CN110079546B

CN110079546B - 一种用于毕赤酵母表达宿主的多基因敲入方法

Info

Publication number: CN110079546B
Application number: CN201910403132.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡孟浩; 刘启; 师晓娜; 张元兴
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2039-05-15
Also published as: CN110079546A

Abstract

本发明涉及一种用于毕赤酵母表达宿主的多基因敲入方法。针对毕赤酵母缺乏高效的靶向性敲入技术的问题，本发明提供了合适的gRNA靶点。应用本发明的方法进行基因组改造后的毕赤酵母，其生长代谢不受影响。所述方法能够高效地实现多个基因的快速敲入，且可以进行筛选标记的回收，为毕赤酵母异源合成天然产物提供强有力的工具。

Description

一种用于毕赤酵母表达宿主的多基因敲入方法

技术领域

本发明属于基因改造技术领域；更具体地，本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的无筛选标记多基因一步敲入的方法。

背景技术

毕赤酵母表达系统已被较为广泛地用于重组蛋白的表达和药用化合物的合成。目前，以毕赤酵母为底盘细胞已成功合成六甲基水杨酸、桔霉素、土曲霉酸、洛伐他汀、莫纳克林J等药用化合物或中间体，表现出巨大的应用前景和生产潜力。

毕赤酵母作为异源表达宿主具有诸多优势，但其同源重组效率相对酿酒酵母较低，导致其重组菌株构建难度较大，筛选效率不高。特别在以毕赤酵母为底盘细胞，进行多酶途径的组装时，重组菌株筛选标记不足，构建周期长等问题尤为突出。因此，在毕赤酵母中开发一套高效、无筛选标记的基因敲入方式，对于毕赤酵母在多酶途径合成方面非常重要。

CRISPR/Cas9系统自发展以来，已实现植物、线虫、果蝇、酵母、小鼠、斑马鱼等多个物种的基因编辑。该系统操作简单，特异性高，便于基因改造。Cas9在gRNA介导下对目标位点进行切割，形成DNA双链断裂(DSB)。DSB主要有两种修复方式，非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)。其中非同源末端连接在DSB附近发生碱基突变、缺失、随机插入，而同源重组需要含同源臂的供体DNA的参与，修复过程精确。

此外，同时表达多种gRNA实现多位点突变或多基因敲入，是提高CRISPR技术的工作效率的一种捷径，目前毕赤酵母内尚无多基因一步敲入方法的报道。

如果能够开发一套基于CRISPR/Cas9技术无筛选标记的多基因一步敲入技术，更高效地实现基因敲入，缩短构建周期，这对于毕赤酵母中多酶途径的组装具有积极意义。但由于毕赤酵母基因组复杂，不合适的基因改造的位点的运用往往导致其生长或代谢出现问题。

因此，本领域亟待找到在不影响毕赤酵母生长代谢的基础上，具有高效性的靶向操作位点，更特别地能够相互配合且敲入效率较高的多基因同时敲入位点。

发明内容

本发明的目的在于提供基于CRISPR技术的毕赤酵母多基因一步敲入方法。

在本发明的第一方面，提供一种对毕赤酵母的基因组进行定向基因敲入方法，所述方法包括：

(1)提供毕赤酵母，该毕赤酵母中KU70功能被下调或缺失；

(2)将一个或多个(如1～5个，进一步如2、3、4种)gRNA表达盒、与之相应的一个或多个(如1～5个，进一步如2、3、4种)供体构建物引入(1)的毕赤酵母中，同时还引入Cas9表达盒；

其中，所述gRNA靶向于gRNA靶点，所述gRNA靶点位于毕赤酵母基因组的基因启动子的上游100bp以内或者终止子的下游100bp以内；

其中，所述供体构建物包含操作性连接的：5’同源臂、外源的基因操作序列、3’同源臂；

(3)培养(2)的毕赤酵母，其基因组中发生一个或多个位置上的基因敲入。

在一个优选例中，所述的外源基因敲入包括：将外源基因设置于所述的“外源的基因操作序列”中，从而当将该基因操作序列被替换入细胞基因组后，该外源基因被定向地敲入到细胞基因组中。

在另一优选例中，所述的启动子包括：GAP启动子、TEF1-α启动子、AOX1启动子、FLD启动子、DHAS启动子、DAS启动子、FDH启动子、FMDH启动子、MOX启动子、AOX2启动子、ZZA1启动子、PEX5-启动子、PEX8-启动子、PEX14-启动子、PMP20启动子、PMP47启动子、AOD1启动子、AOD2启动子。

在另一优选例中，所述终止子包括：AOXTT终止子、DAS1TT终止子、TDH3TT终止子、RPS2TT终止子、RPS3TT终止子、IDP1TT终止子。

在另一优选例中，所述gRNA靶点包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的gRNA靶点。

在另一优选例中，(3)中，在无筛选压力的培养基中培养毕赤酵母，使质粒丢失，实现筛选标记的回收。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母为His营养缺陷型毕赤酵母。

在另一优选例中，所述无筛选压力下培养包括在固体培养基和液体培养基中培养。

在另一优选例中，所述的多个基因为：(a)多个不同基因，(b)多个相同基因，或(a)与(b)的组合。

在另一优选例中，所述gRNA表达盒、Cas9表达盒采用双向启动子表达，称为gRNA-Cas9。

在另一优选例中，所述的Cas9表达盒中，Cas9的编码基因具有密码子优化序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:67所示。

在另一优选例中，所述的5’同源臂、3’同源臂为毕赤酵母基因组中所述gRNA靶点两端的序列；较佳地，其长度为200bp～2000bp(更佳的为300bp～1500bp，如1000±200bp)

