JP2006505288A - 対立遺伝子特異的rna干渉 - Google Patents
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Abstract
Description
本願明細書は、2002年11月4日に提出された米国特許仮出願第60/423,507号「Allele-Specific RNA Interference(対立特異的RNA干渉)」、および2003年7月18日に提出された米国特許仮出願60/488,283号「Allele-Specific RNA
Interference(対立特異的RNA干渉)」の利益を主張する。参照された特許仮出願の内容全体は、引用をもって本願明細書に援用するものとする。
米国政府は、国立衛生研究所(NIH)により授与された認可番号GM62862およびGM53874、ならびに国立神経疾患・卒中研究所(NINDS)により授与された認可番号NS35750にしたがった本願発明の一定の権利を有する可能性がある。
優性の機能獲得型遺伝子によって引き起こされる疾患は、1つの突然変異体と1つのその遺伝子の野生種コピーを有するヘテロ接合体に生じる。この種の疾患で最も知られるものの一部は、共通の神経変性疾患で、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、および筋萎縮性側策硬化症(ALS; 「ルー・ゲーリック病」)が含まれる(Taylor
et al., 2002)。これらの疾患では、突然変異タンパク質が細胞変性を引き起こす正確な経路が明らかになってはいないが、突然変異タンパク質となる細胞毒性の起源は知られている。
1999)を含む様々な異常、ならびに、CNSおよびその他の系への、興奮毒性、虚血、神経毒、および放射線照射など各種の有害な攻撃への高い感受性を生じる。突然変異種の毒性、および野生種タンパク質の機能的重要性を考えると、この疾患のための理想的な治療法は、前記突然変異タンパク質の発現を選択的に阻害する一方で野生種の発現を維持することである。
本願発明は、優性の機能獲得型疾患を治療する新規の方法に関連する。特に、本願発明は、機能獲得型遺伝子から転写された突然変異mRNAを選択的に破壊し、それによりそのような遺伝子によってコードされる突然変異タンパク質の産生を抑制する方法を提供する。本願発明は、低分子干渉RNA(siRNA)および低分子ヘアピンRNA(shRNA)の両方のがたとえばG85R SOD1またはG93A SOD1などの突然変異対立遺伝子の発現を選択的に阻害する一方で、1ヌクレオチド特異性で前記野生種タンパク質の発現を阻害するようにデザインすることができるという発見に、部分的に基づいている。
2001; Elbashir et al.2001c)。本願発明の2本鎖siRNAまたはshRNA発現ベクタを用いて、たとえばSOD1突然変異タンパク質などの毒性突然変異遺伝子の発現を選択的にサイレンシングし、それにより野生種SOD1対立遺伝子を継続的に機能させることができる。
別の局面では、本願発明は本願発明のsiRNAおよび/またはshRNAを含む治療用組成物、および薬学的に許容な担体を提供する。
銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)遺伝子の突然変異は、筋萎縮性側策硬化症のサブセット、運動ニューロンの変性を来す神経変性疾患、麻痺および死を引き起こす(Brown and Robberecht, 2001;Siddique and Lalani, 2002)。突然変異SOD1が毒性を獲得することによって運動ニューロン変性を引き起こすことは、既知である。しかし、この毒性の分子機序も、運動ニューロンの死滅を来す機序も、いずれも解明されていない。疾患の機序の理解が不十分なことから、合理的なデザインの治療法が着実で有効な転帰を生じたことがない。その一方で、運動ニューロンを死滅させる毒性が突然変異したタンパク質に起因することから(Cleveland and Rothstein, 2001)、突然変異タンパク質の減少によって、その疾患を緩和または予防できるはずである。RNA干渉(RNAi)技術を用いてこの目的を達成することができる。
2001; Elbashir et al.2001c)。本願発明の2本鎖siRNAまたはshRNA発現ベクタを用いて、たとえばSOD1突然変異タンパク質などの毒性突然変異遺伝子の発現を選択的にサイレンシングし、それにより野生種SOD1対立遺伝子を継続的に機能させることができる。
2002)。RNAiの方法論は、培養哺乳類細胞にも拡張されている(Caplen et al, 2001; Elbashir
et al., 2001)。このアプローチは、RNAi経路の中間体であるsiRNAが、当該siRNA配列に相当するmRNAの分解を引き起こすことがあるという発見を活用している。さらに、in vivoにおいて転写されたshRNAは、shRNAステムの配列に相補的な標的RNAの分解を引き起こすことがある。それは、細胞内でshRNAがsiRNAに加工されるためである(Paul et al., 2002; Lee et al., 2002;
Paddison et al., 2002; Sui et al., 2002; Yu et al., 2002; McManus et al., 2002;
Zeng et al., 2002; Brummelkamp et al., 2002; Miyagishi et al., 2002; Jacque et al.,
2002)。本願出願人らは、siRNA 2本鎖またはshRNAを発現するウイルスを用いて、突然変異体率遺伝子の発現を選択的に阻害しながら、同時に発現する野生種対立遺伝子の発現を保護することができることを実証する。
Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310に記載されているなどのその他のヘテロ周期性修飾ヌクレオチド類似体も含まれる。
アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどから選択される化学基と置換してもよい。その他の可能な修飾には、米国特許第5,858,988号および6,291,438号に記載されるものが含まれる。
