CN103361345A - 重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法，主要是将T7噬菌体的生物元器件T7RNApolymase gene和T7 promoter，以及乳糖操纵子的元器件lacI、lacP、lacO进行重新组合，并分别整合到次级代谢产物生物合成基因簇的上下游特定位点，强制启动生物合成基因簇，达到高效转录与表达。包括实现生物元件整合所需穿梭载体的构建、重组质粒导入工业微生物、工程菌筛选、工程菌生物合成的调控等。本发明可以大幅度提高次级代谢产物的产量。
Description
技术领域
本发明属于基因组改良重组领域，更具体的涉及一种重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法。
背景技术
提高工业微生物产量，降低消耗，减少污染，提高经济效益是微生物工程和代谢工程的研究重点，同时也是微生物学科研究的难题和热点，是生命科学研究的重要领域。
随着分子生物学技术的飞速发展，基因工程，蛋白质工程，微生物分子遗传学工程相继应运而生；随着计算机科学的发展，生物信息学应运而生，并很快融入了分子生物学，这些学科的相互交融，使得基因工程如虎添翼，以飞快的速度推动了工业微生物基因组改良的发展，并逐步上升到应用阶段的研究。
重组生物元器件导入各种工业微生物，进而改良重要微生物的功能，是发达国家力争控制生命科技制高点的重要战略，是后基因组时代竞争的焦点。
工业微生物基因组改良是微生物工程技术研究前沿的代表，其研究内容，技术特征独树一帜。借助生物元器件重组，改良药用微生物特征，具有极大的科学意义和现实意义，对国民经济发展具有潜在的、不可估量的经济价值。
本研究以药用小单孢菌为例，阐述采用重组生物元器件，改良并强制调控药用微生物生物合成基因簇的转录，达到高效表达，提高次级代谢产物产量的全过程。本研究也适合于相关药用微生物的基因组改良。
小单孢菌(Micromonospora)被称为稀有放线菌，是重要的药用微生物，能产生丰富的化合物，特别是氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素，小诺霉素和西索米星等。氨基糖苷类抗生素是临床上重要的抗感染药物，最新研究表明该类抗生素还具有抗病毒功效。小单孢菌产生的抗生素，对农业和医药等领域的贡献巨大，但药用小单孢菌发酵单位，生物合成能力一直难以提高。
依纽小单孢菌是西索米星产生菌。西索米星（sisomicin，SM）是重要的氨基糖苷类抗生素，属广谱抗感染药物。西索米星可在其脱氧链霉胺环上的1-N位上，以乙基取代而得到半合成氨基糖苷类抗生素—奈替米星（netilmicin），其抗菌作用和安全性都优于西索米星，耳毒副作用较低，疗效好。美国Achaogen公司对西索米星进行结构修饰的衍生物—ACHN-490，被誉为“新一代氨基糖苷类抗生素”。该衍生物对产氨基糖苷类钝化酶的葡萄球菌、肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和不动杆菌具有良好的抗菌活性，该药物有望替代替加环素，多粘菌素，被认为是一种对抗全世界医疗机构耐药菌的潜在有效媒介。
早期对产西索米星的小单孢菌进行改良，主要采用传统的经典常规诱变育种和生产工艺优化，但收效甚微。二十世纪八十年代兴起的基因工程研究，虽然在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、及杂合抗生素生产等方面取得长足进步。但在小单孢菌研究上，始终未能取得实质性进展。因此选择依纽小单孢菌进行基因组改良，特别是生物调控元器件组装的改装，具有代表性，且有特殊的实用意义。
基于T7噬菌体编码的T7RNA聚合酶能选择性地激活T7启动子，并高效启动下游基因的转录。而生物元器件(lacI、lacP、lacO、T7RNApol、T7promoter)偶联，在大肠杆菌基因表达中已经得到验证与应用。科学家还发现哺乳类动物细胞转录系统也能启动T7 Ⅲ类启动子。同时，Sanding利用α-amanitine进行体外转录实验，认为T7 Ⅲ类启动子能被真核生物RNA聚合酶Ⅱ所识别。相关研究也报道了利用核定位信号修饰的T7RNA聚合酶，所构建的串联表达系统，应用于植物基因表达的研究。但噬菌体的重要系列生物元件如何进行巧妙组装，导入药用微生物，特别是跨属小单孢菌，整合到染色体的什么位点，如何进行调控等，是一个未曾研究的科学难题。本发明正是针对这些难题，对重要的噬菌体生物元器件进行合理组装，并插入小单孢菌生物合成基因簇，大幅度地提高次级代谢产物的产量，取得了显著效果。
发明内容
