CN108642095B - 一种酿酒酵母菌株高产乳酸乙酯的新途径及其应用 - Google Patents

一种酿酒酵母菌株高产乳酸乙酯的新途径及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种酿酒酵母菌株高产乳酸乙酯的新途径及其应用。通过将乳酸脱氢酶、丙酰辅酶A转移酶与醇酰基转移酶同时在酿酒酵母中异源表达来实现高产乳酸乙酯。在出发菌株中完全敲除丙酮酸脱羧酶，过表达乳酸脱氢酶，以获得一定L‑乳酸产生能力的酵母菌株；选用强启动子TEF1过表达丙酰辅酶A转移酶及强启动子PGK1过表达醇酰基转移酶，以同宗配合的基因HO作为整合位点，增加一个丙酰辅酶A转移酶的拷贝数，获得乳酸乙酯显著提高的酵母菌株，其乳酸乙酯的产量达353.1mg/L，与出发菌株相比，异戊醇降低49.9％，苯乙醇降低59.2％，满足白酒相关领域对酵母的较高要求，具有广阔的应用前景。

Description

一种酿酒酵母菌株高产乳酸乙酯的新途径及其应用
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种酿酒酵母菌株高产乳酸乙酯的新途径及其应用。
背景技术：
酯香物质是白酒中主要的风味物质，较高的酯含量不仅赋予其重要的酯香，同时能有效地扩张、松弛神经，可减少喝酒引起的副作用。乳酸乙酯则是所有香型中国白酒的重要呈香物质，适宜的乳酸乙酯含量对中国白酒的风味质量至关重要。清香型白酒酯类化合物中乳酸乙酯仅次于乙酸乙酯，乳酸乙酯和乙酸乙酯的含量和比例对白酒的风味影响很大。而对于老白干香型白酒和米香型白酒来说，乳酸乙酯含量要多于乙酸乙酯，其中老白干香型的比例为1.5-2.2:1，米香型白酒的乳酸乙酯含量≥0.3g/L，依据GB/T20825规定，老白干香型白酒乳酸乙酯/乙酸乙酯≥0.80。以茅台为代表的酱香型白酒和以汾酒为代表的浓香型白酒，其乳酸乙酯的含量分别达1.4g/L左右。因此乳酸乙酯的含量在白酒中具有重要的意义。乳酸乙酯也是醋等发酵食品的主要香气成分，产乳酸乙酯酵母的应用可以提高食醋中香气成分的含量，改善食醋香气，提高食醋质量。
大多数以纯种培养的酿酒酵母为主体微生物进行的发酵，其特点是发酵周期短、原料出酒率高，但由于酿酒酵母产酯香物质的能力极低，致使成品酒品质较差。而高档饮料酒中酯香物质含量较高的主要原因是采用自然网罗微生物制曲发酵，通过自然制曲网罗的产酯能力较强的汉逊酵母和假丝酵母以及提供产酯前体物的乳酸菌、己酸菌和霉菌等生香微生物来提高酒中各种酯的含量。一方面，这些天然的酵母和提供酯前体的微生物都不具备产乳酸乙酯的能力。另一方面，野生菌群的存在严重影响了原料出酒率，使酒精发酵效率不到酿酒酵母的三分之一，因而导致了我国高档白酒耗粮高、生产周期长、效率低、成本高。
随着白酒工业的现代化发展，酿造技术的机械化越来越受到人们的关注，清洁生产和GMP(良好生产规范)理念逐步在白酒行业应用，白酒行业将迎来重大的变革。白酒生产机械化，一些传统工艺必然改变，酿酒功能菌的生长繁殖和代谢环境及条件亦会随之而变。因此，白酒机械化必须与微生物的研发同步。作为中国白酒的基础风味物质，微生物产酯尤其是对乳酸乙酯的研究更需走在前面。构建高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，使其在发酵过程中保持优良酒精发酵特性的同时生产基础酯香物质乳酸乙酯，对于白酒产品风味特征维持与强化，对于质量提高与稳定，乃至发酵工艺改革，都具有重要意义。
白酒中酯类的生成途径有两种：一种是通过有机反应生成酯，在常温条件下极为缓慢，往往需要经几年时间才能使酯化反应达平衡；另一种就是由微生物的生化反应生成酯，这是白酒生产中产酯的主要途径。存在于酒醅中的汉逊酵母、假丝酵母等微生物，均有较强的产酯能力。近年来关于酿酒酵母产乳酸的报导非常多，Colombie等为提高乳酸脱氢酶基因ldh在菌体中的稳定性，把植物乳酸杆菌(Lactobacellus plantarum)的ldhL1整合到酿酒酵母基因组中，发酵条件优化后重组子的L-乳酸产量达50g/L，为聚乳酸的生产提供大量的前体物质。刘芳志等为了提高表达的稳定性，敲除BAT2的同时过表达南极假丝酵母脂肪酶B，通过外源添加乳酸菌进行混菌发酵，得到高级醇显著降低，乳酸乙酯显著提高的改造菌株。这些研究或者基于存在的乳酸，或者以酿酒酵母为主体的混菌发酵，并没有纯种酵母菌株发酵酿酒原料产乳酸乙酯的研究报道。但是没有在酿酒酵母产乳酸的基础上进行产乳酸乙酯改造的研究。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明将提供一种在酿酒酵母基因组上构建的全新的乳酸乙酯合成途径，及其构建方法与应用。
