CN105969678A - 一种低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法 - Google Patents

一种低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法，包括目的基因的获得，染色体整合载体的构建和选育菌株发酵验证。选育的酵母菌株对南极假丝酵母(Pseudozyma antarctica)脂肪酶B进行异源分泌表达，与亲本菌株相比：所构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株基本发酵性能不受影响，高粱原料半固态白酒发酵6天后，选育菌株乳酸乙酯含量提高了57.4％‑84.5％；高级醇生成量显著降低，分别为：异戊醇降低了9.5％，异丁醇降低了约50.0％，活性戊醇降低了约44.0％。选育的酿酒酵母菌株显著提高乳酸乙酯生成量的同时降低高级醇生成量，在一定程度上解决了酒类风味物质不协调等问题，在白酒相关领域有广泛的应用前景。

Description

一种低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株及其构建方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种低产高级醇高产乳酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。
背景技术
白酒中的微量风味物质是影响白酒品质的主要因素，含量约占1％-2％，其中酯类物质又占微量成分的60％-90％，因此提高白酒的酯含量对于形成白酒风味典型性具有非常重要的意义。高含量酯能够使得酒体柔和，香味协调，改善饮料酒的品质。清香型白酒酯类化合物中乳酸乙酯仅次于乙酸乙酯，乳酸乙酯和乙酸乙酯的含量及比例对白酒的风味影响很大。而对于老白干香型白酒来说，乳酸乙酯含量要多于乙酸乙酯，其比例为1.5-2.2∶1，GB/T20825规定，老白干香型白酒乳酸乙酯/乙酸乙酯≥0.80，因此乳酸乙酯含量对于对固态清香型白酒具有非常重要的意义。由于现代大型白酒企业卫生条件控制严格，新厂建立等，使得白酒中乳酸乙酯生成量较低，尤其是冬季，乳酸乙酯生成量更少，严重影响白酒风味，造成酒香不突出，后味淡薄。工业上为了增香通常会加入产酯酵母，这对乳酸乙酯的生成量几乎没有作用，另一方面通过延长发酵时间和窖藏陈酿时间提高酯香物质不仅增加耗粮，还会带来糠嗅味、涩味、酸味等异味物质影响白酒品质。同时高级醇作为酒类重要的助香物质，含量过高，使酒产生令人不愉快的异杂味，影响酒的风味和品质。此外高级醇在人体内的代谢速度远低于乙醇，对人体的毒害作用更大。
如何提高饮料酒中酯香物质的含量，能否让酿酒酵母大量酯化乳酸和乙醇合成乳酸乙酯，是一个困扰我国现代大型饮料酒业界和相关科研单位的问题。目前提高普通白酒乳酸乙酯含量的主要方法有如下三种：一是全液法，在发酵醪中加入产香微生物，乳酸菌发酵液或将乳酸发酵液经化学，生物法酯化后，再加到发酵醪中。二是调香法，用天然香料调制或用纯化学药品按某一名酒的香味成分组成来进行调香；三是固液结合法，用液态法生产酒基，用固态法的酒糟、酒尾或成品酒来提高质量；这些提高酒中乳酸乙酯含量的方法大多是从工艺水平上进行的，虽然酯香物质含量有一定提高，但酒质与高档名酒相差仍很大，特别是化学品的添加存在安全隐患。而通过延长发酵时间和窖藏陈酿时间提高酯香物质不仅增加耗粮，还会带来糠嗅味、涩味、酸味等异味物质对白酒品质的影响。对于降低白酒高级醇含量，一般通过改变发酵工艺条件，如发酵温度、时间及工艺方法等，但降低较高不显著，发酵性能不稳定。以上提高酯类物质的方法均以改变发酵工艺为切入点，不仅收效甚微，甚至存在安全隐患。选育高产乳酸乙酯低产高级醇酿酒酵母菌株，通过改变酵母相关代谢途径，能够有效解决乳酸乙酯生成量低高级醇生成量较高的问题。
白酒中酯类的生成途径有两种：一种是通过有机反应生成酯，在常温条件下极为缓慢，往往需要经几年时间才能使酯化反应达平衡；另一种就是由微生物的生化反应生成酯，这是白酒生产中产酯的主要途径。存在于酒中的汉逊酵母、假丝酵母等微生物，均有较强的产酯能力。近年来已有关于南极假丝酵母脂肪酶B合成短链酯类的相关研究。孙海龙等研究了表面展示处理后的南极假丝酵母脂肪酶B对丢糟中有机酸酯化效果的影响，酒样品乙酸乙酯和乳酸乙酯含量均有了很大提高。但目前国内酒类生产的相关研究中，并没有将南极假丝酵母脂肪酶B基因异源整合到酿酒酵母细胞中以提高乳酸乙酯生成量的相关报道。酿酒酵母酒精发酵过程中，25％的高级醇来源于Ehrlich途径，代谢途径中的BAT2基因编码的支链氨基酸转氨酶能够将相关氨基酸分解为高级醇前体物α-酮酸。因此通过选育BAT2基因缺失的酵母菌株，降低α-酮酸生成量可达到降低酿酒酵母高级醇生成量的目的。
