CN102757976A - 消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而表达外源多肽的方法。揭示了一种通过在甲醇营养型酵母细胞内增加Mit1多肽的表达量,激活需要甲醇诱导的启动子表达,以此使得原本依赖甲醇诱导的启动子不再依赖单一甲醇也可表达外源多肽。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域;更具体地,本发明涉及一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而表达外源多肽的方法。
背景技术
甲醇营养型酵母(包括Pichia,Hansenula,Candida,Torulopsis等)表达系统由于其高效的外源多肽表达能力已经在工业生产、制药等领域被非常广泛的运用。其特点在于,它们拥有能够被甲醇高效诱导的启动子(AOX1启动子、DHAS启动子、FDH启动子、MOX启动子、AOX2启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-启动子等),并且这些启动子严格依赖甲醇,其它碳源(如葡萄糖,甘油等)会抑制这些启动子的表达。
随着石油危机的爆发,利用甲醇生产单细胞蛋白,成本变高。之所以利用甲基营养型母酵母表达系统表达如此之多的外源多肽,是因为其具有其他表达系统不可比拟的优势:基因操作简单,外源多肽表达量高,既可以胞内表达,也可以分泌表达;外源多肽基因遗传稳定;作为真核表达系统,具有真核生物的亚细胞结构,具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能;
由于被利用的范围越来越广,在实际的发酵放大过程中遇到很多问题:(1)表达所用的启动子需要甲醇的诱导,甲醇有毒易燃,在大规模工业发酵中需要进行特别的防暴设计;(2)甲醇发酵强耗氧,一般靠增大空气的通气量和提高转速很难满足氧气的需求而需要通纯氧,甲醇代谢需要氧气的量是葡萄糖为碳源所需氧气量的三至四倍。消耗的甲醇越多需要的纯氧越多,这给实际的工业化生产带来很大的麻烦。另外消耗的甲醇越多所产的热量也越大,所需设备的冷却能力要求越高;(3)甲醇作为一种石油化学产品,不适合于一些食品领域添加剂的生产;(4)甲醇代谢会产生H2O2,会导致所表达多肽的水解。
因此,如果得到一种能够利用非甲醇诱导甲醇诱导型启动子表达的方法,使原本依赖甲醇诱导的启动子的高效转录不依赖于甲醇,而可用其他碳源来诱导这些启动子的表达,这对于实现工业上利用非甲醇高效表达外源多肽具有积极意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动甲醇诱导型启动子表达外源多肽的方法。
本发明的另一目的还在于提供重组的甲醇营养型酵母,其可以利用消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性来表达外源多肽。
在本发明的第一方面,提供一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动外源多肽编码基因表达的方法,包括:
(1)提供甲醇营养型酵母,所述甲醇营养型酵母含有:
表达盒1,其表达外源的Mit1多肽;以及
表达盒2,包括甲醇诱导型启动子及与之操作性连接的外源多肽编码基因;
(2)在无甲醇条件或非单一甲醇碳源条件下培养(1)的甲醇营养型酵母。
在一个优选例中,所述的Mit1多肽是转录激活相关因子,使得原本依赖甲醇诱导的启动子不再依赖甲醇也可表达外源多肽。
在另一优选例中,所述的Mit1多肽的功能为:激活甲醇代谢中需要甲醇诱导的启动子表达。
在另一优选例中,所述的Mit1是PpMit1。
在另一优选例中,所述表达盒2在甲醇营养型酵母中以单拷贝或多拷贝存在,例如1-20拷贝,如15,10,8,6,5,3,2拷贝。
在另一优选例中,所述的甲醇诱导型启动子包括(但不限于):AOX1启动子、DHAS启动子、DAS启动子、FDH启动子、FMDH启动子、MOX启动子、AOX2启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-启动子、PMP20启动子、PMP47启动子、AOD1启动子、AOD2启动子。
在另一优选例中,所述的甲醇营养型酵母包括(但不限于):毕赤酵母(Pichia),汉逊酵母(Hansenula),假丝酵母(Candida),球拟酵母(Torulopsis);较佳地,所述的毕赤酵母(Pichia)包括(但不限于):GS115,MIG1基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母(Δmig1Δmig2),NRG1基因、MIG1基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母(Δmig1Δmig2Δnrg1),或HXS1基因不表达的毕赤酵母菌株。
在另一优选例中,述的Mit1多肽选自下组:
(a)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽;或
(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个,更佳地1-20个,更佳地1-15个,更佳地1-10个,更佳地1-5个或1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有利用非甲醇碳源诱导甲醇诱导型启动子表达外源多肽功能的由(a)衍生的多肽;