在另一优选例中，所述gRNA-Cas9质粒能够以游离形式存在于细胞中。

在另一优选例中，所述gRNA-Cas9质粒中含有自复制序列，包括但不限于PARS。

在另一优选例中，所述gRNA-Cas9质粒包含一个或多个选择性标记基因，可以是His、Zeocin、Geneticin、Hygromycin。

在另一优选例中，所述的gRNA表达盒中，在gRNA编码序列两端还包括自切割酶；较佳地，所述的自切割酶为HH核酶和/或HDV核酶；更佳地，在gRNA编码序列方两端分别连接HH核酶和HDV核酶。

在本发明的另一方面，提供用于对毕赤酵母的基因组进行定向基因敲入的构建体，所述构建体包括：

(i)一个或多个(如1～5个，进一步如2、3、4种)gRNA表达盒，所述gRNA靶向于gRNA靶点，所述gRNA靶点位于毕赤酵母基因组的基因启动子的上游100bp以内或者终止子的下游100bp以内；

(ii)与(i)中gRNA表达盒相应的一个或多个(如1～5个，进一步如2、3、4种)供体构建物，所述供体构建物包含操作性连接的：5’同源臂、外源的基因操作序列的插入位点、3’同源臂；

(iii)Cas9表达盒(较佳地，其与(i)的gRNA位于同一表达质粒或不同表达质粒)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒图谱示意图。

图2、pUC18-DKU70质粒图谱示意图。

图3、5个位点敲入效率箱线图。

图4、双片段敲入效率结果图。

图5、三片段敲入效率结果图。

具体实施方式

针对毕赤酵母缺乏高效的靶向性敲入技术的问题，本发明人经过广泛而深入的研究，构建了适于基因改造的菌株、选择到合适的gRNA靶点，开发了一种基于CRISPR技术的单或多基因快速敲入方法。本发明的方法可以在毕赤酵母中实现无筛选标记的多基因一步敲入。应用本发明的方法进行基因组改造后的毕赤酵母，其生长代谢不受影响。

术语

如本文所用，所述“供体构建物”是指一条包含有多个操作性连接的元件的核酸构建物，在基于CRISPR的技术中，其应用于为基因组上基因改造的靶区段提供合适的替换序列。

如本文所用，所述“基因操作序列”是指用于与细胞基因组的待编辑基因区域进行基因替换的序列，在基因编辑完成后，该“基因操作序列”的部分或全部将被替换到目标细胞的基因组中；在本发明中，其被设置于所述的供体构建物中。

如本文所用，所述“gRNA靶点”是指本发明中感兴趣的毕赤酵母基因组中适于进行基因编辑操作的目标区域。

如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或来自不同来源的核酸与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，所述的“构建物”包括“质粒”。

如本文所用，所述的“敲入”是指将外源的基因操作序列引入到目标细胞的基因组中。

如本文所用，所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的活性变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

如本文所用，所述的“终止子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的下游(3’端)，能够终止核酸序列转录为mRNA。在本文中，所述的终止子或终止子区包括终止子的活性变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的蛋白所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码蛋白的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

gRNA靶点

本发明中，找到了一系列适用于进行毕赤酵母基因敲入的gRNA靶点，从而可实现一个或多个基因的定向敲入。所述gRNA靶点位于毕赤酵母基因组的基因启动子的上游100bp以内或者终止子的下游100bp以内。

在本发明的优选方式中，所述的启动子包括：GAP启动子、TEF1-α启动子、AOX1启动子、FLD启动子、DHAS启动子、DAS启动子、FDH启动子、FMDH启动子、MOX启动子、AOX2启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-启动子、PMP20启动子、PMP47启动子、AOD1启动子、AOD2启动子等。

在本发明的优选方式中，所述终止子包括：AOXTT终止子、DAS1TT终止子、TDH3TT终止子、RPS2TT终止子、RPS3TT终止子、IDP1TT终止子等。

在本发明的更为优选方式中，所述的gRNA靶点包括TEF gRNA靶点、FLD gRNA靶点、AOX gRNA靶点、GAP gRNA靶点、AOXTT gRNA靶点。这些靶点可单独应用或同时应用于进行单基因或多基因的编辑操作。

在本发明的优选方式中，所述的TEF gRNA靶点核苷酸序列可以是如SEQ ID NO:2所示；所述的FLD gRNA靶点核苷酸序列可以是SEQ ID NO:1所示；所述的AOX gRNA靶点核苷酸序列可以是SEQ ID NO:3所示；所述的GAP gRNA靶点核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述的AOXTT gRNA靶点核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还包括与本发明的前述序列具有高度(如90％以上，更优选95％以上，进一步优选98％、99％以上)相同性的核酸。物种在自然情况下或一些特定因素影响下，可能会有碱基的变化，尽管本发明针对的物种为毕赤酵母，但是毕赤酵母的不同株系(如天然突变或人工改造的株系)的基因组中，仍会存在一些不影响酵母总体性能的碱基的变化。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。

在本发明的揭示下，本领域技术人员可以根据上述指示的gRNA靶点区域，来设计基于CRISPR技术的单或多基因敲入试剂。

本发明提供了一种构建体，其包含一个或多个gRNA表达盒，所述gRNA靶向于gRNA靶点，所述gRNA靶点位于毕赤酵母基因组的基因启动子的上游100bp以内或者终止子的下游100bp以内。

作为本发明的优选方式，还将gRNA表达盒与Cas9表达盒采用双向启动子表达，形成gRNA-Cas9，两者在同一构建体(质粒)中表达，可以有利于提高基因编辑的效率。较佳地，所述gRNA-Cas9质粒能够以游离形式存在于细胞中。较佳地，所述gRNA-Cas9质粒中含有自复制序列，包括但不限于PARS。较佳地，所述gRNA-Cas9质粒包含一个或多个选择性标记基因，可以是His、Zeocin、Geneticin、Hygromycin。

在本发明的优选方式中，设置双核酶(RGR)系统，其是将gRNA编码序列两端分别连接上HH核酶与HDV核酶，HH核酶、HDV核酶能自身形成颈环结构进行自剪切，释放出成熟的gRNA。RGR系统可以单独存在，也可以多个串联。

