について測定した。
- GFP構築物からのイントロンスプライシングを、2mM DTT、0.5mM パルミチン酸塩、1μM MF-43、0.5mM パルミチン酸塩と1μM MF-43の組合せのいずれかの添加、及びAAV合成後、1時間後、3時間後、5時間後、及び24時間後のGFP蛍光のモニタリングにより、測定した。
- 細胞溶解バッファーを、ルシフェラーゼアッセイ系(Promega社; E1500)から、滅菌水で5分の1に希釈することにより調製した。
- 細胞を900xgで5分間、ペレット化し、ルシフェラーゼキットからの細胞溶解バッファーの100μl/1×106細胞中に再懸濁した。
- その後、これを、溶解を起こすために室温で10〜15分間、インキュベートした。
- 細胞核及びデブリを900xgで5分間、採取した。
- 上清を、96ウェル黒色プレートへ最大100μl/試料で収集した。
- 上清をPBSで2分の1に希釈した(これは、GFPシグナルに影響を及ぼす、溶解バッファー由来のメルカプトエタノールを希釈することである;GFPシグナルは還元剤の存在下で減少する)。
- 試料を室温で5分間、インキュベートした。
- GFP蛍光を、プレートリーダーを用いて測定し、励起及び発光をそれぞれ、485nm及び520nmに設定した。
- GFP蛍光をまた、蛍光顕微鏡下で直接、可視化した。
分泌性アルカリフォスファターゼは、バイオプロセシング産業においてマーカーとして用いられる標準タンパク質である。分泌性アルカリフォスファターゼは、分泌性タンパク質についての理想的なマーカーであり、そのタンパク質が、細胞のタンパク質品質管理(転写、翻訳、翻訳後修飾、及びその後、分泌)チェックポイントの全部を経験するからである。
構築物SEAP-ATF6-001は、GeneART社において、化学合成により合成された。
CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG(配列番号32)
スプライス部位を含むと、これは、以下の配列を生じる:
CAG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CAG(配列番33)
MLLLLLLLGLRLQLSLGIIPVEEENPDFWNREAAEALGAAKKLQPAQTAAKNLIIFLGDGMGVSTVTAARILKGQKKDKLGPEIPLAMDRFPYVALSKTYNVDKHVPDSGATATAYLCGVKGNFQTIGLSAAARFNQCNTTRGNEVISVMNRAKKAGKSVGVVTTTRVQHASPAGTYAHTVNRNWYSDADVPASARQEGCQDIATQLISNMDIDVILGGGRKYMFRMGTPDPEYPDDYSQGGTRLDGKNLVQEWLAKRQGARYVWNRTELMQASLDPSVTHLMGLFEPGDMKYEIHRDSTLDPSLMEMTEAALRLLSRNPRGFFLFVEGGRIDHGHHESRAYRALTETIMFDDAIERAGQLTSEEDTLSLVTADHSHVFSFGGYPLRGSSIFGLAPGKARDRKAYTVLLYGNGPGYVLKDGARPDVTESESGSPEYRQQTGNFTRRCSQQCPWTKRHTQARTWRCSRAARRRTWFTACRSRPS(配列番号35)
MLLLLLLLGLRLQLSLGIIPVEEENPDFWNREAAEALGAAKKLQPAQTAAKNLIIFLGDGMGVSTVTAARILKGQKKDKLGPEIPLAMDRFPYVALSKTYNVDKHVPDSGATATAYLCGVKGNFQTIGLSAAARFNQCNTTRGNEVISVMNRAKKAGKSVGVVTTTRVQHASPAGTYAHTVNRNWYSDADVPASARQEGCQDIATQLISNMDIDVILGGGRKYMFRMGTPDPEYPDDYSQGGTRLDGKNLVQEWLAKRQGARYVWNRTELMQASLDPSVTHLMGLFEPGDMKYEIHRDSTLDPSLMEMTEAALRLLSRNPRGFFLFVEGGRIDHGHHESRAYRALTETIMFDDAIERAGQLTSEEDTLSLVTADHSHVFSFGGYPLRGSSIFGLAPGKARDRKAYTVLLYGNGPGYVLKDGARPDVTESESGSPEYRQQSAVPLDEETHAGEDVAVFARGPQAHLVHGVQEQTFIAHVMAFAACLEPYTACDLAPPAGTTDAAHPGYSRVGAAGRFEQT(配列番号36)
24ウェルプレートについてのトランスフェクションのプロトコールは、実施例1に記載されている通りであった。その後:
- 上清を、24時間後、SEAP活性について測定した。
- SEAP構築物からのイントロンスプライシングを、2mM DTTの添加後、3時間後、5時間後、及び24時間後のSEAP活性のモニタリングにより測定した。
- SEAP活性を、製造会社の使用説明書(Roche社、Sigma-Aldrich社、カタログNo. 11 779 842 001から得られるSEAPレポーター遺伝子アッセイキット)の通り、測定した。
XBP1イントロンにより形成される二次構造がスプライシングに必須であることは、先行技術において主張されている。しかしながら、上記の全ての実験は、そのような二次構造又は野生型XBP1イントロンに似る構造を形成するとは予想されないイントロン構造を用いており、それにも関わらず、スプライシング系の性能は非常にロバストであった。
発現構築物は、GeneART社において化学合成により合成された。エンハンサー領域は、上記のように、CMV-MPに連結した、20bpの間隔を置いて配置された6×ATF6 (TGACGTGCT)である。
CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG(配列番号32)
スプライス部位を含むと、これは、以下の配列を生じる:
CCG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CAG(配列番号38)
- 図16B - EGFPに用いられる場合のイントロン(すなわち、実施例1〜4に用いられる場合、CAG/CTGCAGCACTCAGACTACGTGCACCTCTG/CTG、配列番号48によりコードされる);
- 図16A - SEAPに用いられる場合のイントロン(すなわち、実施例5に用いられる場合、CAG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CAG、配列番号33によりコードされる);
