BR112014019578B1

BR112014019578B1 - Células de saccharomyces cerevisiae, usos das ditas células e molécula de dna e processos para a produção de etanol e de produto de fermentação

Info

Publication number: BR112014019578B1
Application number: BR112014019578-1A
Authority: BR
Inventors: Zdravko Dragovic; Christian Gamauf; Christoph Reisinger; Ulrich Kettling
Original assignee: Clariant Produkte (Deutschland) Gmbh
Priority date: 2012-02-07
Filing date: 2013-02-07
Publication date: 2022-10-11
Also published as: EA201400877A1; SI2812430T1; BR112014019578A2; HUE035703T2; MX350005B; CA2863734A1; CN104204202A; HRP20171583T1; AU2013218001A1; MX2014009496A; MY171359A; EP2812430B1; EA035000B1; PL2812430T3; CN104204202B; EP2626423A1; DK2812430T3; CA2863734C; US20140377813A1; US20160312177A1

Abstract

PROTEÍNA, MOLÉCULA DE DNA, CÉLULAS EUCARIÓTICAS E DE LEVEDURA GENETICA-MENTE MODIFICADA, USOS DE PROTEÍNA, DE MOLÉCULA DE DNA E DE CÉLULAS EU-CARIÓTICAS E PROCESSOS DE PRODUÇÃO DE ETANOL E DE GERAÇÃO DE PRODUTO DE FERMENTAÇÃO. A presente invenção fornece uma célula eucariótica microbiana capaz de utilizar açúcares C5, particularmente xilose. Outro objetivo da presente invenção é o fornecimento de uma sequência de proteínas aprimorada para permitir que as células eucarióticas degradem açúcares C5. A presente invenção fornece, portanto, proteínas que compreendem uma sequência de aminoácidos que possui identidade de pelo menos 75%, preferencialmente identidade de 80%, de maior prefe-rência identidade de 90% e, de preferência superior, identidade de 95% com SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 8 e possui atividade de isomerase de xilose em células eucarióticas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Xilose é um bloco de construção importante de biomassa vegetal e encontra-se ligada em uma série de produtos alimentícios importantes em destaque por conceitos atuais de biorrefinaria. Exemplos desses materiais ricos em xilose incluem palha de trigo, forragem de milho ou serragem e outros subprodutos de madeira (Blake A. Simmons et al, Genome Biol. 2008; 9 (12): 242).

[002] Consequentemente, hidrólise realizada do material de partida por meio de abordagens enzimáticas, químicas ou quimioenzimáticas gera produtos intermediários ricos em xilose, além de outros açúcares valiosos (Deepak Kumar et al, Biotechnol. Biofuels, 2011; 4: 27). A utilização eficiente de soluções de açúcar ricas em C5 em linhas de fermentação acopladas é fundamental e exigente para as linhagens de fermentação aplicadas (Sara Fernandes e Patrick Murray, Bioeng. Bugs, 2010; 1 (6): 424). Especialmente leveduras C6, tais como Saccharomyces cerevisiae, que são materiais de trabalho desejados devido ao longo histórico de cultivo que culminou em linhagens com extrema tolerância a etanol e altos rendimentos de conversão de glicose, deixam xilose completamente intocada, sem reduzir o potencial de rendimento. Diversas estratégias são conhecidas para contornar esta limitação. Uma etapa fundamental no presente aparentemente é a alimentação bem sucedida da xilose por meio de isomerização em xilulose e subsequente modificação em cascata da parte não redutora do desvio de C5 para o processo de glicólise regular de Saccharomyces cerevisiae. Embora a resistência da absorção de xilose através da membrana por transportadores específicos e a densidade de fluxo que pode ser atingida através do desvio de C5 estejam sujeitas a possíveis melhorias (David Runquist et al, Microb. Cell Fact 2009; 8: 49), a etapa de isomerização principal de xilose em xilulose causa um problema importante no processo geral. Dois processos principais são conhecidos para realizar a etapa. O primeiro, que emprega etapas subsequentes de redução em xilitol (por redutase de xilose) e oxidação (por desidrogenase de xilitol) em xilulose, causa desequilíbrio significativo entre os cofatores NADH e NADPH e gera aumento da formação de xilitol sob condições de fermentação (Maurizio Bettiga et al, Biotechnol. Biofuels, 2008; 1: 16). A isomerização direta alternativa por meio da aplicação de xilose isomerase sofre da falta de disponibilidade de genes de xilose isomerase que combinem expressão ativa em micro-organismos eucarióticos (particularmente leveduras como Saccharomyces cerevisiae), alta eficiência catalítica, temperatura e pH ideal adaptado à temperatura de fermentação e baixa inibição de subprodutos, especialmente xilitol. Um aspecto da presente invenção é a descrição de sequências de proteínas e seus ácidos nucleicos que as codificam, para atender a essa necessidade.

[003] O processo de xilose isomerase é nativo de espécies bacterianas e leveduras raras. Ao contrário do processo de oxidorredutase, o processo de isomerase não requer cofatores. O processo de isomerase consiste pelo menos de enzimas isoladas, isomerases de xilose heterólogas (XI), que convertem diretamente xilose em xilulose. Como ocorre com o processo de oxidorredutase, o aprimoramento adicional do rendimento pode ser obtido por meio da coexpressão de quinase de xilulose (XK) heteróloga.

[004] O primeiro XI funcionalmente expresso foi um gene xylA do fungo anaeróbico Piromyces sp E2 (Kuyper, M. et al, FEMS Yeast Res. 2003; 4 (1): 69). Foi elaborada a linhagem de levedura haploide com capacidade de fermentar xilose como única fonte de carbono sob condições anaeróbicas. A maior parte de isomerases de xilose é de proteínas bacterianas e um obstáculo importante foi a sua expressão em levedura. Trabalhos recentes demonstraram, entretanto, expressão funcional em levedura (Tabela 1). Devido à importância fundamental da atividade de xilose isomerase dentro do conceito de organismos fermentadores de C5, é desejável utilizar isomerases de xilose ideais. Dos relatos anteriores, aprendemos que xilose isomerase de Clostridium phytofermentans fornece padrão técnico baixo, mas o mais alto disponível neste particular. As propriedades benéficas aprimoradas de isomerases de xilose no escopo da presente invenção são, portanto, altamente desejadas.

[005] Tabela 1 Exemplos de Isomerases de Xilose Reivindicadas para Aplicação em Leveduras

[006] O transporte de açúcar através da membrana não limita a fermentação de açúcares de hexose, embora possa limitar o metabolismo de pentose, especialmente no caso de cofermentações de hexose e pentose. Foram realizados diversos estudos de expressão de transportadores de pentose.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[007] Um objetivo da presente invenção é o fornecimento de uma célula eucariótica microbiana capaz de utilizar açúcares C5, particularmente xilose. Outro objetivo da presente invenção é o fornecimento de uma sequência de proteínas aprimorada para permitir que as células eucarióticas degradem açúcares C5.

[008] Descobriu-se, surpreendentemente, que a proteína descrita por SEQ ID N° 2 (sequência publicada anteriormente no acesso GeneBank NCBI n° ZP_07904696.1) ou uma versão truncada de forma N terminal isenta dos dezoito primeiros aminoácidos (mktknniictialkgdif) (SEQ ID N° 8) é expressa funcionalmente em células microbianas eucarióticas, particularmente leveduras como Saccharomyces cerevisiae, quando essas células são transformadas por um vetor que conduz um conjunto de expressão que compreende uma sequência de DNA que codifica a mencionada proteína SEQ ID N° 2, tal como a molécula de DNA descrita como SEQ ID N° 1 (publicado anteriormente no GeneBank como parte do número de acesso NZ_AEPW01000073.1 GI:315651683).

