CN108949869B

CN108949869B - 无碳源阻遏毕赤酵母表达系统、其建立方法及应用

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Publication number: CN108949869B
Application number: CN201710352843.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡孟浩; 刘启; 周祥山; 张元兴
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2017-05-18
Filing date: 2017-05-18
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2037-05-18
Also published as: CN108949869A

Abstract

本发明涉及一种高表达量的、无碳源阻遏的、增强型甲醇营养型酵母表达系统，其建立方法及应用。本发明揭示了一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性和碳源严重阻遏的方法，通过人工改造甲醇营养型酵母细胞内的转录调控遗传线路，提高启动子转录强度并改变其调控模式。本发明的酵母表达系统以及表达方法，使得原本依赖甲醇诱导、存在碳源阻遏的启动子不再依赖甲醇，在其它碳源条件下也可高效地表达外源多肽，最高表达量可达野生型AOX1启动子甲醇条件下的5倍。

Description

无碳源阻遏毕赤酵母表达系统、其建立方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程领域；更具体的，本发明涉及一种无碳源阻遏毕赤酵母表达系统、其建立方法及应用。

背景技术

近年来，生物制品在人们生产生活中所占的比重越来越高，而大部分生物制品如：疫苗、抗体、抗菌肽、抗生素等几乎都是通过异源表达的方式进行生产。而在采用模式生物异源表达生物制品的过程中，由启动子引导的转录起始过程是蛋白表达的关键步骤。因此强力可调控的启动子一直是高水平表达外源蛋白所必不可少的工具。

毕赤酵母中的醇氧化酶(Aox1)启动子(P_AOX1)是目前最强力的启动子，已用于表达多种外源蛋白，胞内表达量和胞外表达量最高分别可达到22g/L的和15g/L。因此，P_AOX1常被用来进行改造以获得具有更高启动强度、不依赖甲醇诱导的合成型启动子。目前对于P_AOX1的改造主要针对于其启动子序列的缺失或者插入及转录调控因子表达水平的调控。在这些研究中在甲醇诱导下相对野生型活性最好的的突变启动子分别为Hartner等的160％、Xuan等的157％。但是由于P_AOX1的调控网络尚未完全清晰，在大规模应用中还存在诸多问题。近年来已经商业化的不依赖甲醇的启动子只有奥地利VTU Technology公司，他们通过对P_AOX1序列进行的改造开发的2nd P_AOX1在甘油诱导下能够达到1nd P_AOX1(野生型菌株的P_AOX1)在甲醇诱导下的18.2％～114.3％，并且要高于P_GAP的表达水平，已经达到工业应用的水平。尽管非甲醇诱导P_AOX1的研究已经取得了很大的突破，但是仍旧无法改变P_AOX1调控模式单一，碳源严重阻遏等问题。

因此，如果得到一种调控更加灵活、能够利用非甲醇诱导启动子表达的方法，使原本依赖甲醇诱导的启动子在其它碳源作为单一碳源的条件下也能够更为高效的转录，这对于实现工业上利用毕赤酵母灵活、高效的表达外源多肽具有积极意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过人工改造甲醇诱导/碳源阻遏型启动子转录调控遗传线路从而构建更为强力的新型表达系统的方法。

在本发明的第一方面，提供一种无碳源阻遏性表达外源多肽的方法，包括：

(1)提供甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母含有：

表达盒1，其表达外源的DNA结合蛋白和转录激活因子的融合多肽，以及

表达盒2，从5’→3’依次包括操作性连接的：蛋白结合序列、甲醇诱导型启动子，外源多肽编码基因；

(2)在无甲醇条件或非单一甲醇碳源条件下、培养(1)的甲醇营养型酵母，表达外源多肽。

在一个优选例中，所述的甲醇营养型酵母包括：毕赤酵母(Pichia)，汉逊酵母(Hansenula)，假丝酵母(Candida)，球拟酵母(Torulopsis)；较佳地，所述的甲醇营养型酵母是毕赤酵母。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母是：GS115毕赤酵母菌株。

在另一优选例中，所述的表达盒1中，包括启动子以及与之操作性连接的DNA结合蛋白和转录激活因子的融合多肽的编码基因。

在另一优选例中，所述的表达盒1中还包括启动子，所述的启动子包括(但不限于)：组成型启动子或葡萄糖浓度控制型启动子；较佳地，所述的组成型启动子包括(但不限于)GAP启动子；较佳地，所述的葡萄糖浓度控制型启动子包括(但不限于)：MSC1启动子、MAL31启动子、GAL4启动子。

在另一优选例中，所述的表达盒1中，所述的DNA结合蛋白包括(但不限于)：LacI，FapR，AraC。

在另一优选例中，所述的LacI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或其简并的序列；

所述的FapR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或其简并的序列；或

所述的AraC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示或其简并的序列。

在另一优选例中，所述的表达盒1中，所述的转录激活因子是甲醇营养型酵母中具备独立招募RNA聚合酶能力的转录因子蛋白；较佳的，为转录激活因子的激活域。

在另一优选例中，所述的表达盒1中，所述的转录激活因子激活域包括(但不限于)：Mit1AD，Mxr1AD，Prm1AD。

在另一优选例中，所述的Mit1AD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示或其简并的序列；

所述的Mxr1AD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示或其简并的序列；或

所述的Prm1AD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示或其简并的序列；

在另一优选例中，所述的表达盒2中，所述的蛋白结合序列包括(但不限于)：lacO、fapO、araI。

在另一优选例中，所述的lacO的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示或其简并的序列；

所述的fapO的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示或其简并的序列；或

所述的araI的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示或其简并的序列。

在另一优选例中，所述的蛋白结合序列以1～15拷贝存在，较佳地为1～9拷贝。

在另一优选例中，所述的甲醇诱导型启动子包括(但不限于)：AOX1启动子、DHAS启动子、FDH启动子或它们的核心启动子；较佳地，为AOX1核心启动子；更佳地，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

在另一优选例中，所述的培养是以甘油和/或葡萄糖为碳源的培养。

在本发明的另一方面，提供DNA结合蛋白和转录激活因子的融合多肽或其编码基因的用途，用于甲醇营养型酵母消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性或碳源阻遏而更加强力的驱动外源多肽编码基因表达。

在一个优选例中，所述的甲醇诱导型启动子是AOX1启动子；或所述的甲醇营养型酵母包括：毕赤酵母(Pichia)，汉逊酵母(Hansenula)，假丝酵母(Candida)，球拟酵母(Torulopsis)；较佳地，所述的甲醇营养型酵母是毕赤酵母；或所述的碳源是甘油和/或葡萄糖。

在本发明的另一方面，提供一种重组的甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母含有：

表达盒1，其表达外源的DNA结合蛋白和转录激活因子激活域的融合多肽，以及

表达盒2，从5’→3’依次包括操作性连接的：蛋白结合序列、甲醇诱导型启动子，外源多肽编码基因。

在一个优选例中，所述的表达盒1中，包括启动子以及与之操作性连接的DNA结合蛋白和转录激活因子激活域的融合多肽的编码基因；或

所述的表达盒1中，所述的启动子包括(但不限于)：组成型启动子或葡萄糖浓度控制型启动子；或

所述的表达盒1中，所述的DNA结合蛋白包括(但不限于)：LacI，FapR，AraC；或

所述的表达盒1中，所述的转录激活因子激活域包括(但不限于)：Mit1AD，Mxr1AD，Prm1AD；或

所述的表达盒2中，所述的蛋白结合序列包括(但不限于)：lacO、fapO、araI；较佳地为lacO，其以1～15拷贝存在，较佳地为1～9拷贝；或

所述的甲醇诱导型启动子包括：AOX1启动子；较佳地，为AOX1核心启动子。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、GS115-pPAG、LM-lacO1cAG、LX-lacO1cAG、LP-lacO1cAG四个菌株在不同碳源下培养后单位细胞的荧光强度。