- 図16C - CASP9に用いられる場合のイントロン(すなわち、実施例7に用いられる場合、CAG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CTG、配列番号43にコードされる)、図16C参照。
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAADGQLYTTLQTSCWNTVKP(配列番号39)
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAADVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV(配列番号40)
- 細胞溶解バッファーを、ルシフェラーゼアッセイ系(Promega社; E1500)から、滅菌水で5分の1に希釈することにより調製した。
- 細胞を900xgで5分間、ペレット化し、ルシフェラーゼキットからの細胞溶解バッファーの100μl/1×106細胞中に再懸濁した。
- その後、これを、溶解を起こすために室温で10〜15分間、インキュベートした。
- 細胞核及びデブリを900xgで5分間、採取した。
- 上清を収集し、10μl/試料を96ウェル白色プレートへ加えた。
- 自動注入装置を用いるプレートリーダーを用いて、生物発光を測定し、50μlの基質を注入した。基質を、製造会社の使用説明書(Promega社; E1500)の通り、調製した。
この実験は、制御可能なイントロンからの発現調節が、発現する細胞にとって致死性である毒性発現産物の発現を調節するのに適切に厳密であることを確認するために実施した。制御可能なイントロンを、アポトーシス誘発性タンパク質カスパーゼ9へ組み込んだ。HEK細胞におけるこのタンパク質の過剰発現は、迅速な死を引き起こす。したがって、このタンパク質の非修飾型配列からの少しの発現でも、培養物内で死細胞の有意な増加をもたらす。このことが、本発明者らが前記イントロンにより提供される調節の厳密性を決定するように促している。カスパーゼ9も、GFP-Sparkと融合させた(イントロンが転写産物に存在しているならば、目で見ることができない)。
発現のために、イントロンをCMV-IE構成的プロモーターと連結した。イントロン構築物を、BsaI制限部位及び2つの相補性オリゴを用いて、プラスミドベクターSYNP-CASPSp-001へクローニングした。そのプラスミドを、BsaI(NEB社 R0535S)で消化し、98℃へ5分間、加熱して二次構造を融解することにより、オリゴをアニールし、その後、55℃で20分間、インキュベートした。これは、オリゴが二本鎖DNAを形成することを可能にした。このDNAを、消化されたSYNP-CASPSp-001へのライゲーションを可能にするだろう、5'末端と3'末端の両方においてオーバーハングを有するようにデザインした。その後、二本鎖DNAをプラスミドへライゲーションし、続いて、one shot top ten chemically competent cells (Thermofisher社、C404003)へ形質転換した。単離されたDNAをシーケンシングして、イントロンの存在を確認した。完全なプラスミドは、SYNP-CASP9-INTと呼ばれ、プラスミドマップは図13に示されている。
INTC9FP: ACGTCAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG(配列番号41)
INTC9RP: ACGTCAGCGTCGTGTAAAGTTGCCCGTCTG(配列番号42)
CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG(配列番号32)
スプライス部位を含むと、これは、以下の配列を生じる:
CAG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CTG(配列番号43)
MDEADRRLLRRCRLRLVEELQVDQLWDALLSRELFRPHMIEDIQRAGSGSRRDQARQLIIDLETRGSQALPLFISCLEDTGQDMLASFLRTNRQAAKLSKPTLENLTPVVLRPEIRKPEVLRPETPRPVDIGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWSAGDPGRHL(配列番号45)
MDEADRRLLRRCRLRLVEELQVDQLWDALLSRELFRPHMIEDIQRAGSGSRRDQARQLIIDLETRGSQALPLFISCLEDTGQDMLASFLRTNRQAAKLSKPTLENLTPVVLRPEIRKPEVLRPETPRPVDIGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWSADGQLYTTLLETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSGGGGS(配列番号46)
この実験の目的は、異なる最小プロモーターと共の、上記の実施例で用いられているようなATF6含有UPR応答性シス制御性エレメント(本明細書ではエンハンサーとも呼ばれる)を試験すること、及びそれらの調節の誘導性及び厳密性を更に評価することであった。この目的を達成するために、ATF6含有UPR応答性シス制御性エレメントを、CMV-MP及びMinTK(ヘルペスチミジンキナーゼ最小プロモーター)の最小プロモーターに作動可能に連結した。
Claims (51)
- 細胞において発現産物を産生するための合成核酸発現構築物であって、前記核酸発現構築物が、前記発現産物をコードする核酸配列と作動可能に連結したプロモーター配列を含み、前記発現産物をコードする核酸配列が、制御可能なイントロンをコードする配列を含み、前記制御可能なイントロンが、細胞におけるアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)系により前記合成発現構築物から産生された転写産物からスプライシングで切り出される能力があり、それにより、結果として、機能性発現産物をコードする転写産物を生じる、切除可能な配列を含むイントロンである、合成核酸発現構築物。