本发明的目的是通过研究利用调控生物元器件，强化药用微生物次级代谢产物生物合成基因簇的转录与表达，获得高产工程菌，提高次级代谢产物的产量。本发明提供了一种重组调控生物元器件强化次级代谢产物合成的方法，适用于相关药用微生物次级代谢产物生物合成基因簇的改良。
本发明通过将功能强大的噬菌体生物元器件T7 promoter、T7RNApolymerase gene，以及调控机制清晰的乳糖操纵子元器件lacI、lacP、lacO，这两类元器件分别整合到次级代谢产物生物合成基因簇的上下游特定位点，借助生物元器件的高效启动与转录功能，高水平转录生物合成关键基因，增强次级代谢产物的合成。
具体步骤如下：
（1） 含有T7 promoter基因片段的重组质粒的构建；
利用PCR技术，分别获得强启动子T7 promoter插入位点的上下游DNA片段，并将这两个片段连接到基础质粒pKC1139上，构建重组质粒。
（2） 重组质粒转化相关工业微生物，获得重组工程菌；
（3） 重组T7 promoter生物元器件工程菌的筛选；
工程菌根据抗生素抗性表型进行筛选，获得同源双交换突变株，利用PCR技术在DNA水平上，对工程菌株进行初步鉴定，并测序验证T7启动子插入到次级代谢产物生物合成基因簇的下游特定位点。
（4） 含有生物元器件lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter的重组质粒的构建；
采用PCR技术，分别获得含有T7 promoter序列的重组生物元器件插入位点的上下游片段和lacI-lacP-lacO-T7RNApol片段，将这三个片段先后连接到基础质粒pKC1139上，构建含有生物元器件lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter的重组质粒。
（5） 重组质粒转化重组工程菌，重组lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter生物元器件工程菌的筛选；
重组质粒转化步骤（3）获得的重组T7 promoter生物元器件工程菌，根据抗生素抗性标记进行筛选，利用PCR技术在DNA水平上对工程菌进行初步鉴定，并测序验证重组生物元器件lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter插入到次级代谢产物生物合成基因簇的上游特定位点，最终获得在药用微生物生物合成基因簇的上下游分别插入T7promoter和重组生物元器件lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter的工程菌。
（6） 工程菌代谢产物生物合成的调控。
其中，所述的次级代谢产物，包括西索米星。
所述的步骤（2）的相关工业微生物，包括小单孢菌。
所述的步骤（2）和步骤（5）的转化方法指可将重组质粒导入工业微生物的各种方法，包括电转化法,接合转移法或原生质体融合法。
本发明可应用于工业微生物基因组改造，达到高产、稳产、低耗、环保和节能的目的。在工业微生物，特别是微生物制药领域，应用空间极大。
附图说明
图1：T7promoter整合到西索米星生物合成基因簇下游位点的示意图
I：出发菌株染色体DNA原型结构示意图1；II：与染色体HB2发生单交换；III：与染色体HB1发生单交换；IV：回复突变；V：与:染色体发生双交换。
图2：重组生物元器件(lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter) 整合到西索米星生物合成基因簇上游位点的示意图
I：出发菌株染色体DNA原型结构示意图2；II：与染色体HB3发生单交换
图3：工程菌依纽小单孢菌DTS213中重组生物元件的调控模式图
I：无诱导物诱导；II：IPTG诱导
具体实施方式
以下是本发明具体实施的例子，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。
实施例1：构建用于生物元器件T7 promoter整合的重组质粒
1. 引物设计与重组质粒构建
根据公布的西索米星生物合成基因簇序列(GenBank Accession Number JF431003)，以基因簇下游的CDS28与CDS29之间202bp序列为T7 promoter的替换靶位点，分别在该位点的上下游设计两对交换臂扩增引物。引物P1/P2扩增HB1序列；引物P3/P4扩增HB2序列。由于T7 promoter只有20bp，而且考虑到T7 promoter的方向应与生物合成基因的转录方向应一致，应将T7 promoter添加到HB1下游引物(P2)的5′端，通过扩增HB1合成T7 promoter。
