CN117165583A

CN117165583A - 用于酵母细胞的低氧诱导启动子及其应用

Info

Publication number: CN117165583A
Application number: CN202210594418.4A
Authority: CN
Inventors: 钱江潮; 周航成; 王志朋
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2022-05-27
Filing date: 2022-05-27
Publication date: 2023-12-05

Abstract

本发明提供了一种用于酵母细胞的低氧诱导启动子及其应用。本发明的启动子可实现对不同氧环境下目的基因的转录/表达的适当驱动，发挥中、高强度的驱动转录/表达的作用。

Description

用于酵母细胞的低氧诱导启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，更具体地，本发明涉及用于酵母细胞的低氧诱导启动子及其应用。

背景技术

启动子是决定基因转录启动和水平的一种基本基因表达调控元件，对准确调节基因表达水平非常关键。现阶段酵母表达系统常用的启动子主要包括诱导型启动子和组成型启动子，这些启动子都有各自的优势，但同样也都存在缺陷和不足。诱导型启动子一般需外源添加诱导剂启动基因表达，不但提高了成本，并且有些诱导剂很容易带来安全隐患。组成型启动子调控的转录很难进行人为操纵调控，无法响应培养环境的条件变化，过量表达会对细胞产生代谢负担，甚至导致细胞死亡。

近些年，环境响应的启动子引起人们的关注，如pH、温度、渗透压、低氧环境等。相对于传统的需添加外源化学诱导剂的启动子而言，环境响应的启动子具有低成本、无需改变培养基成分、操作简单、相对安全等优势，但能用于酵母表达系统的此类启动子却鲜有报道。

PsADH2是树干毕赤酵母乙醇脱氢酶Ⅱ(Pichia stipites alcoholdehydrogenase Ⅱ)的启动子，能够响应低氧条件诱导表达。2005年首次用于毕赤酵母表达VHb异源蛋白，在低氧条件下表达水平更高。在工业发酵过程中，进行高密度培养时很容易出现低氧环境，提供了响应低氧条件诱导启动的天然诱导条件。但是，已报道的PsADH2启动子表达强度较低，更无法实现不同强度基因表达水平的精确调控。

因此，针对酵母细胞，开发能够有效/高效响应低氧条件的启动子，对于开发具有工业应用价值的高性能发酵菌株有着巨大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于酵母细胞的低氧诱导启动子及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种突变型ADH2启动子，所述的启动子包括选自SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的启动子；所述突变型启动子能响应低氧环境、由低氧激活并驱动目的基因的表达。

在一种或多种实施方式中，所述的SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的启动子、SEQ IDNO:2所示核苷酸序列的启动子具有依次减弱的启动目的基因表达的强度；较佳地，所述SEQID NO:1所示核苷酸序列的启动子为低氧响应的高强度增强型启动子，所述SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的启动子为低氧响应的中强度增强型(或中高强度增强型)启动子。

在本发明的另一方面，提供一种表达构建体(如表达盒或表达载体)，所述的表达构建体含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，作为启动子元件。

在一种或多种实施方式中，所述的表达构建体中还含有与所述的启动子元件可操作地连接的目的基因。

在一种或多种实施方式中，所述的目的基因包括(但不限于)：结构基因，功能基因(编码具有特定功能的蛋白的基因)。

在一种或多种实施方式中，所述功能基因包括：报告基因，酶。

在一种或多种实施方式中，所述的报告基因包括但不限于：如荧光蛋白编码因、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因等。

在一种或多种实施方式中，所述荧光蛋白包括但不限于：绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等，或它们的增强型蛋白(如增强型绿荧光蛋白)。

在一种或多种实施方式中，所述的目的基因位于启动子元件的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp。

在一种或多种实施方式中，所述的目的基因位于启动子元件的下游，且与所述启动子的间隔小于1000bp；更佳地小于500bp，如小于200bp，小于100bp，小于50bp，小于30bp，小于20bp，小于10bp或没有间隔。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞：含有所述的表达构建体；或其基因组中整合有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的核酸；较佳地其基因组中还整合有目的基因，该目的基因与所述的启动子元件可操作地连接。

在一种或多种实施方式中，所述的细胞是酵母细胞。

在一种或多种实施方式中，所述的细胞是毕赤酵母(Pichia Pastoris)细胞。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的突变型ADH2启动子的用途，用于与目的基因连接，在表达环境中响应低氧环境、由低氧激活并驱动目的基因的表达。

在本发明的另一方面，提供一种驱动目的基因在低氧环境下表达的方法，所述方法包括：

(a)将表达构建体(如表达盒或表达载体)转化宿主细胞，所述的表达构建体含有前面任一所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；

(b)将(a)的宿主细胞置于发酵表达体系中表达，该发酵表达体系能形成低氧环境；所述启动子响应低氧环境、由低氧激活并驱动目的基因的表达。

在一种或多种实施方式中，所述的驱动目的基因在低氧环境下表达的方法中，所述发酵表达体系为初始表达阶段设置为低氧环境，或为在表达过程(表达前期、中期胡后期)中形成低氧环境。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、质粒pAHg构建流程。

