BRPI0817154B1

BRPI0817154B1 - "método de modificar uma célula de levedura para a produção de etanol, célula de levedura modificada, uso de uma célula de levedura modificada e método para a produção de etanol"

Info

Publication number: BRPI0817154B1
Application number: BRPI0817154A
Authority: BR
Inventors: Stephane Guillouet; Carine Bideaux; Elke Nevoigt; Sandrine Alfenore
Original assignee: Technische Universität Berlin
Priority date: 2007-10-29
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2018-11-27
Also published as: EP2060632A1; US20160153009A1; US9175270B2; ES2521316T3; EP2222860A1; WO2009056984A1; EP2222860B1; BRPI0817154B8; BRPI0817154A2; US20120295319A1; EP2222860B8; CA2703856A1

Description

(54) Título: MÉTODO DE MODIFICAR UMA CÉLULA DE LEVEDURA PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL, CÉLULA DE LEVEDURA MODIFICADA, USO DE UMA CÉLULA DE LEVEDURA MODIFICADA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL (73) Titular: TECHNISCHE UNIVERSITÃT BERLIN. Endereço: STRESSE DES 17. JUNI 135 - BERLIN, ALEMANHA (DE) (72) Inventor: STEPHANE GUILLOUET; CARINE BIDEAUX; ELKE NEVOIGT; SANDRINE ALFENORE.

Código de Controle: 839F82257C827224 EB7CA062B328069B

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 27/11/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 27/11/2018

Assinado digitalmente por:

Alexandre Gomes Ciancio

Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

1/29 “MÉTODO DE MODIFICAR UMA CÉLULA DE LEVEDURA PARA A

PRODUÇÃO DE ETANOL, CÉLULA DE LEVEDURA MODIFICADA, USO DE

UMA CÉLULA DE LEVEDURA MODIFICADA E MÉTODO PARA A

PRODUÇÃO DE ETANOL”

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a um método de modificar uma célula de levedura, em particular para a produção de etanol. A presente invenção, além disso, refere-se a um método para produzir etanol a partir de biomassa.

Antecedentes da Invenção [002] O bioetanol é uma alternativa promissora para combustíveis fósseis. O interesse crescente em biocombustíveis renováveis resulta principalmente do fato de que os combustíveis fósseis no mundo estão limitados. Além disso, existe a tendência em diminuir a dependência de óleo de importação. A Comissão Européia planeja substituir progressivamente 20% dos combustíveis fósseis convencionais por combustíveis alternativos no setor de transporte em 2020 (5,75% em 2010). Uma via técnica é produzir bioetanol por fermentação microbiana de várias plantações domésticas (biomassa).

[003] A produção de bioetanol a partir de biomassa contendo açúcar e amido é comum no Brasil e nos US. A levedura Saccharomyces (S.) cerevisiae tem sido tradicionalmente usada neste processo. De fato, a levedura S. cerevisiae tem propriedades excelentes para a produção de bioetanol. Em particular, sua alta tolerância às condições que ocorrem durante a produção de etanol industrial dificilmente permitirá que outros micro-organismos substituam a levedura neste campo.

[004] O glicerol é formado por S. cerevisiae como um subproduto durante o catabolismo de glicose além dos produtos de fermentação principais;

etanol, dióxido de carbono e biomassa. O fluxo de carbono para glicerol é muito

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2/29 substancial e pode totalizar até 0,1 g de glicerol por grama de glicose (Alfenore etal., 2004; Aldiguier etal., 2004).

[005] A biossíntese de glicerol a partir de fosfato de dihidroxiacetona intermediário glicolítico (DHAP) em S. cerevisiae é efetuada por duas etapas enzimáticas catalisadas por 3-fosfato glicerol desidrogenase (GPDH) e 3-fosfatase glicerol (GPP) (ver também a figura 1). Cada enzima é codificada por dois isogenes GPD1/GPD2e GPP1/GPP2, respectivamente.

[006] A biossíntese de glicerol tem papéis essenciais em S. cerevisiae. Uma das funções mais importantes é manter o equilíbrio de redox citosólico sob condições anaeróbicas, e provavelmente também sob condições aeróbicas quando a concentração de açúcar é elevada (efeito de Crabtree) (Ansell etal., 1997; Bakker etal., 2001; Rigoulet etal., 2004; Valadi etal.; 2004). A via biossintética de glicerol também está envolvida na biossíntese de glicerofosfolipídeos e triacilgliceróis que são formados de 3-fosfato L-glicerol (Kohlwein etal., 1996; Mullner e Daum, 2004). Além disso, o glicerol intracelular está envolvido na osmoadaptação (Hohmann, 2002), proteção de estresse oxidativo (Pahlman et al., 2001) e resposta a choque térmico (Siderius et al., 2000). As respostas em temperaturas elevadas e alta osmolaridade envolvem várias vias de sinalização incluindo a via proteína cinase C e a via HOG, que regulam os níveis intracelulares de glicerol (Hohmann, 2002; Wojda etal., 2003).

[007] Teoricamente, a redireção do fluxo de carbono em S. cerevisiae em direção à via sintética de etanol eliminando a formação de glicerol aumentaria o rendimento de etanol em pelo menos 10%. Além disso, o glicerol no caldo de fermentação levaria a um decréscimo nos custos da extração de etanol uma vez que o glicerol tem causado problemas nas unidades de destilação e nos processos de separação após o estágio de fermentação. Além disso, os volumes de refugo poderíam ser reduzidos. Sob aspectos práticos, no entanto, a redução da formação de glicerol sem afetar negativamente a boa

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3/29 forma da célula é extremamente desafiante devido às várias funções da via biossíntética de glicerol, como será agora exposto com referência a estudos anteriores.

