CN116284308B - 多肽lgtx-f2突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多肽LGTX‑F2突变体及其应用，该突变体为天然LGTX‑F2氨基酸第2位、第7位、第10位和第20位处的单个氨基酸替换带正电荷氨基酸，以及第45～65位氨基酸的至少一位氨基酸删除，获得的多肽LGTX‑F2突变体在不同pH，温度，金属离子，溶剂和酶条件下稳定性提高，解决了多肽在体内的稳定性差的缺陷，为多肽LGTX‑F2在开发新型止血药物中具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及多肽领域，具体涉及多肽LGTX-F2突变体，还涉及多肽LGTX-F2突变体在制备止血药物中的应用。
背景技术
大出血或出血过多是临床手术中的高死亡原因之一，局部止血药物在深度出血或复杂出血过程中往往不能解决问题，需要激发机体的深度凝血才能提高止血的效率。公开号为CN108822196A的中国专利公开了格式狼蛛毒液中发现的一种活性多肽LGTX-F2，研究发现LGT X-F2具有明显的凝血活性，能够在制备凝血药物中应用。而公开号为CN114107353A的中国专利公开了利用高效表达载体的方式解决了LGTX-F2的制备产率低的问题。但是还结构稳定性问题，如易降解和半衰期短的缺陷，限制了其在临床中的应用。多肽药物的稳定性是制约其发展的一个重要因素。
因此，亟需对LGTX-F2的进行改造，延长蛋白的半衰期，来增加多肽的稳定性，减少多肽药物的注射频率。
发明内容
有鉴于此，为了增强多肽结构的稳定性，科研人员致力于通过对多肽结构进行改造和增加屏障，来实现稳定性的优化。对多肽进行改造是将多肽改造成环型，修饰氨基酸骨架，插入非天然氨基酸，替换个别氨基酸，或删除氨基酸序列；本发明的目的之一在于提供一种多肽LGTX-F2突变体；本发明的目的之二在于提供所述多肽LGTX-F2突变体在制备止血药物中的应用；本发明的目的之三在于提供一种止血药物；本发明的目的之四在于提供表达所述多肽LGTX-F2突变体的重组载体；本发明的目的之五在于提供表达所述多肽LGTX-F2突变体的宿主；本发明的目的之六在于提供制备所述多肽LGTX-F2突变体的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、多肽LGTX-F2突变体，所述多肽LGTX-F2突变体为天然LGTX-F2氨基酸第2位、第7位、第10位和第20位处的单个氨基酸替换带正电荷氨基酸，所述天然LGTX-F2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明优选的，所述多肽LGTX-F2突变体还在在第45～65位氨基酸的至少一位氨基酸删除。
本发明优选的，所述多肽LGTX-F2突变体为天然LGTX-F2氨基酸第2位选自E，R，A中的任意一种；
或天然LGTX-F2氨基酸第7位选自A，E，H，K中的任意一种；
或天然LGTX-F2氨基酸第10位选自A，R，L中的任意一种；
或天然LGTX-F2氨基酸第20位A，E，H，K中的任意一种。
本发明优选的，所述第45～65位氨基酸的至少一位氨基酸删除为第46-65位QPKSHKYIEKVVDKTKTLVG删除；或第47-65位PKSHKYIEKVVDKTKTLVG删除；或第48-65选取KSHKYIEKVVDKTKTLVG删除；或第49-65选取SHKYIEKVVDKTKTLVG删除。
本发明优选的，所述多肽LGTX-F2突变体氨基酸如SEQ ID NO.2所示；或氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2、所述多肽LGTX-F2突变体在制备止血药物中的应用。
3、一种止血药物，其特征在于：包括所述多肽LGTX-F2突变体或其药学上可接受盐。
4、表达所述多肽LGTX-F2突变体的重组载体。
5、表达所述多肽LGTX-F2突变体的宿主。
6、制备所述多肽LGTX-F2突变体的方法，将编码多肽LGTX-F2突变体的核苷酸序列连入表达载体pET-26b-DsbC，诱导表达，纯化制得。