图2、三种启动子调控laZ和vgb基因重组质粒构建流程。

图3、构建含有突变启动子重组质粒文库和重组菌文库。

图4、高通量筛选突变启动子和启动子文库构建流程。

图5、突变启动子AM23和AM30重组菌在不同供氧条件下调控不同报告基因表达的生长曲线；

A.调控egfp报告基因；

B.调控lacZ报告基因；

C.调控vgb报告基因；

其中，高氧条件用空心符号表示，低氧条件用实心符号表示；每份样品做三次平行。

图6、AM23和AM30启动子突变序列低氧诱导特性；

A.yEGFP表达水平；

B.egfp基因转录水平；

其中，空心符号表示高氧培养条件，实心符号表示低氧培养条件；转录水平以ADH2野生型启动子6h的转录水平为参照；每份样品做三次平行。

图7、突变启动子AM23和AM30在不同供氧条件下表达lacZ和vgb基因；

A.β-Gal单位菌体酶活；

B.VHb单位菌体产量；

C.lacZ基因转录水平；

D.vgb基因转录水平；

其中，高氧条件用空心符号表示，低氧条件用实心符号表示；将每份样品检测得到的酶活和VHb产量与细胞干重(g/L)进行归一化计算来获得β-Gal单位菌体酶活和VHb单位菌体产量；以野生型ADH2启动子高氧条件下6h样品作参照计算转录水平；每份样品做三次平行。

图8、AM30启动子突变序列重组菌在摇瓶补料发酵过程中表达不同基因的调控特性；

A、蛋白比产量；

B、转录水平；

蛋白比产量以各报告基因6h单位菌体蛋白表达量为参照；相对转录水平以各报告基因6h的转录水平为参照。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的筛选研究，基于低氧诱导野生型启动子ADH2序列构建突变型ADH2启动子文库，从中筛选到兼具低氧响应(激活)特性和普遍调控作用的突变型启动子。本发明的启动子可实现对不同氧环境下目的基因的转录/表达的适当驱动，发挥中、高强度的驱动转录/表达的作用。

术语

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。

如本文所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种核酸构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、目的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的，形成所述表达盒。

如本文所用，所述的“响应低氧环境、由低氧激活并驱动目的基因的转录/表达”是指本发明的启动子在能够感受到低氧环境，能够适应该低氧环境并收到其激活，发挥更为显著的驱动目的基因转录/表达的作用。

如本发明所用，所述的“低氧环境”或“低氧条件”，通常指发酵液(培养液)中氧含量低于常规培养氧环境，例如小于80％。

如本发明所用，所述的“高氧环境”或“高氧条件”，通常指发酵液(培养液)中氧含量高于常规培养氧环境，例如高于120％。

如本文所用，所述的“ADH2启动子组合”是指含有本发明筛选得到的突变型ADH2启动子的核酸集合体。

如本文所用，所述的“ADH2启动子”也可简称为pADH2或P_ADH2。

如本文所用，所述的“可操作地连接”或“操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子的引导，从而，启动子被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的启动子指导而进行转录/表达的基因。本发明对合适的目的基因没有特别的限制，例如包括但不限于：结构基因、编码具有特定功能的蛋白的基因、酶、报告基因(如绿色荧光蛋白、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ)。本领域已知，可以利用酵母细胞进行大量的目的基因的转录/表达，此类适于由酵母转录/表达的基因均可被作用本发明所述的“目的基因”。

如本文所用，所述的“增强型ADH2启动子”是指相对于野生型ADH2启动子(其序列如SEQ ID NO:8所示)其启动目的基因转录/表达的强度显著增强，例如增强10％以上，较佳的增强20％以上，更佳的增强30％以上，如增强50％以上、增强80％以上、增强100％以上、增强150％以上、增强200％以上、增强250％以上、增强300％以上、增强400％以上、增强500％以上、增强600％以上、增强800％以上、增强1000％以上，等等。其启动目的基因转录/表达的强度可通过检测目的的基因转录/表达量而得知，转录/表达量的检测是本领域技术人员熟知的技术。

如本文所用，所述的“高强度增强型启动子”或“中强度增强型启动子”是相对而言的，通常意义而言前者的相应低氧并驱动目的基因转录/表达的强度显著大于后者；而它们与野生型ADH2启动子相比，驱动目的基因的转录或目的蛋白的转录/表达的强度呈现显著性提高。在一些方式中，所述的“高强度增强型启动子”是与野生型ADH2启动子相比，驱动目的基因的转录或目的蛋白的表达的强度呈现非常显著的提高，例如高1.8倍，较佳地高2倍，更佳地高2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍，或更高倍数。在一些方式中，所述的中强度增强型启动子是与野生型ADH2启动子相比，驱动目的基因的转录或目的蛋白的转录/表达的强度呈现显著的提高，例如高于1.1倍，较佳地高于1.2倍，更佳地高于1.5倍、1.8倍、2倍、2.5倍或3倍。应理解，根据目的基因/蛋白的不同，所述高强度增强型、中强度增强型的启动子与野生型相比驱动转录/表达的提高是浮动的，但高强度的提高会高于中强度。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，“驱动目的基因的转录/表达”、“启动目的基因的转录/表达”、“指导目的基因的转录/表达”可互换使用。

