CN107937294A

CN107937294A - 一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法

Info

Publication number: CN107937294A
Application number: CN201710461603.5A
Authority: CN
Inventors: 肖冬光; 洪坤强; 董健; 郭学武; 王鹏飞; 陈叶福
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2017-06-14
Publication date: 2018-04-20

Abstract

本发明公开了一株适量产乙酸乙酯的酒酵母菌种及其构建方法，所述适量产乙酸乙酯的酵母菌株通过在醇乙酰转移酶的编码基因ATF1的ORF前插入梯度截断的PGK1启动子，敲除序列大小分别是100bp、200bp和300bp。启动子靶序列的精确敲除通过融合PCR和酵母整合质粒YIplac211来实现。构建得到ATF1的ORF前插入梯度截断的PGK1启动子的酿酒酵母突变株。在30℃玉米浓醪发酵实验证明在ATF1前分别插入截断的启动子序列，能够实现乙酸乙酯的调节，CLy12a‑P‑100，CLy12a‑P‑200 and CLy12a‑P‑300的乙酸乙酯含量相比于CLy12a‑P减少了28％，30％和42％。本发明构建的酵母菌中基因组上无外源基因残留，因此可以安全的用于生产。

Description

一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术：

乙酸乙酯为白酒中含量最多的风味物质之一，在白酒中呈现出令人愉悦的果香气，乙酸乙酯是我国白酒的主体酯类之一，在浓香型及酱香型酒中分别还有相当量的乳酸乙酯，己酸乙酯及少量的丁酸乙酯，这四大酯在不同香型的酒占到总酯的90％～95％，构成了我国名优白酒的主体香，此外还有少量的乙酸异戊酯和乙酸异丁酯等。酯类含量变化对白酒风味有着决定性的影响。白酒中酯类含量过高或过低都会对风味产生不良影响，含量过低，白酒香味不足，酒精味重，不适宜饮用，且容易带来饮后上头的问题；酯类含量过高，会产生青草味，脂肪臭等不愉快气味。由于乙酸乙酯含量相对较多，容易检测，因此，控制白酒中的乙酸乙酯从而控制白酒中的总酯在适量的范围内，使得酯在白酒风味中发挥积极作用。

对于调节酿酒酵母中乙酸乙酯的合成，ATF1基因其中关键性作用，ATF1基因编码的醇乙酰转移酶AATaseI是催化合成乙酸乙酯的关键酶。研究发现使用强启动子PGK1等过表达 ATF1基因可以构建高产乙酸酯的酿酒酵母菌株(含量可以提高2-10倍)，而且，敲出ATF1 基因会导致最终的发酵产物中的乙酸酯含量减少。这些突变株所发酵的最终产物中乙酸酯含量可以通过启动子工程改变但不影响菌株的生长性能和基本发酵性。

醇乙酰转移酶的酶活力的改变会影响酵母细胞产乙酸酯的能力。通过对ATF1基因的表达调控，实现酿酒酵母细胞在最终的发酵产物中酯的改变。改变目的基因的启动子强度是实现基因表达调控的重要方法。采用融合PCR方法可以实现基因片段的精确无缝拼接，而且不受酶切位点的限制避免重复操作所带来的未知影响。该方法利用融合PCR和整合型载体质粒 YIplac211介导的两步整合方法，在无外源基因残留的前提下，实现对3’端不同程度敲的PGK1 启动子序列无缝插入到ATF1基因序列的5’端。构建的工程菌株可以安全应运到酿酒生产中，同时融合PCR介导的两步整合方法和启动子截断调控目的基因表达的方法可以广泛应运到酵母以及其他微生物的基因表达调控，促进了基因表达调控的发展。

发明内容：

本发明解决的技术问题是提供一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。获得适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315，保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可购买获得。

所述适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株在正常的生长性能和发酵性能不受影响的情况下，在30℃静止玉米浓醪发酵约84小时产生的乙酸乙酯相对于发菌株提高了53％，相对于插入全长的PGK1启动子的菌株降低了30％

所述适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株具体可以在出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315的ATF1基因5’端插入截断的强启动子(截断PGK1启动子的-300bp 至-100bp，ATG＝+1)来实现。