Apr. 10(2):117-21、
Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000
Oct. 10(5):333-45、 Stein, Antisense
Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25、 Vorobjev et al. Antisense
Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85、 および米国特許第5,684,143号などに記載される目的の機能を実施できるようなその他の置換を行うことによって修飾してもよい。上に参照した修飾の一部は、好ましくは、たとえばin vivo またはin vitroにおいて前記類似体を含むポリヌクレオチドの加水分解速度を低減させる。
本願明細書に記載の「単離されたRNA」(たとえば「単離されたsiRNA」または「単離されたsiRNA前駆体」)という用語は、組換え技術によって生成した場合には他の細胞物質または培養培地を実質的に含まない、または化学的に合成された場合には、化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない、RNA分子を意味する。
筋萎縮性側策硬化症(ALS)は、ルー・ゲーリック病としても知られ、大脳皮質、脳幹、および脊髄の運動ニューロンが関与する、進行性、致死性の神経変性障害である(Hirano, A., 1996, Neurology 47 (Suppl. 2), S63-S66)。この疾患は、たとえばSOD1など、前記遺伝子の1つの突然変異種と1つの野生種コピーを有する人間において生じる、優性の機能獲得型遺伝子によって引き起こされる。SOD1突然変異を引き起こすALSは、前記タンパク質中の1つのアミノ酸を変化させる1ヌクレオチド点突然変異である。この疾患はさらに、進行性の運動ニューロン変性によって特徴づけられ、麻痺、運動神経および呼吸機能の完全喪失、および最終的には最初の臨床徴候の出現から2乃至8年(発症後の平均期間は3年)に死に至るALSは、患者の10%が遺伝子に由来しており、症例の90%が特発性である。染色体21 q22-1に位置する銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)をコードする遺伝子における点突然変異は、家族性の症例の20%の病変に関与している(Rosen et al., Mutations in Cu/Zn
superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis,
Nature, 362, 59-62, 1993, review in Rowland, Amyotrophic lateral sclerosis:
Human challenge for neuroscience, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1251-1253,
1995)。したがって、欠陥のあるSOD1は、運動ニューロン死に関連しており、家族性筋萎縮性側策硬化症の理解および可能な治療についての示唆を有する。
SOD1は銅原子1個、亜鉛原子1個を含む金属酵素で、ホモ二量体として細胞質の中に存在している。銅は酵素活性に必要であり、その一方で亜鉛はタンパク質の構造を安定化させる(Hirano, A. 1996, Neurology 47 (Suppl. 2). S63-S66)。SOD1はすべての真核細胞で発現し、マンガン依存性ミトコンドリアSOD(SOD2)および銅/亜鉛細胞外(SOD3)を含む、3種類のSOD酵素のファミリの1種類である(I Fridovich, 1986,
"Superoxide dismutases," Advances in Enzymology 58: 61-97)。SOD1の主な天然の機能は、スーパーオキシドジスムターゼで、スーパーオキシド(O2 -)が過酸化水素(H2O2)および酸素に転換する。下流酵素のカタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ(H2O2 を水と酸素に転換する)とともに、SOD1は細胞のフリーラジカルを解毒する。この機能の重要性は、生殖性の減退(Matzuk et al., 1998)、運動軸索障害(Shefner et al., 1999)、蝸牛有毛細胞の加齢に関連する喪失(McFadden et al., 2001)、および神経筋接合部シナプス(Flood et al., 1999)を含む、SOD1遺伝子が欠損するマウスの様々な異常、ならびに、軸索損傷(Reaume et al., 1996)、虚血(Kondo
et al., 1997; Kawase et al., 1999)、溶血血液の曝露(Matz et al., 2000)、および放射線照射(Behndig et al., 2001)など各種の有害な攻撃への高い感受性によって理解される。突然変異タンパク質の毒性、および野生種の機能的重要性を考えると、ALSの理想的な治療法は、前記突然変異SOD1タンパク質の発現を選択的に阻害する一方で野生種SOD1タンパク質の発現を維持することである。
100を超えるSOD1突然変異が特定されている。これらの突然変異の大半が、アミノ酸のスーパーオキシドジスムターゼの酵素鎖において1アミノ酸の置換を生じる。最も頻発する置換は、アミノ酸鎖の4位で生じるバリンによるアルギニンの置換(Arg4Valとも書く)であって、1型筋萎縮性側策硬化症を罹患するアメリカ人患者の50%に生じる。
RNAiは2本鎖RNA(dsRNA)が動物および植物細胞において相同的なmRNAの配列特異的分解を誘発する著しく有効なプロセスである(Hutvagner and Zamore
(2002), Curr. Opin. Genet. Dev., 12, 225-232; Sharp (2001), Genes Dev., 15,
485-490)。哺乳類細胞では、RNAiは低分子干渉RNA(siRNA)の21ヌクレオチド(nt)2本鎖 (Chiu et al. (2002), Mol.