[008] A primeira abordagem de engenharia metabólica para reduzir o glicerol foi relatada há alguns anos (Nissen etal., 2000a). O rendimento de etanol em fermentações em batelada aeróbicas foi aumentado em 12% quando a formação de glicerol foi completamente abolida deletando GPD1 e GPD2. O crescimento deste duplo mutante foi severamente afetado mesmo na presença de oxigênio. Portanto, a produtividade volumétrica de etanol obtida com esta abordagem estava longe da relevância industrial. O fato de que o crescimento do duplo mutante gpd1A e gpd2A foi fortemente prejudicado é explicado por uma capacidade limitada da reoxidação de NADH respiratório (pelas NADH desidrogenases Ndelp, Nde2p e o shuttle de L-G3P/DHAP mitocondrial) (Nissen etal., 2000a) que são as únicas vias para reoxidar NADH citosólico em excesso quando GPD está ausente.

[009] Outras tentativas para reduzir a formação de glicerol dependem da introdução de trans-hidrogenases bacterianas em leveduras. Estas abordagens falharam desde que, por um lado, a trans-hidrogenase Azotobacter vinelandiiproduziu o efeito oposto esperado (Nissen etal., 2001), e, por outro lado, a trans-hidrogenase ligada à membrana de Escheríchia coli permaneceu localizada na membrana do retículo endoplásmico (Anderlund et al., 1999).

[010] Uma estratégia muito bem-sucedida para melhorar o rendimento de etanol é a engenharia metabólica da assimilação de amónio, reduzindo a produção de NADH durante a biossíntese de aminoácidos (Nissen et al., 2000b). O rendimento de glicerol foi reduzido em 38% e o rendimento de etanol aumentado em 10%. No entanto, para a função apropriada, esta abordagem requer que a levedura utilize o amónio como uma fonte de nitrogênio.

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O meio industrial com frequência contém aminoácidos, um fato que reduzirá consideravelmente o sucesso desta abordagem sob as condições relevantes industriais.

[011] Recentemente, estudo in silico foi realizado usando um modelo metabólito de S. cerevisiae em escala de genoma a fim de avaliar as estratégias de engenharia metabólica possíveis para melhorar o rendimento de etanol em S. cerevisiae (Bro et al., 2005). Estas abordagens são designadas para prevenir a produção de NADH em excesso através da síntese de biomassa e, portanto, reduzem a necessidade de produzir glicerol. Baseado nas previsões dos autores, várias abordagens devem ser capazes de aumentar o rendimento de etanol em até 10,4%. Uma das estratégias previstas foi testada in vivo, mas em contraste com a teoria, resultaram somente em um aumento de 3% do rendimento de etanol.

[012] Portanto, as abordagens de engenharia metabólica mencionadas acima não têm nenhum impacto ou somente um impacto marginal sobre a produtividade de etanol sob as condições industrialmente relevantes devido às limitações no rendimento de etanol, no crescimento ou na dependência do meio. Além disso, permanece questionável se as abordagens atuais ou previstas provariam ser bem-sucedidas sob alto teor de etanol e estresse térmico de fermentações industriais uma vez que elas não levam em conta a necessidade de células para o glicerol intracelular.

Descrição Da Invenção [013] O problema referido na presente invenção foi, portanto, aumentar o rendimento da conversão dos constituintes da biomassa fermentável em etanol por levedura e, em efeito, aumentar a eficácia econômica das usinas de bioetanol. Um modo de resolver este objetivo é reduzir a produção do subproduto glicerol.

[014] Um desafio particular na resolução deste problema está no

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5/29 fato de que a eliminação completa da formação de glicerol tem provado ser bemsucedida, uma vez que a via biossintética de glicerol tem várias funções importantes para o crescimento de células e tolerância a estresse.

[015] Em vez disso, os inventores revelaram surpreendentemente uma estratégia para modificar uma célula de levedura do tipo selvagem que leva a um rendimento aumentado de etanol a partir de açúcares, isto é, açúcares fermentáveis presentes nos hidrolisados da biomassa de plantas, mas ao mesmo tempo não têm uma influência negativa sobre a taxa de crescimento das células de levedura ou o rendimento de biomassa. De acordo com a presente invenção, isto é obtido reduzindo (mas não eliminando) a atividade da proteína Gpd1 (3fosfato glicerol desidrogenase-1) e/ou da proteína Gpd2 (3-fosfato glicerol desidrogenase-2) quando comparada à atividade destas proteínas em uma célula do tipo selvagem.

[016] Na realidade, um rendimento mais alto de etanol, de título e de produtividade específica comparado à cepa do tipo selvagem isogênica é obtido através da presente invenção. Também, a modificação da via metabólica tem a vantagem adicional de abaixar os custos para a recuperação da produtividade e reduz os volumes de refugo.

[017] O termo “redução da atividade” significa não incluir a eliminação da atividade da proteína. Além disso, o termo “atividade” refere-se ao fluxo metabólico in vivo através da proteína particular, que, de acordo com a definição do termo “reduzindo a atividade” não significa incluir o bloqueio completo deste fluxo metabólico. Em vez disso, o cerne da presente invenção reside na redução da atividade da proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2, mas, ao mesmo tempo, fornecendo uma atividade mínima da proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2 a fim de permitir a produção de substâncias à jusante destas enzimas (tal como glicerol) que são necessárias para manter a taxa de crescimento normal.

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6/29 [018] Este resultado pode ser obtido de diferentes modos: Primeiramente, é possível reduzir a atividade da proteína Gpd1 e eliminar a atividade da proteína Gpd2. Em segundo lugar, a atividade da proteína Gpd1 pode ser eliminada e a atividade da proteína Gpd2 pode ser reduzida. Em terceiro lugar, a atividade de ambas a proteína Gpd1 e da proteína Gpd2 pode ser reduzida. Qual das três opções leva aos melhores resultados dependendo, por exemplo, do tipo da cepa de levedura usada ou das condições de crescimento, pode ser determinada por um técnico no assunto sem encargos indevidos.

[019] As células de levedura de acordo com a presente invenção são úteis para qualquer aplicação em que a produção de glicerol na célula necessita ser minimizada a um nível que não influencie negativamente a taxa de crescimento da célula.

[020] A redução da atividade da proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2 pode ser obtida de vários modos que serão agora expostos (sob a) a e)). Está dentro do conceito inventivo que uma ou mais combinações das possibilidades dadas pode ser usada para a redução na atividade da proteína;

a) Um modo é reduzir a expressão do gene GPD1 e/ou do gene GPD2, que leva a uma redução da proteína na célula.