[009] A presente invenção fornece, portanto, proteínas que compreendem uma sequência de aminoácidos que possui identidade de pelo menos 75%, preferencialmente identidade de 80%, de maior preferência identidade de 90% e, de preferência superior, identidade de 95% com SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 8, que possui atividade de xilose isomerase em células eucarióticas.

[0010] A presente invenção também fornece uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA que codifica a proteína de acordo com a presente invenção, em que a sequência de DNA é ligada operativamente a uma sequência reguladora eucariótica.

[0011] Descobriu-se ainda que células transformadas exibem velocidade mais alta de consumo de xilose em comparação com as células não transformadas. A presente invenção também fornece, portanto, uma célula eucariótica que expressa a proteína de acordo com a presente invenção e/ou que contém a molécula de DNA de acordo com a presente invenção.

[0012] Como aspecto adicional, a fermentação de biomassa a partir de meios que contêm fonte de carbono de xilose aumentou e a quantidade de metabólitos formados por essas linhagens transformadas sob essas condições aumentou em comparação com controles transformados.

[0013] Outro aspecto da presente invenção refere-se às propriedades biocatalíticas da proteína expressa e sua aplicação como biocatalisador in situ ou em forma purificada para geração de produtos de açúcar isomerizado ou intermediários.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0014] Figura 1: processo de utilização de xilose.

[0015] Figura 2: comparação de crescimento de colônia entre Saccharomyces cerevisiae transformado com Eubacterium saburreum (Es XI), Piromyces sp (Pi XI) e Clostridium phytofermentas (Cp XI). Como controle negativo, foi utilizada a linhagem transformada com vetor de expressão pleno pSCMB454 (vetor). 1 na escala corresponde a crescimento fraco após seis dias, enquanto 4 corresponde a crescimento muito forte após seis dias.

[0016] Figura 3: mapa de plasmídeos de expressão de leveduras.

[0017] Figura 4: plasmídeo de expressão para EsXI.

[0018] Figura 5: comparação de crescimento de colônias entre Saccharomyces cerevisiae transformado com Eubacterium saburreum (Es-sh XI) e Clostridium phytofermentas (Cp XI). Como controle negativo, foi utilizada a linhagem transformada com vetor de expressão pleno pSCMB454 (vetor).

[0019] Figura 6: atividade de xilose isomerase em extratos celulares de Saccharomyces cerevisiae que expressam Eubacterium saburreum (Es-sh XI, losangos) e Clostridium phytofermentas (Cp XI, círculos). Como controle negativo, foi utilizada a linhagem transformada com vetor de expressão pleno pSCMB454 (vetor). Fórmulas para enquadramentos de curvas lineares (Abs340nm = v*Tempo+Abs3min) são exibidas abaixo da legenda. Por razões de clareza, apenas o enquadramento da curva foi plotado para controle negativo (vetor).

[0020] Figura 7: atividade específica de isomerases de xilose purificadas: Eubacterium saburreum Es-sh XI e Clostridum phytofermentas Cp XI. Como controle negativo, foi utilizada a mistura de reação sem enzimas (somente tampão). A atividade específica é expressa como percentual de xilose convertida em razão entre enzima e substrato (E/S) de 0,05% p/p.

[0021] Figura 8: determinação do pH ideal para isomerases de xilose purificadas: Eubacterium saburreum (Es-sh XI, losangos) e Clostridum phytofermentas (Cp XI, círculos). Como controle negativo, foi utilizada a mistura de reação sem enzimas (Buff, triângulos). A atividade é expressa na forma de percentual de atividade máxima.

[0022] Figura 9: determinação da temperatura ideal para isomerases de xilose purificadas: Eubacterium saburreum (Es-sh XI, losangos) e Clostridum phytofermentas (Cp XI, círculos). Como controle negativo, foi utilizada a mistura de reação sem enzimas (Buff, triângulos). A atividade é expressa na forma de percentual de atividade máxima.

[0023] Figura 10: determinação de Km para isomerases de xilose purificadas: Eubacterium saburreum (Es-sh XI) e Clostridum phytofermentas (Cp XI).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[0024] Atividade de xilose isomerase é definida no presente como a atividade enzimática de enzimas pertencentes à classe de isomerases de xilose (EC 5.3.1.5), de forma a catalisar a isomerização de vários açúcares de aldose e cetose e outras reações laterais enzimáticas inerentes a esta classe de enzimas. A atribuição de proteínas à classe de xilose isomerase é realizada com base em considerações de padrões de atividade ou homologia, o que for mais relevante em cada caso. A atividade de xilose isomerase pode ser determinada pelo uso de um teste fotométrico enzimático acoplado que emprega desidrogenase de sorbitol.

[0025] Construção de expressão no presente é definida como sequência de DNA que compreende todos os elementos de sequências necessários para estabelecer a expressão de um quadro de leitura aberta (ORF) compreendido na célula hospedeira que inclui sequências de início de transcrição (promotores), término e regulagem, locais de início de tradução, regiões de reprodução estável ou integração ao genoma hospedeiro e marcador genético selecionável. A configuração funcional pode, portanto, já estar estabelecida ou ser atingida por meio de um evento de disposição (integração etc.) na célula hospedeira. Em uma realização preferida, a construção de expressão contém um promotor ligado funcionalmente ao quadro de leitura aberta seguido por uma sequência de término opcional. Sequências reguladoras da expressão em células eucarióticas compreendem sequências promotoras, locais de ligação de fatores de regulagem de transcrição, sequências de início de tradução e sequências terminais. Sequências reguladoras da expressão em células eucarióticas são compreendidas como regiões codificadas de DNA ou RNA que permanecem em conexão funcional com o processo de transcrição e/ou tradução de fitas de DNA de codificação em células eucarióticas, quando encontradas conectadas a fitas de DNA de codificação isoladas ou em combinação com outras sequências reguladoras. No foco da presente invenção, encontram-se sequências promotoras acopladas aos genes de xilose isomerase de acordo com a presente invenção, de forma a permitir a sua expressão em células fúngicas ou leveduras eucarióticas selecionadas. A combinação de promotor eucariótico e sequências de DNA que codificam a xilose isomerase de acordo com a presente invenção gera a expressão de xilose isomerase na célula eucariótica transformada. Promotores preferidos são promotores com média a alta resistência de Saccharomyces cerevisiae, ativos sob condições de fermentação. Exemplos desses promotores preferidos são promotores do processo glicolítico ou transporte de açúcar, particularmente os promotores dos genes conhecidos como PFK1, FBA1, PGK1, ADH1, ADH2, TDH3 e suas variantes truncadas ou que sofreram mutação. Elementos de estabelecimento de estabilidade mitótica são conhecidos na técnica e compreendem origem de plasmídeo de reprodução de S. cerevisiae 2μ, sequências centroméricas (CEN), sequências de reprodução autônomas (ARS) ou sequências homólogas de qualquer comprimento para a promoção de integração cromossômica por meio do processo de união de extremidades homólogas. Marcadores selecionáveis incluem elementos genéticos referentes à resistência a antibióticos para a célula hospedeira. Exemplos são genes marcadores kan e ble. Podem ser utilizados marcadores auxotróficos que complementam auxotrofias definidas da linhagem hospedeira. Exemplos desses marcadores a serem mencionados são genes e mutações que refletem o processo de leucina (LEU2) ou uracil (URA3), mas também isomerase de xilose.