Cell., 10, 549-561; Elbashir et al. (2001),
Nature, 411, 494-498)、またはDNAテンプレートを用いてRNAポリメラーゼIIIプロモータとともにin vivoで発現するその他のdsRNA(Zeng et al. (2002), Mol. Cell, 9, 1327-1333; Paddison et al. (2002), Genes Dev.,
16, 948-958; Lee et al. (2002), Nature Biotechnol., 20, 500-505; Paul et al.
(2002), Nature Biotechnol., 20, 505-508; Tuschl, T. (2002), Nature Biotechnol.,
20, 440-448; Yu et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(9), 6047-6052;
McManus et al. (2002), RNA, 8, 842-850; Sui et al. (2002), Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 99(6), 5515-5520.)によって引き起こすことができる
本願発明は「低分子干渉RNA分子」(「siRNA分子」または「siRNA」)、前記siRNA分子を作製する方法、および前記siRNA分子を使用する方法(たとえば研究および/または治療方法)を特徴とする。本願発明のsiRNA分子はセンス鎖および相補的なアンチセンス鎖からなる2本鎖であって、アンチセンス鎖はRNAiを媒介するのために十分な標的mRNAへの相補性を有している。好ましくは、前記鎖は、鎖がアニーリングされる時に2本鎖末端の片方または両方に1、2、または3残基のオーバーハングが生じるように、鎖末端に、アラインメントされない(つまり相補的な塩基が反対側の鎖に生じない)少なくとも1、2、または3塩基があるようにアラインメントされる。好ましくは、前記siRNA分子は約10乃至50またはそれを超えるヌクレオチドの長さを有し、つまり、各鎖が10乃至50ヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)を含むより好ましくは、前記siRNA分子は、各鎖にたとえば16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30 ヌクレオチドなど約16乃至30の長さを有し、当該分子において片方の鎖が標的領域に実質的にたとえば少なくとも80%(またはそれを超える、たとえば85%、90%、95%、または100%)相補的であって、たとえば3、2、1または0のミスマッチヌクレオチドを有し、当該標的領域が野生種と突然変異の対立遺伝子の差が少なくとも1塩基対はある、たとえば機能獲得型突然変異を含む標的領域などの標的領域であって、もう片方の鎖は第1の鎖と実質的に同一である。
当業に知られる任意の方法を用いて、標的候補と適切なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラットなど)を比較し、他のコード配列に顕著に相同性を有する任意の標的配列を考慮から除外する。そのような配列相同性の探索に使われる1つの方法はBLASTとして知られ、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで入手することができる。
評価基準に合う1つ以上の配列を選択する。
さらに、siRNAのデザインおよび使用についての一般的な情報は、マックスプランク生物物理化学研究所のウエブサイトで入手できる「The siRNA User Guide(siRNAユーザーガイド)」の中に見つけることもできる。
のグループから選択される。
Science 296:550-553 (2002); Lee et al, (2002). supra; Miyagishi and
Taira, Nature Biotechnol. 20:497-500 (2002); Paddison et al. (2002), supra;
Paul (2002), supra; Sui (2002) supra; Yu et al. (2002), supra。
2本差を発現させる方法は当業に知られており、機能的な2本鎖siRNAを発現することが可能な哺乳類Pol III プロモータシステム(たとえばH1またはU6/snRNAプロモータシステム(Tuschl (2002), supra)
)が含まれる(Bagella et
al., J. Cell. Physiol. 177:206−213 (1998); Lee et al. (2002), supra;
Miyagishi et al. (2002), supra; Paul et al. (2002), supra;
Yu et al. (2002), supra; Sui et al. (2002), supra)。RNA Pol IIIによる転写終了は、一連のDNAテンプレートの連続する4つのT残基で生じ、特定の配列においてsiRNA転写物を終了させるメカニズムを提供する。前記siRNAは5’-3’および3’-5’の方向に向いた前記標的遺伝子の配列に相補的であって、siRNAの2本鎖は同一の作製物または別々の作製物中に発現することができる。H1またはU6 snRNAプロモータによって駆動され、細胞内で発現するヘアピンsiRNAは、標的遺伝子の発現を阻害することができる(Bagella et al. (1998),
supra; Lee et al.