[021] Isto pode ser obtido em uma modalidade da presente invenção expressando o gene GPD1 e/ou GPD2 por um promotor fraco que está operativamente ligado ao gene GPD1 e/ou operativamente ligado ao gene GPD2. Um promotor é fraco quando a taxa de transcrição do gene é reduzida para pelo menos 20% ou 15%, de preferência para pelo menos 10%, mais de preferência para menos de 7% ou 5% da taxa de transcrição do gene expressado sob o promotor do tipo selvagem TEF1 (SEQ ID NO 11). Os modos de medir a resistência de um promotor são conhecidos de um técnico no assunto, tal como usando um gene repórter como luciferase ou a proteína fluorescente verde

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7/29 (GFP), medindo os níveis de mRNA, por exemplo, usando Northern blot ou PCR de transcriptase reversa em tempo real; no nível de proteína por Western blot ou através de medições da atividade enzimática específica.

[022] Prefere-se que a expressão do gene GPD1 e/ou do gene GPD2 seja reduzida em pelo menos 50%, pelo menos 60% ou pelo menos 70% comparada a sua expressão em uma célula do tipo selvagem sob seu promotor do tipo selvagem. É de particular vantagem reduzir a expressão em pelo menos 80% ou pelo menos 90%, e é mais preferido reduzir a expressão em pelo menos 95% ou pelo menos 99%, comparada à expressão do gene particular em uma célula de levedura do tipo selvagem, isto é, uma célula de levedura com um promotor nativo.

[023] Em uma modalidade preferida, o promotor fraco é um promotor de acordo com a SEQ ID NO 5 ou 6. O promotor de acordo com a SEQ ID NO 5 leva a uma taxa de transcrição de 7% e o promotor de acordo com a SEQ ID NO 6 leva a uma taxa de transcrição de 16% da taxa de transcrição causada pelo promotor do tipo selvagem TEF1 (SEQ ID NO 11) (Nevoigt et al., 2006);

b) A redução da capacidade da atividade da proteína Gpd1 e/ou a proteína Gpd2 também pode ser obtida fornecendo ou expressando uma molécula anti-sense, tal como uma molécula de RNA, ao mRNA de Gpd1 e/ou de Gpd2 para impedir a transferência do mRNA em uma proteína.

[024] Prefere-se que a molécula anti-sense tenha uma sequência que hibridiza com o mRNA de acordo com a SEQ ID NO 1 ou 2. Em outra modalidade, a molécula anti-sense hibridiza com ou é complementarmente inversa para todas de 10 a 30 bases, de preferência para todas de 18 a 23 bases do mRNA de acordo com a SEQ ID NO 1 ou 2.

[025] Quando se usa moléculas anti-sense, prefere-se geralmente projetar as mesmas contra as regiões não transferidas do mRNA.

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8/29 [026] Outro meio possível de reduzir a atividade da proteína Gpd1 e/ou a proteína Gpd2 são as ribozimas, que podem clivar cataliticamente o mRNA de gpd1 e/ou de gpd2.

[027] Várias abordagens são desenvolvidas baseadas nas moléculas anti-sense e em ribozimas para regular a expressão de genes, tal como ribocomutadores. Os ribocomutadores contêm sítios de domínio de aptâmeros compreendendo bolsas altamente específicas na região não transferida 5’ dos mRNAs que ligam moléculas pequenas ou ligandos. Na ligação de um ligando a um sítio de aptâmero uma mudança na conformação da estrutura do RNA leva a uma mudança na expressão de genes.

[028] Além disso, é possível marcar os fatores para diminuir a taxa de transcrição da proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2. Foi descrito, por exemplo, que a super expressão de Yiglp leva a uma atividade diminuída de GPP (Granath etal., 2005);

c) Alternativamente, a redução da atividade da proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2 também pode ser obtida fornecendo ou expressando um antagonista funcional na proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2, que inibe funcionalmente a atividade enzimática da respectiva proteína.

d) Também, a redução da atividade da proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2 pode ser obtida fornecendo ou expressando uma forma mutada da proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2;

[029] Tal mutante exibe uma inibição funcional da atividade enzimática que pode conter uma mutação em um domínio funcional da proteína, tal como o centro ativo ou um domínio de ligação ou de reconhecimento e leva a uma atividade enzimática reduzida da respectiva proteína sem abolir sua função;

e) Finalmente, a redução da atividade da proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2 também pode ser obtida fornecendo uma molécula inibitória

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9/29 pequena para inibir a proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2.

[030] As sequências de aminoácidos da proteína Gpd1. Da proteína Gpd2, da proteína Gpp1 (3-fosfatase glicerol-1) e da proteína Gpp2 (3fosfatase glicerol-2) de S. cerevisiae podem ser encontradas como SEQ ID NO 26,27, 28 e 29, respectivamente. Para outras espécies de leveduras, um técnico no assunto pode identificar a sequência de aminoácidos respectiva.

[031] Em uma modalidade preferida do método de acordo com a presente invenção, a proteína Gpp1 e/ou a proteína Gpp2, isto é, outra enzima chave da via de glicerol, também é reduzida em sua atividade além da redução da atividade da proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2.

[032] É possível tanto reduzir a atividade de Gpp1 e eliminar a atividade da proteína Gpp2, para eliminar a atividade de Gpp1 e reduzir a atividade da proteína Gpp2, como reduzir ambas as atividades da proteína Gpp1 e Gpp2. Além disso, também é possível eliminar ambas as atividades da proteína Gpp1 e Gpp2 em uma modalidade, como será mostrado nos exemplos.