PAM序列为Cas9识别gRNA靶点所必需的一段核苷酸序列，存在于gRNA靶点下游。优选地，对于本文所用Cas9蛋白，其识别的PAM序列为NGG。

基因编辑的供体

本发明提供了一种对毕赤酵母的基因组进行定向基因敲入方法，其中包括供体构建物。在gRNA介导下Cas9对靶标序列切割形成双链断裂后，供体DNA能够通过同源重组的方式敲入到基因组。

本发明的供体构建物，该构建物依次(5’→3’)包括：5’同源臂、外源的基因操作序列、3’同源臂；其中，所述的基因操作序列是用于对细胞基因组的待编辑基因区域进行改造的序列。

本发明的供体构建物中，5’同源臂以及3’同源臂为毕赤酵母基因组中双链断裂位点两端的序列；较佳地，其长度为200bp～2000bp，更佳的为300bp～1500bp，如1000±200bp，更具体地如600bp、800bp、1000bp。对于本领域技术人员而言，在本发明的揭示下，可以方便地获得所述同源臂。

本发明的供体构建物中，所述的“基因操作序列”设置有与野生型基因序列相比发生外源基因片段插入的序列，从而当该基因操作序列被替换入细胞基因组后，细胞基因组定向地发生外源基因或基因片段的敲入；应理解，本发明的供体构建物中的各个元件(即：5’同源臂、外源的基因操作序列、3’同源臂)是根据所进行基因编辑的细胞的基因组序列进行设计的。在本发明所揭示的框架下，根据本发明所指出的毕赤酵母基因组中的优选的gRNA靶点，本领域技术人员可设计出序列不同的元件、组成序列不同的构建物，这也应被包含在本发明的范围内。

本发明的技术方案，适用于进行多基因的一次性敲入操作。因此，在一次的操作方法中，可以向酵母细胞中引入一个供体构建物，但其包含有多组5’同源臂-外源的基因操作序列-3’同源臂串联结构；或者，同时向酵母细胞中引入多个(包括两个)供体构建物。

在所述供体构建物的构建中，基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。所述的质粒中各元件的上游以及下游的位置，还可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。

通常，所述的供体构建物为一种质粒或被包含在质粒中，所述的质粒可被引入到细胞中。因此，本发明还包括一种质粒，其含有本发明所述的供体构建物，以及其它对于细胞转化、阳性转化子筛选有用的元件。

基因敲入方法及应用

本发明提供了一种对细胞基因组进行定向基因敲入方法，所述方法包括：(1)提供毕赤酵母，该毕赤酵母中KU70功能被下调或缺失；(2)将一个或多个gRNA表达盒、与之相应的一个或多个供体构建物引入(1)的毕赤酵母中，同时还引入Cas9表达盒；其中，所述gRNA靶向于gRNA靶点，所述gRNA靶点位于毕赤酵母基因组的基因启动子的上游100bp以内或者终止子的下游100bp以内；其中，所述供体构建物包含操作性连接的：5’同源臂、外源的基因操作序列、3’同源臂；(3)培养(2)的毕赤酵母，其基因组中发生一个或多个位置上的基因编辑。

作为本发明的优选方式，所述的毕赤酵母为非同源末端连接关键蛋白Ku70功能被下调(如被下调60％以上，较佳地被下调80％以上，更佳地被下调90％或95％以上)或缺失。在本发明的更为优选的实施方式中，设计了SEQ ID NO:66的KU70-gRNA片段，其靶向下调Ku70的效果理想。更佳地，所述的毕赤酵母为组氨酸营养缺陷型。本发明的方法可实现无筛选标记的多基因一步敲入。

在本发明的具体实施例中，建立了⊿ku70缺陷株，其在葡萄糖、甲醇、乙醇为唯一碳源条件下，生长均与出发菌株无明显差异。

在本发明的具体实施例中，将GFP作为报告蛋白进行同源重组效率验证，论证了本发明的靶向位点的高效性，可高效实现单一基因的敲入。此外，通过RGR系统将不同gRNA靶点进行组装，可高效地实现多基因的同时敲入。同时，筛选标记可以回收利用，基因敲入数量不受筛选标记的影响，为毕赤酵母异源合成天然产物提供强有力的工具。

本发明的高效的基因编辑方法可以应用于在基因组的特定位点敲入各种外源基因。所述外源基因可以是任何本领域技术人员感兴趣的基因，包括功能性基因、报告基因(比如荧光蛋白基因)、结构基因等。可以将多个基因同时敲入，或在多位点上同时敲入入同一个基因，当然，单基因单位置的敲入也是可以的。

本发明的方法也适用于给内源基因(目标基因)添加标签蛋白编码基因等。

本发明的高效的基因编辑方法，不仅能够高效地实现基因的敲入，同时也不影响毕赤酵母宿主菌的生长代谢。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料

所使用的工具酶均购自TaKaRa生物公司(大连，中国)，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。