(2002), supra; Miyagishi et al. (2002), supra; Paul et
al. (2002), supra; Yu et al. (2002), supra; Sui et
al. (2002) supra)。T7プロモータの制御下にあるsiRNA配列を含有する作製物もまた、T7 RNA ポリメラーゼを発現するベクタを有する細胞に同時トランスフェクトされると、機能性siRNAをつくる。1つの作製物は、同一の遺伝子または複数の遺伝子に方向付けられている突然変異SOD1をコードする遺伝子の複数の領域など、siRNAをコードする複数の配列を含有することがあり、たとえば、別々のPolIIIプロモータ部位によって駆動することができる。
Release 53(1-3):137-43 (1998) (ナノ粒子に結合させた核酸について記載)、 Schwab et al., Ann. Oncol.
5 Suppl. 4:55-8 (1994) (挿入剤、疎水基、ポリカチオンPACAナノ粒子に結合させた核酸について記載)、およびGodard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995) (ナノ粒子に結合させた核酸について記載)の方法を用いるなど、当業に知られる方法によって実現することができる。
配列番号4, アンチセンス、またはガイド), 突然変異 siRNA P9 (配列番号1, センス; 配列番号2 アンチセンス、またはガイド), SOD1 野生種標的(配列番号7), SOD1 突然変異 標的(配列番号8), 野生種siRNA
P11 (配列番号9 センス; 配列番号10, アンチセンス、またはガイド), 野生種siRNA P10 (配列番号11, センス; 配列番号12, アンチセンス、またはガイド), 野生種siRNA P9 (配列番号13, センス;
配列番号14, アンチセンス、またはガイド)が含まれる図1に記載の配列、G93A SOD1 siRNA (SEQ ID
NO:16)が含まれる図3に記載の配列、およびその対立遺伝子変異種などを含む、またはそれらからなっていてもよい。
本願明細書に記載の細胞または組織全体に導入された組換えRNA前駆体によって、望ましいsiRNA分子の産生が引き起こされるだろう。そこで、そのようなsiRNA分子は、切断および破壊のための特異的なmRNA配列に結合し、標的とするRNAi経路の内因性タンパク質要素に関連するだろう。このようにすれば、組換えRNA前駆体から作製されたsiRNAが標的とするmRNAは、前記細胞および組織から大幅に減少し、前記細胞または組織中のmRNAによってコードされるタンパク質の濃度が減少するだろう。
本願発明のsiRNA分子は薬学的組成物に組み込むことができる。そのような組成物には、典型的には、核酸分子および薬学的に許容な担体が含まれる。本願明細書に記載の「薬学的に許容な担体」という用語は、薬学的投与に適合する、食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、ならびに等張および吸収遅延剤などを意味する。補助的な活性化合物も、当該組成物に組み込むことができる。
(2002), Nature, 418(6893), 38-9 (流体力学トランスフェクション); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006-10 (ウイルス媒介送達); またはPutnam
(1996), Am. J. Health Syst. Pharm.53(2), 151-160, 誤字 Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3), 325 (1996)に記載の方法が限定されずに含まれる、当業に知られる方法を用いてトランスフェクションまたはインフェクションによって投与することができる。
205-10に記載されているものなど、経鼻送達も可能である。リポソーム(たとえば米国特許第6,472,375号に記載されているなど)およびマイクロカプセル封入も使用することができる。生分解性標的化可能微粒子送達システムも使用することができる(たとえば米国特許第6,471,996号に記載されているなど)。
(2002)に記載の方法が限定されずに含まれる、当業に知られる方法を用いて、たとえばウイルスベクタ、レトロウイルスベクタ、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクタなどの発現作製物に挿入することができる。発現作製物は、たとえば吸入、経口、静脈内投与、局所投与(米国特許第5,328,470号参照)、または定位固定注射(たとえばChen et al. (1994), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3054-3057参照)によって対照に送達することができる。前記輸送ベクタの薬学的調製には許容な希釈剤に入れたベクタが含まれてもよく、または輸送用賦形剤が埋め込まれた徐放性基質を含んでもよい。代替的には、たとえばレトロウイルスベクタなど、完全な輸送ベクタを組換え細胞から無傷で作製できる場合、前記薬学的調製物は遺伝子送達システムをつくる1つ以上の細胞を含むことができる。
Brummelkamp et al. (2002), Science, 296, 550-553; Lee et al, (2002). supra;
Miyagishi and Taira (2002), Nature Biotechnol., 20, 497-500; Paddison et al.