发明内容
本发明的目的是解决酿酒酵母在酒类生产中合成乳酸乙酯能力较低以及高级醇含量较高的问题，提供一种低产高级醇高产乳酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。
为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
本发明提供三株含分泌信号肽低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，命名为α5CALBi、α5CALBn和α5CALBα。选择的分泌信号肽分别为酿酒酵母α接合因子信号肽MFα1，菊粉酶信号肽CSS和南极假丝酵母脂肪酶B信号肽nsB。高粱原料半固态白酒发酵6天后，α5CALBi乳酸乙酯含量提高了84.5％、α5CALBn提高了74.7％、α5CALBα提高了57.38％；高级醇生成量降低显著，分别为：异戊醇降低了9.5％，异丁醇降低了约50.0％，活性戊醇降低了约44.0％。
本发明所述低产高级醇高产乳酸乙酯酵母菌株的构建方法，是通过用强启动子异源分泌表达南极假丝酵母脂肪酶B基因，并同时敲除细胞质支链氨基酸转氨酶基因来实现。
所述异源表达南极假丝酵母脂肪酶B基因替换细胞质支链氨基酸转氨酶基因。
所述细胞质支链氨基酸转氨酶基因为BAT2，其Gene ID为：853613，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ NO：1所示；所述异源表达南极假丝酵母脂肪酶B基因为CALB，其GeneID为：515792，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ NO：2所示。
所述出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。
本发明低产高级醇高产乳酸乙酯酵母菌株的构建方法具体包括如下步骤：
1)将通过PCR方法获得到来源于华南理工大学赠予的质粒pMD20-T-CALB-2上的CALB基因片段连到质粒Yep-PGK上，得到三种质粒Yep-PGK-CALB(目的片段含有三种分泌信号肽序列)；
2)使用PCR方法获得来源于酿酒酵母CICC32315支链氨基酸转氨酶基因BAT2上下同源臂BA、BB；
3)使用PCR方法获得来源于三种质粒Yep-PC上的目的片段PGKp-CALBi-PGKT、PGKp-CALBn-PGKT和PGKp-CALBα-PGKT；以及来源于质粒pUG6上的抗性基因KanMX；
4)使用融合PCR方法将三种目的片段PGKp-CALB-PGKT和BA融合得到BA-PGK-CALB片段，连接到质粒pUC19后得到质粒pUC-BAPCi、pUC-BAPCn和pUC-BAPCα；
5)使用融合PCR方法将片段KanMX与BB融合得到片段KanMX-BB片段，连接三种质粒pUC-BAPC后得到pUC-BABPCiK、pUC-BABPCnK和pUC-BABPCαK；
6)制备出发酵母菌株CICC32315的单倍体，筛选出各项发酵性能综合最优的a型和α型单倍体，并以α型单倍体作为出发菌株进行以下步骤操作。
7)将通过PCR方法获得的来源于构建的三种质粒pUC-BABPCK的重组盒BA-PGK-CALBi-KanMX-BB、BA-PGK-CALBn-KanMX-BB和BA-PGK-CALBα-KanMX-BB，用醋酸锂转化法分别将其重组入酿酒酵母CICC32315α型单倍体，同源重组后得到酿酒酵母基因菌株。
高粱原料半固态白酒发酵：称取78g高粱，加入200mL 60-70℃热水，静置20min后加入液化酶85～90℃浸泡1h，充分吸水液化，115℃蒸煮20min，降温至60℃，加糖化酶水浴保温30min，静置降温到30℃后加入大曲12g和接种2％乳酸菌，培菌12h后，按500万/mL接菌量接种α5CALB酵母菌株，30℃培养发酵。
GC分析：发酵液经蒸馏后，酒样进行气相色谱分析，色谱条件为：气相色谱仪为Agilent 7890C，并且配置有Agilent G4512A自动进样器，色谱柱Agilent 1909N-213，30m×0.32mm×0.5μm毛细血管柱，检测器为FID。进样口的温度设置为200℃，检测器的温度为200℃。进样量条件：1μL的进样量，并设置为5∶1的分流比。载气为高纯度的氮气，流速设置为2.0mL/min。升温程序：起始柱温设置为50℃，保持8min，再以5℃/min的升温速度上升至120℃，保持5min。