以依纽小单孢菌TS388基因组为模板进行PCR，分别扩增得到片段HB1和HB2。最后将这两个片段通过酶切位点先后连接到含有安普霉素筛选标记的pKC1139质粒上，获得最终重组质粒pHB202。所用相关引物如下：
实施例2：重组质粒pHB202转化依纽小单孢菌
1. 供体菌制备
通过CaCl2法将穿梭质粒pHB202转入到大肠杆菌ET12567(pUZ8002)，得到供体菌（ET12567/pUZ8002/pHB202）。将过夜培养的供体菌以1%的接种量转接到含相应抗生素（卡那霉素25ug/ml，氯霉素25ug/ml以及安普霉素50ug/ml）的30 mL LB液体培养基中，37℃培养2-3 h，控制OD600在0.4-0.6之间，离心收集菌体。用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体两次后，再用1mL新鲜LB重悬浮，备用。
2. 依纽小单孢菌孢子悬液制备
从生长良好的斜面刮取新鲜孢子，用5 mL 0.05 mol/L的TES缓冲液（pH 8.0）悬浮，于旋涡混合器上剧烈震荡，打散孢子；将孢子悬液置于50℃水浴锅中，热激10min；冷却至室温后加入等体积的预萌发培养基（预先加入了1M CaCl2），混合均匀；37℃摇床震荡培养12-14 h；离心（8000 rpm×5 min），收集孢子并重悬浮于适量的LB中；在漩涡振荡器上打散孢子。
3. 细菌与依纽小单孢菌的接合转移
将质粒pHB202转入E.coli ET12567 (pUZ8002)中，得到供体菌E.coliET12567 (pUZ8002/pHB202)。经接合转移将质粒导入依纽小单孢菌TS388孢子，37℃培养18-20 h后，用安普霉素（50ug/ml）和萘啶酸（25ug/ml）水溶液覆盖，37℃继续培养5天长出转化子，将所获得的安普霉素抗性（ApR）转化子点接至含有安普霉素（50ug/ml）和萘啶酸（25ug/ml）的平板培养基上，37℃培养7d。只有质粒整合到染色体上的转化子才能表现出安普霉素抗性。进一步提取其染色体DNA，利用引物（A1/A2）进行PCR验证，以证实单交换顺利完成。获得的单交换菌株命名为依纽小单孢菌DTS202。
实施例3：生物元器件T7 promoter插入基因簇工程菌的筛选
将依纽小单孢菌DTS202在无抗性斜面上连续传3代后，进行分离纯化，挑取单菌落分别点到含安普霉素（50μg/mL)的平板和无安普霉素抗性的平板上，从中筛选安普霉素敏感菌株。挑选其中一株，提取其染色体DNA作为模板，设计一对引物（P5/P6）进行PCR验证，并测序，证明生物元器件T7promoter插入到西索米星生物合成基因簇下游的CDS28与CDS29之间。该菌株即为双交换工程菌，命名为依纽小单孢菌TS202。
实施例4：构建用于重组元器件(lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter)整合的重组质粒
1. 引物设计与重组质粒构建
以基因簇16S rRNA与 CDS2之间的169bp序列，作为生物元器件(lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter)的替换靶点，分别在该靶点的上下游设计两对交换臂扩增引物：引物P7/P8扩增HB3序列；引物P9/P10扩增HB4序列。由于T7 promoter只有20bp，而且考虑到T7 promoter的方向应与生物合成基因的转录方向一致，应将T7 promoter添加到HB3下游引物(P9)的5′端，通过扩增HB3插入T7 promoter。
以依纽小单孢菌TS388基因组为模板进行PCR反应，分别扩增得到片段HB3和HB4，同时以 E.coli BL21（DE3）染色体为模板，以引物P11/P14进行PCR扩增，得到(lacI-lacP-lacO-T7RNApol)片段（4371bp），最后将这三个片段通过酶切位点先后连接到含有安普霉素筛选标记的pKC1139质粒上，获得最终重组质粒pHB213。所用相关引物如下：
实施例5：含重组质粒pHB213依纽小单孢工程菌的筛选
将穿梭质粒pHB213转入E.coli ET12567/pUZ8002，经接合转移将其导入依纽小单孢菌TS202。转化后置于37℃中培养18-20h，覆盖安普霉素溶液（50ug/ml）和萘啶酸溶液(25ug/ml)，继续培养直至长出转化子，其中1个，命名为依纽小单孢菌DTS213。提取其染色体DNA作为模板，以引物A1/A2进行PCR检测，同时分别以引物P11/P12（lacI-lacP-lacO）和P13/P14（T7RNApol）进行PCR验证，初步证实DTS213菌株为单交换工程菌。