下面的商品化质粒和菌株用于基因克隆和蛋白表达：质粒pUC18、质粒pPIC3.5k、大肠杆菌Top10、毕赤酵母菌株GS115均购自Invitrogen公司。p414-TEF1p-Cas9-CYC1t(#43802)购自Addgene。质粒pRDM05获自加州大学圣地亚哥分校。

pBAD33-mCherry质粒参见杨震博士学位论文：溶藻弧菌中Ⅵ型分泌系统对细菌的毒力调控机制[D](上海：华东理工大学，2018)中的记载。

pP-GFP质粒参见屠肖虎硕士学位论文：洛伐他汀合成途径的多细胞异源组装及优化[D](上海：华东理工大学，2017)中的记载。

KU70-gRNA片段：其序列为SEQ ID NO:6，合成后装载于pUC57质粒，即pUC57-KU70-gRNA质粒。

YPD培养基：2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖。

YNB培养基：1.34％YNB。

YND液体培养基：1％葡萄糖，1.34％YNB。

YNDH液体培养基：每100ml YND培养基添加12.5ug His。

配制以上培养基时，His溶液采用过滤除菌，葡萄糖115℃高压灭菌20min，其它成分121℃高压灭菌20min。固体培养基加2％琼脂粉。

PCR扩增上游及下游同源臂片段所用的引物如表1所示。

表1

本发明筛选获得的gRNA靶点以及一系列用于建立重组质粒的引物的序列如表2所示。

表2

实施例1、非同源末端修复机制功能缺陷株(⊿ku70)的构建

1.pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒的构建

根据KU70基因序列，进行位点的筛选，选择KU70 gRNA靶点序列(SEQ ID NO:6)，其靠近转录起始位置，并且其在NCBI中与GS115基因组BLAST同源性较低。

以GS115基因组为模板，以DAS1TT-F/DAS1TT-R-2扩增出DAS1TT片段、以PARS-F/PARS-R扩增出PARS片段，以HTX1-F和HTX1-R pHTX扩增出pHTX片段。

以pUC57-KU70-gRNA质粒为模板，以pHTX1-HH-F/3AOX1扩增KU70-gRNA片段(SEQID NO:66)。其中包含HH核酶的编码序列。

以p414-TEF1p-Cas9-CYC1t质粒为模板，以Cas9(NLS)-F/Cas9(NLS)-R扩增Cas9片段。

以pPIC3.5K质粒为模板，以Plasmid-PARS/3AOX1F扩增CK片段。

将DAS1TT片段和PARS片段进行Overlap PCR得PARS-DAS1TT片段。

将KU70-gRNA片段和pHTX片段进行Overlap PCR得pHTX-KU70-gRNA片段。

将pHTX-KU70-gRNA片段、Cas9片段、PARS-DAS1TT片段、CK片段进行多片段克隆，得pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒(图1)。

2.pUC18-DKU70质粒的构建

分别以EcoR-Kup-F/MCS-Kup-R、MSC-Kdown-F/Hind-Kdown-R为引物，从GS115基因组上扩增出上游同源臂HAUP片段(KU70_UP)、下游同源臂HADO片段(KU70_DOWN)。将上述两片段经过Overlap PCR得到HAUP-HADO片段，之后与经EcoRI、HindIII双酶切线性化的pUC18质粒进行无缝克隆，得pUC18-DKU70质粒(图2)。

3.⊿ku70缺陷株的筛选

以pUC18-DKU70为模板，以引物Hind-Kdown-R/EcoR-Kup-F经PCR扩增获得供体DNA片段。将1μg供体DNA片段、100ng pPIC3.5K-KU70-gRNA环形质粒共转化到GS115。复苏后涂布于YND平板。4天后，挑取48个单菌落于液体YND培养基。提取基因组后PCR验证。以基因组为模板，inKU70UP-F/inKU70DO-R经PCR扩增后，电泳后出现较短条带(802bp)的为敲除KU70的菌株。

选择6株阳性菌株经YPD活化后于YPD固体培养基划线，倒置培养。2天后挑取单菌落，提取基因组PCR验证。采用引物inCas9 R1/3AOX1验证质粒是否丢失，采用引物inKU70UP-F/inKU70DO-R再次验证KU70基因是否敲除。将验证正确的菌株，经无菌水洗涤后涂布于MGY固体培养基，倒置培养5天后，平板上一直没有生长菌落，说明菌株中含His的游离质粒已经丢失。

由上述结果可见，本发明方法可获得非同源末端修复机制功能缺陷株(⊿ku70)，并实现His筛选标记的回收。

实施例2、敲入位点筛选

1、敲入位点的选择及gRNA设计

敲入位点应不影响毕赤酵母菌株的生长代谢，不影响已鉴定基因表达盒，以及能最大限度保证外源片段的插入不影响菌株本身生长。为了获得适合的敲入位点，本发明人进行了大量的筛选、实验论证，最终选择到相对高效的5个gRNA靶点，分别称为TEF、FLD、AOX、GAP、AOXTT，这些靶点主要位于启动子P_TEF1-a、P_FLD、P_AOX1、P_GAP上游100bp、终止子AOXTT下游100bp范围内。

TEF gRNA靶点序列如SEQ ID NO:2所示；FLD gRNA靶点序列如SEQ ID NO:1所示；AOX gRNA靶点序列如SEQ ID NO:3所示；GAP gRNA靶点序列如SEQ ID NO:5所示；AOXTTgRNA靶点序列如SEQ ID NO:4所示。

2、gRNA-Cas9系列质粒构建

以PAOX1-gRNA-F/inOri R引物，以pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒为模板，扩增出AOX-1片段。

以inOri F/PAOX1-gRNA-HTX-R引物，以pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒为模板，扩增出AOX-2片段。

以PGAP-gRNA-F/inOri R引物，以pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒为模板，扩增出GAP-1片段。

以inOri F/P GAP-gRNA-HTX-R引物，以pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒为模板，扩增出GAP-2片段。

以PTEF1-gRNA-F/inOri R，以pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒为模板，扩增出TEF-1片段。

以inOri F/P TEF-gRNA-HTX-R，以pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒为模板，扩增出TEF-2片段。

以PFLD-gRNA-F/inOri R，从pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒上扩增出FLD-1片段。

以inOri F/P FLD-gRNA-HTX-R，以pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒为模板，扩增出FLD-2片段。

以AOXTT-gRNA-F/inOri R，从pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒上扩增出AOXTT-1片段。