响应低氧环境的启动子

为了获得响应环境低氧条件的启动子，本发明人经过广泛的研究。根据本发明的具体实施例，以野生型ADH2低氧诱导启动子出发，对启动子进行突变，得到大量的启动子突变序列。利用egfp为报告基因，以毕赤酵母为宿主，建立了高效的高通量低氧诱导筛选方法，筛选到不同表达强度的启动子突变序列，构建了酵母ADH2低氧诱导启动子文库。并且选取一个中强度增强型AM23和一个高强度增强型启动子AM30与目的基因进行连接并验证其启动子的特性。结果表明，AM23和AM30为非严格厌氧型启动子，能响应低氧条件激活egfp基因的表达，与野生型ADH2启动子相比，它们对低氧环境更加敏感，转录活性更强。除egfp基因以外，AM23和AM30还可调控lacZ和vgb基因在低氧条件的表达，可普遍应用于不同基因(外源基因)的调控。此外，在常规培养过程中，随着菌体密度增加出现的发酵液中溶解氧浓度降低，突变启动子即可响应低氧环境激活基因转录，与常规添加化合物诱导或改变培养条件诱导的启动子相比，降低了成本和操作复杂性。

因此，本发明人筛选到了一组突变型ADH2启动子，包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的启动子，其可被独立应用或构成启动子组合，所述启动子驱动目的基因表达的强度不同，分别呈现高强度增强型驱动表达作用和中强度增强型驱动表达作用，用于在低氧环境下、以不同的强度下指导目的基因表达。两种不同强度的启动子的联合应用，可保证对所调控的目的基因表达进行梯度调节，实施可控基因扰动和系统分析。

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要特性或功能的蛋白。

例如，当用于不同环境(如不同氧环境)下启动子的表达强度的研究时，所述的目的基因包括但不限于：绿色荧光蛋白、增效的绿色荧光蛋白、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因LacZ等。“绿色荧光蛋白”具有内源荧光基团，在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光，且见光不易淬灭。“增效的绿色荧光蛋白”为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白。“荧光素酶”作为一种代表性的指示基因表达状况的工具，可良好地指示由启动子指导的基因表达情况。

作为本发明的优选方式，可以从本发明的启动子组合中选择相应强度的启动子，分别将它们与待研究的目的基因可操作地连接，或将目的基因与所述的启动子可操作的连接入合适的载体中，采取适当的方式导入到宿主细胞内，从而获得其中目的基因表达量不同的一系列细胞。可通过分析这些细胞不同环境(如不同氧环境)下的代谢情况、表型变化、蛋白表达情况或相互作用情况、各种信号分子的变化等，来得知该目的基因的功能或用途。

作为本发明的优选方式，所述的目的基因可以是一种对于某一细胞而言缺失或表达量不足的基因，可将该目的基因与本发明的增强性ADH2启动子可操作地连接，或将目的基因与本发明的启动子可操作的连接入合适的载体中，采取适当的方式导入到该细胞内，从而高水平地表达目的基因。

作为本发明的优选方式，表达所述的目的基因的宿主细胞可以是随着表达进程的进行而密集生长(高密度生长)的一类细胞，当密集生长时其会导致发酵液(培养液)体系的整体或部分发生缺氧。这时候，本发明的启动子会响应低氧、高强度增强基因的转录/表达或中强度增强基因的转录/表达。

本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。

此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。

含有启动子的表达构建体

来自于本发明的启动子组合的任何一种启动子和/或目的基因序列可被包含在表达构建体中。所述的表达构建体包括表达载体或表达盒等，其中含有必要的表达元件。

作为一种方式，提供一种表达构建体(表达载体)，所述的表达构建体(表达载体)包括本发明的启动子，在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。

作为一种方式，所述的表达构建体(表达载体)包括(从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域技术人员所熟知的。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。优选的，所述的表达载体是酵母细胞适用的表达载体。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。

重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：酵母，大肠杆菌，动物的组织细胞，植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。作为本发明的优选方式，所述的宿主细胞是酵母细胞，更优选地，所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明通过大量筛选获得了受到低温诱导而驱动表达能力增强的启动子，其促进转录/表达的能力显著。

(2)本发明的突变启动子对氧响应的条件属于非严格厌氧型，能够适应常规环境；而当随着菌体生长耗氧增加和溶氧降低，无需额外的诱导条件即能自发激活启动多种多样的目的基因的表达，这一特性在工业发酵规模上具有很大的应用潜力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、菌株、质粒与引物