进一步设计两对双交换鉴定引物P15/P16 （覆盖上游染色体DNA序列，HB3和部分lacI序列）和P17/P18（覆盖部分T7RNApol，HB4和下游染色体DNA）进行PCR鉴定。引物P15/P16扩增结果与预测吻合；引物P17/P18扩增没有得到清晰的主条带，这是因为序列太长（13468bp），PCR无法扩增出来。说明单交换是发生在HB3交换臂上，证明(lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter)插入到西索米星生物合成基因簇下游的16SrRNA与CDS2之间。
实施例6：依纽小单孢菌DTS213发酵单位的测定
1. 依纽小单孢菌DTS213的发酵培养
种子培养基：黄豆饼粉1.0%，玉米淀粉1.0%，葡萄糖0.1%，蛋白胨0.2%，玉米粉1.5%， CaCO3 0.5%，KNO3 0.05%，pH7.0。
发酵培养基：黄豆饼粉2.0 %，玉米粉1.0%，玉米淀粉6.0%，蛋白胨0.4%， (NH4)2SO4 0.1%，KNO3 0.01%， CaCO3 0.5%，淀粉酶0.025%，pH7.5。
将实施例5中获得的依纽小单孢菌DTS213进行发酵。从生长良好的新鲜斜面刮取孢子，接入到含有50mL种子培养基的三角瓶中，于37℃, 220 rpm振荡培养约28 h。种子长好后，以10％的接种量接入含50mL的发酵培养基，37℃, 220 rpm振荡培养约120h。
发酵方式包括不加诱导剂和加诱导剂。
2．发酵液处理与测定
发酵液经浓H2SO4酸化至pH 1.5~2.0，室温静置30 min，再通过NaOH回调至pH 6.5~7.0，离心（12000rpm，15min），取上清液。用pH 6.0的磷酸盐缓冲液稀释到合适浓度后，备用。
发酵单位测定采用生物效价鉴定法，见中国药典2010年版。
不加入诱导物诱导，依纽小单孢菌DTS213发酵单位低。
加入IPTG诱导，依纽小单孢菌DTS213的发酵单位比出发菌株提高了约2.5倍。
1.双交换工程菌TS202的引物（P5/P6）PCR测序结果
AGCCAGTCATGCTGCGCGACGCACGCTTGACCAGGGAAGCTAATCGAAGGTTCTTCATGACCTTTCCTCAACTCTTGAGAGTGACGGATAAATGCCAGGCAGTCGACCGCCGAATACGGCGAGAATGGTCGCCATTCGGCTAGATCAATGCTAGCTAAACTGTCAAGCGGGTTGCCGCTGACCAGATCCCAGATTCGGGTGCATTCACGGAGGCCTGAACCAACAGTCGCGGGTCCGCCCTATAGTGAGTCGTATTATCTAGAGATTACTAGTTCCGGAATTGGCCACTTGCCCGGTCAGTCACGTGGACGCGTCGGACACTTCCCTTATTTCCGACGGCTCCGGCATCATGCAGCAGCGGAATCACTTATGGTGACAACCCCGCGAGCAATACGTTGCCGCGGCTCCCATCGGGAGGCTCTATCCGCTGGTTCGGGCTCCGGAACGACCGGCGCGGGCGGATTGCTCCGTGGTGCCCGCGCTCCCCTGCTGCGCCGCCAGGCGCACCTGCTCGTACACCCAGTTGCG
2.工程菌DTS213的引物（P11/P12）PCR测序结果
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TCGCAGAAACGTGGCCGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTAGTGGTTTCACATTCACCACACTAGT
3.工程菌DTS213的引物（P13/P14）PCR测序结果
TCTAGATATTGATTTGGCGTTACGCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTCACGGAGGTTCAAGTTACCTTTAGCCGGAAGTGCTGGCATTTTGTCCAATTGAGACTCGTGCAACTGGTCAGCGAACTGGTCGTAGAAATCAGCCAGTACATCACAAGACTCATATGTGTCAACCATAGTTTCGCGCACTGCTTTGAACAGGTTCGCAGCGTCAGCCGGAATGGTACCGAAGGAGTCGTGAATCAGTGCAAAAGATTCGATTCCGTACTTCTCGTGTGCCCACACTACAGTCTTACGAAGGTGGCTACCGTCTTGGCTGTGTACAAAGTTAGGAGCGATACCAGACTCCTGTTTGTGTGCATCAATCTCGCTATCTTTGTTGGTGTTAATGGTAGGCTGTAAGCGGAA