(c)与(a)限定的序列在具有70%以上(较佳地80%以上,更佳地90%以上,更佳地95%以上,更佳地98%以上,如99%或更高)的序列相同性的,且具有利用非甲醇碳源诱导甲醇诱导型启动子表达外源多肽功能的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中,所述的Mit1多肽的编码基因的NCBI Reference Sequence为XM_002493021.1。
在另一优选例中,所述的Mit1多肽的编码基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在另一优选例中,所述的Mit1多肽的编码基因在甲醇存在的情况下诱导表达,在甘油、葡萄糖等碳源存在的情况下不表达。
在另一优选例中,所述的表达盒1中,包括启动子以及与之操作性连接的Mit1多肽的编码基因;较佳地,该启动子包括(但不限于):组成型启动子,诱导型启动子,组织或器官特异性启动子,时空特异性表达启动子。
在另一优选例中,表达盒1中,所述启动子包括(但不限于):GAP启动子、PGK1启动子、MIT1启动子等任意能使MIT1过表达的启动子。
在另一优选例中,所述的表达盒1在甲醇营养型酵母中以单拷贝或多拷贝存在,例如1-20拷贝,如15,10,8,6,5,3,2拷贝。
在另一优选例中,步骤(2)中,采用存在甘油和/或葡萄糖的酵母培养基。
在本发明的另一方面,提供Mit1多肽或其编码基因的用途,用于消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动外源多肽编码基因表达。
在本发明的另一方面,提供一种重组的甲醇营养型酵母,所述甲醇营养型酵母含有:
表达盒1,其能够表达外源的Mit1多肽;以及
表达盒2,包括甲醇诱导型启动子及与之操作性连接的外源多肽编码基因。
在一个优选例中,所述的甲醇营养型酵母包括(但不限于):毕赤酵母(Pichia),汉逊酵母(Hansenula),假丝酵母(Candida),球拟酵母(Torulopsis);较佳地,所述的毕赤酵母(Pichia)包括(但不限于):GS115,MIG1基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母(Δmig1Δmig2),NRG1基因、MIG1基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母(Δmig1Δmig2Δnrg1),或HXS1基因不表达的毕赤酵母菌株。
在一个优选例中,所述的所述的MIG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示;
所述的MIG2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示;或
所述的HXS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所述的NRG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示(NCBI ReferenceSequence:XM_002493138.1)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、pGAPZαA的质粒图谱示意图。
图2、载体pAG32的质粒图谱示意图。
图3、野生型及GS115-MIT1分别在非甲醇或含甲醇(甘油+甲醇)的培养基中培养,并进行Aox显色反应的结果。
图4、野生型及GS115-MIT1分别在非甲醇或含甲醇的培养基中培养,并进行Aox酶活测定的结果。
图5、菌株GS115-MIT1-GFP在YND液体培养基中过夜预培养,然后分别转移至非甲醇或含甲醇的培养基中培养,取样后用流式细胞仪检测样品中GFP的几何平均荧光强度。
图6、野生型及Δmig1Δmig2-MIT1和Δhxs1-MIT1菌株分别在非甲醇或含甲醇的培养基中培养,生长到对数生长期后取样1ml,在离心后的菌体中加入Aox酶活显色液显色。
图7、野生型及Δmig1Δmig2-MIT1和Δhxs1-MIT1菌株分别在非甲醇或含甲醇的培养基中培养,生长到对数生长期后取样提取总蛋白,经Bradford法蛋白定量后进行Aox酶活的测定。
图8、野生型及Δmig1Δmig2-MIT1和Δhxs1-MIT1菌株分别在非甲醇或含甲醇的培养基中培养,取样后用流式细胞仪检测样品中GFP的几何平均荧光强度。
图9、载体pPIC3.5K的质粒图谱示意图。
图10、载体pUC18的质粒图谱示意图
图11、野生型及Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1菌株分别在非甲醇或含甲醇的培养基中培养,生长到对数生长期后取样提取总蛋白,经Bradford法蛋白定量后进行Aox酶活的测定。
图12、野生型及Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1菌株分别在非甲醇或含甲醇的培养基中培养,取样后用流式细胞仪检测样品中GFP的几何平均荧光强度。
具体实施方式
为了克服目前甲醇诱导型启动子在发酵时对于甲醇诱导的依赖性,本发明人经过深入的研究,揭示了一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性的方法,通过在甲醇营养型酵母细胞内增加Mit1(甲醇诱导的转录因子1;MethanolInduced Transcription Factor 1)多肽的表达量,激活甲醇代谢中需要单一甲醇诱导的启动子表达,以此使得原本依赖甲醇诱导的启动子不再依赖甲醇也可表达外源多肽。
术语