[0026] Consumo de xilose aprimorado é definido no presente como qualquer velocidade de consumo de xilose que resulte em crescimento e proliferação celular, formação de metabólitos e/ou geração de energia calorífera mais alta em comparação com a velocidade de consumo de xilose da célula não modificada (cultivo) com relação à característica considerada. A velocidade de consumo pode ser determinada, por exemplo, de forma fenomenológica, considerando a densidade celular formada ou o tamanho da colônia, por meio de determinação da velocidade de consumo de oxigênio, velocidade de formação de etanol ou por meio de medição direta da concentração de xilose nos meios de crescimento ao longo do tempo. Consumo, neste contexto, é equivalente aos termos utilização, fermentação ou degradação.

[0027] Genes envolvidos no metabolismo de xilose foram descritos por vários autores e codificam transportadores de hexose e pentose, xiluloquinase, 3- epimerase de 5-fosfato de ribulose, isomerase de 5-fosfato de ribulose, transcetolase, transaldolase e genes homólogos.

[0028] Células que expressam xilose isomerase no presente designam células eucarióticas microbianas que foram geneticamente modificadas na condução de construção de expressão para expressão da xilose isomerase descrita. Em uma realização preferida, a célula que expressa xilose isomerase é uma levedura selecionada a partir de Pichia, Pachysolen, Yarrowia, Saccharomyces, Candida, Arxula, Ashbya, Debaryomyces, Hansenula, Hartaea, Kluyveromyces, Schwanniomyces, Trichosporon, Xanthophylomyces, Schizosaccharomyces e Zygosaccharomyces, de preferência superior Saccharomyces cerevisiae.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0029] A presente invenção fornece soluções de construção genética de células eucarióticas com metabolismo de xilose aprimorado, formação de biomassa aprimorada na presença de xilose e/ou aumento da formação de metabólitos. Estas são propriedades desejáveis e apresentam gargalos para muitas linhas de produção industriais, especialmente linhas de produção do gênero Saccharomyces, nomeadamente Saccharomyces cerevisiae como exemplo não limitador. A presente invenção soluciona este problema fornecendo sequências de DNA e de proteína de genes de xilose isomerase que são expressos funcionalmente em células eucarióticas inferiores, especialmente leveduras, com exemplo descrito de leveduras do gênero Saccharomyces, novamente tais como Saccharomyces cerevisiae como exemplo não limitador. A linhagem criada é uma célula que expressa xilose isomerase que exibe consumo de xilose potencialmente aprimorado. A propriedade desejada de atividade de xilose isomerase produzida pela célula que expressa xilose isomerase é dificilmente compreendida de forma satisfatória com os meios conhecidos na técnica.

[0030] A presente invenção fornece, portanto, proteínas que compreendem uma sequência de aminoácidos que possui identidade de pelo menos 75%, tal como identidade de pelo menos 80%, preferencialmente identidade de 85%, de maior preferência identidade de 90% e, de preferência superior, identidade de 95% com SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 8, que possui atividade de xilose isomerase em células eucarióticas. Em uma realização preferida, a proteína consiste dessa sequência de aminoácidos. Em outra realização preferida, a proteína consiste dessa sequência de aminoácidos fundida a outra parte de outras proteínas, preferencialmente partes de proteínas que exibem altos níveis de identidade com isomerases de xilose conhecidas ou que demonstraram elas próprias atividade de isomerase de xilose.

[0031] Em uma realização preferida, a proteína consiste na sequência de SEQ ID N° 2 ou de uma sequência de aminoácidos que possui identidade de pelo menos 75%, preferencialmente identidade de 80%, de maior preferência identidade de 90% e, de preferência superior, identidade de 95% com SEQ ID N° 2 e possui atividade de xilose isomerase em células eucarióticas.

[0032] Proteínas homólogas deverão também compreender sequências de proteínas truncadas com atividade de xilose isomerase conservada. Um exemplo dedicado dessas sequências de proteínas truncadas é fornecido como SEQ ID N° 8 ou suas variantes que exibem identidade de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% com SEQ ID N° 8.

[0033] A proteína de acordo com a presente invenção ou composição que contém a mencionada proteína é preferencialmente diferente de uma proteína ou composição que é obtida por meio de expressão de uma célula procariótica. A proteína é, portanto, geralmente uma que pode ser obtida por meio de expressão de uma célula eucariótica.

[0034] A proteína de acordo com a presente invenção exibe preferencialmente atividade de xilose isomerase ideal dentro da faixa de pH de 7,5 a 8,5, conforme determinado pelo método descrito nos Exemplos.

[0035] Os níveis de identidade podem ser determinados pelo programa de computador AlignX, vendido no Pacote Vetor-NTI pela Life® Technology. São aplicadas as configurações padrão do componente de embalagem na versão 10.3.0.

[0036] Fica claro para os técnicos no assunto que altas quantidades de moléculas de DNA variáveis são traduzidas na mesma sequência de proteínas e deverão ser cobertas pela presente invenção. A presente invenção fornece, portanto, uma molécula de DNA que compreende (preferencialmente consiste de) uma sequência de DNA que codifica a proteína de acordo com a presente invenção, ou seja, uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que possui identidade de pelo menos 75%, tal como identidade de pelo menos 80%, preferencialmente identidade de 85%, de maior preferência identidade de 90% e, de preferência superior, identidade de 95% com SEQ ID N° 2 e possui atividade de xilose isomerase em células eucarióticas, ou uma realização preferida conforme ilustrado acima, em que a sequência de DNA é ligada operativamente a uma sequência reguladora eucariótica, ou seja, uma sequência reguladora que permite a expressão de uma célula eucariótica. Exemplos não limitadores de sequências de DNA são fornecidos em SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 7. São conhecidos métodos de aprimoramento computacional de uma sequência de DNA com relação aos níveis de produção de proteínas. Eles incluem, de forma não exclusiva, métodos que empregam avaliação estatística de códons preferidos (tabelas de uso de códons), algoritmos que preveem estruturas secundárias de mRNA e modelos com base em conhecimento baseados em HMM ou NN. Desta forma, sequências de DNA otimizadas calculadas a partir da sequência de proteína alvo são preferidas e incluídas na presente invenção. Também são incluídas na presente invenção sequências de DNA obtidas por meio de etapas recursivas ou não recursivas de mutagênese e seleção de variantes aprimoradas. Este é um método regular de aprimoramento de sequências de proteína e de DNA e sequências obtidas por meio desses métodos não podem ser excluídas do conceito inventivo. Isso deverá ser observado independentemente da questão se a sequência de DNA resultante desse experimento deixa a sequência de proteínas traduzida intocada ou é traduzida em mutações, desde que os níveis de identidade não caiam abaixo de, preferencialmente, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 8, respectivamente. Uma realização preferida da presente invenção realmente aplica esses processos de aprimoramento para ajuste das moléculas de ácido nucleico e sequências de proteína descritas ao problema específico.

[0037] Outro aspecto da presente invenção refere-se a sequências quiméricas geradas por fusões de partes da sequência de xilose isomerase de acordo com a presente invenção com partes de outras proteínas, preferencialmente partes dessas proteínas que exibem altos níveis de identidade com isomerases de xilose conhecidas ou que demonstraram elas próprias atividade de isomerase de xilose, bem como moléculas de ácido nucleico que codificam essas proteínas quiméricas. Especialmente fusões da parte N-terminal da proteína SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 8 ou da parte 5’ de SEQ ID N° 1 ou a molécula de ácido nucleico de SEQ ID N° 7 serão ressaltadas como realizações preferidas da presente invenção. Encontra-se no campo de visão dos inventores que a etapa de isomerização de xilose solucionada pela presente invenção é uma alteração central necessária e, para configuração de um fluxo de carbono eficiente com xilose como bloco inicial, poderão ser necessárias alterações adicionais da célula que expressa isomerase de xilose. Questões conhecidas dos autores incluem transporte transmembranas de xilose, especialmente absorção do meio de crescimento, fosforilação e as etapas metabólicas do desvio de C5 (parte não oxidativa do desvio de fosfato de pentose). Mudanças adicionais introduzidas na célula, especialmente as que refletem alterações das questões conhecidas e modificam os níveis de expressão de genes envolvidos no metabolismo de xilose, portanto, representam uma realização preferida da presente invenção. A ordem das introduções dessas mudanças nas células, que podem ser realizadas em seguida ou paralelamente de forma ordenada ou aleatória, não deverá ser diferenciada neste ponto e todas as estratégias possíveis são consideradas parte integrante e realizações especiais da presente invenção.