CTGACCGAGGAACATCAGGTTCAAGCGCGTCTGAATAGGCTTCTTGTATTCCTGCCACACAGGGAAACCATCAGGAGTTACCCAATGCACAGCGCAACGCTTGCGAAGAATCTCTCCAGTCTTCTTATCTTTGACCTCAGCAGCCAGCAGCTTAGCAGCAGACTTAAGCCAGTTCATTGCTTCAACCGCAGCTACCACCGTCACGCTCACAGATTCCCAAATCAGCTTAGCCATGTATCCAGCAGCCTGATTCGGCTGAGTGAACATCAGACCCTTGCCGGAATCAATAGCTGGCTGAATGGTATCTTCCAGCACTTGTTGACGGAAGCCGAACTCTTTGGACCCGTAAG
CCAGCGTCATGACTGAACGCTTAGTCACACTGCGAGTAACACCGTAAGCCAGCCATTGACCAGCCAGTGCCTTAGTGCCCAGTTTGACTTTCTCAGAGATTTCACCAGTGTTCTCATCGGTCACGGTAACTACTTCGTTATCGGTCCCATTGATTGCGTCTGCTTGTAGAATCTCGTTGACTTTCTTAGCAACAATCCCGTAGATGTCCTGAACGGTTTCACTAGGAAGCAAGTTAACCGCGCGACCACCTACCTCATCTCGGAGCATCGCGGAGAAGTGCTGGATGCCAGAGCAAGACCCGTCAAACGCCAGCGGAAGGGAGCAGTTATAGCTCAGGCCGTGGTGCTGT
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TGCTCAAGCATGAACTCAAGGCTGATACGGCGAGACTTGCGAGCCTTGTCCTTGCGGTACACAGCAGCGGCAGCACGTTTCCACGCGGTGAGAGCCTCAGGATTCATGTCGATGTCTTCCGGTTTCATCGGGAGTTCTTCACGCTCAATCGCAGGGATGTCCTCGACCGGACAATGCTTCCACTTGGTGATTACGTTGGCGACCGCTAGGACTTTCTTGTTGATTTTCCATGCGGTGTTTTGCGCAATGTTAATCGCTTTGTACACCTCAGGCATGTAAACGTCTTCGTAGCGCATCAGTGCTCTCTTACTGTGAGTATGCACCAGCGCCAGAGGACGACGACCGTTAGC
CCAATAGCCACCACCAGTAATGCCAGTCCACGGCTTAGGAGGAACTACGCAAGGTTGGAACATCGGAGAGATGCCAGCCAGCGCACCTGCACGGGTTGCGATAGCCTCAGCGTATTCAGGTGCGAGTTCGATAGTCTCAGAGTCTTGACCTACTACGCCAGCATTTTGGCGGTGTAAGCTAACCATTCCGGTTGACTCAATGAGCATCTCGATGCAGCGTACTCCTACATGAATAGAGTCTTCCTTATGCCACGAAGACCACGCCTCGCCACCGAGTAGACCCTTAGAGAGCATGTCAGCCTCGACAACTTGCATAAATGCTTTCTTGTAGACGTGCCCTACGCGCTTGT
TGAGTTGTTCCTCAACGTTTTTCTTGAAGTGCTTAGCTTCAAGGTCACGGATACGACCGAAGCGAGCCTCGTCCTCAATGGCCCGACCGATTGCGCTTGCTACAGCCTGAACGGTTGTATTGTCAGCACTGGTTAGGCAAGCCAGAGTGGTCTTAATGGTGATGTACGCTACGGCTTCCGGCTTGATTTCTTGCAGGAACTGGAAGGCTGTCGGGCGCTTGCCGCGCTTAGCTTTCACTTCCTCAAACCAGTCGTTGATGCGTGCAATCATCTTAGGGAGTAGGGTAGTGATGAGAGGCTTGGCGGCAGCGTTATCCGCAACCTCACCAGCTTTAAGTTGACGCTCAAAC