如本文所用,所述的“启动子”是指一种核酸序列,其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端),能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地,启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中,所述的启动子或启动子区包括启动子的活性变异体,该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。
如本文所用,所述的“甲醇诱导型启动子”是与甲醇代谢有关的酶的启动子。在现有技术中,这些启动子通过向生长培养基中添加甲醇,可以控制外源多肽由所述启动子的表达。所述的“甲醇诱导型启动子”可以由本领域技术人员使用常规技术从酵母中分离获得。
如本文所用,所述的“单一甲醇(碳源)诱导”是指启动子需要以甲醇为唯一碳源进行诱导来驱动与之操作性连接的基因的表达,在非甲醇为唯一碳源(如甲醇+葡萄糖)的条件下不能驱动与之操作性连接的基因的表达。所述的“消除单一甲醇诱导”是指使得启动子在不以甲醇为唯一碳源(如甲醇+葡萄糖,或葡萄糖,或甘油)的条件下就可驱动与之操作性连接的基因的表达。“非单一甲醇(碳源)诱导”是指除了甲醇碳源外,还存在至少一种非甲醇的碳源。
如本文所用,所述的“组成型启动子”是指在其调控下不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异的一类启动子。
如本文所用,所述的“诱导型启动子”可根据需要在特定细胞生长阶段或特定生长环境下,快速诱导基因转录的“开”与“关”或者“高”与“低”。根据来源,可将诱导型启动子分为天然存在的启动子和人工构建的启动子。
如本文所用,所述的“组织或器官特异性启动子”是指基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中的启动子。
如本文所用,“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如,如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的,则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
如本文所用,所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为外源多肽或Mit1多肽)所需的所有必要元件的基因表达系统,通常其包括一下元件:启动子、编码多肽的基因序列,终止子;此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
如本文所用,所述的“甲醇营养型酵母”是指可利用甲醇作为唯一碳源的酵母。包括来自汉逊酵母属(Hansenula),毕赤酵母属(Pichia),球拟酵母属(Torulopsis),假丝酵母属(Candida)等的酵母。
如本文所用,所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如:启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置,使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导,从而,启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用,术语“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%,优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上,更优选是95%以上时才发生杂交。
如本文所用,所述的“含有”,“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
Mit1多肽
本发明揭示了Mit1多肽在消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动外源多肽编码基因表达中的应用。在对依赖甲醇控制外源多肽表达的启动子(甲醇诱导型启动子)的研究工作中,本发明人意外发现Mit1多肽可以解除甲醇诱导型启动子对于甲醇的依赖性,使其可利用非单一甲醇碳源或非甲醇碳源进行外源多肽的表达。
本发明还包括所述的Mit1多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的MIT1多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或多肽原序列,或融合多肽)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中,术语“Mit1多肽”指具有利用非甲醇碳源诱导甲醇诱导型启动子表达外源多肽功能的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有利用非甲醇碳源诱导甲醇诱导型启动子表达外源多肽功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个,还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与编码Mit1多肽的DNA杂交的DNA所编码的多肽、以及利用抗Mit1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽,如包含Mit1多肽或其片段的融合多肽。