本发明所用菌株见表1。

表1、菌株及特征

本发明所用质粒见表2。

表2、质粒及特征

本发明所用引物见表3。

表3、引物

本发明筛选获得的启动子序列如表4。

表4、突变启动子AM23和AM30序列

2、主要试剂和仪器

分子生物学操作的工具酶，包括限制性内切酶、连接酶、DNA Marker、反转录试剂盒、RT-PCR酶等，购自大连TaKaRa生物科技有限公司。

分子克隆操作用试剂盒，包括质粒提取、PCR纯化以及胶回收试剂盒等，购自Axygen公司。

酵母基因组DNA提取试剂盒和酵母RNA提取试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

酶标仪Varioskan LUX Microplate Reader，购自赛默飞世尔科技有限公司。

3、培养基

YPD和MD培养基参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。

高通量筛选所用碳源限制型YPD培养基中葡萄糖含量为0.2％(w/v)。

BMGT培养基(％，w/v)：1.34％YNB，1％甘油，2％胰蛋白胨，4×10^-5％生物素，100mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)。

4、质粒提取、DNA片段纯化和胶回收

质粒提取、PCR产物纯化、酶切产物纯化和胶回收等操作均根据Axygen公司相关试剂盒操作说明书进行。

其他基础分子克隆实验如常规PCR、酶切反应、连接反应和毕赤酵母相关分子操作操作参见《分子克隆实验指南》和Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。毕赤酵母基因组提取、总RNA提取、反转录cDNA和RT-PCR等实验操作方法参见相关试剂盒及工具酶的说明书进行。

5、易错PCR反应(EP-PCR)

50μL反应体系：

易错PCR反应参数：

6、重组质粒及对应重组菌的构建

(1)pAHg重组质粒和G/AHg重组菌的构建

首先用低氧诱导启动子ADH2构建重组质粒pAHg。利用egfp作为报告基因，以pGHg作为载体骨架，将载体中PGAP启动子替换为低氧诱导启动子ADH2。基本表达载体构建流程如图1所示，将载体pGHg在SpeⅠ/NotⅠ位点进行酶切，胶回收大片段载体骨架。然后利用引物ADH2-F/ADH2-R从树干毕赤酵母基因组上扩增ADH2启动子片段，将载体骨架和ADH2启动子片段进行连接，得到基本表达载体pAHg。

将质粒pAHg经SalⅠ位点线性化后，电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，经平板培养得到转化子。从平板上随机挑取阳性转化子，提取阳性转化子基因组DNA，利用RT-PCR方法，以arg4为内参基因，用arg4基因的引物qarg4-F/qarg4-R和egfp基因的引物qegfp-F/qegfp-R进行拷贝子数检测。挑选单拷贝菌株并命名为G/AHg。

(2)含有突变启动子序列AM23和AM30的重组质粒和重组菌的构建

经过规模筛选及比较，本发明人挑选获得突变启动子序列AM23和AM30。

在pAHg重组质粒的SpeⅠ/NotⅠ位点替换野生型ADH2启动子，得到含有突变启动子序列AM23和AM30、以其调控egfp报告基因的重组质粒pAM23g和pAM30g。

将重组质粒转化至毕赤酵母，挑选单拷贝阳性转化子，分别命名为重组菌G/AM23g和G/AM30g。

(3)构建lacZ和vgb报告基因重组质粒和重组菌

分别将质粒pAHg，pAM23g和pAM30g经NotⅠ/HindⅢ酶切，得到3个含有不同启动子的载体骨架。分别用引物lacZ-F/lacZ-R从质粒pPIC9KL上扩增lacZ基因，用引物vgb-F/vgb-R从质粒pPIC9K-vgb上扩增vgb基因，随后分别插入到3个不同启动子载体骨架NotⅠ/HindⅢ位点，构建lacZ基因的重组质粒pAHl，pAM23l和pAM30l，构建vgb基因的重组质粒pAHb，pAM23b和pAM30b(图2)。

将重组质粒转化至毕赤酵母，挑选单拷贝阳性转化子，分别得到含有不同启动子调控lacZ基因表达的重组菌G/AHl，G/AM23l和G/AM30l，以及含有不同启动子调控vgb基因表达的重组菌G/AHb，G/AM23b和G/AM30b。

7、菌株培养方法

(1)不同供氧水平条件下的摇瓶培养

通过控制摇瓶体积、装液量、转速和封口方式来实现摇瓶培养条件下氧环境的差异。具体培养方法如下：

(1)种子培养。从平板上挑取毕赤酵母重组菌的单菌落，接种于3mL YPD培养基，30℃，220rpm过夜培养。

(2)富集培养。吸取1mL种子液，接种于装有100mL YPD培养基的500mL摇瓶中，30℃，220rpm培养至OD₆₀₀＝0.5。

(3)将富集培养的菌液分为体积相等的2份，每份50mL，设置两种不同的供氧条件对菌液进一步培养。高氧条件：500mL摇瓶，最终装液量10％，用八层医用纱布封口，转速220rpm(培养液氧含量为常规培养氧环境的120％以上)；低氧条件：100mL摇瓶，最终装液量50％，微孔胶塞封口，转速150rpm(培养液氧含量为常规培养氧环境的80％以下)。在培养过程中定时取样检测yEGFP、β-Gal、VHb单位菌体蛋白表达量及转录水平。