上述基因无痕敲除可以用以下方法实现。各步骤所涉及具体操作方法参考现有文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。

用PCR方法获得突变ura3片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组实现出发菌株的URA3基因突变；

用PCR方法分别扩增1047bp的上游同源臂序列，弱化的PGK1启动子序列以及1046bp 的下同源臂序列，然后通过融合PCR，分别将三段序列融合成无缝片段；将该片段克隆至酵母整合质粒YIplac211上，获得能够进行整合敲除的质粒；

在整合敲除质粒的上游同源臂或者下游同源臂中，选择合适的单一酶切位点，将质粒酶切线性化；

通过醋酸锂化学转化法，将线性化的整合敲除质粒导入酿酒酵母中，用不含尿嘧啶的酵母合成培养基筛选发生第一步整合重组的酵母突变株；将经过鉴定的发生第一步整合重组的酵母突变株，经含有5-氟乳清酸合成培养基平板反向筛选获得发生第二步整合重组的酵母突变株；

用二步整合重组的酵母突变株和URA3基因正常的α型菌株在KAG培养基进行杂交产孢，然后分出正常的a型酵母突变菌株，以此方法回复突变的ura3标记基因。

本发明所述酿酒酵母菌株可应用于白酒发酵生产中。

有益效果：

1、本发明提供一种适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株以及构建方法，解决了启动子工程调节乙酸酯产量过高或者过低的问题。

2、本发明提供的适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株是在保持优良发酵性能的前提下，醇乙酰转移酶的编码基因ATF1的表达量有一定程度的降低，进而降低了酵母细胞的AATaseI的活性，使得酵母细胞的乙酸乙酯的产量发生变化，为解决白酒生产中酯类过高或者过低提供了解决思路，而且具有重要的市场价值。

3、本发明所使用的靶序列敲除方法，避免了酵母传统敲除过程中筛选标记残留的问题，满足自克隆的条件，可以安全的用于工业生产。并且本方法在基因精确修饰方面具有广阔的应用前景。

附图说明：

图1为CLy12aΔU的表型验证

图2为PGK1启动子截断策略以及质粒构建示意图；(a)质粒构建示意图(以YIplac211-UPD为例，其他同理)(b)PGK1启动子截断示意图

图3为融合PCR构建质粒以及两步同源重组的构建流程示意图；

图4为重组质粒的酶切验证图：泳道M为15000DNA maker；1：NruI单酶切载体质粒YIplac211-UPD：2：YIplac211-UPD；3：NruI单酶切载体质粒YIplac211-UPD-100；4：YIplac211-UPD-100；5：NruI单酶切载体质粒YIplac211-UPD-200；6：YIplac211-UPD-200；7：NruI单酶切载体质粒YIplac211-UPD-300；8：YIplac211-UPD

图5为发生第一步整合重组菌株的电泳验证图：

泳道M为DNA maker；1：CLy12aΔU为模板；2-5：模板分别为CLy12aΔU-U、CLy12aΔU-U-100、CLy12aΔU-U-200和CLy12aΔU-U-300，YIP-UPD-F和YIP-UPD-R为验证引物； 6：AY15aΔU为模板；7-10：模板分别为CLy12aΔU-U、CLy12aΔU-U-100、CLy12aΔU-U-200 和CLy12aΔU-U-300，YIP-UD-F和YIP-UD-R为验证引物；

图6为发生第二步整合重组的菌株的电泳验证图：

a泳道M为DNA maker；1：CLy12aΔU为模板；2-5：模板分别为CLy12aΔU-P、CLy12aΔU-P-100、CLy12aΔU-P-200和CLy12aΔU-P-300，UD-F和UD-R为验证引物；

b泳道M为DNA maker；1：CLy12aΔU为模板；2-5：模板分别为CLy12aΔU-P、CLy12aΔU-P-100、CLy12aΔU-P-200和CLy12aΔU-P-300，UP-F和UP-R为验证引物；

c泳道M为DNA maker；1：CLy12aΔU为模板；2-5：模板分别为CLy12aΔU-P、CLy12aΔU-P-100、CLy12aΔU-P-200和CLy12aΔU-P-300，PD-F和PD-R为验证引物；