(2002), supra; Paul (2002), supra; Sui (2002) supra; Yu et
al. (2002), supra。
本願発明は、機能獲得型突然変異タンパク質によって、全体的にまたは部分的に引き起こされた疾患または障害のリスクがある(または感受性がある)を治療するための予防および治療方法の両方を提供する。ある実施態様では、前記疾患または障害は優性の機能獲得型疾患である。好ましい実施態様では、前記疾患または障害はSOD1遺伝子の改変、特にSOD1突然変異対立遺伝子における点突然変異に関連する疾患であって、臨床徴候にはALS患者に認められるものが含まれるような、SOD1遺伝子(構造または機能)またはSOD1タンパク質(構造または機能または発現)に異常を引き起こす疾患である。
材料および方法
RNAおよびDNA作製物
21本のヌクレオチド1本鎖RNA(図1)は、ダーマコン・リサーチ社から購入し、製造者の指示に従って脱保護して記載の通りアニーリングした(Nykanen et al., 2001)。野生種および突然変異SOD1-GFP融合タンパク質を作製するために、SOD1 wt(Genbank Accession No. ジェンバンク受入番号NP_000445; 図7; 配列番号18)、SOD1G85R、およびSOD1 G93A(配列番号16)cDNAを、pCMV/myc/mito/GFP(インビトロゲン社)のPmlI およびPstI部位の間でPCRクローニングした。このクローニングステップによって、ミトコンドリア標的配列が削除された。mycタグ付き野生種SOD1を作製するために、SOD1wt cDNA (配列番号17)をpCMV/myc/mito/GFPのPstIおよびXhoI部位の間でPCRクローニングした。ミトコンドリア標的配列は、BssHIIおよびPmlIで切断し、平滑末端化ライゲーションすることによって削除した。すべての作製物を、シーケンシングによって確認した。DsRed (pDsRed2-C1) は、クロンテック社(カリフォルニア州パロアルト)から購入した。U6-G93A は上述の通り作製した(Sui et al., 2002)。3’ブロックsiRNAは標準技術によって合成された。
野生種または突然変異SOD1のいずれかをコードする配列を有する560ヌクレオチドヒトSOD1標的RNAを、既報の通り調製する(Zamore et al., 2000)。標的切断は、濃度約5nMのショウジョウバエ胚ライセートを含有する標準in vitro RNAi反応において25乃至100nM siRNAを有する5’32P-キャップ放射標識標的をインキュベートすることによって決定した。
Hela細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)、100ユニット/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンをDMEMならびにDMEDおよびOpti-MEM(1:1)に入れたN2A 細胞の両方ともに添加し、その中で培養した。
トランスフェクションの24時間前、細胞(集密度70乃至90% )を倍散で脱離させ、6穴プレートに移して、抗生物質を含まない新鮮培地で培養した。トランスフェクションは、リポフェクタミン2000(インビトロゲン社)を、製造者の指示に従って用いて行った。トランスフェクションに用いた作製物の量は、突然変異または野生種SOD1-GFPおよびDsRedプラスミドそれぞれ4μg 、siRNAを4x10-11または4x10-12モル、ならびにU6-G93Aを20または8μgである。
生後6乃至8週間のマウス24匹を3つのグループに分けた。第1のグループはshRNAベクタの投与を受けておらず、第2のグループは20μgの空ベクタの投与を受け、第3のグループはSOD1 G93A (配列番号16)に対するU6-hpRNA ベクタ20μgを投与された。すべてのグループは、mycでタグしたヒト野生種SOD1 (SEQ ID
NO: 7) 20μg、およびGFPでタグしたSOD1 20μgの両方が投与された。前記ベクタを合計体積がマウス1匹あたり2.5mlになるように、リンガ液で希釈した。マウスをアバーチン(240mg/kg)で麻酔し、前記ベクタを26ゲージ針を用いて10病未満で尾部静脈から注入する。注入から48時間後、肝臓から血液を除去するために、動物を5ml PBSで灌流した。肝臓を切り取り、素速くドライアイス上で冷凍させた。サンプルを、1% SDS、1mM DTT、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、およびプロテアーゼ阻害物質カクテル(シグマ社1:100希釈)を含有する25mM PBSバッファ(pH 7.2)中に入れ、携帯用ポリトロン(プロサイエンティフィック社)を用いてホモジナイズした。
タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイキット(ピアース社、イリノイ州ロックビル)を用いて決定した。Hela細胞タンパク質25μg、または100μg肝タンパク質を15% SDS-PAGE 上で分離し、ジーンスクリーン・プラス(パーキンエルマー社)上に移動させた。ウサギ抗SOD1(バイオデザイン社)またはヒツジ抗SOD1は1次抗体、およびHRP標識ヤギ抗ウサギIgG(アマシャム社)またはロバ抗ヒツジIgGは2次抗体だった。タンパク質のバンドの可視化には、スーパーシグナル・キット(ピアース社)およびコダック・デジタルイメージステーション440CFを用いた。そのバンドの強度の定量化には、コダック1Dソフトウェアを用いた。