图2、GS115-pPAG、P_MSCLM-lacO1cAG、P_MALLM-lacO1cAG、P_GALLM-lacO1cAG四个菌株分别在甲醇和不同葡萄糖浓度下进行培养后单位细胞的荧光强度。

图3、GS115-pPAG与含有1-9个拷贝lacO的菌株在甲醇条件下培养后单位细胞的荧光强度。

具体实施方式

为解决目前甲醇诱导型启动子存在的调控模式单一，碳源严重阻遏等问题，本发明人经过深入的研究，揭示了一种消除甲醇诱导型启动子甲醇碳源依赖性和葡萄糖等碳源严重阻遏的方法，通过人工改造甲醇营养型酵母细胞内的转录调控遗传线路，提高启动子转录强度并改变其调控模式，使得酵母表达系统可以更为灵活和高效的表达外源多肽。

如本文所用，所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的活性变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

如本文所用，所述的“甲醇诱导型启动子”是与甲醇代谢有关的酶的启动子。在现有技术中，这些启动子通过向生长培养基中添加甲醇，可以控制外源多肽由所述启动子的表达。所述的“甲醇诱导型启动子”可以由本领域技术人员使用常规技术从酵母中分离获得。

如本文所用，所述的“单一甲醇(碳源)依赖”是指启动子需要以甲醇为唯一碳源进行诱导来驱动与之操作性连接的基因的表达，在非甲醇为唯一碳源(如葡萄糖，或甲醇+葡萄糖)的条件下不能驱动与之操作性连接的基因的表达。所述的“消除单一甲醇依赖”是指使得启动子在不以甲醇为唯一碳源(如甲醇+葡萄糖，或葡萄糖，或甘油)的条件下就可驱动与之操作性连接的基因的表达。“非单一甲醇(碳源)诱导”是指除了甲醇碳源外，还存在至少一种非甲醇的碳源。

如本文所用，所述的“组成型启动子”是指在其调控下不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异的一类启动子。

如本文所用，所述的“诱导型启动子”可根据需要在特定细胞生长阶段或特定生长环境下，快速诱导基因转录的“开”与“关”或者“高”与“低”。根据来源，可将诱导型启动子分为天然存在的启动子和人工构建的启动子。

如本文所用，所述的“组织或器官特异性启动子”是指基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中的启动子。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(例如，本发明中的外源多肽或LacI-Mit1AD融合多肽(编码基因如SEQ ID NO:11))所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“甲醇营养型酵母”是指可利用甲醇作为唯一碳源的酵母。包括来自汉逊酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)，假丝酵母属(Candida)等的酵母。

如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明揭示了一种通过在甲醇营养型酵母细胞中异源表达DNA结合蛋白与转录激活因子激活域的融合蛋白，激发下游合成启动子的表达，以此使得原本依赖甲醇诱导的启动子不再依赖单一甲醇、不受葡萄糖等其他碳源阻遏，可以更加灵活、高效的表达外源多肽。更具体地，在本发明构建的酵母表达系统中，一方面，DNA结合蛋白和转录激活因子构成融合蛋白。另一方面，表达盒1中的DNA结合蛋白通过与表达盒2中的核心甲醇诱导型启动子上游的蛋白结合序列可以发生结合，这种结合使得转录激活因子与甲醇诱导型启动子在空间上靠近。从而，所述的转录激活因子能够招募RNA聚合酶结合到所述的核心甲醇诱导型启动子上，启动外源多肽的转录。

本发明中，所述的DNA结合蛋白包括但不限于：LacI，FapR，AraC；所述的蛋白结合序列包括但不限于：lacO、fapO、araI。并且，当DNA结合蛋白应用LacI时，相应的蛋白结合序列应用lacO；当DNA结合蛋白应用FapR时，相应的蛋白结合序列应用fapO；当DNA结合蛋白应用AraC时，相应的蛋白结合序列应用araI。

所述的LacI基因的核苷酸序列可以是SEQ ID NO:1所示；所述的FapR基因的核苷酸序列可以是SEQ ID NO:2所示；所述的AraC基因的核苷酸序列可以是SEQ ID NO:3所示。所述的lacO的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述的fapO的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述的araI的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。本发明还涉及上述多核苷酸的简并的序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与上述核苷酸所编码的相同氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述多核苷酸同源的多核苷酸，较佳地同源性为70％以上、80％以上、90％以上、93％、95％以上或97％以上，这些多核苷酸所编码的多肽也具有与前述多核苷酸所编码的多肽相同的功能。

本发明中，所述的转录激活因子激活域包括但不限于：Mit1AD，Mxr1AD，Prm1AD。所述的Mit1AD基因具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。所述的Mxr1AD基因具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。所述的Prm1AD基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。本发明还涉及这些多核苷酸的简并的序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与上述这些核苷酸所编码的相同氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。本发明还涉及与上述这些多核苷酸同源的多核苷酸，较佳地同源性为70％以上、80％以上、90％以上、93％、95％以上或97％以上，这些多核苷酸所编码的多肽也具有Mit1AD，Mxr1AD或Prm1AD相同的功能。

本领域技术人员熟悉甲醇依赖型启动子，可使用常规技术从酵母中分离获得。由于甲醇依赖型启动子具有基本相同的工作机制和工作原理，本发明对于甲醇依赖型启动子的种类没有特别的限制。例如，所述的甲醇诱导型启动子包括但不限于：AOX1启动子、DHAS启动子(或者DAS启动子)、FDH启动子(或者FMDH启动子)、MOX启动子、AOX2启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-启动子、PMP20启动子、PMP47启动子、AOD1启动子、AOD2启动子。作为本发明的优选方式，所述的甲醇依赖型启动子为AOX1启动子，较佳地为AOX1核心启动子；更佳地，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。本发明还包括与上述甲醇依赖型启动子的多核苷酸序列具有至少70％，更佳地至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同性的启动子。这些启动子在引发转录的必要位点及转录起始点的位置上是严格保守的。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述甲醇依赖型启动子的核苷酸序列可杂交的多核苷酸，且该多核苷酸也具有野生型甲醇依赖型启动子的功能。

所述的表达盒1中，也包括使得DNA结合蛋白和转录激活因子激活域的融合多肽顺利表达的启动子元件。任意能使融合多肽大量表达的启动子均可应用于表达盒1中。所述的启动子可以是：组成型启动子，诱导型启动子，组织或器官特异性启动子，时空特异性表达启动子等。较佳地，所述的启动子包括(但不限于)：组成型启动子P_GAP，葡萄糖浓度控制型启动子P_MAL、P_MSC、P_GAL。同样地，所述的表达盒1中也包括适用的终止子，这是本领域技术人员构建基因表达盒所熟知的元件。

作为本发明的优选方式，表达盒2中，所述的蛋白结合序列在核心启动子上游以单拷贝或多拷贝存在，较佳地为1～15拷贝，更佳地1-9拷贝，如9、7、5、3、1拷贝。

本发明中，所述的“无甲醇的条件”或“非单一甲醇碳源条件”是本领域技术人员易于建立的，也即，在常规应用的甲醇营养型酵母培养基中，不加入甲醇作为碳源，取代以其它类型的碳源；或者，在常规应用的甲醇营养型酵母培养基中，含有甲醇作为碳源的同时，还含有其他碳源(如葡萄糖、甘油)。常用的碳源是本领域技术人员熟知的，例如但不限于：甘油、葡萄糖、淀粉(含淀粉水解液，木薯淀粉，玉米淀粉，纤维素类水解液等)、蔗糖、麦芽糖等。较佳地，采用以甘油和/或葡萄糖为碳源的酵母培养基。