[033] Os meios que podem ser usados para reduzir a atividade da proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2 são equivalentes aos meios explicados acima e aplicados em um aspecto equivalente também para a redução da atividade de Gpp1 e/ou de Gpp2, como será realizado por um técnico no assunto. Consequentemente, a atividade de GPP pode ser reduzida reduzindo a expressão da proteína Gpp1 e/ou Gpp2, fornecendo uma molécula anti-sense ao mRNA de GPP1 (SEQ ID NO 3) e/ou GPP2 (SEQ ID NO 4), fornecendo um antagonista à proteína Gpp1 e/ou Gpp2, fornecendo uma forma mutada da proteína Gpp1 e/ou da proteína Gpp2 ou fornecendo uma molécula inibitória pequena tal como fluoreto, que foi descrita como um inibidor não específico de fosfatases, para inibir a proteína Gpp1 e/ou a proteína Gpp2. Para detalhes com respeito a estes meios de redução referência é feita à descrição dada acima.

[034] A presente invenção geralmente pode ser usada com

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10/29 qualquer cepa de levedura, tal como S. cerevisiae e espécies intimamente relacionadas (isto é, outras espécies dos gêneros Saccharomyces). Outras espécies não Saccharomyces, especialmente as que mostram fermentação etanólica e têm a capacidade de fermentar as pentoses tal como Pichia (P.) stipitis, também são preferidas. É particularmente preferido usar cepas que são vantajosas em aplicações industriais, tais como a cepa de levedura S. cerevisiae prototrófica (CEN.PK113-7D. Outras cepas são conhecidas dos técnicos no assunto.

[035] Será compreendido por um técnico no assunto que quando se usa uma cepa diploide ou poliploide, torna-se necessário reduzir as atividades de Gpplp e/ou de Gpp2p bem como possivelmente de Gpdlp e/ou de Gpd2p em todos os alelos presentes a fim de obter a necessária redução na atividade da proteína.

[036] O problema exposto também é resolvido por uma célula de levedura, em particular uma célula de levedura geneticamente modificada que é obtenível através de um método como descrito acima.

[037] Especificamente, em tal célula de levedura, a atividade da proteína Gpd1 p e/ou Gpd2p é reduzida em comparação com a atividade de ditas proteínas em uma célula de levedura do tipo selvagem, isto é, em uma célula de levedura com uma atividade de proteína normal (fluxo normal) e uma taxa de crescimento normal, ou, colocado diferentemente, em comparação a uma célula de levedura em que as modificações presentes na célula de levedura geneticamente modificada de acordo com a presente invenção, que levam à atividade reduzida da proteína Gpd1 e/ou Gpd2, não estão presentes, [038] Para a quantidade de redução da atividade de proteína preferida, é feita referência à descrição acima.

[039] Meios para reduzir a atividade de ditas proteínas foram descritos acima, a aplicação desses leva a uma célula de levedura em que

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11/29 a expressão do gene GPD1 e/ou GPD2é reduzida, uma molécula anti-sense do mRNA de GPD1 e/ou de gpd2, por exemplo, na forma de uma molécula de RNA, está presente, um antagonista funcional para a proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2 está presente.

uma forma mutada de uma proteína Gpd1 e/ou da proteína Gpd2, que é funcionalmente inibida está presente, e/ou uma molécula inibitória pequena para inibir a proteína Gpd1 e/ou Gpd2 está presente.

[040] Outras características de tal célula de levedura, de acordo com a presente invenção, foram descritas acima em relação ao método de acordo com a presente invenção.

[041] O problema exposto também é resolvido através do uso de uma célula de levedura, em particular uma célula geneticamente modificada como descrito acima para produzir etanol a partir de biomassa. Isto pode ser obtido fornecendo uma célula de levedura modificada como descrito acima, fornecendo a biomassa e cultivando a célula de levedura na presença da biomassa, bem como obtendo o etanol. Em geral, a célula de levedura da presente invenção pode ser usada em qualquer aplicação em que a produção com alto teor de glicerol na célula deve ser evitada, uma vez que a redução de glicerol de acordo com o método presentemente descrito não leva a taxas de crescimento menores.

[042] O termo biomassa quando usado junto com um método de produzir etanol, significa referir-se a um material de planta ou derivado de planta, tal como amido, açúcar, celulose, hemicelulose, em particular de cana-deaçúcar, beterraba, milho, grão, etc.

[043] O problema exposto é, além disso, resolvido por um método para a produção de etanol que compreende as seguintes etapas:

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12/29 fornecer uma célula de levedura como descrito acima;

fornecer a biomassa, e cultivar a célula de levedura na presença da biomassa em condições que permitam a produção de etanol.

[044] Como será evidente a um técnico no assunto, pode ser necessário ou vantajoso tratar a biomassa quimicamente, enzimaticamente ou mecanicamente antes de cultivar a levedura junto com a biomassa a fim de facilitar a fermentação. Os métodos para tais tratamentos são conhecidos dos técnicos no assunto.

[045] Como mostrado por Alfenore et al., 2004, a produção de glicerol também pode ser reduzida adaptando as condições do crescimento da célula. Particularmente as condições de aeração da composição do meio podem ter uma grande influência na produção de glicerol e, portanto, na produção de etanol.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 [046] As vias envolvidas no metabolismo de glicerol em Saccharomyces cerevisiae são mostradas.

[047] O glicerol é formado a partir de fosfato de dihidroxiacetona glicolítico (DHAP) pela ação tanto de 3-fosfato glicerol desidrogenase (GPD codificado por GPD1 e GPD2) e 3-fosfatase glicerol (G3Pase codificado por GPP1 e GPP2). Gutlp e Gt2p são responsáveis pela utilização de glicerol. As vias para a biossíntese e metabolização de glicerol em S. cerevisiae são estudadas por Nevoigt e Stahl (1997). O canal de Fps1 p é o mediador da maior parte da difusão passiva de glicerol (Oliveira et al., 2003). As células de levedura recolhem o glicerol pelo transportador StUp e provavelmente por Guplp e Gup2p (Ferreia et al., 2005). O glicerol é convertido em di-hidroxiacetona (DHA) por glicerol desidrogenase dependente de NADP+ (GDH). Os genes ARA1, GCY1, GRE3, YPR1 são

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13/29 sugeridos para contribuir com esta atividade (Izawa etal., 2004); no entanto, outros relataram que nenhuma atividade desta enzima é detectável, um resultado que coloca a relevância da via DHA para S. cerevisiae em questão (Norbeck e Blomberg, 1997). DAK1 e DAK2 codificam di-hidroxiacaetona cinase (Molin etal., 2003). NDE1 e NDE2 codificam a NADH desidrogenase externa na levedura que é capaz de reoxidar diretamente o NADH citosólico transferindo os elétrons para a cadeia respiratória. DHAP: fosfato de dihidroxiacetona, GAP: 3-fosfato gliceraldeído, L-G3P: 3-fosfato L-glicerol, DHA: di-hidroxiacetona, FBP: bisfosfato de 1,6-frutose, e TPI1: gene codificando triose fosfato isomerase.