本发明技术方案概述如下：
本发明以酿酒酵母菌株作为出发菌株，通过将乳酸脱氢酶基因ldh、丙酰辅酶A转移酶基因Pct与醇酰基转移酶基因AAT同时异源整合到酿酒酵母基因组上，构建全新的乳酸乙酯合成途径，并通过提高丙酰辅酶A转移酶基因Pct的拷贝数进一步提高乳酸乙酯的产量，为实现纯种酿酒酵母菌株发酵酿酒原料产乳酸乙酯提供了新的方法。
本发明还提供一种高产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，是以酿酒酵母为出发菌株，过表达植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1，同时异源表达丙酰辅酶A转移酶基因Pct和醇酰基转移酶基因AAT获得的；
优选地，所述丙酰辅酶A转移酶基因Pct为双拷贝表达；
优选地，所述丙酰辅酶A转移酶基因Pct为来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctCp、真氧产碱杆菌H16的丙酰辅酶A转移酶基因PctRe、埃氏巨型球菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctMe，或热醋穆尔氏菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctMt；
更优选地，所述丙酰辅酶A转移酶基因为热醋穆尔氏菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctMt，其Gene ID为3833054，酿酒酵母密码子优化后核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ IDNO:2所示；
优选地，所述醇酰基转移酶基因AAT为来自酿酒酵母的ATF1、EHT1或EEB1基因、草莓的SAAT基因、草莓的VAAT基因、香瓜的Mel2基因或猕猴桃的AeAT9基因；
更优选地，所述所述醇酰基转移酶基因AAT为来自草莓的醇酰基转移酶基因VAAT，其对应醇酰基转移酶的Protein_ID为CAC09062.1，酿酒酵母密码子优化后核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:3所示；
进一步地，所述出发酵母菌株可以是黄酒酵母CGMCC NO2.1525，啤酒酵母W303-1A和BY-2及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315；
优选地，所述出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315；
进一步地，所述植物乳杆菌乳酸脱氢酶基因ldhL1，其Gene ID为：1061886，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示；
本发明还提供上述高产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，首先将植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1在酿酒酵母中进行异源表达，得到一定水平的产乳酸酵母菌株；其次，分别将不同来源的丙酰辅酶A转移酶基因Pct和醇酰基转移酶AAT基因进行组合，并用强启动子TEF1P和PGK1P分别对丙酰辅酶A转移酶Pct基因和醇酰基转移酶AAT基因在上述产乳酸酵母菌株中进行强表达，之后再增加一个丙酰辅酶A转移酶Pct基因拷贝数；
所述植物乳杆菌乳酸脱氢酶ldhL1基因的异源表达是通过替换酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因实现的；
所述丙酮酸脱羧酶基因为PDC1，其Gene ID为：850733；
所述丙酰辅酶A转移酶基因Pct与醇酰基转移酶AAT基因的异源过表达是通过替换转录调节因子Gal80基因实现的，Gal80基因Gene ID为：854954；
所述丙酰辅酶A转移酶Pct基因进行双拷贝时的整合位点为HO基因，其Gene ID为：851371；
所述启动子PGK1P其Gene ID为：850370，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；