(2)常规非限氧条件培养

将含有不同报告基因的突变启动子毕赤酵母重组菌接种于3mL YPD培养基，过夜培养，随后按1％接种量接种于装有50mL YPD培养基的250mL摇瓶中，220rpm培养。在48h和72h时各补加2mL 2×YPD液体培养基。在培养过程中定时取样检测yEGFP、β-Gal、VHb单位菌体蛋白表达量及转录水平。

8、报告基因的检测

(1)yEGFP荧光蛋白检测

样品处理：高通量筛选过程中，孔板培养结束后，直接用PBS缓冲液将培养液稀释适当倍数；摇瓶培养过程中，取1mL菌液离心后，去上清，用PBS缓冲液中稀释适当倍数。用多功能酶标仪检测荧光强度，激发波长为485nm，发射波长为525。同时检测OD600数值，计算样品单位菌体荧光强度。

(2)β-galactosidasey(β-Gal)酶活力检测

具体实验操作及相关溶液配置参见毕赤酵母操作手册。用多功能酶标仪读取每孔OD₄₂₀数值。按照以下公式计算单位菌体酶活。

(3)CO差光谱法测定VHb活性

取一定体积的胞内粗提液，加入过量的Na₂S₂O₄(终浓度为10mg/mL)，充分混合，还原处理10min。将还原处理的胞内粗提液平均分成两份，各置于10mL试管中，一份作为对照样品，另一份向胞内粗提液中鼓入CO，每秒2-3个气泡，持续3min，使CO与还原态的VHb进行络合。通气结束后，黑暗静置5min，随即迅速进行差光谱检测。利用多功能酶标仪在380-500nm波长范围内进行扫描，记录419nm和436nm处的吸光值，用消光系数E419-436＝274nm^- ¹cm^-1计算的表达水平。每个时间点做三个检测平行。

实施例1、高通量筛选方法的建立及筛选突变型启动子

1、高通量筛选

创建一种能够适用于高通量培养的低氧条件，用来同时激活大批量重组菌突变启动子的转录调控水平，进而实现报告基因的表达和检测，是启动子文库构建过程中最关键的因素之一。

首先，以重组菌G/AHg为研究对象，接种于每孔装有500μL YPD液体培养基的96孔培养板中，30℃，220rpm培养24h，此阶段为种子培养。

随后，进入预培养阶段。从种子培养板中每孔吸取200μL种子液，接种于装有800μL葡萄糖含量为0.2％(w/v)的YPD培养基中。预培养阶段的主要目的是促进细胞进一步生长，为最后阶段的低氧诱导提供足够的菌体浓度，同时保证每孔中的菌体细胞处于同步生长状态。

预培养结束后，进入诱导培养阶段。将培养板在5000rpm条件下离心5min，弃上清液，每孔用1mL BMGT培养基重悬菌体，充分混合均匀后，转移至96深孔培养板，通过用较高的装液量和菌体浓度，还有低转速和低透气性实现低氧诱导培养。

随后，将低氧诱导培养板于30℃，150rpm培养72h。培养结束后，检测报告基因egfp表达的蛋白的荧光强度。

2、突变型启动子的获得

利用易错PCR(error-prone PCR，EP-PCR)技术对ADH2启动子野生型序列进行随机突变。为了得到更高的突变率，采取提高EP-PCR反应体系中的离子浓度和EP-PCR反应轮次数的策略，用每一轮纯化后的易错PCR产物作为下一轮反应的模板，通过连续三轮的EP-PCR方法来获得启动子突变序列。

经连续三轮EP-PCR反应，突变率由第一轮的0.47％提高到第三轮的1.52％。将携带第三轮EP-PCR启动子突变序列的混合质粒作为突变启动子重组质粒文库，将混合的突变重组质粒文库在SalⅠ位点线性化，电击转化至毕赤酵母GS115，得到含有ADH2启动子突变序列的重组菌文库，待下一步高通量筛选(图3)。

3、高通量筛选不同突变序列启动子

平板挑取重组菌文库的单菌落，用高通量筛选方法对重组菌进行高通量孔板培养，用酶标仪检测重组菌yEGFP的荧光强度，以重组菌G/AHg的荧光强度为参照，计算突变启动子重组菌的相对荧光强度以表示突变启动子的相对活性。最后挑选不同相对活性的突变启动子构建低氧诱导启动子文库(图4)。