本发明的有益效果在于：通过对氨基酸替换，和无序结构的删除，明显提高了多肽LGT X-F2的稳定性，增强了抗降解能力，解决了多肽在稳定性差的缺陷，为多肽LGTX-F2在开发新型止血药物中具有重大意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为蛋白制备结果泳道1-3：SEQ ID NO：1破菌上清，多肽酶切前及酶切后；泳道4-6：SEQ ID NO：2破菌上清，酶切前及酶切后；泳道7-9：SEQ ID NO：3破菌上清，酶切前及酶切后；
图2为在不同pH下多肽序列稳定性；
图3为在不同温度下稳定性测试结果；
图4为在不同盐浓度稳定性测试结果；
图5为多肽抗蛋白酶降解测定结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
多肽LGTX-F2，三维结构解析得到，Ala1-Ala3从整个毒素中突出；Cys4-Gln47，包括1个β-sheet(magenta)，1个Ωloop(orange)and 1个β-hairpin；Lys47-Gly 64为一段无序结构，远离结构中间部分。其中N端1-30位氨基酸为活性部位，45位氨基酸起为无序结构，通过分子模拟和分子对接实验表明，所述N端活性部位中带正电荷氨基酸为关键作用位点，无序结构的去除对活性无明显影响。因此将N端活性部位的第2、7、10和20位突变为带正电荷氨基酸，并对无序结构氨基酸进行删减。
因此本发明对天然多肽LGTX-F2氨基酸序列进行突变，天然多肽LGTX-F2氨基酸序列如下：
AKACTPRLHDCSHDRHSCCRGELFKDVCYCFYPEGEDKTEVCSCQQPKSHKYIEKVV DKTKTLVG(SEQ ID NO.1)。
为了使LGTX-F2相较于天然多肽体内外的稳定性更好，具有更好的活性，从而更好的发挥其止血效果，将天然多肽选自2、7、10和20的序列位置处的单个氨基酸或多个氨基酸替换，以及包括从45号位置起不同位数的氨基酸删减，具体替换或删减如下：
X2选自E，R，A，K中的任意一种；
X7选自A，E，H，K中的任意一种；
X10选自H，R，K中的任意一种；
X20选自A，E，H，K中的任意一种；
X45-65选取QQPKSHKYIEKVVDKTKTLVG删除；
X46-65选取QPKSHKYIEKVVDKTKTLVG删除；
X47-65选取PKSHKYIEKVVDKTKTLVG删除；
X48-65选取KSHKYIEKVVDKTKTLVG删除；
X49-65选取SHKYIEKVVDKTKTLVG删除。
实施例1、多肽表达载体构建
根据大肠杆菌密码子使用偏好，对所表达的基因系列进行优化，采用化学方法合成下表1所示基因序列(上海生物工程公司)，经Not I和Xho I双酶切后连接入同样酶切且添加DsbC标签的原核表达载体pET-26b-DsbC(购自Novagen公司)，重组质粒进行DNA测序。
表1、替换或删减氨基酸序列及对应核酸序列
X2选自E，R，A中的任意一种；
X7选自A，E，H，K中的任意一种；
X10选自A，R，L中的任意一种；
X20选自A，E，H，K中的任意一种；
X45-65选取QQPKSHKYIEKVVDKTKTLVG删除；
X46-65选取QPKSHKYIEKVVDKTKTLVG删除；
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X48-65选取KSHKYIEKVVDKTKTLVG删除；
X49-65选取SHKYIEKVVDKTKTLVG删除。
实施例2、多肽原核表达与纯化
按照公开号为CN114107353A的中国专利将SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35所示序列分别连入质粒载体pET-26b-DsbC，然后制备多肽突变体，蛋白制备结果如图1所示。结果显示，多肽突变蛋白制备成功。
实施例3、血浆复钙实验检测
将20μL正常人血浆(加3％枸橼酸钠抗凝，取自昆明血液中心)与3μL的样品(孵育样品终浓度为1.5μM)。混合于Hepes缓冲液中(150mM NaCl，pH7.5)，终体积为70μL。然后在37℃的恒温培养箱中孵育10min。孵育结束之后加入50μL、37℃预热好的CaCl2溶液(25mM)引发反应。凝血反应的酶促动力学使用Epoch(BioTek)酶标仪、GEN CHS1.09软件检测OD650nm，20min，间隔47s，三个重复。由表2可知，突变后的LCTX-F2均具有一定的止血效果。
表2、替换或删减氨基酸序列的血浆复钙检测
实施例3、不同因素下多肽稳定测定
(1)pH稳定性测试