有益效果：
1、本发明提供了一种低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，既克服了普通酿酒酵母酯化生成乳酸乙酯能力低导致的风味不协调，同时降低了对人体有不良影响的高级醇的产生量。
2、本发明提供的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母在保持良好发酵性能的前提下，完全敲除氨基酸转氨酶编码基因BAT2，同时异源高表达南极假丝酵母脂肪酶B编码基因CALB，达到了高产乳酸乙酯低产高级醇的目的，为酿造出风味优良且更有利于健康的白酒奠定了理论基础，具有广阔的市场前景。
3、本发明选育得到的酵母菌株乳酸乙酯、高级醇生成量有显著变化：高粱原料半固态白酒发酵6天后，与亲本菌株相比，乳酸乙酯含量提高了57.4％-84.5％，异戊醇降低了9.5％，异丁醇降低了约50.0％，活性戊醇降低了约44.0％。
附图说明
图1重组质粒pUC-BABPCK的构建流程示意图；
图2重组质粒pUC-BABPCK的验证电泳图；
图3重组质粒pUC-BABPCK与酵母基因组的同源重组示意图；
图4酿酒酵母构建菌株的PCR验证电泳图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒酵母菌株。
实施例1：低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株的构建
菌株主要构建过程如下：
1)pUC-BABPCK质粒的构建
以pUC-19为基础质粒构建同源重组质粒pUC-BABPCK，构建流程如图1所示(菌株构建方法基本相同)，以酿酒酵母CICC32315单倍体α5为模板使用引物BA-U(SEQ NO：3)和BA-D(SEQ NO：4)PCR扩增得到502bp的上游同源臂BA以及BB-U(SEQ NO：5)和BB-D(SEQ NO：6)501bp的下游同源臂BB。以华南理工大学赠予的pMD20-T-CALB-2质粒为模板，使用三种目的基因上游引物Ci-U(SEQNO：7)、Cn-U(SEQNO：8)、Cα-U(SEQNO：9)和下游引物C-D(SEQ NO：10)PCR扩增得到954bp的南极假丝酵母脂肪酶B基因CALB，通过Bgl II单酶切插入到Yep-PGK质粒上的启动子PGKp和终止子PGKT之间，得到三种质粒Yep-PGK-CALB；以Yep-PGK-CALB质粒为模板，使用引物PGKr-U(SEQ NO：11)和PGKr-D(SEQ NO：12)PCR扩增得到2794bp、2800bp和3012bp目的片段PGK-CALBi、PGK-CALBn和PGK-CALBa片段。使用融合PCR方法将PGK-CALB和BA进行融合得到三种片段BA-PGK-CALB，大小为3296bp、3202bp和3514bp；以pUG6质粒为模板，使用引物Kr-U(SEQ NO：13)和Kr-D(SEQ NO：14)PCR扩增获得1613bp的KanMX基因，使用融合PCR方法将KanMX和BB进行融合得到片段KanMX-BB，大小为2115bp；将三种片段 BA-PGK-CALB经Sma I酶切回收后用Solution I连接酶连接到pUC19质粒，得到质粒pUC-BAPC；然后Sph I酶切KanMX基因和质粒pUC-BAPC，用Solution I连接酶连接，构建三个重组质粒pUC-BABPCiK、pUC-BABPCnK和pUC-BABPCαK。整个过程所用引物的序列如表1。
表1 PCR引物
图2为质粒pUC-BABPCK的验证电泳图：其中泳道M为5000bp DNALadder Marker；其中图(a)泳道1-2为以受体菌为模板PCR扩增到的502bp上同源臂片断BA和501bp下同源臂BB；泳道3为以质粒pUG6为模板PCR扩增到的1613bp KanMX片段；(b)泳道1为对照片段KanMX；泳道2为融合片段KanMX-BB；(c)泳道1为以Yep-PGK-CALB为模板PCR扩增得到2794bp大小对照片段PGK-CALBi；泳道2为PGK-CALBi和BA融合为3296bp的BA-PGK-CALBi片段；泳道3为PGK-CALBn和BA融合为3302bp的BA-PGK-CALBn片段；泳道4为PGK-CALBα和BA融合为3514bp片段BA-PGK-CALBα；(d)泳道1为以三个重组质粒pUC-BABPCK为模板，分别PCR扩增得到5410bp、5416bp和5628bp条带大小的BA-PGK-CALBi-KanMX-BB、BA-PGK-CALBn-KanMX-BB和BA-PGK-CALBα-KanMX-BB同源重组片段。