图7为杂交产包回复URA3的双倍；a-d分别为CLy12aΔU-P、CLy12aΔU-P-100、CLy12a ΔU-P-200和CLy12aΔU-P-300与CLy12α杂交的二倍体。

图8为亲本菌株和酵母重组菌株的生长曲线；

图9为亲本菌株和酵母重组菌株ATF1基因的mRNA水平以及AATaseI酶活水平结果图；

图10为亲本菌株和酵母重组菌株的风味物质含量的实验结果图。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：PGK1启动子部分缺失插入到ATF1基因5’端的酿酒酵母菌株的构建

本实例所用的出发菌株CICC32315。所述大肠杆菌DH5a购自Takara公司。所述YPD培养基为通用的完全培养基，固体培养基含2％进口琼脂粉。

根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述引物。

表1本实施例中所用到的引物

注a：下划线表示酶切位点。

(1)带有缺陷ura3基因的酿酒酵母CLy12aΔU的构建

使用Solarbio公司的酵母基因组提取试剂盒，提取实验室菌株W303-1a的基因组。利用引物对URA3-F和URA3-R，以W303-1a的基因组为模板，PCR扩增菌株W303-1a突变ura3片段。经过试剂盒回收以后，将片段通过醋酸锂化学转化法导入到亲本菌株CICC32315中，通过突变ura3与正常URA3之间的同源重组，实现标准菌株的URA3基因突变。转化后的菌悬液，涂布于补加了5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶(uracil)酵母合成培养基(SD)平板上，30℃培养48h，获得带有缺陷ura3基因的酿酒酵母CLy12aΔU。获得的突变株经过表型验证确定正确，如图1所示CLy12aΔU在酵母合成培养基上不长，在YPD平板上生长良好。

(2)整合敲除质粒YIplac211-UPD*的构建

首先，以亲本菌株CICC32315的基因组为模板，使用引物pATF1-F和pATF1-F通过PCR 获得1047bp的上同源臂基因序列，PCR反应条件：95℃5min；98℃15s，55℃15s，72 ℃65s，35个循环；72℃ 10min，命名为U；

同时使用引物pPGK-F和pPGK-R，pPGK-R-100，pPGK-R-200，pPGK-R-300扩增PGK1启动子及其截断基因序列(1479bp的PGK1p，1379bp的PGK1p-100，1279bp的PGK1p-200 和1179bp的PGK1p-300，分别命名为P，P-100，P-200和P-300)PCR反应条件：95℃5min； 98℃15s，55℃15s，72℃ 90s，35个循环；72℃ 10min；使用和截断启动子对应带有不同重叠序列的上游引物ATF-F和下游引物ATF1-R扩增下同源臂基因序列，PCR反应条件： 95℃5min；98℃15s，55℃15s，72℃65s，35个循环；72℃10min，分别命名为 D，D-100，D-200和D-300。然后以U和P的混合物为模板，加入引物pATF-F和PGK1-R进行融合PCR，获得无缝融合片段UP。进切胶回收(试剂盒)后，以片段UP和D为模板，加入引物pATF-F和ATF-R进行融合PCR，获得无缝融合片段UPD，同样方法获得无缝融合片段 UPD-100，UPD-200和UPD-300。融合片段纯化回收后分别用KpnI和BamHI双酶切，最后亚克隆到整合质粒YIplac211的相应酶切位点中，整合敲除质粒 YIplac211-UPD，YIplac211-UPD-100，YIplac211-UPD-200和YIplac211-UPD-300构建成功，后三种质粒中缺失序列大小为100bp，200bp和300bp。融合PCR策略和启动子截断如图2所示，质粒构建流程图如图3所示。将这四种质粒统称为YIplac211-UPD*。图4为重组质粒的酶切验证图。

上述融合PCR法为本领域公知的采用具有互补末端的引物，形成具有重叠序列PCR产物，通过PCR产物重叠序列延伸，从而将任意DNA片段连接起来的方法，此技术不需要内切酶的消化和连接酶的处理，就可实现DNA片段的体外连接，这使得整合质粒经过两步整合重组后，酵母基因组不会残留外源酶切位点。