本发明还提供Mit1多肽或多肽的类似物。这些类似物与天然Mit1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到,如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变,还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
本发明还提供了编码本发明Mit1多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2序列或其变异形式的蛋白,但与SEQ ID NO:1中的编码区序列有差别的核酸序列。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述多核苷酸同源的多核苷酸,它们是与上述多核苷酸具有至少50%,较佳地至少60%,更佳地至少70%,更佳地至少80%相,更佳地至少90%;更佳地至少95%;更佳地至少98%或99%相同性的多核苷酸。这些多核苷酸所编码的蛋白也具有与前述多核苷酸所编码的多肽相同的利用非甲醇碳源诱导甲醇诱导型启动子表达外源多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。
本发明的Mit1多肽核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,可进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本发明中,编码Mit1多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Mit1多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
增加Mit1多肽表达的方法是本领域周知的。例如,可通过转入携带Mit1多肽编码基因的表达构建物使酵母细胞过表达Mit1多肽;或可通过用强启动子驱动从而增强Mit1多肽的表达;或者通过增强子来增强该Mit1多肽的表达。
甲醇诱导型启动子
在现有常规技术中,所述的甲醇诱导型启动子依赖于在培养基中添加甲醇,从而控制外源多肽由所述启动子的表达。而本发明人利用Mit1多肽解除了甲醇诱导型启动子对于甲醇的依赖。
本领域技术人员熟悉甲醇依赖型启动子,可使用常规技术从酵母中分离获得。由于甲醇依赖型启动子具有基本相同的工作机制和工作原理,本发明对于甲醇依赖型启动子的种类没有特别的限制。例如,所述的甲醇诱导型启动子包括但不限于:AOX1启动子、DHAS启动子(或者DAS启动子)、FDH启动子(或者FMDH启动子)、MOX启动子、AOX2启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-启动子、PMP20启动子、PMP47启动子、AOD1启动子、AOD2启动子。
本发明还包括与上述启动子的多核苷酸序列具有至少70%,更佳地至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)相同性的启动子。这些启动子在引发转录的必要位点及转录起始点的位置上是严格保守的。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述甲醇依赖型启动子的核苷酸序列可杂交的多核苷酸,且该多核苷酸也具有野生型甲醇依赖型启动子的功能。
消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动外源多肽编码基因表达的方法
本发明还提供了一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动外源多肽编码基因表达的方法,包括:
(1)提供甲醇营养型酵母,所述甲醇营养型酵母含有:
表达盒1,其能够表达外源的Mit1多肽;以及表达盒2,包括甲醇诱导型启动子及与之操作性连接的外源多肽编码基因;
(2)在无甲醇条件或非单一甲醇碳源条件培养(1)的甲醇营养型酵母。
所述的表达盒1和表达盒2可以存在于同一表达载体中,也可以存在于不同的表达载体中。
所述表达盒1在甲醇营养型酵母中以单拷贝或多拷贝存在,例如1-20拷贝,如15,10,8,6,5,3,2拷贝。所述的表达盒2在甲醇营养型酵母中也可以单拷贝或多拷贝存在,例如1-20拷贝,如15,10,8,6,5,3,2拷贝。
所述的表达盒2中,包括启动子以及与之操作性连接的Mit1多肽的编码基因。应理解,任何可使得Mit1多肽在甲醇营养型酵母中重组表达的启动子都可用于本发明。不限于组成型启动子、诱导型启动子或特异性启动子。本领域技术人员可以根据所需达到的目的进行合适的选择,例如当希望通过一定的条件干预来控制Mit1多肽的表达或不表达,则可以选择诱导型启动子。较佳地,表达盒2中,所述启动子包括:GAP启动子、PGK1启动子、MIT1启动子等任意能够使得MIT1过表达的启动子。
步骤(2)中,“无甲醇的条件”是本领域技术人员易于建立的,也即,在常规应用的甲醇营养型酵母培养基中,不加入甲醇作为碳源,取代以其它类型的碳源,常用的碳源是本领域技术人员熟知的,例如但不限于:甘油、葡萄糖、淀粉(含淀粉水解液,木薯淀粉,玉米淀粉,纤维素类水解液等)、蔗糖、麦芽糖等。较佳地,采用以甘油和/或葡萄糖为碳源的酵母培养基。类似地,“非单一甲醇碳源条件”也是本领域技术人员易于建立的。
重组甲醇营养型酵母
基于本发明的新发现,还提供了一种重组的甲醇营养型酵母,所述甲醇营养型酵母含有:表达盒1,其能够表达外源的MIT1多肽;以及表达盒2,包括甲醇诱导型启动子及与之操作性连接的外源多肽编码基因。附加条件是,所述的表达盒1和表达盒2可以存在于同一表达载体中,也可以存在于不同的表达载体中。