2)重组酿酒酵母菌株的构建
以3个重组质粒pUC-BABPCK为模板，PCR扩增获得长达5410bp、5416bp和5628bp重组盒BA-PGK-CALB-KanMX-BB，用醋酸锂转化法分别将其转化入酿酒酵母CICC32315生孢分离获得的α型单倍体中，获得同源重组后的酿酒酵母单倍体菌株。同源重组过程如图3所示。
重组酿酒酵母单倍体的验证：
根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。引物序列为：
D1-U：TCTTTTCGTCACCGTGTCGC (SEQ NO：15)
D1-D：AATATCTGTGCGTCTTGAGTTG (SEQ NO：16)
D2-U：CGCAATCACGAATGAATAACGGT (SEQ NO：17)
D2-D：TTCGCCCAGTTAGCTGTTTG (SEQ NO：18)
分别以引物D1-U/D1-D和D2-U/D2-D进行上、下游定点PCR验证，其中上游引物D1-U/D1-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条大小1483bp的特异性条带，其大小与预期一致；下游引物D2-U/D2-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条大小1343bp的特异性条带，其大小与预期一致，受体菌α型单倍体的阴性对照无条带，说明重组盒BA-PGK-CALB-KanMX-BB片段已成功重组到酿酒酵母CICC32315单倍体基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图4所示，重组酿酒酵母验证结果。
图4中M为5000bp DNA Ladder Marker，其中(a)中泳道1为受体菌α型单倍体的阴性对照；泳道2为α5CALBi上游定点验证PCR产物；泳道3为α5CALBn上游定点验证PCR产物；泳道4为α5CALBα上游定点验证PCR产物；(b)中泳道1为受体菌α型单倍体的阴性对照；泳道2为α5CALBi下游定点验证PCR产物；泳道3为α5CALBn下游定点验证PCR产物；泳道4为α5CALBα下游定点验证PCR产物
实施例2：含菊粉酶信号肽INU菌株高粱原料半固态白酒发酵实验
1)发酵工艺路线：
高粱→浸泡→液化→糖化→冷却→拌曲、接乳酸菌→培菌12h→发酵→蒸馏
2)工艺条件：浸泡条件：60-70℃，充分吸水；蒸煮条件：115℃蒸煮30min左右；液化条件：85～90℃，耐高温α-淀粉酶，液化60min；糖化条件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20min；发酵条件：30℃，7天；蒸酒条件：100mL发酵液，加100mL水，蒸出100mL酒样。
3)配料：高粱粉：78g；加水200mL；耐高温α-淀粉酶：25μL；糖化酶：45μL；酸性蛋白酶：1.2mL；大曲5g；接种量：500万/mL。
按上述发酵工艺对酿酒酵母出发菌株α5和选育菌株α5CALBi进行半固态大曲白酒发酵实验；发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精度以及主要香气成分含量。以发酵能力、残糖浓度和产物生成量表征其综合性能，结果见表2。
表2表明：本发明所获得的酿酒酵母菌株与初始的原菌相比，高粱原料半固态白酒发酵实验时，发酵性能没有太大变化。
表2高粱原料半固态白酒发酵的发酵性能
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值
表3高粱原料半固态白酒发酵的主要风味物质
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值
表3表明：本发明所获得的酿酒酵母菌株与初始的原菌相比，高粱原料半固态白酒发酵实验时，高级醇类的正丙醇含量没有变化。与亲本菌株相比，选育的酵母菌株α5CALBi异丁醇降低了48.7％，活性戊醇降低了42.7％，异戊醇降低较少，为12.9％。对于乳酸乙酯生成量，酵母菌株α5CALBi提高了84.5％，乳酸乙酯生成量提高显著。
实施例3：含CalB自身信号肽nsB菌株高粱原料半固态白酒发酵实验
1)发酵工艺路线：
发酵工艺与实施例2中1)一致。
2)工艺条件：与实施例2中2)一致。
3)配料：与实施例2中3)一致。