ATCTTGCGGAAGCGTGCTTCACCCATCTCGTAAGACTCATGCTCAAGGGCCAACTGTTCGCGAGCTAAACGCTCACCGTAATGGTCAGCCAGAGTGTTGAACGGGATAGCAGCCAGTTCGATGTCAGAGAAGTCGTTCTTAGCGATGTTAATCGTGTTCATTTAGTGCCTCTTCCAGTTAAGATCT
4.工程菌DTS213的引物（P15/P16）PCR测序结果（P15单端）
GAGTATCATGCAGTACTCCGGATCACTATTTGTTTTCTCTTCCTACGGGTACTGAGATGTTTCACTTCCCCGCGTTCCCCCCATACACCCTATGTGTTCAGGTGCAGGTGACATCACATGACTGATGCCAGGTTTCCCCATTCGGACACCCTGGGATCACAGCTTGGTTGACAGCTCCCCCAGGCCTATCGCGGCCTCCCACGTCCTTCATCGGCTCCTGGTGCCAAGGCATCCACCGTTCGCCCTTGACAACTTGACCACAAAGATGCTCGCGTCCACTGTGCAATTCTCAACCAACGACCAACCCACAACCCACAAGCCCCACACCTAAACCCACACCAGGATCCGGTTTGCAGGACCAGGCCATGCCTGGCAGCTTTCGCCTAAAGAAACCAACCACACAAGGTTGTTCCTTCAGGACCCAACAGGGTGCCATCCGCCCCTCCCCAGCCGCACCACAACCCCCGTTCCTGCACCCCCCGAAGAGAGCGTGTACTAGAAGATCCATGGCCGTTGCCAGGAAAAGACTCACCAGTGTCTCCGCCATCGAGCACCCCGACCTGACATTCGCAGATCGCGGGCTCCTTACCACCCTTCGGTGGAAGGTGCTCCTTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGGTACGGCTACCTTGTTACGACTTCGTCCCAATCGCCAGCCCCACCTTCGACGGCTCCCTCCACAAGGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTGCCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCACGGGGTCGAGTTGCAGACCCCGATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGGGATTCGCTCCACCTCACGGTATCGCAGCCCATTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTTCGATGAGTCCCCCGCCATAACGCGCTGGCAACATCGAACGAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCCACCAACCTGTGAA
5.工程菌DTS213的引物（P15/P16）PCR测序结果（P16单端）
AGAGGCTATGATCCAGCAGTGGCGCGCTGCCCGAGGGATGGTGGCCGCCGCGTTGAGGGTTCGACGCCGGTTCGTTGTAACATCGACACCGCCACGCTGGCGGCCAATTGATCGGCGCGGCAGGAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGGCTGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACACTAGAGATTACTAGTGATTTATACCCCGGACTGGCTGGGCATGCTTCGGTGTGTCTGGTTGGTTGGGATTCCTTTGGCAACACTTTTGTTGCCGGGACGATTGTTCAACAAGTTTTTGTTGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGTCCTAGGCTTTGGGATAACCCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGAATAGGACCGTCGATCGCATGATCGTTGGTGGAAAGTTTTTCGGCCTGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGTGCGGAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGTAAGTGACGGTACCTGCAGAACAACCGCCTGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCTCGGTAAGACGTACGGCGCGAAGCGTTGTCGGGATTTATTGGAGCGTAAAGAGCTGTAAGGCGGCTTGTCCCGTTCAACTGTTGAAAACCCGCAATTCAACTG