Figura 2 [048] A figura 2 mostra o alinhamento da sequência do promotor TEF1 não mutado de Saccharomyces cerevisiae e o mutante 2 do promotor de TEF1. É mostrada a resistência do promotor normalizado.

Figura 3 [049] A atividade específica de 3-fosfato glicerol desidrogenase da cepa de Saccharomyces cerevisiae engenheirada referiu-se ao tipo selvagem isogênico. A unidade é definida como a conversão de 1 μιτιοΙ de substrato por minuto e mg de proteína.

Figura 4 [050] Os rendimentos de etanol, de biomassa e de glicerol em grama por glicose consumida da cepa de Saccharomyces cerevisiae engenheirada e do tipo selvagem isogênico após o esgotamento de glicose nas fermentações do meio YEDP sob as condições limitadas com oxigênio.

Figura 5 [051] É mostrado o resultado de uma experiência de crescimento da cepa de Saccharomyces cerevisiae engenheirada e do tipo selvagem isogênico em meio YEDP (placas de ágar) sob as condições anaeróbicas.

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Figura 6 [052] É mostrado o resultado de uma experiência de crescimento da cepa de Saccharomyces cerevisiae engenheirada do tipo selvagem isogênico em meio YEDP líquido sob condições aeróbicas.

Figura 7 [053] A produção de etanol, glicerol e o consumo de açúcar após a fermentação da batelada sob condições limitadas com oxigênio a 30°C em pasta de trigo. A pasta de trigo foi completamente sacarificada e centrifugada antes da fermentação ser iniciada. O hidrolisado continha aproximadamente 143 g/l de açúcar total, isto é, glicose e frutose. As condições limitadas com oxigênio foram obtidas fechando os frascos Erlenmeyer com travas de ar que permitem a liberação de gases. A mistura foi realizada usando um agitador magnético fixado a 200 rpm. Para esta experiência, a cepa de levedura de S. cerevisiae prototrófica CEN.PK113-7D e um derivado deletado em GPD2e as modificações de carregamento do promotor de GPD1 (uma versão mutante do promotor TEF1 (mutante 2 do promotor, SEQ ID NO 5) e a sequência loxP-KmR-loxP como um marcador selecionável) foram usados. Os genes codificando GPP1 e GPP2 não foram modificados nesta cepa.

[054] Em todos os painéis A a F da figura 7, a barra esquerda mostra: CEN.PK113-7D, 100% de atividade de GPD, e a barra direita mostram CEN.PK113-7D, 6% de atividade de GPD.

[055] O eixo geométrico y dos painéis é como se segue:

7A. Concentração de glicerol final (g/l)

7B. Concentração de etanol final (g/l)

7C. Rendimento de glicerol (g/g de glicose, frutose consumidas)

7D. Rendimento de etanol (g/g de glicose, frutose consumidas)

7E. Relação: glicerol/etanol (g/g)

7F. Açúcar (glicose, frutose) consumido (g/l).

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Exemplos Material e Métodos: Meio:

[056] Meio YEDP (1 % de extrato de levedura; 2% de peptona; 2% de glicose).

Cepas De Levedura:

[057] As cepas de levedura geradas neste estudo originam-se da cepa W303-1A de laboratório de S. cerevisiae (tabela 1). A cepa YA103 correspondendo a uma cepa com dupla deleção de gpp1A gpp2A foi publicada por Pahlman etal. (2001).

Outras Modificações Genéticas Da Cepa Ya103 De S. Cerevisiae.

1. Deleção Do Gene GPD2/Abolição Da Expressão De GPD2 [058] O gene GPD2 foi rompido na cepa YA103 pelo método descrito por (Guldener etal., 1996) usando pUG72 (Gueldner etal., 2002) como um gabarito e os iniciadores P29 e P30 (tabela 2). O rompimento de GPD2 foi checado por PCR de diagnóstico usando o par de iniciadores P33/P34 (tabela 2). A seleção de transformantes positivos foi realizada em placas de ágar contendo o meio CSM desprovido de uracila. A cepa resultante foi referida como para ΕΝ-GGG (tabela 1).

2. Regulação Descendente Da Expressão De GPD1 [059] O promotor de GPD1 cromossômico nativo na cepa EMGGG foi substituído pelo cassete de substituição de promotor ampliado a partir do DNA genômico de uma cepa de levedura derivada da cepa BY4741 de laboratório carregando o promotor TEF mutado com a atividade mais baixa (Nevoigt etal., 2006) em lugar do promotor de GPD1 nativo. Os iniciadores P9 (SEQ ID NO 7) e P10 (SEQ ID NO 8) foram usados para ampliação de PCR do cassete de substituição de promotor (incluindo a sequência loxP-K.I.LEU2-loxP como um marcador selecionável). As condições de PCR foram como

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16/29 anteriormente publicadas (Nevoigt et al., 2006). Duas alíquotas de PCR de 100 μΙ foram combinadas, precipitadas e usadas para transformação como descrito por Güldener et al. (1996). A seleção de transformantes positivos foi realizada em placas de ágar contendo o meio CSM desprovido de leucina.

[060] A integração correta do cassete de substituição de promotor foi checada por PCR de diagnóstico usando a combinação de iniciadores P9 (SEQ ID NO 7)/P12 (SEQ ID NO 10) e P11 (SEQ ID NO 9)/p12 (SEQ ID NOA 10) (tabela 2). A cepa resultante foi referida como EN-G46a (tabela 1).