按上述发酵工艺对酿酒酵母出发菌株α5和选育菌株α5CALBn进行半固态大曲白酒发酵实验；发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精度以及主要香气成分含量。以发酵能力、残糖浓度和产物生成量表征其综合性能，结果见表4。
表4高粱原料半固态白酒发酵的发酵性能
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值
表4表明：本发明所获得的酿酒酵母菌株与初始的原菌相比，高粱原料半固态白酒发酵实验时，发酵性能没有太大变化。
表5表明：本发明所获得的酿酒酵母菌株与初始的原菌相比，高粱原料半固态白酒发酵实验时，选育菌株高级醇类的正丙醇含量没有明显变化。与亲本菌株相比，选育菌株α5CALBn异丁醇降低了47.4％，活性戊醇降低了41.0％，异戊醇降低较少，为11.5％。对于乳酸乙酯生成量，酵母菌株α5CALBn提高了74.7％，乳酸乙酯生成量提高显著。
表5高粱原料半固态白酒发酵的主要风味物质
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值
实施例4：含α接合因子信号肽菌株高粱原料半固态白酒发酵实验
1)发酵工艺路线：
发酵工艺与实施例2中1)一致。
2)工艺条件：与实施例2中2)一致。
3)配料：与实施例2中3)一致。
按上述发酵工艺对酿酒酵母出发菌株α5和选育菌株α5CALBα进行半固态大曲白酒发酵实验；发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精度以及主要香气成分含量。以发酵能力、残糖浓度和产物生成量表征其综合性能，结果见表6。
表6高粱原料半固态白酒发酵的发酵性能
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值
表6表明：本发明所获得的酿酒酵母菌株与初始的原菌相比，高粱原料半固态白酒发酵实验时，发酵性能没有太大变化。
表7高粱原料半固态白酒发酵的主要风味物质
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值
表7表明：本发明所获得的酿酒酵母菌株与初始的原菌相比，高粱原料半固态白酒发酵实验时，选育菌株高级醇类的正丙醇含量没有变化。与亲本菌株相比，选育菌株α5CALBα异丁醇降低了50.9％，活性戊醇降低了45.6％，异戊醇降低较少，为13.5％。对于乳酸乙酯生成量，酵母菌株α5CALBn提高了57.4％，乳酸乙酯生成量提高显著。

Claims (6)

1.选育出的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，是在酿酒酵母出发菌株中完全敲除支链氨基酸转氨酶编码基因BAT2同时分泌表达南极假丝酵母(Pseudozyma antarctica)脂肪酶B编码基因CALB获得的。
2.如权利要求1所述的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。
3.如权利要求1所述的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株为异源分泌表达。
4.如权利要求1所述的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述BAT2基因其Gene ID为：853613，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ NO：1所示；所述CALB基因其Gene ID为：515792，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ NO：2所示。
5.选育的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株制备方法，包括以下步骤：
将目的片段CALB连接到含有PGK强启动子的质粒上；通过PCR扩增获得CALB基因和强启动子的连接片段；通过融合PCR方法将连接片段、KanMX基因、BAT2上下同源臂序列按照顺序进行融合，通过PCR扩增获得含BAT2基因同源序列的重组盒。将同源重组盒转入酵母出发菌株中，获得整合分泌表达的重组菌株。
6.如权利要求1所述的低产高级醇高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株在酒类生产中的应用。
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