以inOri F/AOXTT-gRNA-HTX-R，从pPIC3.5K-KU70-gRNA质粒上扩增出AOXTT-2片段。

将AOX-1片段、AOX-2片段无缝克隆得3.5k-PAg质粒，含有AOX gRNA编码序列。

将GAP-1片段、GAP-2片段无缝克隆得3.5k-PGg质粒，含有GAP gRNA编码序列。

将AOXTT-1片段、AOXTT-2片段无缝克隆得3.5k-PAOXTT质粒，含有AOXTT gRNA编码序列。

将FLD-1片段、FLD-2片段无缝克隆得3.5k-PFg质粒，含有FLD gRNA编码序列。

将TEF-1片段、TEF-2片段无缝克隆得3.5k-PTg质粒，含有TEF gRNA编码序列。

上述构建的gRNA编码序列两端均包含核酶。

3、供体DNA装载质粒构建

使用GFP-F/GFP-R引物，以pP-GFP质粒为模板，扩增出GFP片段。将GFP片段与SacI、KpnI双酶切线性化的pUC18质粒进行无缝克隆得到pGG质粒。

以表1中相应引物，从GS115基因组上扩增出上游同源臂片段(AUP、GUP、TUP、FUP、ATUP)、下游同源臂片段(ADO、GDO、TDO、FDO、ATDO)。将相应上下游同源臂片段进行OverlapPCR得UP-DO片段。将UP-DO片段与XbalI、SalI双酶切线性化的pGG质粒无缝克隆得装载同源臂的质粒(pDGG-PAg、pDGG-PGg、pDGG-PTg、pDGG-PFg、pDGG-PATg)。

4、不同gRNA靶点敲入效率测定

利用SpeI、ApaI双酶切供体DNA质粒得相应供体DNA片段。将100ng前述建立的gRNA-Cas9质粒与1ug相对应的供体DNA片段共转入⊿ku70菌株后，使用酶标仪进行荧光结果的检测。利用荧光值的差异计算敲入效率。

结果表明，AOX位点敲入效率达到近100％，AOXTT位点效率为76.34％。GAP位点效率为92.63％。pTEF1位点效率为98.96％。pFLD位点效率为93.75％。5个位点敲入效率箱线图如图3。也即，敲入效率方面，AOX位点>pTEF1位点>pFLD位点>GAP位点>AOXTT位点。而本发明人前期验证过的其它一系列位点，则敲入效率更低于上述或无法实现敲入。

由上述结果可见，采用本发明方法可筛选到高效的gRNA。

同时，本发明人未观测到上述发生单位点敲入的酵母菌株、CS115出发菌株、未进行上述敲入的⊿ku70缺陷株的生长差异。

实施例3、双片段一步法同时敲入验证

1、3.5k-PAT质粒的构建

以HDV-2-R/inOri F为引物，从3.5k-PAg质粒上扩增出PAg片段。

以HDV-HH-T1-F/inOri R为引物，从3.5k-PTg质粒上扩增出PTg片段。

将PAg片段、PTg片段进行无缝克隆得3.5k-PAT质粒。含有AOX gRNA编码序列以及TEF gRNA编码序列。每个gRNA编码序列两端为核酶。

2、供体DNA装载质粒的构建

分别从pBAD33-mCherry质粒、pDGG-PTg质粒中扩增出mChy片段(引物mChy-F/3AOX1)、Tg片段(引物3AOX1F/pGAPDO-R)。

将mChy片段和Tg片段进行无缝克隆，得到pDGChy-PTg质粒。

3、双位点敲入效率验证

采用内切酶ApaI、SpeI分别双酶切pDGG-PAg、pDGChy-PTg质粒得到GA片段、mT片段。

将100ng 3.5k-PAT质粒、1μg GA片段、1μg mT片段加入酵母感受态中后电转，复苏3h后，涂布于YND平板。倒置培养5天后，挑单菌落于装有500ul YNDH培养基的96孔板培养。培养3天后，取50μl菌液于96孔板中，用去离子水稀释至合适浓度，利用酶标仪分别测量荧光值与OD值。结果见图4，结果表明两片段同时敲入的效率为65％。

由上述结果可见，本发明方法可实现双片段一步法同时敲入。

同时，本发明人未观测到上述发生双位点敲入的酵母菌株、CS115出发菌株、未进行上述敲入的⊿ku70缺陷株的生长差异。

实施例4、三片段一步法同时敲入验证

1、3.5k-PFAT质粒的构建

以3.5k-PFg质粒为模板，采用引物HDVTT-R/inOri F经PCR扩增得PFg片段。以3.5k-PAT为模板，采用引物HDV-pHTX-HH-F/inOri R经PCR扩增得PAT片段。将PFg片段和PAT片段进行克隆得到3.5k-PFAT质粒，含有FLD gRNA编码序列、AOX gRNA编码序列以及TEFgRNA编码序列。每个gRNA编码序列两端为核酶。

2、供体DNA装载质粒的构建

以pRDM05质粒为模板，以pGAP F/3AOX1为引物，扩增获得BFP片段。以pDGG-PFg质粒为模板，以3AOX1F/pGAP R为引物，扩增获得Fg片段。将BFP片段和Fg片段进行克隆得到pDGB-PFg质粒。

3、三位点敲入效率验证

采用内切酶ApaI、SpeI分别双酶切pDGG-PAg、pDGChy-Tg、pDGB-PFg质粒后，得到GA片段、mT片段、BF片段。

将100ng 3.5k-PFAT质粒和GA片段、mT片段、BF片段各1μg加入酵母感受态中后电转，复苏3h后，涂布于YND平板。倒置培养5天后，挑单菌落于装有500ul YNDH培养基的96孔板培养。培养3天后，取50μl菌液于96孔板中，用去离子水稀释至合适浓度，利用酶标仪分别测量荧光值与OD值。结果见附图5，结果表明三片段同时敲入的效率为24％。

由上述结果可见，本发明方法可实现三片段一步法同时敲入。

同时，本发明人未观测到上述发生三位点敲入的酵母菌株、CS115出发菌株、未进行上述敲入的⊿ku70缺陷株的生长差异。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改进或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种用于毕赤酵母表达宿主的多基因敲入方法