基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种重组的甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母含有：前面所述的表达盒1以及表达盒2。任何甲醇营养型酵母均可被应用于本发明中，以构建上述重组的甲醇营养型酵母。例如，所述的甲醇营养型酵母包括但不限于：毕赤酵母(Pichia)，汉逊酵母(Hansenula)，假丝酵母(Candida)，球拟酵母(Torulopsis)；较佳地为毕赤酵母(Pichia)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料

质粒构建方法应用诺唯赞生物科技公司的无缝克隆试剂盒。

所使用的工具酶均购自TaKaRa生物公司(大连，中国)，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。

下面的商品化质粒和菌株用于基因克隆和蛋白表达：质粒pGAPZαA、质粒pPIC3.5k、大肠杆菌Top10、毕赤酵母菌株GS115，均购自Invitrogen公司。

质粒pPAG是通过在质粒pPIC3.5k的AOX1启动子下游的SnaB I酶切位点处插入GFP基因(全长714bp，序列见GenBank登录号AY656807.1中第80～793位)而获得。

LacI多肽的DNA片段(SEQ ID NO:1)通过金唯智生物科技有限公司人工合成，lacO序列的DNA片段通过捷瑞生物公司合成两条单链的引物lacO F(SEQ ID NO:12)和lacO R(SEQ ID NO:13)退火连接获得。

YPD培养基：2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖，2％琼脂粉；YNB培养基：0.67％YNB；MGY培养基：1％甘油，0.67％YNB；YND液体培养基：1％葡萄糖，0.67％YNB。

配制以上培养基时，葡萄糖115℃高压灭菌20min，甲醇在使用时添加。其它成分121℃高压灭菌20min。固体培养基加2％琼脂粉。

实施例1、无碳源阻遏的甲醇营养型酵母组成型表达系统

1.pPlacO1cAG质粒的构建

分别以lacO-cAOX1F(SEQ ID NO:14)和pPcAG R(SEQ ID NO:15)为引物以及以pPcAG F(SEQ ID NO:16)和lacO-pPIC R(SEQ ID NO:17)为引物，通过PCR的方法，从pPAG质粒上扩增AOX1核心启动子(即SEQ ID NO:7)和GFP的区域以及pPHis整合位点和抗性片段区域，通过无缝克隆试剂盒将两条片段进行组装，得到的重组质粒为pPlacO1cAG。

2.电转毕赤酵母和GS115-lacO1cAG菌株的筛选

将重组质粒pPlacO1cAG电转毕赤酵母菌株GS115，涂于不含组氨酸的YND平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用real-time PCR验证GFP拷贝数。把real-time PCR检验GFP为单拷贝的毕赤酵母表达菌株命名为GS115-lacO1cAG。

表达菌株GS115-pPAG的构建：将重组质粒pPAG电转毕赤酵母菌株GS115，获得表达菌株GS115-pPAG。

3.P_GAP表达LacI和转录因子激活域融合多肽质粒的构建

以pGAP F(SEQ ID NO:18)和LacI-GAP R(SEQ ID NO:19)为引物，通过PCR的方法，从pGAPZαA上扩增GAP启动子和抗性区域片段；从毕赤酵母GS115基因组上扩增Mit1AD(SEQID NO:4)、Mxr1AD(SEQ ID NO:5)、Prm1AD片段(SEQ ID NO:6)，分别与抗性区域片段及LacI片段通过无缝克隆试剂盒进行无缝组装，获得重组质粒pGGLacIMit1AD、pGGLacIMxr1AD、pGGLacIPrm1AD。

Mit1AD扩增引物：LacI-Mit1AD F(SEQ ID NO:20)和pGAP-Mit1AD R(SEQ ID NO:21)；

Mxr1AD扩增引物：LacI-Mxr1AD F(SEQ ID NO:22)和pGAP-Mxr1AD R(SEQ ID NO:23)；

Prm1AD扩增引物：LacI-Prm1AD F(SEQ ID NO:24)和pGAP-Prm1AD R(SEQ ID NO:25)。

4.电转毕赤酵母和单拷贝菌株的筛选

将重组质粒pGGLacIMit1AD、pGGLacIMxr1AD、pGGLacIPrm1AD分别电转GS115-lacO1cAG菌株，涂于添加Zeocin抗生素的YPD固体培养基平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用real-timePCR验证LacI拷贝数。把real-time PCR检验为单拷贝的毕赤酵母表达菌株分别命名为LM-lacO1cAG、LX-lacO1cAG、LP-lacO1cAG。

5.酶标仪检测GFP荧光强度

将菌株GS115-pPAG、LM-lacO1cAG、LX-lacO1cAG、LP-lacO1cAG分别在YPD液体培养基中过夜预培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤2次后，分别转移至含有0.5％(v/v)甲醇，1％葡萄糖，1％甘油的YNB液体培养基中进行培养，取样后用酶标仪检测样品中GFP的荧光强度。

结果图1所示，LM-lacO1cAG、LX-lacO1cAG、LP-lacO1cAG三个菌株在甲醇、葡萄糖和甘油条件下均不受碳源阻遏，有显著的荧光蛋白表达，其中LM-lacO1cAG菌株表达强度约为GS115-pPAG的3.5倍；LX-lacO1cAG菌株表达强度约为GS115-pPAG的3倍；LP-lacO1cAG菌株表达强度约为GS115-pPAG的0.75倍，但体现出碳源阻遏的消除。

由上述结果可见，本发明的方法可有效地消除酵母菌菌株的碳源阻遏。

实施例2、诱导调控型表达系统

1.诱导型启动子表达LacIMit1AD融合多肽质粒的构建

以LacI F(SEQ ID NO:26)和pGout R(SEQ ID NO:27)为引物，通过PCR的方法，从pGGLacIMit1AD上扩增LacIMit1AD融合多肽的ORF框、终止子和抗性区域片段，分别与从毕赤酵母GS115基因组上扩增出的MSC1启动子、MAL31启动子、GAL4启动子片段通过无缝克隆试剂盒进行无缝组装，使得上述启动子分别位于融合多肽ORF框的上游、可驱动多肽表达。分别获得重组质粒pGP_MSCLacIMit1AD、pGP_MALLacIMit1AD、pGP_GALLacIMit1AD。

MSC1启动子扩增引物：pG-MSC F(SEQ ID NO:28)和LacI-MSC R(SEQ ID NO:29)；

MAL31启动子扩增引物：pG-MAL F(SEQ ID NO:30)和LacI-MAL R(SEQ ID NO:31)；

GAL4启动子扩增引物：pG-GAL F(SEQ ID NO:32)和LacI-GAL R(SEQ ID NO:33)。

2.电转毕赤酵母和PmscMit1AD-lacO1cAG菌株的筛选

将重组质粒pGP_MSCLacIMit1AD、pGP_MALLacIMit1AD、pGP_GALLacIMit1AD分别电转GS115-lacO1cAG菌株，涂于添加Zeocin抗生素的YPD固体培养基平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用real-time PCR验证LacI拷贝数。把real-time PCR检验LacI为单拷贝的毕赤酵母表达菌株分别命名为P_MSCLM-lacO1cAG、P_MALLM-lacO1cAG、P_GALLM-lacO1cAG。