[0038] A presente invenção também fornece, portanto, uma célula eucariótica que expressa a proteína de acordo com a presente invenção e/ou que contém a molécula de DNA de acordo com a presente invenção. A proteína consiste preferencialmente da sequência de SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 8. A célula eucariótica é preferencialmente uma célula de levedura, de maior preferência selecionada a partir do grupo de Pichia, Pachysolen, Yarrowia, Saccharomyces, Candida, Arxula, Ashbya, Debaryomyces, Hansenula, Hartaea, Kluyveromyces, Schwanniomyces, Trichosporon, Xanthophylomyces, Schizosaccharomyces e Zygosaccharomyces, de preferência superior Saccharomyces cerevisiae. A presente invenção também fornece, portanto, uma célula de levedura geneticamente modificada que compreende um gene xilose isomerase exógeno funcional na mencionada célula de levedura, preferencialmente em que o gene xilose isomerase exógeno é ligado operativamente a sequências promotoras e terminais que são funcionais na mencionada célula de levedura. Em uma realização preferida, o gene xilose isomerase exógeno é uma molécula de DNA de acordo com a presente invenção. A célula de levedura geneticamente modificada é preferencialmente selecionada a partir do grupo de Pichia, Pachysolen, Yarrowia, Saccharomyces, Candida, Arxula, Ashbya, Debaryomyces, Hansenula, Hartaea, Kluyveromyces, Schwanniomyces, Trichosporon, Xanthophylomyces, Schizosaccharomyces e Zygosaccharomyces, de preferência superior Saccharomyces cerevisiae.

[0039] A célula eucariótica que possui níveis mais altos de atividade de xilose isomerase é preferencialmente obtida por meio de transformação de uma linhagem de levedura do tipo selvagem com uma sequência de DNA de acordo com a presente invenção. Um aspecto adicional da presente invenção refere-se à aplicação da xilose isomerase de acordo com a presente invenção ou da célula que expressa xilose isomerase de acordo com a presente invenção para produção de substâncias bioquímicas com base em xilose que contêm material de partida tal como por meio da fermentação de biomassa. Substâncias bioquímicas incluem biocombustíveis como etanol ou butanol, bem como materiais de partida com base biológica para substâncias a granel como ácido láctico e ácido itacônico, para indicar alguns exemplos. Uma lista de possíveis substâncias bioquímicas foi publicada pelo Departamento de Energia dos Estados Unidos. A proteína de acordo com a presente invenção ou a célula de acordo com a presente invenção pode também ser utilizada como biocatalisador in situ ou em forma purificada para produção de produtos de açúcar isomerizado ou intermediários, preferencialmente para produtos de açúcar isomerizado.

[0040] Um aspecto adicional da presente invenção refere-se ao uso da enzima xilose isomerase isolada de um hospedeiro eucariótico, especialmente de expressão de leveduras, em que a mencionada xilose isomerase é livre de contaminantes bacterianos ou fragmentos de material bacteriano. Possíveis aplicações dessa xilose isomerase compreendem aplicações alimentícias e de ração, em que a presença de contaminantes mencionados mesmo em nível muito baixo representa risco de segurança de produto. Devem ser levantadas neste ponto preocupações com aplicação direta de Eubacterium sabbureum como hospedeiro de produção. A aplicação da xilose isomerase de acordo com a presente invenção em um hospedeiro eucariótico sugerido, preferencialmente uma levedura, é claramente vantajosa.

EXEMPLOS 1. IDENTIFICAÇÃO DE POSSÍVEIS SEQUÊNCIAS GENÉTICAS COM FUNÇÃO DE ISOMERASE DE XILOSE

[0041] Para encontrar sequências de xilose isomerase no Genebank, foi selecionado o programa BlastP (Stephen F. Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-3402) no local BLAST genômico do NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi). Como sequência de teste, a sequência de proteínas do gene xilose isomerase de Escherichia coli K12 (SEQ ID N° 3) foi tomada como sequência de consulta. Os parâmetros padrão do programa não foram modificados e a consulta passou por BLAST contra os bancos de dados de proteínas bacterianas, incluindo o banco de dados de Eubacterium saburreum DSM 3986 elaborado com base nos resultados da sequência de instantâneos do organismo (número de aceso NZ_AEPW01000000). Foram consideradas sequências com nível de homologia significativo ao longo de todo o comprimento da sequência. A pesquisa revelou uma série de possíveis genes em potencial que foram clonados em seguida em S. cerevisiae e testados para determinar a expressão funcional. Todos esses genes possíveis foram tratados como inscrição ZP_07904696.1 (SEQ ID N° 2) que é xilose isomerase (EsXI) de Eubacterium saburreum DSM 3986, conforme descrito nos parágrafos a seguir. A inscrição de sequência de codificação ligada (NZ_AEPW01000073 região 2583..3956: SEQ ID N° 1) foi considerada como base de construção de primers de clonagem.

2. AMPLIFICAÇÃO DO GENE XILOSE ISOMERASE DE EUBACTERIUM SABURREUM DSM 3986

[0042] Métodos de manipulação de moléculas de ácido nucleico são geralmente conhecidos dos técnicos no assunto e são apresentados no presente como referência (1. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Joseph Sambrook, David William Russell; 2. Current Protocols in Molecular Biology, última atualização: 11 de janeiro de 2012; contagem de páginas: cerca de 5300. ISSN de impressão: 1934-3639;.). DNA modelo genômico de Eubacterium saburreum DSM 3986 foi adquirido da DSMZ (Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen). Pares de primers laterais foram projetados para coincidir com as extremidades N e C terminais de SEQ ID N° 1. Para amplificação da versão truncada de forma N-terminal de SEQ ID N° 1, a região de ligação do primer com sentido foi alterada 54 bp para baixo no fluxo (a partir de A55). A reação de PCR é configurada utilizando Polimerase de Alta Fidelidade Finnzymes Phusion® (sistema de tampão de HF) seguindo as recomendações do fornecedor para concentrações de dNTP, primer e tampão. A amplificação dos produtos de PCR é realizada em um Termociclizador Eppendorf utilizando o programa padrão de Polimerase de Fusão (desnaturação inicial por 30 seg a 98 °C seguida por 35 ciclos de etapas de 98 °C (20 seg), 60 °C (20 seg) e 72 °C (1min20seg) e uma fase de alongamento final a 72 °C por dez minutos. Os produtos de PCR com tamanho esperado são purificados por meio de eletroforese de gel de agarose-TAE manchado com brometo de etídio preparativo e recuperados do gel utilizando o Kit de Purificação de Gel e PCR SV Promga Wizard. Para fusão de 6xmarca His C-terminal, os produtos de PCR primários são utilizados como modelos de reamplificação do fragmento de DNA completo utilizando um primer reverso estendido com extensão 5’ correspondente sob condições idênticas (PCR de fusão 6xmarca His Os produtos de PCR obtidos são novamente purificados por meio de Eletroforese de Gel de Agarose e recuperados utilizando o Kit de Purificação de Gel e PCR SV Promga Wizard. Ele contém a versão 6x-marca His C-terminal do gene EsXI ou uma versão 6xmarca His C-terminal do gene Es-sh XI (EsXI truncado), respectivamente.