<130> 193180

<160> 67

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 1

gcggcagtaa ttgatatcgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

gcaagatggt taaaaggtga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

gcgcctacaa tgatgacatt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

tgacgcttat tatacccttt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

ttttaagatt tcaatcttga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

catcttagag aatgtcagtg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

caaatggcat tctgacatcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

ggatgtcaga atgccatttg 20

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

cacctgacgt tcgacaatta atatttactt attttggtca ac 42

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

agttacctaa acaaatcaaa aagatgctga tgagtccgtg agg 43

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

tcagtttgat tttgatttgt ttaggtaact 30

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

tcttgtccat cgtttcgtgt tgtagtttta atatagt 37

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

taattgtcga acgtcaggtg gcacttttc 29

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

cttatctcga gacccttgtg actgacactt 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

gaaggtgtga acgggaagtc tttacagttt 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

cacaagggtc tcgagataag ctgggggaac 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

gacttcccgt tcacaccttc ctcttcttct 30

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

aactacaaca cgaaacgatg gacaagaagt actccat 37

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

gggagaaagg cggacaggta 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 20

tacctgtccg cctttctccc 20

<210> 21

<211> 49

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 21

acagctatga ccatgattac gaattccacg ggtgattact tgtttacat 49

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 22

cggtaccatc gatgagctcg gctaagtgtg agaagaagag a 41

<210> 23

<211> 49

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 23

gtaaaacgac ggccagtgcc aagcttcaat accgataaag tggtcaact 49

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 24

cgagctcact agtggtaccg tgttccttac tttttcctcg ca 42

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 25

ctggccgtac acatttcaga 20

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 26

gcggagtctc gttattcata g 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 27

ccgagtgaca gggcgataag a 21

<210> 28

<211> 97

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 28

acaaatcaaa tcttgcctga tgagtccgtg aggacgaaac gagtaagctc gtcgcaagat 60

ggttaaaagg tgagttttag agctagaaat agcaagt 97

<210> 29

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 29

ctcatcaggc aagatttgat ttgtttaggt aacttgaact gg 42

<210> 30

<211> 97

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 30

acaaatcaaa ttaaaactga tgagtccgtg aggacgaaac gagtaagctc gtcttttaag 60

atttcaatct tgagttttag agctagaaat agcaagt 97

<210> 31

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 31

tcagttttaa tttgatttgt ttaggtaact tgaactgg 38

<210> 32

<211> 97

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 32

acaaatcaaa gcgtcactga tgagtccgtg aggacgaaac gagtaagctc gtctgacgct 60

tattataccc tttgttttag agctagaaat agcaagt 97

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 33

tcagtgacgc tttgatttgt ttaggtaact tgaactgg 38

<210> 34

<211> 97

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 34

acaaatcaaa tgccgcctga tgagtccgtg aggacgaaac gagtaagctc gtcgcggcag 60

taattgatat cgtgttttag agctagaaat agcaagt 97

<210> 35

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 35

ctcatcaggc ggcatttgat ttgtttaggt aacttgaact gg 42

<210> 36

<211> 97

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 36

acaaatcaaa aggcgcctga tgagtccgtg aggacgaaac gagtaagctc gtcgcgccta 60

caatgatgac attgttttag agctagaaat agcaagt 97

<210> 37

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 37

tcaggcgcct tttgatttgt ttaggtaact tgaactgg 38

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 38

taattcgcgg ccgtcccatt c 21

<210> 39

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 39

gaatgggacg gccgcgaatt atcttgcctg atgagtccgt g 41

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 40

gtcccattcg ccatgccgaa 20

<210> 41

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 41

ttcggcatgg cgaatgggac atcaaaaggc gcctgatga 39

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 42

ccatggtcct cgtttcgaaa 20

<210> 43

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 43

tttcgaaacg aggaccatgg tgagcaaggg c 31

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 44

gacgaggaca ccaagacatt 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 45

aatgtcttgg tgtcctcgtc 20

<210> 46

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 46