所述启动子TEF1P其Gene ID为：856195，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示
所述出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。
构建方法具体包括如下步骤：
(1)产乳酸酿酒酵母菌株的构建
1)从NCBI上获取植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因序列，合成用于异源过表达的乳酸脱氢酶基因ldhL1；
2)以出发酵母菌株基因组作为模板，通过PCR方法分别获得同时作为启动子和丙酮酸脱羧酶基因PDC1上游同源臂的PA片段及丙酮酸脱羧酶基因PDC1下游同源臂PB；
3)以出发酵母菌株基因组作为模板，PCR扩增得到PGK1T终止子；
4)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到KanMX基因；
5)使用融合PCR方法将片段KanMX与PGK1T融合得到融合片段PGK1T-KanMX；
6)分别对Yep352和融合片段PGK1T-KanMX进行酶切，酶切片段PGK1T-KanMX与酶切载体Yep352连接得到质粒Yep352-PK；
7)以质粒Yep352-PK为模板，PCR扩增得到带ldhL1和PB同源区的PGK1T-KanMX；
8)制备出发酿酒酵母菌株CICC32315的单倍体，筛选出各项发酵性能综合最优的a型和α型单倍体，并以α型单倍体作为出发菌株进行以下操作；
9)PCR得到带相邻片段同源区的上述片段：PA、ldhL1、PGK1T-KanMX和PB，将PCR产物导入出发酵母菌株α型单倍体中，同源重组后得到重组菌株1；
10)用pGAPza质粒去除步骤9)获得菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX基因的重组菌株P1，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株P；
(2)两步酶法产乳酸乙酯酿酒酵母菌株的构建
1)从NCBI上分别获取丙酰辅酶A转移酶Pct基因和醇酰基转移酶AAT基因，合成并完成酿酒酵母密码子优化，分别得到包含密码子优化的Pct的pUC57-Pct质粒以及包含密码子优化的AAT的pUC57-AAT质粒；
2)以出发酵母菌株作为模板，通过PCR得到强启动子TEF1P，以质粒pUC57-Pct作为模板，通过PCR扩增得到密码子优化后的Pct片段；
3)将酿酒酵母密码子优化后的Pct与启动子TEF1P融合，得到融合片段TEF1P-Pct；
4)将步骤(1)-6)得到的质粒Yep352-PK及融合片段TEF1P-Pct分别酶切，回收后进行连接，得到质粒Yep352-TPPK(Pct)；
5)以质粒pUC57-AAT作为模板，通过PCR扩增得到密码子优化后的AAT片段；将含有PGK1P和PGK1T的质粒Yep352-PGK酶切线性化，再用重组酶将片段AAT与线性化质粒Yep352-PGK进行体外重组，得到质粒Yep352-PGK(AAT)；
6)以出发株酿酒酵母基因组作为模板，PCR扩增分别得到Gal80基因的上下同源臂GA和GB；
7)分别以质粒Yep352-TPPK(Pct)和Yep352-PGK(AAT)作为模板，PCR分别扩增得到含丙酰辅酶A转移酶Pct的TEF1P-Pct-PGK1T-KanMX及含醇酰基转移酶AAT的PGK1P-AAT-PGK1T片段；
8)将上述PCR得到的TEF1P-Pct-PGK1T-KanMX、PGK1P-AAT-PGK1T、GA和GB一起对(1)-10)得到的菌株P进行醋酸锂化学转化，同源重组后得到重组菌株2；
9)用pGAPza质粒去除上一步骤获得菌株中的KanMX基因，获得不含抗性基因，传代得到相应不含pGAPza质粒的重组菌株P-Pct-AAT。
(3)高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株的构建
1)以(2)-4)构建的质粒Yep352-TPPK(Pct)作为模板，通过PCR扩增得到含丙酰辅酶A转移酶Pct的TEF1P-Pct-PGK1T-KanMX片段；
2)以出发株酿酒酵母基因组作为模板，PCR扩增分别得到HO基因的上、下同源臂HA和HB；