例I乃至VIIIは、siRNAが、まずsiRNA活性をショウジョウバエ胚ライセートを含む無細胞RNAI反応でテストし、次に培養哺乳類細胞中の活性1ヌクレオチド選択性siRNAを分析することによって、1ヌクレオチド選択性を有するようにデザインされたことを明らかにする。結果は、2つのmRNAの差が1ヌクレオチドしかなく同一の細胞に存在するとしても、21ヌクレオチドsiRNAおよびshRNAの両方とも、選択的に突然変異SOD1(配列番号8)の発現を阻害するが、野生種SOD1(配列番号7)ではそのようなことがないようにデザインすることができることを示した。したがって、RNAiはとりわけ、優性機能獲得型突然経によって生じる疾患の治療法として有用である。
それぞれ野生種または突然変異mRNAのいずれかを狙う3つのsiRNA
2セット(図1A、配列番号8)を、標的の切断部位またはその近傍のミスマッチが要求されるA型らせん形を乱しているかどうかをテストするように方向付けた。グアニン256(たとえばジェンバンク受入番号K00056などの、翻訳開始に関連するG256)SOD1の対立遺伝子がシトシンに突然変異し、グリシン-アルギニン突然変異(G85R) を生じているSOD1の対立遺伝子を選択した。突然変異したヌクレオチドは、SOD1 mRNA切断の予測された部位の近傍、すなわち、siRNAのアンチセンス鎖の5’末端に対して9位(P9)、10位(P10)、11位(P11)(図1A)に位置した。SOD1 mRNA切断のこの予測された部位は、前記siRNAとRNAiエンドヌクレアーゼの活性部位の中または近傍の非同族標的RNAとの間にミスマッチを配置する。これらのsiRNAのテストは、in vitroにおいてRNAを再利用する、確立されたショウジョウバエ胚性ライセートで行った(Zamore et al., 2000; Tuschl et al., 1999)。予想通り、6つのsiRNAのそれぞれが相当する標的RNAを切断したが、その有効性の差は劇的だった。たとえば、P11突然変異種および野生種siRNA(配列番号6, 10)は、それぞれの標的RNAを効率的に切断できなかった。反対に、P10突然変異種siRNA(配列番号4)は前記突然変異種標的RNAを効率的に切断した。完全長突然変異種SOD1標的mRNAの切断は、相当する約288ヌクレオチドの5’切断産生物の蓄積によって行われ、結果は、前記標的mRNAの非特異的分解ではなくRNAiを示唆している。siRNAの欠如下、またはルシフェラーゼに対するsiRNAの存在下において、前記突然変異標的RNA(配列番号8)はショウジョウバエ胚性ライセート中で安定だった(データは非表示)。標的RNAの切断および5’切断産生物の蓄積のデータは両方とも、1つの指数方程式に良くフィットし、この反応は擬1次動力学にしたがっていることを示している(図1B)。
6つのsiRNAの特異性を決定するために、突然変異SOD1配列(配列番号8)に相当する各siRNAを、野生種SOD1 RNA (配列番号7)を切断する能力についてテストし、各野生種siRNAについて突然変異RNAを切断する能力をテストした。すべてではないが一部のsiRNA 2本鎖が、効率的に、完全にマッチする標的と1ヌクレオチドのミスマッチを有する標的を区別した。たとえば、突然変異と野生種のsiRNA(配列番号6、10)の両方のP11は、完全にマッチした標的RNAもミスマッチの標的RNAのいずれにも効率的な切断を惹起しなかった(図1A)。したがって、これらのsiRNA配列は本質的にRNAiを惹起する能力が乏しい。反対に、P9 (配列番号 14)およびP10野生種(配列番号12) siRNAは、相当する野生種標的の迅速な切断を惹起しただけでなく、突然変異RNAの著しい切断も生じた(図1A)。これらのsiRNAはRNAiを惹起する優れた能力があるが、乏しい選択性を示す。P10突然変異種siRNA(配列番号4)が、突然変異種および野生種SOD1 RNA (配列番号7、8)を効率的および堅固に識別し、突然変異RNAを野生種よりもはるかに効率的に切断することが示された。最も重要なのは、P10突然変異siRNA(配列番号4)は、突然変異および野生種SOD1 mRNA 標的を実質的に完全に識別することが示された(Fig. 1A)。このP10突然変異siRNAは、突然変異SOD1標的の切断を効率的に媒介したが、野生種SOD1 mRNAの切断はほとんど媒介せず(Fig. 1B)、このsiRNAは治療用途に理想的であることが示唆された。