3.酶标仪检测GFP荧光强度

将菌株GS115-pPAG、P_MSCLM-lacO1cAG、P_MALLM-lacO1cAG、P_GALLM-lacO1cAG分别在YPD液体培养基中过夜预培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤2次后，将GS115-pPAG转移至含有0.5％(v/v)甲醇的YNB液体培养基中进行培养，将P_MSCLM-lacO1cAG、P_MALLM-lacO1cAG、P_GALLM-lacO1cAG分别转移至含有2％、1％、0.5％葡萄糖的YNB液体培养基进行培养，取样后用酶标仪检测样品中GFP的荧光强度。

结果如图2所示，P_MSCLM-lacO1cAG、P_MALLM-lacO1cAG、P_GALLM-lacO1cAG三个菌株在不同浓度葡萄糖作为碳源条件下均有荧光表达，且表达强度均呈现随葡萄糖浓度降低而升高的趋势，其中，强度最高的菌株P_GALLM-lacO1cAG在0.5％葡萄糖浓度时可达到菌株GS115-pPAG的3倍左右。

实施例3、含有不同lacO拷贝数的甲醇营养型酵母表达系统

1.毕赤酵母GS115-LM单拷贝菌株的筛选

将重组质粒pGGLacIMit1AD分别电转GS115菌株，涂于添加Zeocin抗生素的YPD固体培养基平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用real-time PCR验证LacI拷贝数。把real-time PCR检验为单拷贝的毕赤酵母表达菌株分别命名为GS115-LM。

2.含有不同拷贝数lacO质粒的构建

通过酶切的方法，将重组质粒pPlacO1cAG(含有1个拷贝的lacO)在SacI/XhoI进行双酶切线性化，然后与lacO片段进行连接反应，得到的重组质粒为pPlacO2cAG(含有2个拷贝的lacO)。

同理可得到重组质粒pPlacO3cAG、pPlacO4cAG、pPlacO5cAG、pPlacO6cAG、pPlacO7cAG、pPlacO8cAG、pPlacO9cAG，它们分别含有3、4、5、6、7、8、9个拷贝的lacO。

3.毕赤酵母LM-lacOncAG单拷贝菌株的筛选

将含有1-9拷贝lacO的重组质粒(pPlacO1cAG、pPlacO2cAG…pPlacO9cAG)分别电转GS115菌株，涂于不含组氨酸的YND平板，放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中，30℃摇床培养后提基因组，用real-time PCR验证GFP拷贝数。把real-time PCR检验为单拷贝的毕赤酵母表达菌株命名为LM-lacOncAG(n为相应lacO拷贝数)

4.酶标仪检测GFP荧光强度

将菌株、LM-lacOncAG(n为相应lacO拷贝数，本实验中为1-9)分别在YPD液体培养基中过夜预培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤2次后，转移至含有0.5％(v/v)甲醇的YNB液体培养基中进行培养，取样后用酶标仪检测样品中GFP的荧光强度。

如图3所示，含有1-9个拷贝的菌株LM-lacOncAG均有荧光蛋白表达，其中，LM-lacO5cAG菌株表达强度最高，可达到GS115-pPAG菌株的5倍左右。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 无碳源阻遏毕赤酵母表达系统、其建立方法及应用