3)将上述PCR得到的TEF1P-Pct-PGK1T-KanMX、HA和HB一起对(2)-9)得到的改造菌P-Pct-AAT进行醋酸锂化学转化，胞内同源重组后得到重组菌株3；
4)用pGAPza质粒去除上一步骤获得菌株中的KanMX基因，获得不含抗性基因，传代得到相应不含pGAPza质粒的重组菌株dPct-AAT。
工业应用当中应对出发酵母菌株a型单倍体作上述同样的改造，获得的重组菌与α型重组菌融合后进行应用。
所述重组菌株可通过上述方法构建，所涉及具体操作方法已有很多文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。
本发明还提供上述重组菌株的应用。
有益效果：
1、本发明提供了一种高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，既克服了普通酿酒酵母生成乳酸乙酯的能力低下，同时降低了对人体有不良影响的高级醇的产量。
2、本发明提供的高产乳酸乙酯酿酒酵母在保持良好发酵性能的前提下，敲除丙酮酸脱羧酶基因PDC1，同时异源过表达植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1，达到一定L-乳酸生产能力；以转录调节因子基因Gal80作为整合位点，同时异源高表达丙酰辅酶A转移酶基因Pct与醇酰基转移酶基因AAT，得到一定乳酸乙酯生产能力的菌株P-Pct-AAT；以同宗配合的基因HO作为整合位点，增加丙酰辅酶A转移酶的拷贝数，达到了高产乳酸乙酯的目的，为酿造出风味优良且更有利于健康的白酒奠定了理论基础，具有广阔的市场前景。
3、本发明选育得到的酵母菌株乳酸乙酯、高级醇生成量有显著变化：玉米水解液发酵5天后，亲本α型菌株基本无乳酸乙酯的产生能力，产乳酸的重组菌株P其乳酸乙酯的产量为164.14mg/L左右；同时过表达丙酰辅酶A转移酶PctMt和醇酰基转移酶VAAT的菌株P-PctMt-VAAT其乳酸乙酯的含量达217.88mg/L，在此基础上增加一个PctMt拷贝数的改造菌株dPctMt-VAAT，其乳酸乙酯的含量增加了62％，达353.1mg/L，同时高级醇的生成量显著降低，与出发菌株相比分别为：异戊醇降低了约49.9％，苯乙醇降低了约59.2％。
4、本发明选育得到的酵母菌株通过Cre/LoxP系统完全剔除了KanMX抗性基因，不含外源抗性基因，可以安全的用于工业生产，有广泛的应用前景。
附图说明：
图1为Yep352-PK质粒构建过程；
图2为质粒Yep352-PK的PCR验证：
其中：M为marker；1-3为分别以质粒Yep352-PK为模板，PCR扩增得到的PGK1T-KanMX、PGK1T和KanMX片段。
图3为胞内整合乳酸脱氢酶基因ldhL1同源重组过程；
图4为胞内整合乳酸脱氢酶基因ldhL1重组子的PCR验证：
其中：(a)中M为marker；1为以出发菌株AY12-α的基因组为模板，2为以重组菌株1基因组为模板，以D1-U/D1-D为引物，PCR扩增验证片段；
(b)中M为marker；1为以出发菌株AY12-α的基因组为模板，2为以重组菌株1的基因组为模板，以D2-U/D2-D为引物，PCR扩增验证片段。
(c)中M为marker；1为以出发菌株AY12-α的基因组为模板，2为以重组菌株1的基因组为模板，以D3-U/D3-D为引物，PCR扩增验证片段。
图5为KanMX抗性基因的丢除及pGAPza质粒的丢失验证电泳图：
其中：(a)中M为marker；1为以菌株丢KanMX前的基因组为模板，2为以丢KanMX后的基因组为模板，以Kr-U/Kr-D为引物，PCR扩增验证片段；
(b)中M为marker；1、2为以传代前的重组菌株的基因组为模板，3为以传代后的重组菌株的基因组为模板，以Zeocin-U/Zeocin-D为引物，PCR扩增验证片段；
图6为Yep352-TPPK(PctMt)质粒构建过程；
图7为质粒Yep352-TPPK(PctMt)的验证电泳图：
其中：M为marker；1-3为分别以质粒Yep352-TPPK(PctMt)为模板，PCR扩增得到的TEF1P-PctMt、PGK1T-KanMX和TEF1P-PctMt-PGK1T-KanMX片段。
图8为Yep352-PGK质粒构建过程；
图9为质粒Yep352-PGK的PCR验证电泳图：
其中：M为marker；1-2为分别以质粒Yep352-PGK为模板，PCR扩增得到的PGK1P及PGK1T片段。
图10为Yep352-PGK(VAAT)质粒构建过程；
图11为质粒Yep352-PGK(VAAT)的PCR验证电泳图：