actagtctcg aggggcccct gagagtacat cggtttcaaa agg 43

<210> 47

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 47

ttgcatgcct gcaggtcgac tgtaggcgct gggatttcag g 41

<210> 48

<211> 47

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 48

ggtacccggg gatcctctag aatttggatt tggttgactc atgttgg 47

<210> 49

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 49

gggcccctcg agactagtgg gatagccatc gtttcgaata a 41

<210> 50

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 50

actagtctcg aggggcccaa aactggtctg ccaagcaca 39

<210> 51

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 51

ttgcatgcct gcaggtcgac tgatggattt cattgatcga t 41

<210> 52

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 52

ggtacccggg gatcctctag aagattgaaa tcttaaaatt gcccc 45

<210> 53

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 53

gggcccctcg agactagtgg agccaaacag ttggtagtac 40

<210> 54

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 54

actagtctcg aggggcccgt ggactttctt aggagagtca cta 43

<210> 55

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 55

ttgcatgcct gcaggtcgac tgaaggaggc cagacaggat t 41

<210> 56

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 56

ggtacccggg gatcctctag accttttaac catcttgccc attc 44

<210> 57

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 57

gggcccctcg agactagtgg gttgtaacca accttcttga t 41

<210> 58

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 58

actagtctcg aggggcccgc ccaatctgtt gtccccaaac ataa 44

<210> 59

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 59

ttgcatgcct gcaggtcgac atatcaatta ctgccgcatt gg 42

<210> 60

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 60

gggcccctcg agactagtct acagaatccc caaccttcac g 41

<210> 61

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 61

gggcccctcg agactagtct acagaatccc caaccttcac g 41

<210> 62

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 62

actagtctcg aggggccctc cagaggttcc attcacatta c 41

<210> 63

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 63

ttgcatgcct gcaggtcgac ttttggcatc gttgaagctt gca 43

<210> 64

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 64

ggtacccggg gatcctctag agggtataat aagcgtcatt tgcagc 46

<210> 65

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 65

gggcccctcg agactagtga ctcgtgtgtt ggccagtaa 39

<210> 66

<211> 211

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 66

aagatgctga tgagtccgtg aggacgaaac gagtaagctc gtccatctta gagaatgtca 60

gtggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa 120

agtggcaccg agtcggtgct tttggccggc atggtcccag cctcctcgct ggcgccggct 180

gggcaacatg cttcggcatg gcgaatggga c 211

<210> 67

<211> 4140

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 67

tcacaccttc ctcttcttct tggggtcagc cctgctgtct ccaccgagct gagagaggtc 60

gattcttgtt tcatagagcc ccgtaattga ctgatgaatc agtgtggcgt ccaggacctc 120

ctttgtagag gtgtaccgct ttctgtctat ggtggtgtcg aagtacttga aggctgcagg 180

cgcgcccaag ttggtcagag taaacaagtg gataatgttt tctgcctgct ccctgatggg 240

cttatccctg tgcttattgt aagcagaaag caccttatcg aggttagcgt cggcgaggat 300

cactcttttg gagaattcgc ttatttgctc gatgatctca tcaaggtagt gtttgtgttg 360

ttccacgaac agctgcttct gctcattatc ttcgggagac cctttgagct tttcatagtg 420

gctggccaga tacaagaaat taacgtattt agagggcagt gccagctcgt tacctttctg 480

cagctcgccc gcactagcga gcattcgttt ccggccgttt tcaagctcaa agagagagta 540

cttgggaagc ttaatgatga ggtctttttt gacctcttta tatcctttcg cctcgagaaa 600

gtcgatgggg tttttttcga agcttgatcg ctccatgatt gtgatgccca gcagttcctt 660

gacgcttttg agttttttag acttcccttt ctccactttg gccacaacca gtacactgta 720

agcgactgta ggagaatcga atccgccgta tttcttgggg tcccaatctt ttttgcgtgc 780

gatcagcttg tcgctgttcc ttttcgggag gatactttcc ttggagaagc ctccggtctg 840

tacttcggtc tttttaacga tgttcacctg cggcatggac aggaccttcc ggactgtcgc 900

gaaatcccta cccttgtccc acacgatttc tcctgtttct ccgtttgttt cgataagtgg 960

tcgcttccga atctctccat tggccagtgt aatctcggtc ttgaaaaaat tcataatatt 1020

gctgtaaaag aagtacttag cggtggcctt gcctatttcc tgctcagact ttgcgatcat 1080

tttcctaaca tcgtacactt tatagtctcc gtaaacaaat tcagattcaa gcttgggata 1140

ttttttgata agtgcagtgc ctaccactgc attcaggtag gcatcatgcg catggtggta 1200

attgttgatc tctctcacct tataaaactg aaagtccttt ctgaaatctg agaccagctt 1260

agacttcaga gtaataactt tcacctctcg aatcagtttg tcattttcat cgtacttggt 1320

gttcatgcgt gaatcgagaa tttgggccac gtgcttggtg atctggcgtg tctcaacaag 1380

ctgccttttg atgaagccgg ctttatccaa ctcagacagg ccacctcgtt cagccttagt 1440

cagattatcg aacttccgtt gtgtgatcag tttggcgttc agcagctgcc gccaataatt 1500

tttcattttc ttgacaactt cttctgaggg gacgttatca ctcttccctc tatttttatc 1560

ggatcttgtc aacactttat tatcaataga atcatctttg agaaaagact ggggcacgat 1620

atgatccacg tcgtagtcgg agagccgatt gatgtccagt tcctgatcca cgtacatgtc 1680

cctgccgttc tgcaggtagt acaggtagag cttctcattc tgaagctggg tgttttcaac 1740