<130> 171666

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> LacI基因的核苷酸序列

<400> 1

atgggtgtta agccagttac tttgtatgac gttgctgaat acgctggagt ttcctaccaa 60

actgtctcta gagttgttaa tcaagcttct catgtctccg ctaagactag agagaaggtt 120

gaggctgcta tggctgaatt gaactatatt ccaaatagag ttgctcagca gttggctgga 180

aagcaatctt tgttgattgg agtcgctact tcttctttgg ctttgcatgc tccatctcag 240

attgttgctg ctattaagtc cagagctgac cagttgggag cttctgttgt tgtttctatg 300

gttgagagat ctggagttga ggcttgcaag gctgctgttc ataacttgtt ggctcagaga 360

gtttctggat tgattattaa ttacccattg gacgatcaag acgctattgc cgttgaggcc 420

gcttgtacca acgtcccagc tttgttcttg gacgtttccg atcaaactcc aattaattct 480

attatttttt ctcacgagga tggaactaga ttgggagttg aacacttggt tgctttggga 540

catcaacaga ttgctttgtt ggctggacca ttgtcttccg tttctgctag attgagattg 600

gccggatggc acaagtactt gaccagaaac cagattcaac caattgctga gagagaggga 660

gattggtctg ctatgtctgg attccagcag actatgcaga tgttgaacga aggaattgtc 720

ccaaccgcta tgttggtcgc taatgaccaa atggctttgg gagctatgag agctattact 780

gaatctggat tgagagtcgg agctgacatt tctgttgttg gatatgatga cactgaggat 840

tcttcttgct acattccacc attgactact attaagcaag acttcagatt gttgggacag 900

acttctgttg atagattgtt gcagttgtcc caaggacaag ctgttaaagg aaaccaattg 960

ttgccagttt ctttggttaa gagaaagact actttggctc caaacactca gactgcttcc 1020

ccaagagctt tggctgactc tttgatgcaa ttggctagac aagtctctag attggagtct 1080

ggacaataa 1089

<210> 2

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> FapR基因的核苷酸序列

<400> 2

atgcgccgca acaaacgcga acgtcaagag ctgttacagc aaaccatcca ggcgacgccg 60

tttattaccg acgaagaatt ggcaggtaag ttcggcgtct cgattcagac aatccgtctg 120

gatcgtctgg agttgtccat tccggaattg cgtgaacgta ttaaaaacgt cgccgaaaag 180

acgttagaag acgaggtgaa atctttatca ttggacgagg taattggcga aattattgac 240

cttgaattag acgaccaggc tatttcaatt ttggagatta aacaggaaca cgtgttcagt 300

cgtaaccaga tcgcccgcgg tcatcatctg ttcgcgcagg ccaacagcct ggctgtggct 360

gttattgatg acgaacttgc gctgaccgct tcggcagaca tccgctttac ccgtcaggtg 420

aaacaaggcg agcgcgtcgt agcgaaagct aaagttaccg cggttgagaa ggaaaaaggt 480

cgtacggttg tggaagtcaa ctcatacgtc ggcgaagaaa tcgtgttttc aggacgtttt 540

gatatgtacc gcagcaaaca cagctaa 567

<210> 3

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> AraC基因的核苷酸序列

<400> 3

atggctgaag cgcaaaatga tcccctgctg ccgggatact cgtttaatgc ccatctggtg 60

gcgggtttaa cgccgattga ggccaacggt tatctcgatt tttttatcga ccgaccgctg 120

ggaatgaaag gttatattct caatctcacc attcgcggtc agggggtggt gaaaaatcag 180

ggacgagaat ttgtttgccg accgggtgat attttgctgt tcccgccagg agagattcat 240

cactacggtc gtcatccgga ggctcgcgaa tggtatcacc agtgggttta ctttcgtccg 300

cgcgcctact ggcatgaatg gcttaactgg ccgtcaatat ttgccaatac ggggttcttt 360

cgcccggatg aagcgcacca gccgcatttc agcgacctgt ttgggcaaat cattaacgcc 420

gggcaagggg aagggcgcta ttcggagctg ctggcgataa atctgcttga gcaattgtta 480

ctgcggcgca tggaagcgat taacgagtcg ctccatccac cgatggataa tcgggtacgc 540

gaggcttgtc agtacatcag cgatcacctg gcagacagca attttgatat cgccagcgtc 600

gcacagcatg tttgcttgtc gccgtcgcgt ctgtcacatc ttttccgcca gcagttaggg 660

attagcgtct taagctggcg cgaggaccaa cgtatcagcc aggcgaagct gcttttgagc 720

accacccgga tgcctatcgc caccgtcggt cgcaatgttg gttttgacga tcaactctat 780

ttctcgcggg tatttaaaaa atgcaccggg gccagcccga gcgagttccg tgccggttgt 840

gaagaaaaag tgaatgatgt agccgtcaag ttgtcataa 879

<210> 4

<211> 2667

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> Mit1AD基因的核苷酸序列

<400> 4

atgagtaccg cagccccaat caaggaagaa agccaatttg cccatttgac cctaatgaac 60

aaggatatac cttcgaacgc aaaacaggca aagtcgaaag tttcagcggc ccctgctaag 120

acgggctcca aatctgctgg tggatctggc aacaacaacg ctgcacctgt gaaaaaaaga 180

gtccgcacgg gctgtttgac ctgccgaaag aagcacaaga aatgtgacga gaacagaaac 240

ccaaaatgtg acttttgcac tttgaaaggc ttggaatgtg tctggccaga gaacaataag 300

aagaatatct tcgttaacaa ctccatgaag gatttcttag gcaagaaaac ggtggatgga 360

gctgatagtc tcaatttggc cgtgaatctg caacaacagc agagttcaaa cacaattgcc 420

aatcaatcgc tttcctcaat tggattggaa agttttggtt acggctctgg tatcaaaaac 480

gagtttaact tccaagactt gataggttca aactctggca gttcagatcc gacattttca 540

gtagacgctg acgaggccca aaaactcgac atttccaaca agaacagtcg taagagacag 600

aaactaggtt tgctgccggt cagcaatgca acttcccatt tgaacggttt caatggaatg 660

tccaatggaa agtcacactc tttctcttca ccgtctggga ctaatgacga tgaactaagt 720

ggcttgatgt tcaactcacc aagcttcaac cccctcacag ttaacgattc taccaacaac 780

agcaaccaca atataggttt gtctccgatg tcatgcttat tttctacagt tcaagaagca 840

tctcaaaaaa agcatggaaa ttccagtaga cacttttcat acccatctgg gccggaggac 900

ctttggttca atgagttcca aaaacaggcc ctcacagcca atggagaaaa tgctgtccaa 960

cagggagatg atgcttctaa gaacaacaca gccattccta aggaccagtc ttcgaactca 1020

tcgattttca gttcacgttc tagtgcagct tctagcaact caggagacga tattggaagg 1080

atgggcccat tctccaaagg accagagatt gagttcaact acgattcttt tttggaatcg 1140

ttgaaggcag agtcaccctc ttcttcaaag tacaatctgc cggaaacttt gaaagagtac 1200

atgaccctta gttcgtctca tctgaatagt caacactccg acactttggc aaatggcact 1260

aacggtaact attctagcac cgtttccaac aacttgagct taagtttgaa ctccttctct 1320

ttctctgaca agttctcatt gagtccacca acaatcactg acgccgaaaa gttttcattg 1380

atgagaaact tcattgacaa catctcgcca tggtttgaca cttttgacaa taccaaacag 1440