称取的FXlla粉末溶解于灭菌超纯水中，使其浓度为3.2mg/mL；称取的S2302粉末溶解于灭菌超纯水中，使其浓度为4.8mg/mL；分别配制pH3.0、pH7.0和pH11.0的溶液；称取LCTX-F2与突变体冻干粉末样品，溶解于不同pH溶液中，使其浓度为2mg/mL，样品放置于室温孵育24h后取出检测，检测结果如图2所示。结果显示，与SEQ ID NO.1的稳定性相比较，在酸性或碱性溶液中，突变后的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4多肽序列稳定性有明显提高。
(2)温度稳定性测试
称取的FXlla粉末溶解于灭菌超纯水中，使其浓度为3.2mg/mL；称取的S2302粉末溶解于灭菌超纯水中，使其浓度为4.8mg/mL；称取LCTX-F2与突变体冻干粉末样品，溶解于灭菌超纯水中，其浓度为2mg/mL，将样品分别放置于4℃、37℃和65℃水浴锅中孵育24h后取出检测；检测结果如图3所示，与SEQ ID NO.1的稳定性相比较，在65℃的温度下，突变后的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4多肽序列稳定性有明显提高。
(3)盐浓度稳定性测试
配制50mM、150mM和450mM的氯化钠溶液；称取LCTX-F2与突变体冻干粉末样品，溶解于不同盐浓度溶液中，使其浓度为2mg/mL，孵育24h后取出检测；具体检测方如下：96孔板中分别加入88μL1xPBS缓冲液与1μL浓度为0.004mg/mL的FXlla，检测样品组按顺序加入1μL经不同条件下处理后的多肽样品，室温静置10分钟，最后加入10μL终浓度为0.04mM的S2302溶液。检测波长为OD405nm，20min，间隔10s，检测结果如图4所示。结果显示，与SEQ ID NO.1的稳定性相比较，在400mM的氯化钠溶液中，突变后的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4多肽序列稳定性有明显提高。
(4)多肽抗蛋白酶降解测定
每个测试肽与含蛋白水解酶胰蛋白酶和糜蛋白酶的消化缓冲液(50mmTris-HCl，pH7.4，5mM CaCl2)混合于37℃孵育，摩尔比为25：1(肽：酶)，时间为0到6小时。在指定的时间点，95℃下加热10分钟后停止反应。然后收集消化混合物，用16.5％ Tricine-SDS-PAGE进行分析。如图5所示，SEQ ID NO：4对胰蛋白酶和糜蛋白酶的蛋白降解可达4小时。
其余序列分别在pH、温度、盐浓度、在蛋白酶作用下降解稳定性结果如表1所示。
表1、突变多肽的稳定性结果
综上所述，7号位的精氨酸替换成丙氨酸，及46-65号位氨基酸的删除，去除多肽的无序结构，在不同影响因素下的稳定性多肽LGTX-F2有明显的提高。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (6)
1.多肽LGTX-F2突变体，其特征在于：所述多肽LGTX-F2突变体为天然LGTX-F2氨基酸第7位处的单个氨基酸替换为K和X47-65截短，所述多肽LGTX-F2突变体的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
2.权利要求1所述多肽LGTX-F2突变体在制备止血药物中的应用。
3.一种止血药物，其特征在于：包括权利要求1所述多肽LGTX-F2突变体或其药学上可接受盐。
4.表达权利要求1所述多肽LGTX-F2突变体的重组载体。
5.表达权利要求1所述多肽LGTX-F2突变体的宿主。
6.制备权利要求1所述多肽LGTX-F2突变体的方法，其特征在于：将编码多肽LGTX-F2突变体的核苷酸序列连入表达载体pET-26b-DsbC，诱导表达，纯化制得。
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| LCTX-F2, a Novel Potentiator of Coagulation Factors From the Spider Venom of Lycosa singoriensis;Pengpeng Li等;Front Pharmacol;第11卷;第1-10页 * |
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