4、低氧诱导启动子文库的构建

共计筛选检测菌株12442株，从中挑选表达荧光强度不同的重组菌，提取基因组DNA并检测拷贝数，在确认单拷贝整合后，测定所含突变启动子序列，确定不同突变序列的30个启动子，构建低氧诱导启动子文库。

实施例2、突变启动子AM23和AM30低氧诱导特性摇瓶培养验证

经过综合分析，本发明人从30个启动子中挑选2个突变启动子AM23和AM30及对应的重组菌G/AM23g和G/AM30g。摇瓶培养条件下，设置高氧培养和低氧培养两种供氧方式来验证高通量筛选的结果。为了消除菌体生长量不同带来的差异，本发明人选用总荧光强度与菌体生长量的比值，即用单位菌体相对荧光强度来表示启动子调控下的蛋白表达水平。

分析3株重组菌在两种供氧条件下的生长状态，结果如图5A所示，3株重组菌在两种不同的供氧条件下菌体生长差异非常明显。从整体培养过程的生长曲线来看，3株重组菌在高氧培养条件下具有比低氧培养更高的菌体浓度，同时，3株重组菌在每种供氧条件下的生长状态都保持相同的生长趋势，这表明突变启动子表达egfp报告基因时不会给菌株本身带来额外的生长负担。

如图6A所示，3个启动子在两种供氧条件下的表达强度顺序符合高通量筛选的结果，即AM30最高，野生型ADH2启动子最低。在低氧条件下，突变启动子重组菌表达水平全部高于各自在高氧条件下的水平，这说明突变启动子在低氧条件下进一步激活诱导并提高蛋白的表达水平。在低氧条件下3个启动子调控蛋白表达与各自高氧条件相比，启动子ADH2，AM23和AM30调控下的相对荧光强度分别增加1.5倍、1.6倍和1.6倍。突变启动子AM23和AM30在低氧条件下得到的最高相对荧光强度分别比低氧条件下野生型ADH2启动子高4.7倍和8.1倍，高于高通量筛选时孔板培养条件下的3.5倍和5.5倍。

随后，考察了两个突变启动子的转录水平，以6h高氧条件下野生型ADH2启动子的转录水平为对照。结果如图6B，从整体上看，所有启动子在低氧条件下的转录水平全部高于各自高氧条件下的水平。3个启动子在两种供氧条件下24h之前的转录水平逐渐升高，在24h达到最大，并且转录水平的大小顺序与蛋白表达水平保持一致，即突变启动子AM30最高，野生型ADH2启动子最低。在培养初期(6h)，突变启动子AM30的转录水平要高于其他俩个启动子，说明突变启动子AM30对低氧环境更加敏感。在低氧培养条件下，突变启动子AM30，AM23和野生型ADH2启动子各自的最高转录水平分别是高氧条件下的1.4倍，1.5倍和1.9倍，与此同时，突变启动子AM30和AM23最高转录水平分别达到野生型ADH2启动子的3.6倍和7.6倍，转录水平明显提高。

综合以上实验结果，通过在摇瓶培养条件下设置两种供氧条件，验证了高通量筛选方法获得了有效的启动子。即相同培养条件下，突变启动子AM23和AM30具有比野生型ADH2启动子更高的诱导强度。实验结果也证明，突变启动子在低氧条件下具有比自身高氧条件下更高的蛋白表达水平和转录水平。同时，在相同培养条件下，随着菌体量的提高，培养环境中氧含量降低，本发明的启动子都能响应低氧环境，进一步实现激活并自发诱导从而获得更高的诱导强度。

实施例3、突变启动子低氧调控特性的适用性

为了考察低氧诱导启动子表达多种异源蛋白的适用性，选取了编码β-Gal的基因lacZ和编码VHb的基因vgb作为另外两种报告基因，选用野生型ADH2启动子和突变启动子AM23和AM30构建重组菌，调控两个异源蛋白的表达，考察突变启动子的低氧调控特性。

首先，考察了突变启动子在重组菌调控lacZ和vgb基因时的菌体生长情况(图5B和图5C)。对于表达β-Gal的3株重组菌来说，菌体量几乎保持着同步增长，这说明两个突变启动子AM23和AM30在lacZ基因异源表达的过程中没有对重组菌的生长造成不良影响。而对于表达VHb的3株重组菌，到培养终点48h，高氧条件的AM30重组菌的菌体细胞干重比其他2株重组菌提高了约8.7％，低氧条件下比其他2株重组菌提高了约7.7％。这说明vgb基因在强度最高的AM30突变启动子调控下表达了更多的VHb蛋白，在细胞生长过程中，VHb蛋白促进了细胞与氧的结合，进而促进了细胞生长。