哺乳類細胞において、無細胞反応が正確、効率的、および選択的にsiRNAを予想できるかどうかをテストするために、カルボキシ末端を融合させたGFPを有する野生種または突然変異種SOD1 G85Rを発現したプラスミド作製物を作製した。各作製物を、dsRed発現ベクターを用いてHela細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション対照とした。突然変異または野生種のSOD1 (配列番号7、8)のいずれかの発現を、蛍光標示式細胞分取法(FACS)で緑色および赤色細胞を定量することによって監視した。P9、P10およびP11 siRNAを相当する突然変異種または野生種標的でトランスフェクションしたところ、遺伝子発現を抑制したが、効率および選択性には差があった(図2)。反対に、ホタルルシフェラーゼに相補的なsiRNAによるコトランスフェクションでは、突然変異または野生種SOD1の発現のいずれも抑制しなかった(図2)。野生種に対するsiRNA p10以外のすべてのsiRNAは1ヌクレオチドミスマッチを有するmRNAを抑制しなかったが、野生種に対するsiRNA
p10は野生種および突然変異SOD1の発現の両方を効率的に抑制した(図2)。この結果は全般的にin vitroデータ(図1)と一致しており、すべてではないが一部のsiRNAは1ヌクレオチドの差を有するmRNA標的を効率的に区別することができることを示唆した。
最近、shRNAがin vivoにおいてRNAiを惹起することができることが示された。突然変異種SOD1に対するshRNAが、選択的に野生種SOD1発現ではなく突然変異種SOD1の発現を阻害することができるかどうかをテストするために、別の疾患の原因となる突然変異種SOD1
G93A に相同なshRNA(ヌクレオチド281位のGをCに交換し、shRNAと野生種SOD1G:Gミスマッチを配置するヌクレオチド交換;配列番号16)を、RNAポリメラーゼIII(U6)プロモータの制御下において合成するプラスミドを作製した(Sui et al., 2002)。結果から、野生種または突然変異SOD1-GFPプラスミドのいずれかとコトランスフェクトした場合、この作製物を用いて、培養細胞中の突然変異種SOD1の1ヌクレオチド選択的RNAiを惹起することができるということが示された(図3)。
突然変異種の選択的阻害が神経細胞で実現するかどうかをテストするために、野生種および突然変異SOD1-GFP作製物を、SOD1 G85R に対するsiRNA P10、またはSOD G93A (配列番号16)に対するshRNA合成ベクタのいずれかを用いて、神経芽細胞腫細胞株N2aにコトランスフェクトした。Hela細胞と同様に、合成siRNAおよびshRNA作製物が、N2a細胞における突然変異SOD1発現の選択的阻害を方向付けた(図4A、B)。
同一の細胞に突然変異および野生種SOD1 mRNA1が両方とも存在する場合、ヌクレオチド選択的siRNAがその突然変異および野生種SOD1を識別できるかどうかを明らかにするために、Hela細胞にP10 siRNAおよび突然変異SOD1 G85R-GFPでトランスフェクトした。抗SOD1抗体で免疫ブロットすることによって、トランスフェクト融合SOD1-GFPおよび内因性野生種ヒトSOD1の両方の検出が可能になった。内因性野生種SOD1発現の約50%阻害は、約50%のトランスフェクション効率を反映した。P10野生種siRNAに対して、突然変異種に対するP10 siRNAは2種類の異なる用量において突然変異種の発現を阻害したが、内因性野生種SOD1の発現には効果がなかった。
選択的阻害をin vivoで生じさせることができるかどうかをテストするために、SOD1レポータおよびshRNAプラスミドを、水力学的トランスフェクションプロトコルを用いてマウスにトランスフェクトした。突然変異SOD1 G93A-GFP プラスミドおよびmycでタグした野生種ヒトSOD1(ゲル上においてトランスフェクトしたヒトSOD1を内因性マウスSOD1からよりよく分離することができる)をU6空ベクトルまたはU6-G93Aベクタでコトランスフェクトした。SOD1
G93A-GFP およびSOD1mycの肝臓における発現を、ウエスタンブロットによって検証した。結果から、U6-G93Aで選択的にコトランスフェクトする場合のみ、G93A発現が減少することが示された(図6)。
突然変異SOD1に対するshRNAがin
vivoにおいて突然変異SOD1の発現を抑制することができるかどうかを明らかにするために、RNAポリメラーゼIII(Pol
III)プロモータU6の制御下におけるSOD1G93A に対するshRNAを発現するトランスジェニックマウス(U6-G93A マウス)を、C57BL/6JおよびSJLのハイブリッド背景において作製した。
導入マウスと交雑させた。
shRNA作製物を、2種類の遺伝子を導入したトランスジェニックマウスから採取した細胞に発現させた。ウエスタンブロット法を用いて測定した結果、前記U6-G93A
shRNA 作製物は、2種類の遺伝子を導入したトランスジェニックマウスにおける突然変異種SOD1G93A
の発現(U6-G93A shRNA 作製物および突然変異種SOD1G93Aを発現)をサイレンシングすることが明らかになった。