tttggaacaa aaattccagt tctggccaaa aaatgttctt cattgtacta tgccattctg 1500

gctatatctt ctcgtcaaag agaaaggata aagaaagagc acaatgaaaa aacattgcaa 1560

tgctaccaat actcactaca acagctcatc cctactgttc aaagctcaaa taatattgag 1620

tacattatca catgtattct cctgagtgtg ttccacatca tgtctagtga accttcaacc 1680

cagagggaca tcattgtgtc attggcaaaa tacattcaag catgcaacat aaacggattt 1740

acatctaatg acaaactgga aaagagtatt ttctggaact atgtcaattt ggatttggct 1800

acttgtgcaa tcggtgaaga gtcaatggtc attcctttta gctactgggt taaagagaca 1860

actgactaca agaccattca agatgtgaag ccatttttca ccaagaagac tagcacgaca 1920

actgacgatg acttggacga tatgtatgcc atctacatgc tgtacattag tggtagaatc 1980

attaacctgt tgaactgcag agatgcgaag ctcaattttg agcccaagtg ggagtttttg 2040

tggaatgaac tcaatgaatg ggaattgaac aaacccttga cctttcaaag tattgttcag 2100

ttcaaggcca atgacgaatc gcagggcgga tcaacttttc caactgttct attctccaac 2160

tctcgaagct gttacagtaa ccagctgtat catatgagct acatcatctt agtgcagaat 2220

aaaccacgat tatacaaaat cccctttact acagtttctg cttcaatgtc atctccatcg 2280

gacaacaaag ctgggatgtc tgcttccagc acacctgctt cagaccacca cgcttctggt 2340

gatcatttgt ctccaagaag tgtagagccc tctctttcga caacgttgag ccctccgcct 2400

aatgcaaacg gtgcaggtaa caagttccgc tctacgctct ggcatgccaa gcagatctgt 2460

gggatttcta tcaacaacaa ccacaacagc aatctagcag ccaaagtgaa ctcattgcaa 2520

ccattgtggc acgctggaaa gctaattagt tccaagtctg aacatacaca gttgctgaaa 2580

ctgttgaaca accttgagtg tgcaacaggc tggcctatga actggaaggg caaggagtta 2640

attgactact ggaatgttga agaatag 2667

<210> 5

<211> 3468

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> Mxr1AD基因的核苷酸序列

<400> 5

atgagcaatc tacccccaac ttttggttcc actagacaat ctccagaaga ccaatcacct 60

cccgtgccca aggagctgtc attcaatggg accacaccct caggaaagct acgcttattt 120

gtctgtcaga catgtactcg agcatttgct cgtcaggaac acttgaaacg acacgaaagg 180

tctcacacca aggagaaacc tttcagctgc ggcatttgtt ctcgtaaatt cagccgtcga 240

gatctgttat tgagacatgc ccaaaaactg cacagcaact gctctgatgc ggccataaca 300

agactaaggc gcaaggcaac tcgtcggtct tctaatgccg cgggttccat atctggttct 360

actccggtga caacgccaaa tactatgggt acgcccgaag atggcgagaa acgaaaagtt 420

cagaaactgg ccggccgccg ggactcaaat gaacagaaac tgcaactgca acaacaacat 480

ctacagcaac aaccacagtt gcaataccaa caatctctta agcagcatga aaatcaagtc 540

cagcagcctg atcaagatcc attgatatcc ccgagaatgc aattattcaa tgattccaac 600

catcacgtaa acaatttgtt tgatcttgga ctaagaagag cttccttctc cgccgttagt 660

ggaaataatt atgcccatta tgtgaataat tttcaacaag atgcctcttc taccaatcca 720

aatcaagatt caaataatgc cgaatttgag aatattgaat tttctacccc acaaatgatg 780

cccgttgaag atgctgaaac ttggatgaac aacatgggtc caattccgaa cttctctctc 840

gatgtgaaca ggaacattgg tgatagcttt acagatatac aacacaagaa ttcagagcct 900

attatatccg aaccgcccaa ggacaccgct ccaaacgaca agaagttgaa tggctactct 960

ttttacgaag cccccatcaa gccattagaa tccctatttt ctgtcaggaa tacaaagaga 1020

aacaagtata aaacaaatga cgactctcca gacaccgtgg ataataactc cgcaccggct 1080

gctaatacca ttcaagaact tgagtcttct ttgaatgcat ccaagaattt ttgcttgcca 1140

actggttatt ccttctatgg taatttggac caacagactt tctctaacac gttatcatgc 1200

acttcttcta atgccacaat ttcgcccatt ctactcgata actccattaa taataactcc 1260

actagtgacg tgagaccaga atttagaaca caaagtgtca cctctgaaat gagtcaagcc 1320

cctccccctc ctcaaaaaaa caactcgaaa tattccaccg aagttctttt taccagcaac 1380

atgcggtcgt ttattcacta cgctctttcc aagtatcctt ttattggtgt gcccactcca 1440

actcttccgg agaacgaaag actaaatgaa tatgctgatt cattcaccaa ccgtttctta 1500

aatcattatc ctttcataca tgtcacgatt ctcaaagaat actccctttt caaggcaatt 1560

ttagatgaga atgagtcgac taagaactgg gaaaataatc agttttactt agagaaccaa 1620

cgaatatcaa ttgtttgtct tcctcttttg gtggctacga taggtgcagt actatcaaac 1680

aacaaaaagg atgcttcgaa tttatacgaa gcttcaaggc gttgtattca tgtttactta 1740

gattccagga aaaagatacc cacttccttg tccgcaaata acaatgactc tccactttgg 1800

ctaattcaat ccctgacgtt atctgttatg tatgggttat ttgcggacaa tgacattagt 1860

ttgaatgtcg tgatcagaca agttaacgca cttaattctc tggtcaagac ttcgggcctg 1920

aataggacct caattataga tcttttcaac atcaacaaac ctttggataa tgaactctgg 1980

aatcaattcg tgaaaataga gtccaccgta aggacaatcc acacgatttt tcaaatcagt 2040

tccaacttaa gcgccttgta caatattatt ccatcgttga aaattgatga cctaatgatt 2100

actctaccag ttcccacaac actttggcaa gctgattctt ttgtgaaatt caaaagtcta 2160

agttacggaa atcagatccc ttttcaatat acaagagtac tacagaattt gattgattac 2220

aatcagccat tgagcgatgg aaaatttttg tatgaaaacc atgtaagtga gtttggactc 2280

atatgcctac agaatggtct acaccaatac agctatttcc aaaaattgac tgctgtcaat 2340

aacagagaag atgcgctatt cacaaaggtt gttaattcac ttcacagttg ggataggatg 2400

atttcgaatt ctgatttgtt tccaaagaag atatatcagc agagttgctt gattttggac 2460

tcaaagttgc ttaataattt cctgattgtc aagagctcat tgaaagtttc gaccggagac 2520

gttagttctt tgaataagtt aaaagaaaac gtgtggctta aaaactggaa tcaagtgtgt 2580

gctatctatt ataacagctt catgaacatt cctgctccca gtattcaaaa gaagtacaat 2640

gacatagagt ttgtggatga catgattaat ttgagtctaa tcatcatcaa gattatgaaa 2700

ctcattttct ataacaatgt caaagacaat tatgaggatg aaaatgactt caaattgcaa 2760

gagttaaatt taacatttga caattttgat gagaaaatat ccttgaattt gacaatatta 2820

ttcgatatat ttttgatgat ctacaagata attaccaatt acgagaagtt tatgaagatc 2880

aaacacaagt ttaattacta caattctaat tcgaatataa gcttcttgca tcatttcgaa 2940