Tabela 1. Cepas De S. Cerevisiae Usadas Nos Exemplos

Cepa	Genótipo	Referência
W303-	MATa	Thomas e Rothstein
1A*	MATa gpp1A::kanMX4 gpp2A::/7/S3	(1989)
YA103*	MATa gpp1A::kanMX4 gpp2A::/7/S3	Pahlman etal. (2001)
EN-	gpd2A: :K.I. URA3
GGG*	MATa gpp1A::kanMX4 gpp2A::HIS3
EN-	gpd2A: :K.I. URA3
G46a*	gdpl p::TEFmut2::K.\.LEU2

* Estes mutantes abrigam mutações adicionais como a seguir: leu2-3/112 ura31 trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 ma10

Tabela 2: Primers Usados ______Uso/Nome__________________Sequência__________________Seq Id No______ Ampliação do cassete de substituição de promotor incluindo a versão mutante do promotor TEF1 (mutante 2 de promotor descrito em Nevoigt et al., 2006) e a sequência loxP-K.I.LEU2-loxP como um marcador selecionável:

P9 (liga o prom. de GPD1 a cccaaggcaggacagttacc SEQ ID NO 7 montante) agcaccagatagagcaccaca SEQ ID NO 8

P10 (liga a seq. cod. de GPD1)

PCR de diagnóstico para checar a integração correta do cassete de substituição de promotor:

P11 (liga em K. 1.LEU2) ggaccaccaacagcacctagt SEQ ID NO 9

P12 (liga o sítio de integração a gtaagcaactgttgtttcaga SEQ ID NO 10 jusante na sequência de codificação de GPD1)

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17/29 ______Uso/Nome__________________Sequência__________________Seq Id No

Deleção de GPD2usando loxP-K.I.URA3-loxPcomo um marcador selecionável:

P29	atgcttgctgtcagaagattaacaagatacacatt ccttagatcccaatacaacagatcac	SEQ ID NO 12
P30	cgatgtctagctcttcaatcatctccggtaggtctt ccatgttttatttaggttctatcg	SEQ ID NO 13
PCR de diagnóstico para checar o rompimento de GPD2:
P33	ggtagattcaattctctttccc	SEQ ID NO 14
P34	aggcaacaggaaagatcagagg	SEQ ID NO 15

FERMENTAÇÕES EM BATELADA COM OXIGÊNIO LIMITADO E DETERMINAÇÃO DOS

RENDIMENTOS DO PRODUTO

1^o Dia [061 ] 1^a pré-cultura: inocular 20 ml de YEPD com 500 ml de carga de glicerol.

[062] Incubar durante a noite a 30°C em um agitador (170 rpm) durante 20 horas.

2^o Dia [063] 2^a pré-cultura: inocular 150 ml de YEPD com 1,5 ml da primeira pré-cultura.

[064] Incubar durante a noite a 30°C em um agitador (170 rpm) durante 20 horas.

3^o Dia [065] Centrifugar a 2^a pré-cultura (10 min, 5000 rpm, 4°C) e lavar as células uma vez com água destilada.

[066] Inoculação da cultura principal: inocular 100 ml de YEPD em frascos Schott de 100 ml ajustando um OD de 0,2.

[067] Imediatamente, as amostras foram tomadas para determinação das concentrações iniciais de glicerol, etanol, glicose e biomassa.

[068] Adicionar um agitador magnético e fechar os frascos com travas de ar para assegurar a liberação dos gases, mas prevenir a entrada de oxigênio.

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18/29 [069] Agitar a cultura por 24 h à 28°C e 300 rpm.

4^o Dia [070] As amostras (2 x 1 ml) foram tomadas, centrifugadas (10 min, 12000 rpm, 4°C) e os sobrenadantes foram armazenados a -20°C até as concentrações de glicerol, etanol e glicose serem medidas. As medições de glicose e dos produtos de fermentação foram realizadas como anteriormente descrito (Nevoight e Stahl, 1996). O peso seco da levedura foi determinado filtrando 30 ml da cultura usando filtros de nitrocelulose pré-pesados (tamanho de poro 0,45 mm). Os filtros com as células foram lavados com água destilada e secados até o peso ter alcançado um valor estável.

Determinação Da Atividade Específica De 3-Fosfato Glicerol Desidrogenase [071] As atividades da enzima in vitro foram, em geral, determinadas durante o crescimento logarítmico, isto é, quando a densidade das células era cerca de 1 durante as fermentações das bateladas. As células de levedura foram quebradas por vórtice com esferas de vidro (0,5 mm de diâmetro) durante 15 minutos, a 4°C, de acordo com um método descrito anteriormente (Ciriacy, 1975). A fim de testar o GPD, aproximadamente 3 x 10⁹ células foram coletadas e homogeneizadas em 3 ml de tampão de trietanolamina (Blomberg e Adler, 1989; Andre etal., 1991) contendo 0,2 mmol/1-fenilmetil-sulfonilfluoreto e 2 g de esferas de vidro. O homogeinizado foi centrifugado em cada caso e 12.000 g a 4°C durante 15 minutos. O sobrenadante foi usado após dessalinização passando através de uma coluna G-25 Sephadex. (Pharmacia PD-10, Pharmacia Fine Chemicals, Suécia). GPD foi testado em tampão de imidazol em pH 7,0 de acordo com Gancedo et al. (1968). A concentração de proteína foi medida pelo método de Coomassie blue (Bradford, 1976) usando albumina de soro bovino A 3350 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como um padrão (Nevoigt e Stahl, 1996).

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Crescimento Em Placas De Ágar Sob Condições Aeróbicas E Anaeróbicas [072] As culturas estacionárias das duas cepas do meio YEPD foram diluídas (diluições em séries de 10) e uma alíquota foi transferida para as placas de ágar com YEPD usando um selo. As placas foram incubadas durante 3 dias. As condições livres de oxigênio foram obtidas aplicando Anaerocult A (MERCK) em um incubador hermético.