对于蛋白水平的表达，3种启动子在两种供氧条件下调控2种报告基因的表达强度如图7A和图7B所示。3种启动子在低氧条件下的蛋白表达水平全部高于各自在高氧条件下的水平，这说明3种启动子均可以响应低氧环境来进一步诱导蛋白表达。对于β-Gal的表达(图7A)，3种启动子在低氧条件下始终保持升高的趋势，其中突变启动子AM30的表达水平显示出强劲的低氧诱导表达特性。与3种启动子各自在高氧条件下得到的最高表达水平相比，启动子ADH2，AM23和AM30在低氧条件下的β-Gal表达水平分别提高了1.4，1.9和1.9倍。与此同时，在低氧条件下，突变启动子AM23和AM30重组菌在培养终点(48h)达到的最高表达水平是同时间野生型ADH2启动子的2.6倍和10.1倍。从VHb蛋白表达情况来看(图7B)，3株重组菌在两种不同的供氧条件下，VHb的表达量随培养时间而增加。低氧条件下3株重组菌在36h之前表达量逐渐增加，与高氧条件下3株菌获得的最高表达相比，启动子ADH2，AM23和AM30在低氧条件下的最高表达量(36h)分别提高了1.4倍、1.5倍和1.9倍。此外，在低氧条件下，突变启动子AM23和AM30调控下的VHb表达量比同条件下野生型启动子ADH2所调控的表达量提高了1.9倍和3.1倍。

为了更深入地了解启动子对氧环境响应的诱导动力学特点，考察了3种启动子调控下的lacZ和vgb基因的转录水平(图7C和图7D)。从整体趋势上来看，两种供氧条件下，野生型启动子ADH2以及突变启动子AM23和AM30的转录强度同样呈现出强度梯度，即突变启动子AM30的转录强度最高，野生型启动子ADH2的最低。转录水平在24h转录水平达到最高，与此同时，低氧条件下3种启动子的整体转录水平全部高于各自在高氧条件下的转录水平。对于lacZ基因(图7C)，3种启动子各自在低氧条件下最高转录水平与高氧条件相比，分别提高了1.3倍，1.4倍和2.2倍。此外，在低氧条件下，突变启动子AM23和AM30调控lacZ基因的转录水平分别比野生型ADH2启动子提高了2.1倍和7.6倍。另一方面，对于vgb基因的转录(图7D)，低氧条件与高氧条件相比，野生型ADH2启动子以及突变启动子AM23和AM30的调控下的转录水平分别提高了1.5倍，1.7倍和2.1倍。在低氧条件下，突变启动子AM23和AM30调控vgb基因的转录水平分别比野生型ADH2启动子提高了2.3倍和5.7倍。

启动子突变序列调控egfp、lacZ和vgb这3个报告基因的实验结果说明，相对于高氧条件，本发明的启动子在低氧条件下具有更强的自诱导能力并且对于低氧环境更加敏感，促使多种异源蛋白的转录水平和蛋白表达都不同程度地增强。对于不同供氧条件下的突变启动子AM23和AM30，与野生型ADH2启动子相比，蛋白表达和转录水平均得到不同程度的提高，这表明本发明的突变启动子在响应低氧诱导时更活跃。此外，证明了突变启动子可以响应不同的供氧条件，在不添加任何外源诱导剂或添加剂的情况下受低氧条件激活来实现自发诱导，从转录层面诱导调控蛋白的表达，并且所构建的启动子在多种供氧条件下都能够表现出调控强度的梯度差异。

实施例4、突变启动子AM30在摇瓶发酵过程中的调控特性

将含有突变启动子AM30的重组菌G/AM30g，G/AM30l和G/AM30b在常规非限氧条件下进行摇瓶发酵培养并进行补料，检测重组菌的生长状态以及在突变启动子调控下的报告基因蛋白表达水平和转录水平。

从蛋白表达水平来看(图8A)，在摇瓶批次补料培养过程中，3个报告基因的蛋白表达在初始24h内显着升高，随后保持缓慢增加直到培养结束，这表明启动子在发酵结束前(96h)始终发挥作用。与各自报告基因6h的蛋白表达量相比，β-Gal的产量在培养过程中提升最多，直到培养结束时产量提高了45.8倍，其他2个报告基因egfp和vgb表达的蛋白yEGFP和VHb的产量分别提高了13.5倍和3.9倍。随后检测了3个报告基因在突变启动子AM30调控下的转录水平(图8B)。在培养初期，3个报告基因的转录水平与蛋白表达趋势相似，即24h之前转录水平快速提高。在24h时，报告基因egfp，lacZ和vgb的转录水平分别达到4.8，7.4和6.2。24h之后转录水平提升的趋势减缓并维持缓慢提高的状态直到培养结束。在培养结束时报告基因egfp，lacZ和vgb的转录水平分别达到6.2，9.2和7.0，与24h转录水平相比稍有提高。这个结果表明启动子突变序列在常规非限氧条件下始终能够转录和表达异源蛋白，同时在后期随着溶氧降低，启动子响应低氧环境而进一步自发诱导并提高异源蛋白的转录和表达水平。