ctctcctcgg ttatcaataa cacccaaatg aaccagaatg attatatgaa aacagatatt 3000

gatgaaaagc ttgatcagct tttccacatc tatcaaacat ttttccggct gtatctggat 3060

ttagaaaagt ttatgaagtt caaattcaac tatcatgact ttgagacaga gttttcaagt 3120

ctctcaatat ccaatatact gaacactcat gctgcttcta acaatgacac aaatgctgct 3180

gatgctatga atgccaagga tgaaaaaata tctcccacaa ctttgaatag cgtattactt 3240

gctgatgaag gaaatgaaaa ttccggtcgt aataacgatt cagaccgcct gttcatgctg 3300

aacgagctaa ttaattttga agtaggtttg aaatttctca agataggtga gtcatttttt 3360

gatttcttgt atgagaataa ctacaagttc atccacttca aaaacttaaa tgacggaatg 3420

ttccacatca ggatatacct agaaaaccga ctagatggtg gtgtctag 3468

<210> 6

<211> 2970

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> Prm1AD基因的核苷酸序列

<400> 6

atgcctccta aacatcggct ggagcagagt atacagccca tggcttctca acaaatagta 60

cccggtaata aggttattct gccgaatcca aaagtagatg caaaatctac cccaaacatt 120

tcagttcaga agagaagaag agtcaccaga gcttgtgatg aatgtcggaa aaagaaggtc 180

aaatgtgatg gtcaacaacc atgcattcat tgtaccgttt attcctatga gtgcacttac 240

agccaacctt ccagtaagaa gagacaggga caatctctga gtctgagtgc tccgtcaaac 300

attaatgcaa caagttccgt acaaaaatct gtaaaacctc ctgaaatcga tttccaaagg 360

atgagagacg cactcaaata ttacgaagat cttttaaacc agttgatata ccccaacagt 420

gctccaactg ttcgagttaa tccgattcgt ctagcatcga tcttaaaaca attgagagcc 480

gataaatcaa gtgatgaatt aatttcagtc aaggctcttt ctgacaatta cattgagatg 540

cttcacaaaa cgatgcaaca acctgtacag cagccagctc ctccttcatt ggggcaagga 600

gggtccttct ctaatcacag tcccaatcat aataatgctt ctattgatgg ttccatagaa 660

tctaatctag ggagggaaat acgtatcata ttacctccga gagatattgc gctgaagctt 720

atctacaaga cttgggacaa cgcgtgtgta cttttccgct tttatcacag acccgcattt 780

attgaggacc tgaatgagtt atatgaaaca gatttggcaa actacaccaa taaacaacaa 840

aggtttttac ctcttgtata ttcggtgatg gcttgtggtg ctcttttttg caagactgat 900

gggattaatc acggccaaaa gagctccaag cccaaagact cttctgatga aagtctcata 960

gacgatgagg gttacaagta ttttattgcc gcaagaaaac taatagatat cacggatacc 1020

agggatacct acggaattca gactattgtt atgctgatca tttttttaca atgttcggct 1080

cgtctttcaa catgctattc ttatattggc attgctctaa gagctgcatt gagagaaggt 1140

ttgcatcgtc agttgaacta tcctttcaat ccaattgagt tagaaacaag aaagcgtctt 1200

ttttggacta tctataaaat ggacatctat gtcaatacaa tgctggggct tccaagaacc 1260

atttctgaag aggatttcga ccaggaaatg cctatcgaac ttgatgatga gaacattagt 1320

gaaaccggat ataggttcga tttacaaggt acaaagttat ccagttcagg aatagccaat 1380

gctcacacta gattgatatt cataatgaag aaaattgtga aaaaattata tcctgtcaaa 1440

ctacagaaac caacctcaaa cagtggcgat accccacttg agaacaatga tttattggct 1500

catgaaatcg ttcatgaact tgagatggat ctccaaaatt gggtcaatag tctacctgca 1560

gaactaaaac cggggataga accaccgacc gagtatttta aagctaacag attgcttcat 1620

ttggcatacc tgcatgtcaa gattattctc tacaggccat ttattcatta catctcagaa 1680

aaggataagg ttggaaatag ttctatccct ccgtcgcccg aagagatcac ttctatcgag 1740

aaagccaaga attgtgtcaa tgttgccaga attgttgtta aactagccga agacatgatt 1800

aataggaaaa tgttaagtgg ttcatattgg ttttccattt ataccatttt tttttccgtg 1860

gcatgtctgg tgtactatgt tcatttcgct ccaccgaaga aagacaatgg agaactggat 1920

ccccaataca tggaaatcaa gaaagataca gagagtggaa gagaggtctt aaatatcctc 1980

aaagatagta gtatggcggc aagaagaacg tataatattc tcaactcttt gtttgagcag 2040

ttaaacagaa gaactgcaaa ggtcaaccta gcaaaggcac agcaaccacc atcagggttg 2100

aataacccag ctgctaccca gtatcagaaa cagggtgaac acaggcagtt acaaccaagt 2160

aactattctg gaactgtgaa atctgtggac ccagagaata tcgattactc ttcctttggt 2220

tctcagtttg aaaacactaa catcgaagat ggttcctcaa atacaaagat tgatcagaaa 2280

gtgaatgggg tgaactacat cgatggtgtg tttacaggga tcaacctaaa tatgcctaat 2340

ctctcagaaa cttctaacac tcaaggtatc gataatccag catttcaaag tataaacaat 2400

tctaatttga acaataattt tgtacaaaca aagtacattc ccggcatgat ggaccagcta 2460

gatatgaaaa ttttcggaag attccttcca ccttacatgc tgaactccaa caaggttgaa 2520

cagggacaaa atgaaaggaa cctatcaggc caaccatcct cgtcgaatac tcctgatgga 2580

tcacaacctg tgacagttct ggatggatta tacccgttgc agaatgataa taataataac 2640

cacgacccag gaaattcaaa gtctgttgta aataacagta actcggtaga aaacttacta 2700

cagaacttta caatggtgcc ctcggggttg tcatcaacag tgcaaaatcc tgaagcggcc 2760

caaaaattca ataatcatat gtcaaacata tcgaatatga atgatccaag aagagctagc 2820

gtagctacat cagatggatc caatgacatg gatcatcata gccaaggccc gataaacaaa 2880

gatttgaaac cgttgagcaa ctacgagttt gacgatctct tctttaatga ttggaccact 2940

gcgccagata caataaattt tgacagttaa 2970

<210> 7

<211> 179

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> AOX1核心启动子

<400> 7

ctaaccccta cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt 60

tttttatcat cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt 120

tgattttaac gacttttaac gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaa 179

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> lacO的核苷酸序列

<400> 8

tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acaca 35

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> fapO的核苷酸序列

<400> 9

aattatatac tactattagt acctagtctt aatt 34

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> araI的核苷酸序列

<400> 10

atagcatttt tatccataag attagcggat cctacctg 38

<210> 11

<211> 3456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> LacI-Mit1AD融合多肽编码基因