Deleções De Gpd1 E De Gpd2 [073] A deleção do gene GPP1 pode ser executada pela técnica de marcação de PCR por homologia de flanco (Pahlman et al., 2001). Na primeira etapa, um conjunto de iniciadores (TGTGTGAGTTCCTCTTTTCTT) (SEQ ID NO 16) e TCAAAGGCATTGCGATGGTT (SEQ ID NO 17)) foi usado para ampliar uma porção longa (BP) de 263 pares de base do DNA genômico de W303 de S. cerevisiae, a montante do terceiro códon no ORF de GPP1. Um segundo conjunto (CGCTAAGGATGACTTGTTGA (SEQ ID NO 18) e CTCTAACTTCTCGTCGTACT (SEQ NO 19)) foi usado para ampliar um fragmento de 358 bp a partir do nono códon no ORF de GPP1 montante do códon de parada. A extremidade 59 dos iniciadores adjacentes ao sítio de inserção conduziu as extensões do nucleotídeo 25 homólogas às regiões 59 e 39 do cassete de rompimento h/sGMX6 ou kanMX4 do plasmídeo pFA6a-h/sGMX6 e pFA6-kanMX4. Na segunda reação de PCR, pFA6a-h/sGMX6 e pFA6-kanMX4 foram usados como gabarito e as regiões homólogas 59 e 39 da primeira reação de PCR foram fundidas ao cassete de rompimento servindo como iniciadores junto com os iniciadores inversos a montante dianteiros e a jusante das regiões de flanco, produzindo assim um cassete de marcação de ORF. Este cassete foi transformado em uma cepa W303 de S. cerevisiae haploide, e os transformantes independentes foram selecionados para a verificação da substituição de GPP1. Usando um conjunto de iniciadores (dianteiros: CAAGCAGGAAATCCGTATCA (SEQ ID NO 20) e inversos TCATATGGAGCAATCCCACT (SEQ ID NO 21))

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20/29 hibridizando a montante e a jusante, respectivamente, do cassete de rompimento o DNA cromossômico foi ampliado. O comprimento dos produtos PCR foi verificado por eletroforese de gel agarose. O ORF de GPP2 foi rompido de um modo similar usando um conjunto de iniciadores (CAAGTGAGGACTTTTCGGAT (SEQ ID NO 22) e GTAGTCAATCCCATTCCGAA (SEQ ID NO 23)) para ampliar um fragmento de 346 bp a montante do quarto códon no ORF. O segundo conjunto (CGACGATCTGTTGAAATGGT (SEQ ID NO 24) e CCTGTCCACTTTCAAGTTGCT (SEQ ID NO 25)) foi usado para ampliar um fragmento de 287 bp a partir do sétimo códon no ORF de GPP2 a jusante do códon de parada. A integração correta dos módulos de rompimento nos alelos de GPP1 e de GPP2toi verificada por PCR usando os iniciadores apropriados.

[074] Baseadas nesta cepa. Outras deleções foram introduzidas como presentemente descrito.

Experimentos Preliminares [075] Nos estudos iniciais, os inventores testaram as cepas deletadas em GPP para sua capacidade de prevenir a formação de glicerol na produção do combustível bioetanol. A eliminação completa de GPD, uma enzima chave na biossíntese de glicerol, não foi direta. As vantagens principais da abolição da atividade de GPP, em vez de GPD, são vistas em 1) manter a etapa de reoxidação de NADH de biossíntese de glicerol (preenchida pelos produtos genéticos de GPD 1/2), e ii) fornecer L-G3P para fins anabólicos (figura 1).

[076] Ambas as cepas de deleção única (gpp1A e gpp2A) e uma cepa de deleção dupla (gpp1Agpp2A) da cepa de levedura W301-1A de laboratório foram estudadas. Os fenótipos das diferentes cepas foram caracterizados durante os processos de fermentação de etanol dinâmicos em um biorreator altamente instrumentado em meio mineral sob as condições aeróbicas. A análise comparativa da cepa do tipo selvagem e das diferentes cepas mutantes leva às seguintes conclusões:

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21/29 uma deleção única de um dos dois genes GPP não levou a trocas fenotípicas importantes (produção de etanol e glicerol, crescimento).

a concentração de glicerol não somente diminuiu em 65% no mutante de dupla deleção de gpp1A e gpp2A, mas não aboliu;

o mutante de dupla deleção de gpp1A e gpp2A mostrou uma taxa de crescimento negativamente afetada (diminuiu em 65%) e uma tolerância a etanol mais baixa.

[077] A via da formação de glicerol em um mutante de gpp1A e gpp2A é desconhecida. Além disso, as razões para o crescimento negativamente afetado e da tolerância a etanol mais baixa no mutante de dupla deleção de gpp1A e gpp2A permanece não claras. Contudo, os dados mostram que a deleção completa de GPP também não é diretamente ligada ao aumento expressivo da produtividade de etanol. GPP provavelmente tem outra função desconhecida, mas importante na célula.

[078] Os experimentos dos inventores mostram que o crescimento do mutante de gpp1A e gpp2A pode ser recuperado em nível do tipo selvagem após reduzir a atividade de GPD nesta cepa. Portanto, presume-se, sem desejar estar ligado à teoria, que um alto acúmulo intracelular de 3-fosfato L-glicerol é responsável pelo defeito no crescimento de um mutante de gpp1A e gpp2A. Este alto nível é reduzido quando a atividade de GPD é reduzida na célula.

[079] Portanto, os inventores descobriram surpreendentemente que a boa forma da célula é mantida (no tipo selvagem de GPP) ou restaurada (nas células com a atividade de GPP abolida) se a atividade de GPD, uma enzima chave na via biossintética de glicerol não é completamente abolida, mas ao contrário um fluxo mínimo através da enzima chave requerido pela célula é mantido. Isto está em contraste com a abolição completa de GPD ou GPP, uma vez que ambos provaram ser

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22/29 prejudiciais à boa forma da célula.