其中：M为marker；1-2为分别以质粒Yep352-PGK(VAAT)为模板，PCR扩增得到的VAAT及PGK1P-VAAT-PGK1T片段。
图12为同时胞内整合丙酰辅酶A转移酶PctMt和醇酰基转移酶VAAT的同源重组过程；
图13为Gal80基因的敲除同时过表达丙酰辅酶A转移酶PctMt和VAAT基因重组菌株2的验证：
其中：(a)中M为marker；1为以菌株P的基因组为模板，2为以重组菌株2基因组为模板，以D4-U/D4-D为引物，PCR扩增验证片段；
(b)中M为marker；1为以菌株P的基因组为模板，2为以重组菌株2的基因组为模板，以D5-U/D5-D为引物，PCR扩增验证片段。
(c)中M为marker；1为以菌株P的基因组为模板，2为以重组菌株2的基因组为模板，以D6-U/D6-D为引物，PCR扩增验证片段。
图14为二次整合丙酰辅酶A转移酶PctMt的同源重组过程；
图15为HO基因的敲除同时二次整合丙酰辅酶A转移酶PctMt重组菌株的验证：
其中：(a)中M为marker；1为以菌株P-PctMt-VAAT的基因组为模板，2为以重组菌株3基因组为模板，以D7-U/D7-D为引物，PCR扩增验证片段；
(b)中M为marker；1为以菌株P-PctMt-VAAT的基因组为模板，2为以重组菌株3的基因组为模板，以D8-U/D8-D为引物，PCR扩增验证片段。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒酵母菌株，以下实施例所使用的酵母菌株均为酿酒酵母CICC32315。
实施例1：高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株的构建
本实例所用的出发菌株为酿酒酵母CICC32315。所述大肠杆菌DH5a购自Takara公司。所述YPD培养基为通用的完全培养基，固体培养基含2％进口琼脂粉。
本实施例以醋穆尔氏菌的丙酰CoA转移酶PctMt基因和草莓的醇酰基转移酶VAAT基因为例，构建过表达植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1，同时异源表达丙酰CoA转移酶基因和醇酰基转移酶基因的基因工程菌。
菌株主要构建过程如下：
(1)Yep352-PK质粒的构建
以Yep352为基础质粒构建质粒Yep352-PK，构建流程如图1所示。分别以酿酒酵母CICC32315的α型单倍体基因组和pUG6质粒作为模板，使用引物PGK1T-U(SEQ ID NO:6)和PGK1T-D(SEQ ID NO:7)PCR扩增得到258bp的PGK1T片段以及使用引物Kr-U(SEQ IDNO:8)和Kr-D(SEQ IDNO:9)扩增得到1613bp的KanMX基因，使用融合PCR方法将KanMX和PGK1T进行融合得到片段PGK1T-KanMX，大小为1871bp；用限制性内切酶BamHI和XbaI分别对Yep352和融合片段PGK1T-KanMX进行分步酶切，对质粒Yep352切胶回收，PGK1T-KanMX酶切回收后用连接酶进行连接，得到质粒Yep352-PK。
图2为质粒Yep352-PK的验证电泳图：其中泳道M为5000bp DNA Ladder Marker；泳道1-3分别以质粒Yep352-PK为模板，PCR扩增到的1871bp的PGK1T-KanMX片段、258bp的PGK1T片段和1613bp的KanMX片段。
(2)产乳酸酵母菌株的构建
以酵母α型单倍体菌株的基因组为模板，使用引物PA-U(SEQ ID NO:10)和PA-D(SEQ ID NO:11)PCR扩增得到1290bp的同时作为启动子和PDC1上游同源臂的PA片段以及使用引物PB-U(SEQ ID NO:12)和PB-D(SEQ ID NO:13)扩增得到519bp的下游同源臂PB；以合成的带植物乳杆菌乳酸脱氢酶ldhL1(SEQ ID NO:1所示)的质粒作为模板，使用引物ldhL1-U(SEQ ID NO:14)和ldhL1-D(SEQ ID NO:15)PCR扩增得到998bp的乳酸脱氢酶基因ldhL1；以质粒Yep352-PK作为模板，使用引物PK-U(SEQ ID NO:16)和PK-D(SEQ ID NO:17)扩增得到1871bp的PGK1T-KanMX片段。