任何甲醇营养型酵母均可被应用于本发明中,以构建上述重组的甲醇营养型酵母。例如,所述的甲醇营养型酵母包括但不限于:毕赤酵母(Pichia),汉逊酵母(Hansenula),假丝酵母(Candida),球拟酵母(Torulopsis);较佳地,所述的毕赤酵母(Pichia)包括:GS115,MIG1基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母(Δmig1Δmig2),NRG1基因、MIG1基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母(Δmig1Δmig2Δnrg1),或基因HXS1不表达的毕赤酵母菌株。
在本发明的具体实施例中,提供了四株能够利用非甲醇碳源诱导AOX1启动子表达外源多肽的菌株,GS115-MIT1、Δmig1Δmig2-MIT1、Δhxs1-MIT1和Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1。在毕赤酵母野生菌株GS115、毕赤酵母双缺失菌株Δmig1Δmig2、毕赤酵母缺失菌株Δhxs1和毕赤酵母三缺失菌株Δmig1Δmig2Δnrg1中分别过表达了转录激活相关基因MIT1,构建了基因过表达菌株GS115-MIT1、Δmig1Δmig2-MIT1、Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1和Δhxs1-MIT1。经Aox1酶活检测发现,甘油可以诱导GS115-MIT1的AOX1启动子的表达,甘油或者葡萄糖均能诱导Δmig1Δmig2-MIT1、Δhxs1-MIT1和Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1的AOX1启动子表达。并且用流式细胞仪检测了绿色荧光蛋白GFP以AOX1为启动子时在非甲醇碳源中的诱导表达量。
所述的Δhxs1菌株中,与酿酒酵母己糖感应体Snf3/Rgt2有很高相似性的一个基因HXS1(GenBank登录号:8197942)的编码区缺失。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
材料
毕赤酵母总蛋白提取技术参照冷泉港公司提供的酵母蛋白提取手册。
所使用的工具酶均购自TaKaRa生物公司(大连,中国),具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。
下面的商品化质粒和菌株用于基因克隆和蛋白表达:质粒pGAPZαA、质粒pPIC3.5k、大肠杆菌Top10、毕赤酵母菌株GS115均购自Invitrogen公司。
质粒pAG32由质粒pRDM054在酶切位点Bgl II处切除PAOX1-BFP-SKL表达体系得到;质粒pRDM05获自加州大学圣地亚哥分校。
YPD培养基:2%蛋白胨,1%酵母粉,2%葡萄糖,2%琼脂粉;YNB培养基:0.67%YNB;MGY培养基:1%甘油,0.67%YNB;YND液体培养基:1%葡萄糖,0.67%YNB。
配制以上培养基时,葡萄糖115°C高压灭菌20min,甲醇在使用时添加。其它成分121°C高压灭菌20min。固体培养基加2%琼脂粉。
实施例1、甘油可诱导AOX1启动子表达的毕赤酵母菌株GS115-MIT1
1.PpMIT1过表达质粒的构建
采用PCR,酶切连接的方法,以pGAPZαA(图1)为载体在GAP启动子下游的Asu II/Sal I两个酶切位点插入PpMIT1基因(SEQ ID NO:1,基因全长2667bp),得到的重组质粒称为pGM质粒。
以M1-GAP5和M1-AOX1TT为引物(表1),通过PCR的方法从pGM质粒上扩增得到pGAP-PpMIT1-AOX1TT的表达体系(全长3615bp),以pAG32(图2)为载体在Sac I/Spe I处插入该表达体系。得到重组质粒为pGMhph。
表1.引物列表
2.电转毕赤酵母和GS115-MIT1菌株的筛选
将PpMIT1过表达质粒(pGMhph)电转毕赤酵母菌株GS115,涂于4块加潮霉素的YPD固体培养基上,放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至10ml YPD+潮霉素液体培养基中,30℃摇床培养后,提基因组用PCR验证。把PCR检验及测序验证后正确的毕赤酵母菌株命名为GS115-MIT1。
3.Aox显色反应
将各菌株分别在0.5%(v/v)甲醇,1%甘油,1%甘油+0.5%(v/v)甲醇为碳源的YNB液体培养基中培养,生长到对数生长期后取样1ml,在离心后的菌体中加入Aox1酶活显色液显色(参见Stasyk O.V.,T.Y.Nazarko,and A.A.Sibirny.2008.Methods of Plate Pexophagy Monitoring and Positive Selection forATG Gene Cloning in Yeasts.Methods in enzymology.451:229-239。显色底物为o-dianisidine)。
结果如图3,可以看到在含有甘油的培养基中生长后,只有菌株GS115-MIT1中有Aox酶活,野生菌株中均没有酶活。
4.Aox酶活的测定