- 制御可能なイントロンが、IRE1タンパク質又はそのホモログ若しくはオルソログによりスプライシングで切り出される能力がある、請求項1に記載の合成核酸発現構築物。
- 発現産物がタンパク質である、請求項1又は2に記載の合成核酸発現構築物。
- 制御可能なイントロンの切除可能な配列のスプライシングでの切り出しが、発現産物をコードする核酸配列からの転写産物の正しい翻訳を可能にし、それにより、所望の発現産物が産生されるのを可能にする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- 発現産物をコードする核酸配列からの転写産物におけるイントロンの存在が、結果として、非機能性である前記転写産物からタンパク質が翻訳されることになる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- 制御可能なイントロンの切除可能な配列のスプライシングでの切り出しが、転写産物において中途での停止コドンを排除する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- 制御可能なイントロンの切除可能な配列のスプライシングでの切り出しが、制御可能なイントロンの下流に位置する転写産物における配列についてリーディングフレームのシフトを生じる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- 切除可能な配列のヌクレオチド長が3で割り切れない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- 制御可能なイントロンが、配列CNG/CNG-Xn-CNG/CNGを含み、ただし、Xnが長さn塩基の配列を表し、/が切断部位を表し、配列CNG-Xn-CNGが転写産物から切除される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- Xnが、10ヌクレオチドから500ヌクレオチドまで、より好ましくは15〜350ヌクレオチド、更により好ましくは15〜100ヌクレオチド、更により好ましくは15〜35ヌクレオチド、更により好ましくは20〜25ヌクレオチドの長さを有する、請求項9に記載の合成核酸発現構築物。
- 制御可能なイントロンが、配列CNG/CNG-Xn-CNG/CNG[CG]を含み、ただし、Xnが長さnヌクレオチドの配列を表し、/が、切除可能な配列CNG-Xn-CNGがスプライシングにより転写産物から切除されるような切断部位を表し、配列Xnの5'末端におけるヌクレオチドがC又はGである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- Xnが配列CACUCAGACUACGUGCACCU(配列番号1)又はそれと少なくとも60%同一である配列を含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- Xnが以下の配列の1つを含み、又はそれからなる、請求項12に記載の合成核酸発現構築物:
- CACUCAGACUACGUGCACCU(配列番号1);
- CACUCAGACUACGUGCUCCU(配列番号2);
- CACUCAGACUACGUGCCCCU(配列番号3);
- CACUCAGACUACGUGCGCCU(配列番号4);及び
- CACUCAGACUAUGUGCACCU(配列番号5)。 - 制御可能なイントロンが、配列CNG/CNGCACUCAGACUACGUGCACCUCNG/CNGC(配列番号6)又はそれと少なくとも60%同一である配列を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- 制御可能なイントロンが、配列CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号7)又はそれと少なくとも60%同一である配列を含み、又はそれからなる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- 制御可能なイントロンが以下の配列の1つを含み、又はそれからなる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物:
- CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CNG(配列番号8);
- CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCUCCUCUG/CNG(配列番号9);
- CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCCCCUCUG/CNG(配列番号10);
- CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCGCCUCUG/CNG(配列番号11);及び
- CNG/CAGCACUCAGACUAUGUGCACCUCUG/CNG(配列番号12)。 - 制御可能なイントロンが以下の配列の1つを含み、又はそれからなる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物:
- CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号7);
- CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCUCCUCUG/CUGC(配列番号13);
- CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCCCCUCUG/CUGC(配列番号14);
- CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCGCCUCUG/CUGC(配列番号15);及び
- CAG/CAGCACUCAGACUAUGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号16)。 - 制御可能なイントロンが、配列CAG/CUGCAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUG(配列番号17)又はCAG/CUGCAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUGG(配列番号27)を含み、ただし、/が切断部位を表す、請求項1〜17のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- 発現産物をコードする核酸配列と作動可能に連結した誘導性プロモーターを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- 誘導性プロモーターがアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)誘導性プロモーターである、請求項19に記載の合成核酸発現構築物。
- 発現産物をコードする核酸配列が導入遺伝子である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- 発現産物をコードする核酸配列がタンパク質をコードし、適切には、前記タンパク質が酵素、抗体若しくは抗体断片、ウイルスタンパク質、治療用タンパク質、又は毒性タンパク質である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
- 発現産物をコードする配列を含む核酸であって、前記発現産物をコードする配列が制御可能なイントロンをコードする配列を含み、前記制御可能なイントロンが、細胞におけるアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)系により合成発現構築物から産生された転写産物からスプライシングで切り出さる能力があり、それにより、結果として、機能性発現産物をコードする転写産物を生じる、切除可能な配列を含むイントロンであり、前記発現産物が、XBP1タンパク質でも、Hac1タンパク質でも、bZIP60タンパク質でも、そのホモログでもない、核酸。
- 請求項1〜22のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物又は請求項23に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、又は請求項24に記載のベクターを含む薬学的組成物。
- 薬学的組成物の製造のための、請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、又は請求項24に記載のベクターの使用。
- 請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、又は請求項24に記載のベクターを含む細胞。
- 真核細胞、適切には、真菌細胞(例えば、酵母細胞)、動物(後生動物)細胞(例えば、哺乳類細胞)、又は植物細胞である、請求項27に記載の細胞。
- 請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、又は請求項24に記載のベクターが、細胞への毒性がある発現産物をコードする、請求項27又は28に記載の細胞。
- a) 請求項1〜22のいずれか一項に記載の合成核酸発現産物を含む真核細胞集団を供給する工程;
b) アンフォールディング型タンパク質応答を誘導するように前記細胞集団を処理して、それにより制御可能なイントロンからの切除可能な配列のスプライシングを誘導する工程;
c) 前記発現産物の産生についての最適な条件下で前記細胞集団をインキュベートする工程;及び
d) 前記細胞集団から前記発現産物を単離する工程
を含む、発現産物を産生するための方法。 - アンフォールディング型タンパク質応答(UPR)を誘導するように前記細胞集団を処理する工程b)の前に、前記細胞集団を前記細胞の増殖に適した条件下でインキュベートする工程を含む、請求項30に記載の方法。
- 工程b)が、前記細胞にストレスを加えることを含み、前記ストレスがUPRを誘導するのに適している、請求項30又は31に記載の方法。
- 工程b)が、前記細胞においてUPRを誘導することができる化学物質を投与することを含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞においてUPRを誘導することができる化学物質が、フォルスコリン、ジチオスレイトール(DTT)、ツニカマイシン、タプシガルジン、飽和脂肪酸、ステアロイル-CoAデサチュラーゼ酵素活性を下方制御することができる作用物質の1つ又は複数を含む、請求項33に記載の方法。
- 工程b)が、細胞集団においてUPR応答を誘導するために、前記真核細胞集団において誘導タンパク質を発現することを含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)が、前記細胞において誘導タンパク質、好ましくは異種性タンパク質を発現する能力がある発現ベクターを前記細胞集団にトランスフェクションすることを含み、又は工程b)が、すでに細胞へ導入された発現ベクターから誘導タンパク質の発現を誘導することを含む、請求項34に記載の方法。
- 工程b)が、細胞を低酸素又は糖質欠乏に曝すことを含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞集団が、真菌細胞、動物細胞、又は植物細胞を含み、好ましくは、細胞集団が哺乳類細胞を含む、請求項30〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)の前に、核酸発現構築物を細胞へ導入する工程を含む、請求項30〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 処置又は治療の方法における使用のための、請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、請求項24に記載のベクター、請求項25に記載の薬学的組成物、又は請求項27〜29のいずれか一項に記載の細胞。
- 遺伝子治療のための医薬の製造のための、請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、請求項24に記載のベクター、請求項25に記載の薬学的組成物の使用。
- 以下の工程を含む、遺伝子治療を必要としている対象における遺伝子治療のための方法:
- 請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物を含む遺伝子治療ベクターを対象に導入して、前記遺伝子治療ベクターが前記核酸発現構築物を前記対象の標的細胞へ送達する工程であって、前記核酸発現構築物が、治療用発現産物をコードする配列を含む、工程;及び