RNAiを用いた優性突然変異種ALS遺伝子を選択的にサイレンシングする可能性を調べた。野生種または突然変異種のSOD1のいずれかにマッチする複数のsiRNAを用いた結果、in vitroにおいて、突然変異種SOD1 G85R に対するsiRNAは前記突然変異種を切断するが、野生種SOD1 RNAの切断は効率的ではないことが示された(図1)。さらに、同一の細胞に突然変異および野生種SOD1タンパク質の両方が存在する場合でも(図4)、これらのsiRNAは、哺乳類の細胞において突然変異SOD1タンパク質発現を選択的に阻害するが野生種については阻害しなかった(図2)。in vivoにおいてsiRNAに処理されたヘアピンを発現するベクタも、マウス肝において突然変異SOD1の発現を選択的に阻害するが、野生種SOD1の発現は阻害しなかった。これらの結果から、優性突然変異対立遺伝子の選択的阻害はRNAiを用いて実現することができ、in vitroまたはin vivoにおいて、前臨床スクリーニングによって最適化したsiRNAおよびshRNA配列を同定することができることが明らかになった。
第2に、完全にマッチした標的RNAと1ヌクレオチドのミスマッチを有するRNAの間の選択性の差が、使用された6つのsiRNAの中で認められた。たとえば、野生種P10 siRNAは乏しい選択性を付与した。野生種P10は、無細胞アッセイにおいて野生種および突然変異SOD1 RNA の両方を切断し、哺乳類動物の両方の対立遺伝子の発現を高い効率で阻害した。反対に、突然変異SOD1に対して方向付けられたP10 siRNAは最高の選択性を付与した。それは突然変異SOD1 RNA を切断し、無細胞アッセイにおいて突然変異SOD1の発現を阻害し、哺乳類細胞における突然変異SOD1の発現は阻害したが野生種SOD1は阻害しなかった(図1乃至6)。
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本願発明は、発明の詳細な説明に関連して説明されているが、上述の説明は具体例を示すことを意図しており本願発明の範囲を制限することは意図しておらず、それは添付の特許請求の範囲によって定義されると理解される。その他の局面、利点、および改善点は、添付の特許請求の範囲内である。
Claims (20)
- 遺伝子の少なくとも2つの異なる対立遺伝子を含む細胞中の標的対立遺伝子の発現を阻害する方法であって、当該方法が前記標的対立遺伝子に特異的なsiRNAを前記細胞に投与するステップを含む、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、当該方法において、前記標的対立遺伝子が、優性の機能獲得型突然変異に関連する障害と相関する、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、当該方法において、前記障害が筋萎縮性軸索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、およびパーキンソン病からなるグループから選択される、方法。
- 優性の機能獲得型突然変異対立遺伝子の存在と相関する疾患を有する対象の治療方法であって、当該方法が前記突然変異対立遺伝子に特異的なsiRNAを治療上有効な量、前記対象に投与するステップを含む、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、当該方法において、前記siRNAが機能獲得型突然変異を標的とする、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、当該方法において、前記障害が筋萎縮性軸索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、およびパーキンソン病からなるグループから選択される、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、当該方法において前記疾患は筋萎縮性側策硬化症である、方法。
- 請求項7に記載の方法であって、当該方法において前記対立遺伝子はSOD1である、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、当該方法において、前記突然変異対立遺伝子は点変異を含む、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、当該方法において、前記点突然変異はグアニン:シトシン突然変異である、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、当該方法において、前記突然変異はG256Cである、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、当該方法において、前記突然変異はG281Cである、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、当該方法において、前記siRNAは図1Aに記載の配列を含む、方法。
- 図1Aに記載の配列を含むsiRNA。
- 図1Aに記載の前記配列を含むp10突然変異siRNA。
- 図1Aに記載の前記配列を含むp9突然変異siRNA。
- 図3Aに記載の前記配列を含むG93A SOD1 shRNA 。
- 請求項13に記載のshRNAを含む発現作製物。
- 請求項10乃至12に記載の前記siRNAを含む治療用組成物、および薬学的に許容の担体。
- 請求項13に記載の前記shRNAを含む治療用組成物、および薬学的に許容の担体。
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