将各菌株在MGY液体培养基中过夜预培养,然后分别转移到含有0.5%(v/v)甲醇,1%甘油,1%甘油+0.5%(v/v)甲醇,0.5%(v/v)甲醇为碳源的YNB液体培养基中,培养10小时后取样提取总蛋白,经Bradford法蛋白定量后进行Aox1酶活的测定(方法参见Verduyn,C.,J.P.van Dijken,and W.A.Scheffers.1984.Colorometric alcohol assays with alcohol oxidase.J.Microbiol.Methods 2:15-25。显色底物为2,2’-azino-di-(3-ethylbenzthiazoline sulfonate),ABTS)。
由图4可知,菌株GS115-MIT1在含有甘油的培养基中均可以诱导Aox1的表达,野生菌株均不能诱导Aox的表达。
5、毕赤酵母GFP单拷贝表达菌株的筛选
在载体pPIC3.5k(图9)的AOX1启动子下游的SnaB I酶切位点处插入GFP基因(全长714bp),得到GFP表达载体pP-GFP。
6、毕赤酵母GFP单拷贝表达菌株的筛选
分别将表达载体pP-GFP电转GS115-MIT1菌株,涂于不含组氨酸的YND平板,放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至液体培养基中,30℃摇床培养后提基因组,用real-time PCR验证GFP拷贝数(方法参见Xuan,Y.J.,X.S.Zhou,W.W.Zhang,X.Zhang,Z.W.Song,and Y.X.Zhang.2009.An upstream activation sequence controls the expression of AOX1 gene inPichia pastoris.FEMS Yeast Res.9:1271-1282)。把real-time PCR检验为单拷贝的毕赤酵母GFP表达菌株分别命名为GS115-MIT1-GFP。
同理构建了表达菌株Δmig1Δmig2-MIT1-GFP和Δhxs1-MIT1-GFP。
表达菌株Δmig1Δmig2-MIT1-GFP构建方法具体如下:将表达载体pP-GFP和表达载体pGMhph共转Δmig1Δmig2菌株(参见中国公开专利CN101857845A)。
表达菌株Δhxs1-MIT1-GFP构建方法具体如下:将表达载体pP-GFP和表达载体pGMhph共转Δhxs1-MIT1菌株。
7、流式细胞仪检测GFP表达量
将菌株GS115-MIT1-GFP在YND液体培养基中过夜预培养,然后分别转移含有0.5%(v/v)甲醇,1%甘油,1%甘油+0.5%(v/v)甲醇为碳源的YNB液体培养基中培养,取样后用流式细胞仪检测样品中GFP的几何平均荧光强度。
如图5所示,GS 115-MIT1可以在甘油存在的情况下诱导外源多肽GFP表达。
实施例2、甘油或者葡萄糖可诱导AOX1启动子表达的毕赤酵母菌株
1.HXS1基因敲除质粒的构建
用BamH I和Sal I酶将Zeocin抗性基因Sh ble片段从质粒pGAPZαA上切下,以pUC18质粒(图10)为载体,在BamH I和Sal I处酶切连接插入了Zeocin抗性基因Sh ble片段,命名为pUC18-ble质粒。以GS115基因组为模板,首先使用引物HS1-5F/HS1-5R扩增PpHXS1基因的5’端外围启动子区域(起始密码子ATG上游),扩增产物的大小为728bp。引物HS1-3F/HS1-3R用于扩增PpHXS1基因的3’端的区域(终止密码子下游),扩增产物的大小为1011 bp,分别切胶回收目的大小片段。
将回收的PpHXS1基因的5’端外围启动子DNA片段,用EcoRI和BamHI双酶切后,回收片段。pUC18-ble质粒、用EcoRI和BamHI双酶切,回收片段。将回收的两片段连接过夜,转化大肠杆菌,PCR验证阳性克隆,命名为pUC18-(HS15’-ble)。
将上一步构建好质粒SalI和SphI双酶切,回收片段。PpHXS1基因的3’端区域DNA片段也用SalI和SphI双酶切。两片段连接过夜,转化大肠杆菌,PCR阳性菌株,阳性菌株命名为pUC18-(HS15’-ble-HS13’)。
表2、PpHXS1敲除使用的引物
2.Δhxs1基因缺失菌株的构建
将pUC18-(HS1 5’-ble-HS1 3’)质粒用EcoRI和SphI双酶切,胶回收大小为3350bp的PpHXS1敲除片段HS1 5’-ble-HS1 3’。
将回收的20μl PpHXS1敲除片段HS1 5’-ble-HS1 3’(浓度大于50ng/μl)与80μl毕赤酵母GS115感受态在冰上混匀,按照实验步骤提供的方法进行电转化。将50μl复苏的电转化菌液涂于添加Zeocin抗生素的YP+Glycerol固体培养基平板,将筛选平板倒置于30℃培养箱培养2~3天,当有肉眼可见菌落长出时,将菌落挑至含Zeocin的YP+Glycerol液体培养基中培养2~3天。PCR验证PpHXS1敲除的阳性菌株,命名为Δhxs1。
3.Δmig1Δmig2-MIT1和Δhxs1-MIT1的构建
将质粒pGMhph电转毕赤酵母菌株Δmig1Δmig2和Δhxs1,涂于4块加潮霉素的YPD平板,放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至10ml YPD+潮霉素液体培养基中,30℃摇床培养后,抽提基因组用PCR验证。把PCR检验及测序验证后正确的毕赤酵母菌株分别命名为Δmig1Δmig2-MIT1和Δhxs1-MIT1。
4.Aox显色反应
将Δmig1Δmig2-MIT1和Δhxs1-MIT1分别在1%甘油,1%甘油+0.5%(v/v)甲醇,1%葡萄糖,1%葡萄糖+0.5%(v/v)甲醇和0.5%(v/v)甲醇为碳源的YNB液体培养基中培养,生长到对数生长期后取样1ml,在离心后的菌体中加入Aox1酶活显色液显色。