结论

本发明人利用连续易错PCR对野生型树干毕赤酵母ADH2启动子进行随机突变，以毕赤酵母为表达宿主，建立了有效的低氧诱导高通量筛选方法，获得了用于酵母表达系统的低氧诱导启动子文库，从中优选获得本发明的突变型启动子。其中在摇瓶中控制供氧水平，2个不同活性突变启动子AM23和AM30，可受低氧激活诱导目的蛋白如egfp、lacZ和vgb的表达。突变启动子对氧响应的条件属于非严格厌氧型，在摇瓶中模拟通常的补料发酵过程，以AM30为例，随着菌体生长，耗氧增加和溶氧降低，无需额外的诱导条件即能自发激活启动egfp、lacZ和vgb的表达，这一特性在酵母工业发酵规模上具有很大的应用潜力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 用于酵母细胞的低氧诱导启动子及其应用

<130> 223635

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 585

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gagggaaaaa ccggggactc actttatcac gtaccgagaa attcttcgtt tcagcatcac 60

caccatgttg tccaattgca gcccgaagca cagtctaatg ctgaattttg atagagctca 120

tcgtgaacag ccagattcga agaaaggggg gatgagatcc gggttcatct gcaagagaca 180

cagaaaataa aaaacatacg atccgttcag ctacctggcg cttaaccagg aaaatcgctg 240

ctggagtggc cagcatgtca cgaggtggca gaatccgata atgtgtgatt gcgtgtagca 300

tcggcgcaag tcgaatctcg gtcatattcc gtgtctggat attattccac tattttttaa 360

tttttcaggt tggatgcgat tgttcccttt acgtctggac gatgcccgaa gccccaggta 420

tatataaggg gctcgaaagt cctttgacca gctggctgat ttgactttgt ttgttccttt 480

ctttctttca tctactcatc actcaattgc attcgcaatt tcccattaat acacatttca 540

cttgctccac atattgcacc caattacata agtgctgcga tccat 585

<210> 2

<211> 585

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gagggaaaaa ccggggactc agattatcac gtaccgagaa attcttcgtt tcagcatcat 60

caccatgttg tccaattaca gcccgaagca cagtctaatg ctgaattttg atagagctca 120

tcgtgaacag ccagattcga agaaaggggg gatgagatcc gggttcatct gcaagagaca 180

cagaaaataa aaaacatacg atccgttcag ctacctggcg cttaaccagg aaaatcactg 240

ctggagtggc cagcatgtca cgaggtggca gaatccgata atgtgtgatt gcgtgtagca 300

tcggcgcaag tcgaatttcg gtcatattcc gtgtctggat attattccac tattctttaa 360

tttttcaggt tggatgcgat cgttcccttt acgtctggac gatgcctgaa gccccagtta 420

tatataaggg gctcgaaagt cctttgacca gctggttgat ttgactttgt ttgttccttt 480

ctttctttca tctactcatc actcaattgc attcgcaatt tcccattaat acatatttca 540

cttgctccac gtattacacc caaatgcata agtgctgcga tccat 585

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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catccgcatt aggatcttcg actagtgagg gaaaaaccgg ggactca 47

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ttagacataa gcttgggttt gcggccgcat ggatcgcagc acttatg 47

<210> 5

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cccaagcttt tatttttgac accagaccaa ctggtaatg 39

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ttagcagcac cagtggaaga tg 22

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<212> DNA

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cgtacaaatc tgcttccact tg 22

Claims

1.一种突变型ADH2启动子，所述的启动子包括选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的启动子；所述突变型启动子能响应低氧环境、由低氧激活并驱动目的基因的表达。

2.如权利要求1所述的突变型ADH2启动子，其特征在于，所述的SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的启动子、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的启动子具有依次减弱的启动目的基因表达的强度；较佳地，所述SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的启动子为低氧响应的高强度增强型启动子，所述SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的启动子为低氧响应的中强度增强型启动子。

3.一种表达构建体，所述的表达构建体含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，作为启动子元件。

4.如权利要求3所述的表达构建体，其特征在于，所述的表达构建体中还含有与所述的启动子元件可操作地连接的目的基因；较佳地，所述的目的基因包括：结构基因，功能基因；较佳地，所述功能基因包括：报告基因，酶。

5.如权利要求3所述的表达构建体，其特征在于，所述的目的基因位于启动子元件的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞：

含有权利要求3或4所述的表达构建体；或

其基因组中整合有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的核酸；较佳地其基因组中还整合有目的基因，该目的基因与所述的启动子元件可操作地连接。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞是酵母细胞。

8.权利要求1或2任一所述的突变型ADH2启动子的用途，其特征在于，用于与目的基因连接，在表达环境中响应低氧环境、由低氧激活并驱动目的基因的表达。

9.一种驱动目的基因在低氧环境下表达的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)将表达构建体转化宿主细胞，所述的表达构建体含有权利要求1或2任一所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；

10.如权利要求9所述的驱动目的基因在低氧环境下表达的方法，其特征在于，所述发酵表达体系为初始表达阶段设置为低氧环境，或为在表达过程中形成低氧环境。