tgggtgttcc ttaaggattt gggaccccag ttcttttata ccctcttcaa tcctcttcat 1800

cctttcccta ctgttcttct gtcccttctg ggtagtttgg ttctctcggg ccatctcgat 1860

aacgatattc tcgggcttat gccttcccat tactttgacg agttcatcca cgaccttaac 1920

ggtctgcagt attccctttt tgatagctgg gctacctgca agattagcga tgtgctcgtg 1980

aagactgtcc ccctggccag aaacttgtgc tttctggatg tcctccttaa aggtgagaga 2040

gtcatcatgg atcaactgca tgaagttccg gttggcaaat ccatcggact taagaaaatc 2100

caggattgtc tttccactct gcttgtctcg gatcccattg atcagttttc ttgacagccg 2160

cccccatcct gtatatcggc gcctcttgag ctgtttcatg actttgtcgt cgaagagatg 2220

agcgtaagtt ttcaagcgtt cttcaatcat ctccctatct tcaaacaacg taagggtgag 2280

gacaatgtcc tcaagaatgt cctcgttctc ctcattgtcc aggaagtcct tgtctttaat 2340

gattttcagg agatcgtgat acgttcccag ggatgcgttg aagcgatcct ccactccgct 2400

gatttcaaca gagtcgaaac attcaatctt tttgaaatag tcttctttga gctgtttcac 2460

ggtaactttc cggttcgtct tgaagaggag gtccacgata gctttcttct gctctccaga 2520

caggaatgct ggctttctca tcccttctgt gacgtatttg accttggtga gctcgttata 2580

aactgtgaag tactcgtaca gcagagagtg tttaggaagc accttttcgt taggcagatt 2640

tttatcaaag ttagtcatcc tttcgatgaa ggactgggca gaggccccct tatccacgac 2700

ttcctcgaag ttccagggag tgatggtctc ttctgatttg cgagtcatcc acgcgaatct 2760

ggaatttccc cgggcgaggg ggcctacata gtagggtatc cgaaatgtga ggattttctc 2820

aatcttttcc ctgttatctt tcaaaaaggg gtagaaatcc tcttgccgcc tgaggatagc 2880

gtgcagttcg cccaggtgaa tctggtgggg gatgcttcca ttgtcgaaag tgcgctgttt 2940

gcgcaacaga tcttctctgt taagctttac cagcagctcc tcggtgccgt ccattttttc 3000

caagatgggc ttaataaatt tgtaaaattc ctcctggctt gctccgccgt caatgtatcc 3060

ggcgtagcca tttttagact gatcgaagaa aatttccttg tacttctcag gcagttgctg 3120

tctgacaagg gccttcagca aagtcaagtc ttggtggtgc tcatcatagc gcttgatcat 3180

actagcgctc agcggagctt tggtgatctc cgtgttcact cgcagaatat cactcagcag 3240

aatggcgtct gacaggttct ttgccgccaa aaaaaggtct gcgtactggt cgccgatctg 3300

ggccagcaga ttgtcgagat catcatcgta ggtgtctttg ctcagttgaa gcttggcatc 3360

ttcggccagg tcgaagttag atttaaagtt gggggtcagc ccgagtgaca gggcgataag 3420

attaccaaac aggccgttct tcttctcccc agggagctgt gcgatgaggt tttcgagccg 3480

ccgggatttg gacagcctag cgctcaggat tgctttggcg tcaactccgg atgcgttgat 3540

cgggttctct tcgaaaagct gattgtaagt ctgaaccagt tggataaaga gtttgtcgac 3600

atcgctgttg tctgggttca ggtccccctc gatgaggaag tgtccccgaa atttgatcat 3660

atgcgccagc gcgagataga tcaaccgcaa gtcagcctta tcagtactgt ctacaagctt 3720

cttcctcaga tgatatatgg ttgggtactt ttcatggtac gccacctcgt ccacgatatt 3780

gccaaagatt gggtggcgct cgtgcttttt atcctcctcc accaaaaagg actcctccag 3840

cctatggaag aaagagtcat ccaccttagc catctcatta ctaaagatct cctgcaggta 3900

gcagatccga ttctttctgc gggtatatct gcgccgtgct gttcttttga gccgcgtggc 3960

ttcggccgtc tccccggagt cgaacaggag ggcgccaatg aggttcttct ttatgctgtg 4020

gcgatcggta ttgcccagaa ctttgaattt tttgctcggc accttgtact cgtccgtaat 4080

gacggcccaa ccgacgctgt ttgtgccgat atcgagccca atggagtact tcttgtccat 4140

Claims

1.一种对毕赤酵母的基因组进行定向基因敲入方法，其特征在于，所述方法包括：

(1) 提供毕赤酵母，该毕赤酵母中 KU70功能被下调或缺失；

(2) 将一个或多个gRNA表达盒、与之相应的一个或多个供体构建物引入(1)的毕赤酵母中，同时还引入Cas9表达盒；

其中，所述gRNA靶向于gRNA靶点，所述gRNA靶点位于毕赤酵母基因组的基因启动子的上游100 bp以内或者终止子的下游100 bp以内；所述的启动子为GAP启动子、TEF1-α启动子、AOX1启动子或FLD启动子；所述终止子为AOXTT终止子；

(3) 培养(2)的毕赤酵母，其基因组中发生一个或多个位置上的基因敲入。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述gRNA靶点选自SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5的gRNA靶点。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中，在无筛选压力的培养基中培养毕赤酵母，使质粒丢失，实现筛选标记的回收；或

所述的毕赤酵母为His营养缺陷型毕赤酵母。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多个基因为：(a)多个不同基因，(b)多个相同基因，或(a)与(b)的组合。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述gRNA表达盒、Cas9表达盒采用双向启动子表达，称为gRNA-Cas9；或

所述的Cas9表达盒中，Cas9的编码基因具有密码子优化序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO: 67所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5’同源臂、3’同源臂为毕赤酵母基因组中所述gRNA靶点两端的序列。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的5’同源臂、3’同源臂长度为200 bp～2000 bp。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的gRNA表达盒中，在gRNA编码序列两端还包括自切割酶。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的自切割酶为HH核酶和/或HDV核酶。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在gRNA编码序列方两端分别连接HH核酶和HDV核酶。

11.用于对毕赤酵母的基因组进行定向基因敲入的构建体，其特征在于，所述构建体包括：

(i) 一个或多个gRNA表达盒，所述gRNA靶向于gRNA靶点，所述gRNA靶点位于毕赤酵母基因组的基因启动子的上游100 bp以内或者终止子的下游100 bp以内；所述的启动子为GAP启动子、TEF1-α启动子、AOX1启动子或FLD启动子；所述终止子为AOXTT终止子；

(ii) 与(i)中gRNA表达盒相应的一个或多个供体构建物，所述供体构建物包含操作性连接的：5’同源臂、外源的基因操作序列的插入位点、3’同源臂；

(iii) Cas9表达盒。

12.如权利要求11所述的构建体，其特征在于，所述gRNA靶点选自SEQ ID NO: 1、SEQID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5的gRNA靶点；或

所述gRNA表达盒、Cas9表达盒串联表达，称为gRNA-Cas9；或

所述试剂盒中还包括：无筛选压力的培养基；或

所述的毕赤酵母为His营养缺陷型毕赤酵母；或

所述Cas9表达盒中，Cas9的编码基因具有密码子优化序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO: 67所示；或

所述的gRNA表达盒中，在gRNA编码序列方两端还包括自切割酶。

13.如权利要求12所述的构建体，其特征在于，所述的自切割酶为HH核酶和/或HDV核酶。

14.如权利要求13所述的构建体，其特征在于，在gRNA编码序列方两端分别连接HH核酶和HDV核酶。

15.一种基因工程改造的毕赤酵母，其中引入了权利要求11或12所述的构建体；或，其是由权利要求1～10任一所述的方法制备获得的。