[0043] A amplificação de genes de xilose isomerase otimizados por códon foi realizada a partir de modelos de genes otimizados encomendados para a Geneart Regensburg, Alemanha. Algoritmos de otimização para otimização de sequências foram utilizados conforme fornecido pela companhia.

3. CLONAGEM DE ORF ESXI E ES-SHXI EM PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

[0044] Uma preparação de plasmídeo do plasmídeo pSCMB454 isolado de um cultivo de Escherichia coli foi linearizada por meio de restrição com endonuclease de XmnI e fragmentos digeridos separados de substâncias não processadas por meio de eletroforese de gel de agarose. A cadeia principal de vetor linearizado foi recuperada do gel seguindo as instruções do pCR sV promga Wizard e Kit de purificação de Gel. o produto de pCR amplificado é clonado na cadeia principal de vetor digerido XmnI utilizando métodos de clonagem padrão. A transformação foi realizada em células W Mach1 de Escherichia coli quimicamente competentes de acordo com o protocolo do fabricante. Transformadores foram cultivados por uma noite sobre placas de LB-Ampicilina e testados para determinar a correção por meio de MINI-prep de plasmídeos e digestão de controle, bem como sequenciamento de DNA. Uma quantidade maior de DNA de plasmídeo foi preparada a partir de um clone confirmado utilizando o Sistema Midiprep de Plasmídeos Promega PureYield®. Um exemplo da sequência do conjunto de expressão resultante que inclui sequência promotora de GPD e terminal cyc1 é fornecido em SEQ ID N° 6.

4. TRANSFORMAÇÃO EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE

[0045] Linhagem ATCC 204667 de Saccharomyces cerevisiae (MATa, ura3- 52, mal GAL+, CUP(r)) foi utilizada como hospedeiro para todos os experimentos de transformação.

[0046] A transformação é realizada utilizando métodos padrão conhecidos dos técnicos no assunto (vide, por exemplo, Gietz, R. D. e R. A. Woods (2002), Transformation of Yeast by the LiAc/ss Carrier DNA/ PEG Method, Methods in Enzymology 350: 87-96). Uma versão intacta do gene ura3 de S. cerevisiae contido no vetor de expressão foi utilizada como marcador de seleção e transformadores são selecionados para crescimento sobre meio mínimo sem uracil. Meio mínimo consistiu de 20 g-l-1 de glicose, 6,7 g-l-1 de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 40 mg-l-1 de L-tirosina, 70 mg-l-1 de L-fenilalanina, 70 mg-l-1 de L- triptofano, 200 mg-l-1 de L-valina e 50 mg-l-1 de cada um dentre hemissulfato de adenina, cloridrato de L-arginina, mono-hidrato cloridrato de L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, cloridrato de L-lisina, L-metionina, L-serina e L-treonina. o pH foi ajustado em 5,6 e 15 g-l-1 de agar são adicionados para meios sólidos.

5. CRESCIMENTO DE ISOMERASES DE XILOSE QUE EXPRESSAM LINHAGENS DE SACCHAROMYCES SOBRE MEIOS DE XILOSE

[0047] a. Colônia isolada de linhagens de Saccharomyces transformadas com vetor de expressão para xilose isomerase de Eubacterium saburreum (Es XI) e Clostridum phytofermentas (Cp XI), bem como vetor de expressão plena pSCMB454, foram transformados sobre placas com meio mínimo com glicose como fonte de carbono isolada. Colônias isoladas foram transferidas em seguida sobre placas com meio mínimo com xilose como fonte de carbono isolada (20 g-l-1) e incubadas a 30 °C. Após sete dias, somente os transformadores com vetores de expressão de xilose isomerase estavam crescendo de forma visível (Fig. 2).

[0048] O exame do tamanho médio da colônia de linhagens de Saccharomyces que expressam diferentes isomerases de xilose indica que foi observado o efeito mais forte com Es XI. Cp XI e Pi XI apresentaram forte efeito similar neste teste fisiológico, mas o efeito foi notadamente mais fraco que para Es XI. Controle negativo, linhagem de Saccharomyces transformada somente com pSCMB454 (vetor pleno), exibiu apenas crescimento de fundo fraco não diferenciável do crescimento de fundo de Saccharomyces não transformado.

[0049] b. O crescimento das linhagens também foi determinado sobre meio líquido. Meio mínimo com 20 g-l-1 de xilose como fonte única de carbono, ajustado para pH 5,6, foi inoculado com uma colônia isolada. Após sete dias, os cultivos foram parcelados, armazenados a -80 °C e utilizados como cultivos iniciais para experimentos de crescimento. O experimento de crescimento foi realizado sobre o mesmo meio mínimo e inoculado com os cultivos iniciais. A incubação foi realizada por dez dias em frascos agitados a 250 rpm, 30 °C. O crescimento foi determinado medindo-se OD600nm (Fig. 5).

[0050] Como se pode deduzir da Figura 5, o crescimento da linhagem de Saccharomyces transformada com Es XI é levemente mais forte que a linhagem com Cp XI. Barras de erro apresentam desvio padrão de três frascos agitados medidos por linhagem e indicam significado estatístico da medição.

6. PREPARAÇÃO DE EXTRATOS LIVRES DE CÉLULAS DE LEVEDURA

[0051] Colônias isoladas das linhagens de Saccharomyces que expressam Es XI, Cp XI foram transferidas para meio mínimo contendo 20 g-l -1 de xilose e 6,7 g-l-1 de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos. O pH foi ajustado em 5,6. Os cultivos foram incubados de forma aeróbica a 30 °C, 250 rpm, por sete a dez dias. As células foram colhidas por meio de centrifugação, lavadas uma vez com água estéril à temperatura ambiente, novamente suspensas em água dd estéril com OD600nm > 200 e congeladas a -80 °C.

[0052] Suspensão de células congeladas foi descongelada sobre gelo e ajustada em OD600nm = 200. 100 μl de estoque de tampão NMDT (250 mM de NaCl, 10 mM de MnCl2, 1 mM de DTT, 250 mM de Tris/HCl, pH 7,5) e 11 μl de estoque PMSF (100 mM em isopropanol) foram adicionados sobre 1000 μl de suspensão celular. 500 μl de suspensão de células tamponadas foram transferidos para 0,5 mM de Kit de Vidro Precellys (Pedido n° 91 PCS VK05) e lisados mecanicamente em homogeneizador Precellys 24 (Peqlab). A lise foi realizada em 2 x 15 seg a 5500 rpm. O fragmento celular foi removido por meio de centrifugação a 13,200 g/4 °C. O lisato obtido foi parcelado, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 °C.

7. TESTES DE MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE ISOMERASE DE XILOSE

[0053] A) Para algumas medições da atividade de isomerase de xilose, aplicamos teste espectrofotométrico com base em desidrogenase de sorbitol (SD). Como produto de isomerase de xilose, forma-se xilulose de açúcar isomérico. No teste enzimático, foi medida a quantidade de xilulose produzida. Para medição da atividade de isomerase em lisatos celulares totais, foi realizado teste enzimático na forma de teste XI-SD acoplado (Fig. 6). Para todos os outros experimentos, o teste enzimático foi realizado em duas etapas, isomerização de xilose como primeira etapa, seguida por determinação da concentração de xilulose como segunda etapa. Em protocolo de duas etapas, realizou-se desativação de xilose isomerase (95 °C, 10 min) após a primeira etapa. A composição da mistura de teste enzimático é fornecida abaixo:

[0054] O teste foi realizado em placas de microtítulos com 96 cavidades e seguiu-se cinética a 340 nm.