(3)PGK1启动子部分缺失插入到ATF1基因5’端的酵母突变株的构建

在上同源臂序列片段中选取NruI酶切重组质粒YIplac211-UPD*；用醋酸锂化学转化法将线性化的重组质粒YIplac211-UPD*导入缺陷型酵母菌株CLy12aΔU中，经过两步整合重组后，得到CYR1基因启动子3’端部分缺失的酿酒酵母，两步整合重组过程如图3。

第一步整合重组的发生，是由于导入的线性化质粒与酵母基因组的同源部分发生整合，从而将整个质粒带入基因组。转化后的菌悬液，涂布于不含尿嘧啶的酵母合成培养基平板上， 30℃培养48h，获得发生第一步整合重组的酵母菌株，分别命名为CLy12aΔU-U、CLy12aΔ U-U-100、CLy12aΔU-U-200和CLy12aΔU-U-300，这4株菌统称为CLy12aΔU-U*。采用 YIP-UPD-F和YIP-UPD-R，YIP-UD-F和YIP-UD-R为验证引物，进行PCR验证筛选。当使用引物对YIP-UPD-F和YIP-UPD-R进行PCR验证时，因为下游引物YIP-UPD-R的退火序列在YIp1ac211载体质粒上，所以酵母菌株CLy12aΔU无特异性条带，而一步整合重组菌株CLy12aΔU-U*应有一条大小为1800bp左右的条带；当使用引物对YIP-UD-F和YIP-UD-R 进行PCR验证时，因为上游引物YIP-UD-R的退火序列在YIplac211载体质粒上，所以酵母菌株CLy12aΔU无特异性条带，而一步整合重组菌株CLy12aΔU-U*应有一条大小为2700bp 左右条带。PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳结果见图5。转化子与对照比较结果显示，线性化的质粒整合到目的位点。

经过筛选和鉴定的一步整合重组酵母菌株CLy12aΔU-U*，取一环接到5ml液体YPD培养基中，30℃下200rpm振荡12h后，稀释10倍涂布于含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的酵母合成培养基平板上，30℃培养48h，获得发生第二步整合重组的酵母菌株，第二步整合重组后，出现两种结果：一，如果上游同源序列(U)形成的重复序列之间发生整合，则酵母回复成出发菌株CLy12a；二，如果下游同源序列(D)形成的重复序列之间整合，则PGK1启动子及其弱化启动子基因片段分别插入，实现截断启动子的精确插入，同时靶位置上不引入任何外源基因。挑选所得到的单菌落，采用引物对UD-F和UD-R，UP-F和UP-R，PD-F和PD-R 分别进行PCR验证。筛选出启动子靶序列部分得到精确敲除的转化子，分别命名为CLy12a ΔU-P、CLy12aΔU-P-100、CLy12aΔU-P-200和CLy12aΔU-P-300。PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳结果见图6。转化子与对照比较结果显示，插入在ATF1基因的5’端的PGK1的启动子部分是不同程度截断的。

(4)二步重组酿酒酵母菌株突变ura3基因的回复

同本实例中(1)所述的方法，二步重组酿酒酵母菌株均为a型单倍体菌株，将其分别于URA3基因正常的α型菌株CLy12α进行杂交，在28℃，KAC培养基培养3-4天镜检观察是否生孢，待生孢时将其分别取适量和500ul的生理盐水混匀并加入蜗牛酶进行破壁，30℃反应3-6h，然后在50℃水浴10min杀死营养体，涂布于YEPD培养基中挑取较小菌落分别用MAT-F，MAT-α和MAT-a三个引物进行验证，条带大于以上为a型，然后用UD-F和UD-R，UP-F 和UP-R，PD-F和PD-R分别再次进行PCR验证。得到的酵母菌株即为URA3基因回复的菌株，分别命名为CLy12a-P、CLy12a-P-100、CLy12a-P-200和CLy12a-P-300。杂交产孢结果见图7，三引物验证结果见图8.