- 治療的有効量の機能性治療用発現産物を対象の標的細胞において発現する工程。 - 合成のUPR応答性シス制御性エレメントを含む合成UPR誘導性プロモーターであって、前記UPR応答性シス制御性エレメントが、ATF6、XBP1、若しくはbZIP60、又はUPRの一部として遺伝子発現を駆動させるホモログ若しくは別途等価の転写因子に対する少なくとも1つの結合部位を含む、合成UPR誘導性プロモーター。
- 最小プロモーター又は近位プロモーターと作動可能に連結した少なくとも1つの合成UPR応答性シス制御性エレメントを含む、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター。
- 以下の転写因子標的配列の少なくとも1つの1つ又は複数のコピーを含むUPR応答性シス制御性エレメントを含む、請求項43又は44に記載の合成UPR誘導性プロモーター:
- TGACGTG;
- TGACGTGCT;
- TGACGTG[TG];
- CCAAT-N9-CCACG(ERSE1部位として知られている)(配列番号18);及び
- ATTGG-N-CCACG(ERSE2部位として知られている)(配列番号19)。 - 転写因子標的配列TGACGTGの1つ又は複数のコピー、好ましくは転写因子標的配列TGACGTGの3つ又はそれ以上のコピー、及び好ましくは転写因子標的配列TGACGTGの5つ又はそれ以上のコピー、例えば、転写因子標的配列TGACGTGの6つ又はそれ以上のコピーを含む、UPR応答性シス制御性エレメントを含む、請求項43〜45のいずれか一項に記載の合成UPR誘導性プロモーター。
- UPR応答性シス制御性エレメントが、配列
TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG(配列番号54)を含み、ただし、Sが任意選択のスペーサー配列を表す、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター。 - UPR応答性シス制御性エレメントが、配列TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT(配列番号55)を含み、ただし、Sが任意選択のスペーサー配列を表す、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター。
- UPR応答性シス制御性エレメントが、配列TGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCT(配列番号20)を含む、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター。
- UPR応答性シス制御性エレメントが、配列
TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCT(配列番号56)又はそれと少なくとも50%同一である配列を含む、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター。 - 以下の配列の1つを含む、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター:
- TGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTGGTACCGTCGACGATATCGGATCCAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATCGCCACC(配列番号22)又はそれと少なくとも70%同一である配列;
- TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTGCAGTTAGCGTAGCTGAGGTACCGTCGACGATATCGGATCCAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGAT(配列番号57)又はそれと少なくとも50%同一である配列;及び
- TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTGCAGTTAGCGTAGCTGAGGTACCGTCGACGATATCGGATCCTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAG(配列番号58)又はそれと少なくとも50%同一である配列。
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Citations (1)
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---|---|---|---|---|
JP2004081143A (ja) * | 2002-08-28 | 2004-03-18 | Inst Of Physical & Chemical Res | 生体刺激存在下でのmRNAのフレームシフトを利用した蛋白質の発現方法 |
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Non-Patent Citations (2)
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EMBO REPORTS, vol. 16, no. 12, JPN6022028148, 2015, pages 1688 - 1698, ISSN: 0004822100 * |
PLPCX - ADDGENE VECTOR DATABASE (PLASMIDS, EXPRESSION VECTORS, ETC), JPN6022028147, 20 December 2012 (2012-12-20), ISSN: 0004822101 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023068285A1 (ja) * | 2021-10-20 | 2023-04-27 | リファインホールディングス株式会社 | 小胞体ストレス抑制剤、神経変性疾患予防改善剤および認知症の予防・進行防止・改善剤、並びに食品 |
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