[0055] A determinação da atividade enzimática em extratos celulares de Saccharomyces cerevisiae que expressam diferentes XIs (Fig. 6) demonstrou que a atividade mais alta foi obtida com Eubacterium saburreum XI. A atividade de Clostridium phytofermentas XI foi mensurável e encontrava-se acima do nível de fundo do extrato celular livre de XI, mas significativamente mais baixo em comparação com outros dois extratos.

[0056] B) Para algumas medições da atividade de isomerase de xilose, foi aplicado um método com base em HPLC. A quantidade de xilulose produzida foi medida indiretamente sobre a redução da concentração de xilose (Fig. 7). A medição foi realizada com coluna H e instrumento Dionex Ultimate 3000.

8. EXPRESSÃO DE XILOSE ISOMERASE EM E. COLI, MEDIÇÕES DA PURIFICAÇÃO E ATIVIDADE DE ISOMERASE DE XILOSE

[0057] Todas as isomerases de xilose foram expressas em células Top10 K12 de E. coli sob promotor indutível por arabinose utilizando técnicas de biologia molecular padrão. A expressão de XI foi induzida com 0,02% de arabinose a 25 °C e 200 rpm por 14 horas. Os cultivos foram colhidos por meio de centrifugação, os sobrenadantes foram descartados e as células foram novamente suspensas em 100 mM de tampão de fosfato, pH 7,0, a OD600nm de 200 a 300. As células foram lisadas por meio de ultrassonificação de acordo com métodos de purificação padrão. Células lisadas foram centrifugadas por trinta minutos em 20,000 g a 4 °C. Sobrenadantes limpos foram parcelados e congelados a -80 °C. Antes da purificação, os lisatos foram descongelados sobre gelo e adicionou-se imidazol até 10 mM finais. Realizou- se purificação sobre colunas de centrifugação de 500 μl de Ni-NTA (Biorad). As colunas foram equilibradas com 100 mM de tampão de fosfato, pH 7,0, e lisatos celulares foram carregados sobre colunas. As colunas foram lavadas uma vez com 100 mM de fosfato, pH 7,0, com 20 mM de imidazol e eluídas com o mesmo tampão contendo 250 mM de imidazol. A remoção de imidazol e a troca de tampões (de fosfato para Tris-Cl) foram realizadas com colunas Micro Bio-Spin (Biorad) de acordo com o manual de instruções. Realizou-se análise SDS-PAGE sobre géis a 10% (Birad Criterion XT) de acordo com o manual de instruções. Todas as proteínas foram purificadas até a homogeneidade (>99%). A concentração de proteína foi determinada por reagente Bradford da Biorad de acordo com o manual de instruções. Albumina de soro bovino foi utilizada como padrão. Todas as proteínas purificadas foram obtidas em concentração final de cerca de 2 g/l.

[0058] Medições da atividade inicial de proteínas purificadas foram realizadas com método com base em HPLC final (vide acima). As medições foram realizadas em razão entre enzima e substrato (razão E/S) de 0,05%, a 60 °C e por duas horas. Após a isomerização, as reações foram desativadas conforme descrito anteriormente.

[0059] O teste foi empregado para obter detalhes da atividade específica de enzimas purificadas. Conforme exibido na Figura 7, observou-se atividade específica mais alta com Eubacterium saburreum XI (11,9%). A atividade específica mais baixa foi obtida com Clostridum phytofermentas XI (2,1%). Os dados obtidos são consistentes com medições de atividade de XI em extratos de células brutas. Nos dois casos, duas isomerases inovadoras descritas na presente invenção apresentaram atividade superior ao Cp XI de referência.

9. DETERMINAÇÃO DO PH IDEAL PARA ISOMERASES DE XILOSE PURIFICADAS

[0060] O pH ideal para Xis purificados foi determinado com teste de enzimas com base em desidrogenase de sorbitol final descrito anteriormente. Foi utilizado o protocolo em duas etapas descrito. Como medida da atividade de isomerase, foi utilizada a quantidade de NADH oxidado (NAD+; seguido como redução a 340 nm) no final da reação. A quantidade de NADH oxidado é equimolar à quantidade de moléculas de xilulose formadas durante a etapa de isomerização. Tomou-se o cuidado de que NADH não fosse esgotado em nenhuma das reações utilizadas para determinação do pH ideal. Dois sistemas tampão foram utilizados para determinação do pH ideal: BisTris para pH 5,5-7,5 e Tris de 7,5-9,5. Realizou-se comparação das atividades enzimáticas nos dois sistemas de tampão sob pH 7,5. Não foram observadas diferenças significativas.

[0061] o pH ideal determinado, conforme exibido na Figura 8, demonstra diversas diferenças entre Cp Xi de referência e dois Xis inovadores descritos na presente invenção. primeiro: o pH ideal para Cp Xi é neutro (pH = 7,0) e o pH ideal para Es Xi e Cp Xi encontra-se na região alcalina (pH = 8,0). segundo: a atividade residual de Es Xi (pH = 5,5) encontra-se a 50% (seta inferior) de atividade máxima. A atividade residual de Cp Xi sob pH = 5,5 é virtualmente igual a zero. Terceiro: dois Xis inovadores formam um pico relativamente amplo entre pH 7,0 (>90%, seta inferior) e pH 8,0 (= 100%). Em comparação, Cp Xi retém <80% de atividade sob pH = 8,0.

10. DETERMINAÇÃO DA TEMPERATURA IDEAL PARA ISOMERASES DE XILOSE PURIFICADAS

[0062] A temperatura ideal para XIs purificados foi determinada com teste de enzimas final descrito anteriormente. Também neste experimento, tomou-se o cuidado de que NADH não fosse esgotado em nenhuma das reações utilizadas para determinação da temperatura ideal. Os gradientes de temperatura foram gerados com ciclizadores de PCR de laboratório comuns (Eppendorf).

[0063] A determinação da temperatura ideal (Figura 9) revelou várias diferenças entre Cp XI de referência e, na presente invenção, descreveu Es XI I. Primeiro: a temperatura ideal para Cp Xi é definida com pico relativamente agudo a 56,2 °C. Es XI exibe picos significativamente mais amplos que variam de 53,8 °C a 61,6 °C. Segundo: a atividade de Es XI a 67 °C é de cerca de 50% e, para Cp X, é virtualmente igual a zero. Tomados em conjunto, os dados T.opt. demonstram que os XIs de acordo com a presente invenção possuem estabilidade sob temperaturas significativamente mais altas que a referência Cp XI.

11. DETERMINAÇÃO DE KM PARA ISOMERASES DE XILOSE PURIFICADAS

[0064] Valores Km foram determinados com o teste de enzimas descrito em exemplos anteriores. Para o experimentos, foram utilizadas isomerases de xilose purificadas a partir de E. coli.

[0065] A determinação de Km para as isomerases de xilose purificadas revelou Km para Es-sh XI de 18,4 mM. Km para Cp XI (Km = 36,6 mM) (Fig. 10).