Claims (9)
1.一种重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法，其特征是：功能强大的噬菌体生物元器件T7 promoter、T7RNApolymerase gene，以及调控机制清晰的乳糖操纵子元器件lacI、lacP、lacO，这两类元器件分别整合到次级代谢产物生物合成基因簇的上下游特定位点，借助生物元器件的高效启动与转录功能，高水平转录生物合成关键基因，增强次级代谢产物的合成。
2.根据权利要求1所述的重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法，其特征是所述的次级代谢产物，包括西索米星。
3.根据权利要求1所述的重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法，其特征的具体步骤如下：
（1）含有T7 promoter基因片段的重组质粒的构建；
（2）重组质粒转化相关工业微生物，获得重组工程菌；
（3）重组T7 promoter生物元器件工程菌的筛选；
（4）含有生物元器件lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter的重组质粒的构建；
（5）重组质粒转化重组工程菌，重组lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter生物元器件工程菌的筛选；
（6）工程菌代谢产物生物合成的调控。
4.根据权利要求3所述的重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法，其特征是：所述的步骤（1）是利用PCR技术，分别获得强启动子T7 promoter插入位点的上下游DNA片段，并将这两个片段连接到基础质粒pKC1139上，构建重组质粒。
5.根据权利要求3所述的重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法，其特征是：所述的步骤（3）是根据抗生素抗性表型筛选工程菌，获得同源双交换突变株，利用PCR技术在DNA水平上，对工程菌株进行初步鉴定，并测序验证T7启动子插入到次级代谢产物生物合成基因簇的下游特定位点。
6.根据权利要求3所述的重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法，其特征是：所述的步骤（4）是采用PCR技术，分别获得含有T7 promoter序列的重组生物元器件插入位点的上下游片段和lacI-lacP-lacO-T7RNApol片段，将这三个片段先后连接到基础质粒pKC1139上，构建含有生物元器件lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter的重组质粒。
7.根据权利要求3所述的重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法，其特征是：所述的步骤（5）是重组质粒转化步骤（3）获得的重组T7 promoter生物元器件工程菌，根据抗生素抗性标记进行筛选，利用PCR技术在DNA水平上对工程菌进行初步鉴定，并测序验证重组生物元器件lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter插入到次级代谢产物生物合成基因簇的上游特定位点，最终获得在药用微生物生物合成基因簇的上下游分别插入T7 promoter和重组生物元器件lacI-lacP-lacO-T7RNApol-T7promoter的工程菌。
8.根据权利要求3所述的重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法，其特征是：所述的步骤（2）的相关工业微生物包括小单孢菌。
9.根据权利要求3所述的重组调控生物元器件强化次级代谢产物生物合成的方法，其特征是：所述的步骤（2）和步骤（5）的转化方法包括接合转移、电转化法或原生质体融合法。
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