结果如图6,可以看到在含有甘油或者葡萄糖的培养基中,只有菌株Δmig1Δmig2-MIT1和Δhxs1-MIT1中有酶活。
3.Aox酶活的测定
将各菌株分别在1%甘油,1%甘油+0.5%(v/v)甲醇,1%葡萄糖,1%葡萄糖+0.5%(v/v)甲醇和0.5%(v/v)甲醇为碳源的YNB液体培养基中培养,生长到对数生长期后取样提取总蛋白,经Bradford法蛋白定量后进行Aox1酶活的测定。
由图7可知,菌株Δmig1Δmig2-MIT1和Δhxs1-MIT1在含有甘油或者葡萄糖的培养基中均可以诱导Aox1的表达,野生菌株均不能诱导Aox的表达。
4.流式细胞仪检测Δmig1Δmig2-MIT1和Δhxs1-MIT1的GFP表达量
将Δmig1Δmig2-MIT1-GFP和Δhxs1-MIT1-GFP在液体培养基中过夜预培养,然后分别转移到含有0.5%(v/v)甲醇,1%甘油,1%甘油+0.5%(v/v)甲醇,1%葡萄糖和1%葡萄糖+0.5%(v/v)甲醇为碳源的YNB液体培养基中,取样后用流式细胞仪检测样品中GFP的几何平均荧光强度。
如图8所示,Δmig1Δmig2-MIT1和Δhxs1-MIT1可以在甘油或者葡萄糖存在的情况下诱导外源多肽GFP表达。
实施例5、甘油或者葡萄糖可诱导AOX1启动子表达的毕赤酵母菌株Δmig1ΔmigΔnrg1-MIT1
1.NRG1基因敲除质粒的构建
以GS115基因组为模板,使用引物5’NRG1-F/5’NRG1-R扩增PpNIG1基因的5’端外围区域得到大小为320bp片段,将扩增产物命名为5’NRG1,胶回收5’NRG1片段。以上所得到的5’NRG1片段用Sac I和Sma I双酶切,与同样Sac I和Sma I双酶切的pUC18质粒连接,构成pUC18(SacI-5’NRG1-SmaI)。载体pUC18(SacI-5’NRG1-SmaI)转化大肠杆菌感受态,菌落PCR筛选阳性克隆。
然后,使用引物HYG-F和HYG-R,以质粒pRDM054为模板,扩增潮霉素B抗性基因HPH,大小为1648bp。以上所得HPH片段用Sma I和XbaI双酶切,与同样Sma I和XbaI双酶切的载体pUC18(SacI-5’NRG1-SmaI)相连,构成载体pUC18(SacI-5’NRG1-SmaI-HPH-XbaI)。pUC18(SacI-5’NRG1-SmaI-HPH-XbaI)转化入大肠杆菌,菌落PCR筛选阳性克隆。
用引物5’NRG1-F/NRG1-A1以质粒pUC18(SacI-5’NRG1-SmaI-HPH-XbaI)为模板扩增得到片段Overlap-A。用引物NRG1-B2/3’NRG1-R,以GS115基因组为模板,扩增得到片段Overlap-B。然后通过Overlap PCR的方法链接片段A、B,得到5’NRG1-HPH-3’NRG1片段。将该片段连接到pMD19-T载体上,得到敲除质粒pMD19-T(SacI-5’NRG1-SmaI-HPH-3’NRG1-SphI)。
2.Δmig1Δmig2Δnrg1菌株的构建
将得到的SacI-5’NRG1-SmaI-HPH-3’NRG1-SphI片段与Δmig1Δmig2双缺失菌株感受态共转,电转后迅速加入700ul预冷的1mol/L山梨醇,然后转移至EP管中,并加入700ul YPD液体培养基,30℃和200r/min摇床复苏培养1~2h。最后将菌液涂于添加Zeocin、G418和Hygromycin抗生素的YPD固体平板。30℃培养箱倒置培养2~3天。将阳性转化子提基因组PCR验证,得到的阳性菌株命名为Δmig1Δmig2Δnrg1。
3.三缺失菌株中MIT1过表达质粒的构建
以pPIC3.5k为载体在Sac I/BamH I两个酶切位点插入GAP启动子得到pPG质粒。再于BamH I/Not I两个酶切位点间插入PpMPP1基因序列,得到的重组质粒称为pPGPP1质粒。
4.Δmig1ΔmigΔnrg1-MIT1的构建
将质粒pPGPP1电转毕赤酵母菌株Δmig1Δmig2Δnrg1,涂于4块不加his的YND平板,放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至10ml YND液体培养基中,30℃摇床培养后,抽提基因组用PCR验证。把PCR检验及测序验证后正确的毕赤酵母菌株分别命名为Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1。
5.毕赤酵母GFP单拷贝表达菌株的筛选
分别将表达载体pP-GFP电转GS11+-MIT1菌株,涂于不含组氨酸的YND平板,放在30℃培养箱培养48-72小时。将平板上长出的单克隆挑至MGY液体培养基中,在荧光显微镜下观察是否有绿色荧光,有荧光的转化子30℃摇床培养后提基因组,用real-time PCR验证GFP拷贝数(方法参见Xuan,Y.J.,X.S.Zhou,W.W.Zhang,X.Zhang,Z.W.Song,and Y.X.Zhang.2009.An upstreamactivation sequence controls the expression of AOX1 gene in Pichia pastoris.FEMS Yeast Res.9:1271-1282)。把real-time PCR检验为单拷贝的毕赤酵母GFP表达菌株命名为Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1-GFP。
6.Aox酶活的测定
将Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1菌株分别在1%甘油,1%甘油+0.5%(v/v)甲醇,1%葡萄糖,1%葡萄糖+0.5%(v/v)甲醇和0.5%(v/v)甲醇为碳源的YNB液体培养基中培养,生长到对数生长期后取样提取总蛋白,经Bradford法蛋白定量后进行Aox1酶活的测定。
由图11可知,菌株Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1在含有甘油或者葡萄糖的培养基中均可以诱导Aox1的表达,野生菌株均不能诱导Aox的表达。
7.流式细胞仪检测Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1的GFP表达量
将Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1-GFP在液体培养基中过夜预培养,然后分别转移到含有0.5%(v/v)甲醇,1%甘油,1%甘油+0.5%(v/v)甲醇,1%葡萄糖和1%葡萄糖+0.5%(v/v)甲醇为碳源的YNB液体培养基中,取样后用流式细胞仪检测样品中GFP的几何平均荧光强度。
如图12所示,Δmig1Δmig2Δnrg1-MIT1可以在甘油或者葡萄糖存在的情况下诱导外源多肽GFP表达。
表3、PpNIG1敲除使用的引物
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动外源多肽编码基因表达的方法,包括:
(1)提供甲醇营养型酵母,所述甲醇营养型酵母含有:
表达盒1,其表达外源的Mit1多肽;以及
表达盒2,包括甲醇诱导型启动子及与之操作性连接的外源多肽编码基因;
(2)在无甲醇条件或非单一甲醇碳源条件下培养(1)的甲醇营养型酵母。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的甲醇诱导型启动子包括:AOX1启动子、DHAS启动子、DAS启动子、FDH启动子、FMDH启动子、MOX启动子、AOX2启动子、ZZA1、PEX5-、PEX8-、PEX14-启动子、PMP20启动子、PMP47启动子、AOD1启动子、AOD2启动子。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的甲醇营养型酵母包括:毕赤酵母(Pichia),汉逊酵母(Hansenula),假丝酵母(Candida),球拟酵母(Torulopsis);较佳地,所述的毕赤酵母包括:GS115,MIG1基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母,NRG1基因、MIG1基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母,或HXS1基因不表达的毕赤酵母菌株。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的Mit1多肽选自下组:
(a)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽;或
(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有利用非甲醇碳源诱导甲醇诱导型启动子表达外源多肽功能的由(a)衍生的多肽;
(c)与(a)限定的序列在具有70%以上的序列相同性的,且具有利用非甲醇碳源诱导甲醇诱导型启动子表达外源多肽功能的由(a)衍生的多肽。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的表达盒1中,包括启动子以及与之操作性连接的Mit1多肽的编码基因;较佳地,该启动子包括:组成型启动子,诱导型启动子,组织或器官特异性启动子,时空特异性表达启动子。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,采用存在甘油和/或葡萄糖的酵母培养基。
7.Mit1多肽或其编码基因的用途,用于消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性而驱动外源多肽编码基因表达。
8.一种重组的甲醇营养型酵母,所述甲醇营养型酵母含有:
表达盒1,其能够表达外源的Mit1多肽;以及
表达盒2,包括甲醇诱导型启动子及与之操作性连接的外源多肽编码基因。
9.如权利要求8所述的重组的甲醇营养型酵母,其特征在于,所述的甲醇营养型酵母包括:毕赤酵母(Pichia),汉逊酵母(Hansenula),假丝酵母(Candida),球拟酵母(Torulopsis);较佳地,所述的毕赤酵母(Pichia)包括:GS115,MIG1基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母,NRG1基因、MIG1基因和MIG2基因不表达的毕赤酵母,或HXS1基因不表达的毕赤酵母菌株。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的MIG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示;
所述的MIG2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示;或
所述的HXS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
所述的NRG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
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