<400> 11

atgggtgtta agccagttac tttgtatgac gttgctgaat acgctggagt ttcctaccaa 60

actgtctcta gagttgttaa tcaagcttct catgtctccg ctaagactag agagaaggtt 120

gaggctgcta tggctgaatt gaactatatt ccaaatagag ttgctcagca gttggctgga 180

aagcaatctt tgttgattgg agtcgctact tcttctttgg ctttgcatgc tccatctcag 240

attgttgctg ctattaagtc cagagctgac cagttgggag cttctgttgt tgtttctatg 300

gttgagagat ctggagttga ggcttgcaag gctgctgttc ataacttgtt ggctcagaga 360

gtttctggat tgattattaa ttacccattg gacgatcaag acgctattgc cgttgaggcc 420

gcttgtacca acgtcccagc tttgttcttg gacgtttccg atcaaactcc aattaattct 480

attatttttt ctcacgagga tggaactaga ttgggagttg aacacttggt tgctttggga 540

catcaacaga ttgctttgtt ggctggacca ttgtcttccg tttctgctag attgagattg 600

gccggatggc acaagtactt gaccagaaac cagattcaac caattgctga gagagaggga 660

gattggtctg ctatgtctgg attccagcag actatgcaga tgttgaacga aggaattgtc 720

ccaaccgcta tgttggtcgc taatgaccaa atggctttgg gagctatgag agctattact 780

gaatctggat tgagagtcgg agctgacatt tctgttgttg gatatgatga cactgaggat 840

tcttcttgct acattccacc attgactact attaagcaag acttcagatt gttgggacag 900

acttctgttg atagattgtt gcagttgtcc caaggacaag ctgttaaagg aaaccaattg 960

ttgccagttt ctttggttaa gagaaagact actttggctc caaacactca gactgcttcc 1020

ccaagagctt tggctgactc tttgatgcaa ttggctagac aagtctctag attggagtct 1080

ggacaaggtg gcggcggctc tgttaacaac tccatgaagg atttcttagg caagaaaacg 1140

gtggatggag ctgatagtct caatttggcc gtgaatctgc aacaacagca gagttcaaac 1200

acaattgcca atcaatcgct ttcctcaatt ggattggaaa gttttggtta cggctctggt 1260

atcaaaaacg agtttaactt ccaagacttg ataggttcaa actctggcag ttcagatccg 1320

acattttcag tagacgctga cgaggcccaa aaactcgaca tttccaacaa gaacagtcgt 1380

aagagacaga aactaggttt gctgccggtc agcaatgcaa cttcccattt gaacggtttc 1440

aatggaatgt ccaatggaaa gtcacactct ttctcttcac cgtctgggac taatgacgat 1500

gaactaagtg gcttgatgtt caactcacca agcttcaacc ccctcacagt taacgattct 1560

accaacaaca gcaaccacaa tataggtttg tctccgatgt catgcttatt ttctacagtt 1620

caagaagcat ctcaaaaaaa gcatggaaat tccagtagac acttttcata cccatctggg 1680

ccggaggacc tttggttcaa tgagttccaa aaacaggccc tcacagccaa tggagaaaat 1740

gctgtccaac agggagatga tgcttctaag aacaacacag ccattcctaa ggaccagtct 1800

tcgaactcat cgattttcag ttcacgttct agtgcagctt ctagcaactc aggagacgat 1860

attggaagga tgggcccatt ctccaaagga ccagagattg agttcaacta cgattctttt 1920

ttggaatcgt tgaaggcaga gtcaccctct tcttcaaagt acaatctgcc ggaaactttg 1980

aaagagtaca tgacccttag ttcgtctcat ctgaatagtc aacactccga cactttggca 2040

aatggcacta acggtaacta ttctagcacc gtttccaaca acttgagctt aagtttgaac 2100

tccttctctt tctctgacaa gttctcattg agtccaccaa caatcactga cgccgaaaag 2160

ttttcattga tgagaaactt cattgacaac atctcgccat ggtttgacac ttttgacaat 2220

accaaacagt ttggaacaaa aattccagtt ctggccaaaa aatgttcttc attgtactat 2280

gccattctgg ctatatcttc tcgtcaaaga gaaaggataa agaaagagca caatgaaaaa 2340

acattgcaat gctaccaata ctcactacaa cagctcatcc ctactgttca aagctcaaat 2400

aatattgagt acattatcac atgtattctc ctgagtgtgt tccacatcat gtctagtgaa 2460

ccttcaaccc agagggacat cattgtgtca ttggcaaaat acattcaagc atgcaacata 2520

aacggattta catctaatga caaactggaa aagagtattt tctggaacta tgtcaatttg 2580

gatttggcta cttgtgcaat cggtgaagag tcaatggtca ttccttttag ctactgggtt 2640

aaagagacaa ctgactacaa gaccattcaa gatgtgaagc catttttcac caagaagact 2700

agcacgacaa ctgacgatga cttggacgat atgtatgcca tctacatgct gtacattagt 2760

ggtagaatca ttaacctgtt gaactgcaga gatgcgaagc tcaattttga gcccaagtgg 2820

gagtttttgt ggaatgaact caatgaatgg gaattgaaca aacccttgac ctttcaaagt 2880

attgttcagt tcaaggccaa tgacgaatcg cagggcggat caacttttcc aactgttcta 2940

ttctccaact ctcgaagctg ttacagtaac cagctgtatc atatgagcta catcatctta 3000

gtgcagaata aaccacgatt atacaaaatc ccctttacta cagtttctgc ttcaatgtca 3060

tctccatcgg acaacaaagc tgggatgtct gcttccagca cacctgcttc agaccaccac 3120

gcttctggtg atcatttgtc tccaagaagt gtagagccct ctctttcgac aacgttgagc 3180

cctccgccta atgcaaacgg tgcaggtaac aagttccgct ctacgctctg gcatgccaag 3240

cagatctgtg ggatttctat caacaacaac cacaacagca atctagcagc caaagtgaac 3300

tcattgcaac cattgtggca cgctggaaag ctaattagtt ccaagtctga acatacacag 3360

ttgctgaaac tgttgaacaa ccttgagtgt gcaacaggct ggcctatgaa ctggaagggc 3420

aaggagttaa ttgactactg gaatgttgaa gaataa 3456

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 12

cctcgagtgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca cag 43

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 13

tcgactgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca ctcgaggagc t 51

<210> 14

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 14

gaattgtgag cggataacaa tttcacacag ggcccctaac ccctacttga cagca 55

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 15

ctgatgttac tgaaggatca gatcacgcat 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 16

tgatccttca gtaacatcag agattttgag 30

<210> 17

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 17

ttgttatccg ctcacaattc cacacactcg aggagctcgt tcccgatctg cgtcta 56

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 18

ctcgagccgc ggcggccgcc 20

<210> 19

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 19

gtaactggct taacacccat ggtggatcca tagttgttca attgattgaa atag 54

<210> 20

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 20

ctagattgga gtctggacaa ggtggcggcg gctctgttaa caactccatg aaggatt 57

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 21

ggcggccgcc gcggctcgag ttattcttca acattccagt agtca 45

<210> 22

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 22

ctagattgga gtctggacaa ggtggcggcg gctctagcaa ctgctctgat gc 52

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 23

ggcggccgcc gcggctcgag ttagcatgat aacgtgttag agaaa 45

<210> 24

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 24

ctagattgga gtctggacaa ggtggcggcg gctctggaca atctctgagt ctgag 55

<210> 25

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 25

ggcggccgcc gcggctcgag ttaactgtca aaatttattg tatctggcg 49

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 26

ggatccacca tgggtgttaa 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 27

gatctcatgc atgaccaaaa 20

<210> 28

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 28

ttttggtcat gcatgagatc aacagtttct gaaggatcaa ag 42

<210> 29

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 29

ttaacaccca tggtggatcc gttctcttta gtaactgatt aacaag 46

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 30

ttttggtcat gcatgagatc tccttcaggc cagctagtgc 40

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 31

ttttggtcat gcatgagatc tccttcaggc cagctagtgc 40

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 32

ttttggtcat gcatgagatc aagaatgcaa gacaaaaccg 40

<210> 33

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 33

ttaacaccca tggtggatcc gagcgattca aagagaaaca c 41

Claims

1.一种无碳源阻遏性表达外源多肽的方法，包括：

(1) 提供甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母为毕赤酵母(Pichia)，含有：

表达盒1，其表达外源的DNA结合蛋白和转录激活因子的融合多肽，所述的转录激活因子是甲醇营养型酵母中具备独立招募RNA聚合酶能力的转录因子蛋白，所述的转录激活因子为转录激活因子的激活域；所述的DNA结合蛋白为LacI；所述转录激活因子的激活域为Mit1AD，Mxr1AD或Prm1AD；以及

表达盒2，从5’→3’依次包括操作性连接的：蛋白结合序列、核心甲醇诱导型启动子，外源多肽编码基因；所述的蛋白结合序列与表达盒1中的DNA结合蛋白能发生结合；所述蛋白结合序列为lacO，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示；所述核心甲醇诱导型启动子为AOX1核心启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示；

(2) 在无甲醇条件或非单一甲醇碳源条件下、培养(1)的甲醇营养型酵母，表达外源多肽。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达盒1中还包括启动子，所述的启动子包括：组成型启动子或葡萄糖浓度控制型启动子。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的组成型启动子包括GAP启动子。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖浓度控制型启动子包括：MSC1启动子、MAL31启动子、GAL4启动子。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LacI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Mit1AD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO: 4所示。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Mxr1AD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO: 5所示。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Prm1AD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO: 6所示。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白结合序列以1～15拷贝存在。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的蛋白结合序列以1～9拷贝存在。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养是以甘油和/或葡萄糖为碳源的培养。

12.DNA结合蛋白和转录激活因子的融合多肽或其编码基因的用途，用于甲醇营养型酵母消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性或碳源阻遏而更加强力的驱动外源多肽编码基因表达；所述的DNA结合蛋白为LacI；所述转录激活因子的激活域为Mit1AD，Mxr1AD或Prm1AD；所述甲醇营养型酵母为毕赤酵母(Pichia)。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的碳源是甘油和/或葡萄糖。

14.一种重组的甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母含有：

表达盒1，其表达外源的DNA结合蛋白和转录激活因子激活域的融合多肽，所述的转录激活因子是甲醇营养型酵母中具备独立招募RNA聚合酶能力的转录因子蛋白；所述的DNA结合蛋白为LacI；所述转录激活因子的激活域为Mit1AD，Mxr1AD或Prm1AD；以及

表达盒2，从5’→3’依次包括操作性连接的：蛋白结合序列、核心甲醇诱导型启动子，外源多肽编码基因；所述的蛋白结合序列与表达盒1中的DNA结合蛋白能发生结合；所述蛋白结合序列为lacO，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示；所述核心甲醇诱导型启动子为AOX1核心启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示。

15.如权利要求14所述的重组的甲醇营养型酵母，其特征在于，所述的表达盒1中还包括启动子，所述的启动子包括：组成型启动子或葡萄糖浓度控制型启动子。

16.如权利要求15所述的重组的甲醇营养型酵母，其特征在于，所述的组成型启动子包括GAP启动子。

17.如权利要求15所述的重组的甲醇营养型酵母，其特征在于，所述的葡萄糖浓度控制型启动子包括：MSC1启动子、MAL31启动子、GAL4启动子。

18.如权利要求14所述的重组的甲醇营养型酵母，其特征在于，所述的LacI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

19.如权利要求14所述的重组的甲醇营养型酵母，其特征在于，所述的Mit1AD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示。

20.如权利要求14所述的重组的甲醇营养型酵母，其特征在于，所述的Mxr1AD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。

21.如权利要求14所述的重组的甲醇营养型酵母，其特征在于，所述的Prm1AD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示。

22.如权利要求14所述的重组的甲醇营养型酵母，其特征在于，所述的表达盒2中，所述的蛋白结合序列lacO以1～15拷贝存在。

23.如权利要求22所述的重组的甲醇营养型酵母，其特征在于，所述的蛋白结合序列lacO为1～9拷贝。