实施案例2：PGK1启动子部分缺失插入到ATF1基因5’端的酿酒酵母菌株的生长性能测定实验

测定亲本菌株CICC32315及其转化子CLy12a-P、CLy12a-P-100、CLy12a-P-200和CLy12a-P-300在30℃条件下的生长性能，结果如图9。结果显示，PGK1启动子部分缺失插入到ATF1基因5’端没有明显影响酵母的生长性能。

实施案例3：ATF1基因的mRNA水平以及AATaseI酶活水平测定实验

基因mRNA水平按Livak K J文献报道方法测定(Analysis of relative geneexpression datausing real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT method.Methods25：402-408.)试剂盒为索莱宝生物公司提供。采用底物反应法测定各菌株所产醇乙酰基转移酶的活力。在10mL离心管内加入一定量的鲜酵母菌体、1.0mL Tris-Hcl、20μL乙醇(色谱醇)和20μL 10mg/mL乙酰辅酶A，混匀后用封口膜将离心管密封，并放入25℃转速150r/min摇床内进行反应。待反应一定时间后(一般为2～6h)，12000r/min离心5min，取上清液用气相色谱测反应产物乙酸乙酯的生成量。醇乙酰基转移酶活力定义：在25℃下，1g酿酒酵母菌体1h催化乙醇和乙酰辅酶A生成乙酸乙酯的量(μmol)。结果如图10所示。

实施案例4：出发菌株以及四株改造菌株的玉米原料浓醪发酵实验

(1)CLy12a-P、CLy12a-P-100、CLy12a-P-200和CLy12a-P-300与亲本菌株的玉米原料浓醪发酵实验

将亲本菌株CICC32315及转化子CLy12a-P、CLy12a-P-100、CLy12a-P-200和CLy12a-P-300分别同时进行玉米浓醪发酵实验，发酵工艺路线图：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷却→接菌→发酵→蒸酒→测定指标；

工艺条件：

浸泡条件：60～70℃，浸渍20min；液化条件：85～90℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化90min；糖化条件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20min，加入营养盐和酸性蛋白酶，30℃反应20min；

配料：玉米粉60g，水180mL，耐高温α-淀粉酶2×10⁵U/mL，30μL，糖化酶200U/mL，90μL，2.5×10³U/mL酸性蛋白酶1.2mL；营养盐1mL(MgSO₄150g/L、KH₂PO₄75g/L、尿素 81g/L，过滤，4℃保存)；接种量：7.5％，30℃放置12h，再放入40℃，发酵3天，发酵结束后测定各菌株的发酵性能(CO₂失重、乙醇产量、残糖)；结果见表2。

表2菌株发酵性能比较^c

^a单因素方差分析.(P＜0.05)

^b主要为乙酸、琥珀酸、丙酮酸。

^c三个平行试验的结果。

表2显示，在30℃条件下，CLy12a-P、CLy12a-P-100、CLy12a-P-200和CLy12a-P-300与亲本菌株的发酵性能没有很大差距。

表3发酵液风味物质比较^f

d单因素方差分析。(P＜0.05)

e三个平行试验的结果.

f气相色谱分析酒样中风味物质。

Claims

1.选育出的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，是在酿酒酵母出发菌株中醇乙酰基转移酶编码基因ATF1的5’端通过两步重组无缝精确插入弱化的PGK1强启动子获得。

2.如权利要求1所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。

3.如权利要求1所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母具有正常的生长性能并且用于正常的发酵性能以及产酒精能力，在30℃玉米原料浓醪发酵中乙酸乙酯产量相对亲本菌株提高了53％，相对于插入全长的PGK1启动子的菌株降低了30％。

4.如权利要求1所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法是通过融合PCR技术和整合型载体质粒YIplac211介导的两步基因整合法，把强启动子PGK1的3’端-300bp至-100bp(ATG＝+1)这一序列无痕敲除来实现。

5.如权利要求4所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，具体步骤包括：

用PCR方法分别扩增1047bp的上游同源臂序列，弱化的PGK1启动子序列以及1046bp的下同源臂序列，然后通过融合PCR，分别将三段序列融合成无缝片段；将该片段克隆至酵母整合质粒YIplac211上，获得能够进行整合敲除的质粒；

用二步整合重组的酵母突变株和URA3基因正常的α型菌株在KAC培养基进行杂交产孢，然后分出正常的a型酵母突变菌株，以此方法回复突变的ura3标记基因。

6.如权利要求2所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株在白酒生产中的应用。