Geração De Promotores De Atividades Graduadas Para o Reajuste Das Atividades Enzimáticas [080] É de importância crucial ter ferramentas para reajustas as atividades enzimáticas a fim de determinar os requisitos mínimos das células com respeito ao fluxo através da via biossintética de glicerol. Recentemente, uma coleção robusta e bem caracterizada de mutantes do promotor de levedura de resistências finamente graduadas foi desenvolvida (Alper etal., 2005; Nevoigt et al., 2006). Usando estes mutantes de promotores, os cassetes de substituição de promotor foram criados, que estão agora disponíveis em combinação com dois marcadores selecionáveis geneticamente diferentes. Para mostrar a utilidade destes cassetes de promotor, eles foram usados para ajustar a expressão de GPD1 em S. cerevisiae e analisar o impacto na formação de glicerol e de levedura de biomassa (Nevoigt etal., 2006).

Resultados [081] Uma cepa de laboratório de S. cerevisiae foi gerada, que conduz deleções nos genes GPP1, GPP2 e GPD2 e que tem uma expressão muito baixa de GPD1 devido ao fato de que o promotor de GPD1 nativo no genoma da levedura foi substituído por um promotor fraco. Este promotor fraco (SEQ ID NO 5) foi obtido a partir da coleção de mutantes do promotor TEF1 (mutante 2 de TEFp) (criado por Nevoigt etal., 2007) e é mostrado junto com o promotor do tipo selvagem TEF1 (SEQ ID NO 11) na figura 2.

[082] Esta cepa referida como gpp1A gpp2A gpd2A TEF1pmut2GPD1 (EN-G46a; tabela 1) mostrou uma atividade de GPD que foi cerca de 7% da do tipo selvagem isogênico (figura 3). O gpp1A gpp2A gpd2A TEF1pmut2GPD1 e o tipo selvagem correspondente foram usados para fermentar 2% de glicose em um meio complexo (YEPD) sob as condições limitando oxigênio (ver

Métodos acima). A cepa engenheirada mostrou um rendimento de glicerol por

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23/29 grama de glicose consumida que foi somente 14,5% do rendimento do tipo selvagem (figura 4). O rendimento de etanol (grama de etanol por grama de glicose consumida) foi 6,7% mais alto do que o rendimento do tipo selvagem (figura 4). Surpreendentemente, o rendimento de biomassa final (figura 4) não foi influenciado pela engenharia da via de glicerol ainda que as condições durante a fermentação da batelada foram quase anaeróbicas (100 ml de cultura em frascos de 100 ml fechados com travas de ar). O crescimento de ambas as cepas sob as condições aeróbicas e anaeróbicas também foi investigado usando placas de ágar com YEPD e não houve virtualmente nenhuma diferença (figura 5). O crescimento em meio YEPD líquido sob as condições aeróbicas também foi mostrada ser a mesma (figura 6). Ambas as cepas mostraram uma taxa de crescimento média de 0,27 Ir¹ durante a fase de crescimento exponencial.

[083] Os experimentos preliminares mostram que o mesmo resultado pode ser obtido regulando descendentemente a atividade de OPD sozinho, isto é, sem as deleções de GPP1 e de GPP2. Consequentemente parece que as deleções de GPP1 e de GPP2 não são necessárias para a presente invenção.

Relevância Industrial Dos Resultados [084] Os resultados obtidos têm um grande impacto sobre a produção de bioetanol (incluindo os biocombustíveis de primeira geração) uma vez que mais etanol pode ser produzido a partir da mesma quantidade de substrato (carboidratos como os hidrolisados de amido, celulose ou hemicelulose). Além disso, a produção de glicerol é fortemente reduzida. Isto é também importante porque o glicerol participa do fouling (acúmulo de resíduos na superfície das membranas) das unidades de destilação no processo de produção de bioetanol.

[085] Esta é a primeira vez que a produção de etanol foi fortemente reduzida sem influenciar negativamente o crescimento sob as

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24/29 condições limitantes de oxigênio. O aumento na produtividade de etanol é mais alto do que descrito no estado da técnica devido à taxa de crescimento normal das células junto com uma produção aumentada de etanol em detrimento da formação de glicerol.

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Petição 870180124289, de 31/08/2018, pág. 39/50

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Claims

Reivindicações

1. MÉTODO DE MODIFICAR UMA CÉLULA DE LEVEDURA PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL, caracterizado por combinar a redução da atividade da proteína Gpd1 (3-fosfato glicerol desidrogenase-1) e eliminação da atividade da proteína Gpd2 (3-fosfato glicerol desidrogenase-2), em que:

(i) a redução da atividade da proteína Gpd1 em comparação a uma célula de levedura do tipo selvagem é obtida pela ligação operacional do gene GPD1 a um promotor de acordo com a SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6; e (ii) a eliminação da atividade da proteína Gpd2 é obtida pela deleção do gene GPD2.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por eliminar adicionalmente a atividade da proteína Gpp1 e/ou da proteína Gpp2 por meio da deleção dos genes gpp1 e gpp2.
3. CÉLULA DE LEVEDURA MODIFICADA, caracterizada por nela a atividade da proteína Gpd1 ser reduzida em comparação a uma célula de levedura do tipo selvagem e a atividade da proteína Gpd2 ser eliminada, em que (i) a redução da atividade da proteína Gpd1 é obtida pela ligação operacional do gene GPD1 a um promotor de acordo com a SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6 e (ii) a eliminação da atividade da proteína Gpd2 é obtida pela deleção do gene GPD2.
4. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pela expressão do gene GPD1 ser reduzida em pelo menos 50% comparado à expressão do gene do tipo selvagem.
5. USO DE UMA CÉLULA DE LEVEDURA MODIFICADA, conforme descrita em qualquer uma das reivindicações 3 a 4, caracterizado por ser para produzir etanol.
6. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

fornecer uma célula de levedura modificada, conforme definida em

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2/2 qualquer uma das reivindicações 3 a 4;

fornecer biomassa;

cultivar a célula de levedura modificada na presença de biomassa sob condições que permitem a produção de etanol.

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Glicose

4 4

L-NADH

Γ*ΝΑΟ⁴