以上PCR得到的四个片段PA、ldhL1、PGK1T-KanMX和PB用醋酸锂转化法同时转化入酿酒酵母CICC32315生孢分离获得的α型单倍体中，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母重组菌株1。同源重组过程如图3所示。
重组酿酒酵母单倍体的验证：
根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计三组上、下游引物，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组子。引物序列为：
D1-U：TGGCATCTTCACCG
D1-D：TTATTTATTTTCTAATTCAGC
D2-U：ATGCCAAATCATCAAAAAGTTG
D2-D：TAACGAACGCAGAATTTTC
D3-U：CAGCTGAAGCTTCGTACGCTGC
D3-D：TGTGCTACTACAACTGTTCAT
分别以引物D1-U/D1-D、D2-U/D2-D和D3-U/D3-D进行上中下游定点PCR验证，其中上游引物D1-U/D1-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2800bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；中游引物D2-U/D2-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2900bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；下游引物D3-U/D3-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条4000bp左右的特异性条带，其大小与预期一致，受体菌α型单倍体的阴性对照无条带，说明PA-ldhL1-PGK1T-KanMX-PB片段已成功重组到酿酒酵母CICC32315单倍体基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图4所示，为重组酿酒酵母验证结果。
图4中M为5000bp DNA Ladder Marker，其中(a)中，泳道1为出发菌α型单倍体的上游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株1上游定点验证PCR产物；(b)中泳道1为出发菌α型单倍体的中游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株1中游定点验证PCR产物；(c)中泳道1为出发菌α型单倍体的下游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株1下游定点验证PCR产物。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株1中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以基因组为模板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株1则能扩增得到该片段，PCR验证结果如图5(a)所示。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株P，提取酵母质粒，以Zeocin-F/Zeocin-R(SEQ ID NO:42/43)为引物进行PCR验证如图5(b)所示。
(3)Yep352-TPPK(PctMt)的质粒构建
以(1)步骤得到的Yep352-PK为基础质粒构建质粒Yep352-TPPK(PctMt)，构建流程如图6所示。在NCBI上找到热醋穆尔氏菌的丙酰辅酶A转移酶PctMt序列，并交由苏州金唯智公司完成酿酒酵母的密码子优化和基因合成(SEQ ID NO:2所示)。设计引物PctMt-U(SEQID NO:18)和PctMt-D(SEQ ID NO:19)PCR扩增得到1584bp的PctMt片段。以酵母α型单倍体菌株的基因组为模板，分别使用引物TEF1P-U(SEQ ID NO:20)与TEF1P-D(SEQ ID NO:21)，PCR扩增得到带PctMt同源区长度为1000bp的TEF1P片段。使用融合PCR方法将TEF1P片段与PctMt进行融合，得到大小为2584bp的TEF1P-PctMt片段。用限制性内切酶EcoRI和SmaI分别对Yep352-PK和融合片段TEF1P-PctMt进行双酶切，对质粒Yep352-PK切胶回收，片段酶切回收后用连接酶进行连接，得到质粒Yep352-TPPK(PctMt)。