LISTAGENS DE SEQUÊNCIAS

[0066] SEQ ID N° 1: sequência de Eubacterium sabbureum DSM 3986, sequência de DNA que codifica xilose isomerase (NZ_AEPW01000073.1 GI:315651683):gtgaaaacaaaaaacaacattatatgtactattgcattgaaaggagacatatttatgaaagaattttttcccggcatatca cctgtaaagtttgagggcagagatagtaaaaatccacttagtttcaaatattatgatgccaaaagggtgataatgggca aaacaatggaggaacatttatcatttgctatggcatggtggcataatctttgtgcctgtggtgtggatatgttcggacaggg tactgtcgataaaagttttggtgaaagctccggtactatggagcatgcaagggctaaagtggatgcaggcattgaattta tgaaaaagcttggtataaagtattattgcttccatgatacggatattgtacctgaggatcaggaagatataaatgttacca atgcacgtttggatgagattacagactatatcttagaaaaaacaaaggataccgatattaaatgtctttggacaacctgc aatatgttcagtaatccaagatttatgaacggtgcaggaagctcaaacagtgcagatgtattttgctttgcagcggcaca ggcaaagaaaggtcttgaaaatgccgtaaaacttggagcaaagggatttgtattctggggaggcagagaaggttatg agacacttctaaatacagatatgaagcttgaagaggaaaatatagcaacactctttacaatgtgcagagattatggac gcagtataggctttatgggagatttttatattgagcctaagccgaaggagcctatgaagcatcagtatgattttgatgcgg caactgcaatcggttttttaagaaaatatggacttgataaagatttcaaactaaatattgaggcaaatcacgctacacttg caggtcatacttttcagcatgagttaagagtatgtgcagtcaacggtatgatggggtcggtagatgccaatcaaggaga tacattacttggatgggacactgatcaattccctacaaatgtctatgatactacattggctatgtatgaaatattaaaggca ggcggactccgtggaggtctgaactttgattcaaagaatcgcagaccaagtaatacagccgatgatatgttctatggctt tatagcaggtatggacacatttgcacttggacttattaaggcggcggaaattatagaagacggaagaatagatgatttt gttaaagaaagatatgcaagttataattcaggaataggtaagaagataagaaacagaaaagtgacactgatagagt gtgccgagtatgccgcaaagcttaaaaagcctgaactgccggaatcaggaagacaggaatatcttgagagcgtagt gaataatatattgttcggataa

[0067] SEQ ID N° 2: sequência de proteínas de Eubacterium sabbureum DSM 3986 traduzida, sequência de DNA que codifica xilose isomerase (ZP_07904696.1) (EsXI):mktknniictialkgdifmkeffpgispvkfegrdsknplsfkyydakrvimgktmeehlsfamawwhnlcacgvdmf gqgtvdksfgessgtmeharakvdagiefmkklgikyycfhdtdivpedqedinvtnarldeitdyilektkdtdikclwtt cnmfsnprfmngagssnsadvfcfaaaqakkglenavklgakgfvfwggregyetllntdmkleeeniatlftmcrdy grsigfmgdfyiepkpkepmkhqydfdaataigflrkygldkdfklnieanhatlaghtfqhelrvcavngmmgsvda nqgdtllgwdtdqfptnvydttlamyeilkagglrgglnfdsknrrpsntaddmfygfiagmdtfalglikaaeiiedgridd fvkeryasynsgigkkirnrkvtliecaeyaaklkkpelpesgrqeylesvvnnilfg*

[0068] SEQ ID N° 3: xilose isomerase de Escherichia coli (proteína): mqayfdqldrvryegskssnplafrhynpdelvlgkrmeehlrfaacywhtfcwngadmfgvgafnrpwqqpgeal alakrkadvafeffhklhvpfycfhdvdvspegaslkeyinnfaqmvdvlagkqeesgvkllwgtancftnprygaga atnpdpevfswaatqvvtameathklggenyvlwggregyetllntdlrqereqlgrfmqmvvehkhkigfqgtlliep kpqeptkhqydydaatvygflkqfglekeiklnieanhatlaghsfhheiataialglfgsvdanrgdaqlgwdtdqfpn sveenalvmyeilkaggfttgglnfdakvrrqstdkydlfyghigamdtmalalkiaarmiedgeldkriaqrysgwnse lgqqilkgqmsladlakyaqehhlspvhqsgrqeqlenlvnhylfdk*

[0069] SEQ ID N° 4: xilose isomerase de Clostridium phytofermentas (proteína) (CpXI):mknyfpnvpevkyegpnstnpfafkyydankvvagktmkehcrfalswwhtlcaggadpfgvttmdrtygnitdpm elakakvdagfelmtklgieffcfhdadiapegdtfeeskknlfeivdyikekmdqtgikllwgtannfshprfmhgasts cnadvfayaaakiknaldatiklggkgyvfwggregyetllntdlgleldnmarlmkmaveygrangfdgdfyiepkpk eptkhqydfdtatvlaflrkyglekdfkmnieanhatlaghtfehelamarvngafgsvdanqgdpnlgwdtdqfptdv hsatlamlevlkaggftngglnfdakvrrgsfefddiaygyiagmdtfalglikaaeiiddgriakfvddryasyktgigkai vdgttsleeleqyvlthsepvmqsgrqevletivnnilfr*

[0070] SEQ ID N° 5: xilose isomerase de Piromyce sp (proteína - PI_XI): makeyfpqiqkikfegkdsknplafhyydaekevmgkkmkdwlrfamawwhtlcaegadqfgggtksfpwnegt daieiakqkvdagfeimqklgipyycfhdvdlvsegnsieeyesnlkavvaylkekqketgikllwstanvfghkrymn gastnpdfdvvaraivqiknaidagielgaenyvfwggregymsllntdqkrekehmatmltmardyarskgfkgtfli epkpmeptkhqydvdtetaigflkahnldkdfkvnievnhatlaghtfehelacavdagmlgsidanrgdyqngwdt dqfpidqyelvqawmeiirgggfvtggtnfdaktrrnstdlediiiahvsgmdamaralenaakllqespytkmkkery asfdsgigkdfedgkltleqvyeygkkngepkqtsgkqelyeaivamyq*

[0071] SEQ ID N° 6: conjunto de expressão de EsXI (LETRAS MAIÚSCULAS EM NEGRITO: sequência de codificação do gene EsXI com 6xmarca His C-terminal e fusão ligante; LETRAS MAIÚSCULAS PEQUENAS: promotor de GPD; sublinhado: remanescentes de local XnmI; itálico: terminal CYC1): CTCGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATTA GCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATC GTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGG CATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCA TTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGT GATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCT TACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAAGCAGTTCCC TCAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTA TTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTT CGAATaaacacacagaaacaaagaa3ATGAAAACAAAAAACAACATTATATGTACTATT GCATTGAAAGGAGACATATTTATGAAAGAATTTTTTCCCGGCATATCACCTGTA AAGTTTGAGGGCAGAGATAGTAAAAATCCACTTAGTTTCAAATATTATGATGC CAAAAGGGTGATAATGGGCAAAACAATGGAGGAACATTTATCATTTGCTATGG CATGGTGGCATAATCTTTGTGCCTGTGGTGTGGATATGTTCGGACAGGGTACTGTCGATAAAAGTTTTGGTGAAAGCTCCGGTACTATGGAGCATGCAAGGGCTAA AGTGGATGCAGGCATTGAATTTATGAAAAAGCTTGGTATAAAGTATTATTGCTT CCATGATACGGATATTGTACCTGAGGATCAGGAAGATATAAATGTTACCAATG CACGTTTGGATGAGATTACAGACTATATCTTAGAAAAAACAAAGGATACCGAT ATTAAATGTCTTTGGACAACCTGCAATATGTTCAGTAATCCAAGATTTATGAAC GGTGCAGGAAGCTCAAACAGTGCAGATGTATTTTGCTTTGCAGCGGCACAGG CAAAGAAAGGTCTTGAAAATGCCGTAAAACTTGGAGCAAAGGGATTTGTATTC TGGGGAGGCAGAGAAGGTTATGAGACACTTCTAAATACAGATATGAAGCTTG AAGAGGAAAATATAGCAACACTCTTTACAATGTGCAGAGATTATGGACGCAGT ATAGGCTTTATGGGAGATTTTTATATTGAGCCTAAGCCGAAGGAGCCTATGAA GCATCAGTATGATTTTGATGCGGCAACTGCAATCGGTTTTTTAAGAAAATATGG ACTTGATAAAGATTTCAAACTAAATATTGAGGCAAATCACGCTACACTTGCAG GTCATACTTTTCAGCATGAGTTAAGAGTATGTGCAGTCAACGGTATGATGGGG TCGGTAGATGCCAATCAAGGAGATACATTACTTGGATGGGACACTGATCAATT CCCTACAAATGTCTATGATACTACATTGGCTATGTATGAAATATTAAAGGCAGG CGGACTCCGTGGAGGTCTGAACTTTGATTCAAAGAATCGCAGACCAAGTAATA CAGCCGATGATATGTTCTATGGCTTTATAGCAGGTATGGACACATTTGCACTTG GACTTATTAAGGCGGCGGAAATTATAGAAGACGGAAGAATAGATGATTTTGTT AAAGAAAGATATGCAAGTTATAATTCAGGAATAGGTAAGAAGATAAGAAACA GAAAAGTGACACTGATAGAGTGTGCCGAGTATGCCGCAAAGCTTAAAAAGCC TGAACTGCCGGAATCAGGAAGACAGGAATATCTTGAGAGCGTAGTGAATAAT ATATTGTTCGGAGGATCTGGCCATCACCACCATCATCACTAAtgttcgtcctcgtttagtta tgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctagg tccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcat gtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttg

[0072] SEQ ID N° 7: DNA otimizado de S. cerevisiae que codifica versão truncada de Es-sh_XI com fusão C-terminal de 6xmarca His: atgaaggaattcttcccaggtatctccccagttaagtttgaaggtagagattctaagaacccattgtccttcaagtactac gatgccaagagagttattatgggtaagaccatggaagaacatttgtcttttgctatggcttggtggcataatttgtgtgcttg tggtgttgatatgttcggtcaaggtactgttgataagtctttcggtgaatcttctggtactatggaacatgctagagctaaagt tgatgccggtattgaattcatgaagaagttgggtattaagtactactgcttccacgatactgatatcgttccagaagatca agaagatatcaacgttaccaatgccagattggacgaaattaccgattacatcttggaaaagactaaggacaccgata tcaagtgtttgtggactacttgtaacatgttctccaacccaagattcatgaacggtgctggttcttctaattctgctgatgtttttt gtttcgctgctgctcaagctaaaaagggtttggaaaatgctgttaagttgggtgctaagggttttgttttttggggtggtaga gaaggttacgaaactttgttgaacactgacatgaagttggaagaagaaaacattgctaccttgttcaccatgtgtagag attacggtagatccattggtttcatgggtgatttctacattgaacctaagccaaaagaacctatgaagcaccaatacgatt ttgatgctgctactgctattggtttcttgagaaagtatggtttggacaaggacttcaagttgaacattgaagctaaccatgct actttggctggtcatacttttcaacacgaattgagagtttgtgctgtcaatggtatgatgggttctgttgatgctaatcaaggt gatactttgttgggttgggatactgatcaatttccaactaacgtttacgataccaccttggccatgtacgaaattttgaaagc tggtggtttgagaggtggtttaaactttgactctaagaacagaagaccatccaacactgctgatgatatgttttacggtttc attgctggtatggatactttcgctttgggtttgattaaggccgccgaaattattgaagatggtagaattgatgacttcgtcaa agaaagatacgcctcttacaattccggtatcggtaagaagattagaaacagaaaggttaccttgatcgaatgcgctga atatgctgctaaattgaagaaaccagaattgccagaatccggtagacaagaatatttggaatctgtcgtcaacaacat cttgtttggtggttctggtcatcatcatcaccatcattaa

[0073] SEQ ID N° 8: Eubacterium sabbureum DSM 3986 truncado de forma N-terminal Es-sh_XI: mkeffpgispvkfegrdsknplsfkyydakrvimgktmeehlsfamawwhnlcacgvdmfgqgtvdksfgessgt meharakvdagiefmkklgikyycfhdtdivpedqedinvtnarldeitdyilektkdtdikclwttcnmfsnprfmnga gssnsadvfcfaaaqakkglenavklgakgfvfwggregyetllntdmkleeeniatlftmcrdygrsigfmgdfyiepk pkepmkhqydfdaataigflrkygldkdfklnieanhatlaghtfqhelrvcavngmmgsvdanqgdtllgwdtdqfpt nvydttlamyeilkagglrgglnfdsknrrpsntaddmfygfiagmdtfalglikaaeiiedgriddfvkeryasynsgigk kirnrkvtliecaeyaaklkkpelpesgrqeylesvvnnilfg*

Claims

1. Célula de Saccharomyces cerevisiae CARACTERIZADA pelo fato de que expressa a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO. 8 e tendo atividade de xilose isomerase na célula de Saccharomyces cerevisiae ou compreendendo uma molécula de DNA, em que a molécula de DNA compreende uma sequência de DNA que codifica a proteína e ligada operativamente a uma sequência reguladora de célula de Saccharomyces cerevisiae, ou a molécula de DNA consiste na sequência da SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO. 7.

2. Célula de Saccharomyces cerevisiae, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína consiste na sequência da SEQ ID NO. 2 e tem atividade de xilose isomerase na célula de Saccharomyces cerevisiae.

3. Célula de Saccharomyces cerevisiae, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína consiste na sequência da SEQ ID NO. 8 e tem atividade de xilose isomerase na célula de Saccharomyces cerevisiae.

4. Célula de Saccharomyces cerevisiae, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína exibe atividade de xilose isomerase ideal na faixa de pH de 7,5 a 8,5.

5. Célula de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um gene xilose isomerase exógeno funcional, como definido na reivindicação 1, na referida célula de levedura, em que o referido gene xilose isomerase exógeno é ligado operativamente a sequências promotoras e terminadoras que são funcionais na referida célula de levedura, gerando a expressão de uma proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Célula de Saccharomyces cerevisiae tendo níveis mais altos de atividade de xilose isomerase CARACTERIZADA pelo fato de que é obtida por meio de transformação de uma cepa de levedura do tipo selvagem com uma sequência de DNA como definida na reivindicação 1.

7. Uso da célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que é para fermentação de biomassa de um meio que contém fonte de carbono-xilose.

8. Uso da célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que é como um biocatalisador in situ ou em forma purificada para a produção de um produto de açúcar isomerizado.

9. Uso da molécula de DNA, como definida na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a transformação de células de Saccharomyces cerevisiae.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a transformação resulta em uma célula de Saccharomyces cerevisiae como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

11. Uso de células de Saccharomyces cerevisiae, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que é para atingir uma taxa mais alta de consumo de xilose.

12. Processo para a produção de etanol a partir de xilose ou de uma mistura de glicose e xilose CARACTERIZADO pelo fato de que compreende usar Saccharomyces cerevisiae, em que Saccharomyces cerevisiae expressa a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

13. Processo para a produção de produto de fermentação selecionado dentre ácido acético, ácido succínico, aminoácidos, etileno, glicerol, biocombustíveis, ácido láctico, ácido itacônico CARACTERIZADO pelo fato de que o processo compreende as etapas de: a. fermentar um meio contendo uma fonte de xilose com uma célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e, opcionalmente, b. recuperar o produto de fermentação.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto de fermentação é 1,3-propanodiol, butanol ou etanol.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto de fermentação é butanol.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto de fermentação é etanol.