图7为质粒Yep352-TPPK(PctMt)的验证电泳图：其中泳道M为5000bp DNA LadderMarker；泳道1-3分别为以质粒Yep352-TPPK(PctMt)作为模板，PCR扩增得到2584bp的融合片段TEF1P-PctMt、1871bp的PGK1T-KanMX片段和4455bp的TEF1P-PctMt-PGK1T-KanMX片段。
(4)Yep352-PGK质粒的构建
以Yep352质粒作为基础质粒构建Yep352-PGK，构建流程如图8所示。以酿酒酵母CICC32315的α型单倍体基因组为模板，设计引物PGK1P-U(SEQ ID NO:22)和PGK1P-D(SEQ IDNO:23)PCR扩增得到1496bp的PGK1P片段；设计引物PT-U(SEQ ID NO:24)和PT-D(SEQ IDNO:25)PCR扩增得到275bp的PGK1T片段。使用融合PCR方法将PGK1P和PGK1T进行融合，得到片段PGK1P-PGK1T，大小为1771bp；用限制性内切酶BamHI和SalI分别对Yep352和融合片段PGK1P-PGK1T进行酶切，对质粒Yep352切胶回收，PGK1P-PGK1T酶切回收后用连接酶进行连接，得到质粒Yep352-PGK。
图9为质粒Yep352-PGK的验证电泳图：其中泳道M为5000bp DNA Ladder Marker；泳道1，2分别以质粒Yep352-PGK为模板PCR扩增到1496bp的PGK1P和258bp的PGK1T片段。
(5)Yep352-PGK(VAAT)质粒的构建
以Yep352-PGK质粒作为基础质粒构建Yep352-PGK(VAAT)，构建流程如图10所示。在NCBI上找到草莓的VAAT基因序列，并交由苏州金唯智公司完成酿酒酵母的密码子优化和合成(SEQ ID NO:3所示)。合成的含优化片段的质粒使用引物VAAT-U(SEQ ID NO:26)和VAAT-D(SEQ ID NO:27)PCR扩增得到1368bp的VAAT片段。用限制性内切酶XhoI对Yep352-PGK质粒进行酶切，对质粒Yep352-PGK切胶回收，用诺唯赞II重组酶将片段VAAT与线性化质粒Yep352-PGK进行体外重组，得到质粒Yep352-PGK(VAAT)。
图11为质粒Yep352-PGK(VAAT)的验证电泳图：其中泳道M为5000bp DNA LadderMarker；泳道1为优化后1368bp的VAAT片段；泳道2以质粒Yep352-PGK(VAAT)为模板PCR扩增到的3105bpPGK1P-VAAT-PGK1T片段。
(6)敲除Gal80基因同时过表达丙酰辅酶A转移酶PctMt与醇酰基转移酶VAAT
以酵母α型单倍体菌株的基因组为模板，分别使用引物GA-U(SEQ ID NO:28)和GA-D(SEQ ID NO:29)PCR扩增得到563bp的上游同源臂的GA片段以及使用引物GB-U(SEQ IDNO:30)和GB-D(SEQ ID NO:31)扩增得到732bp的下游同源臂GB；以质粒Yep352-TPPK(PctMt)为模板，使用通用引物TP-U(SEQ ID NO:32)和TP-D(SEQ ID NO:33)扩增得到大小为4455bp的TEF1P-PctMt-PGK1T-KanMX片段；以质粒Yep352-PGK(VAAT)作为模板，使用引物PP-U(SEQ ID NO:34)和PP-D(SEQ ID NO:35)扩增得到3105bp的PGK1P-VAAT-PGK1T片段。以上PCR得到的四个片段GA、TEF1P-PctMt-PGK1T-KanMX、PGK1P-VAAT-PGK1T和GB用醋酸锂转化法同时转化入(2)步骤得到的产乳酸的重组菌株P，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母单倍体重组菌株2。同源重组过程如图12所示。
重组酿酒酵母单倍体的验证：
根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计三组上下游引物，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组菌株。引物序列为：
D4-U：CATCAATGTCCCTCACC；
D4-D：TTTGTAATTAAAACTTAGAT
D5-U：CAGCTGAAGCTTCGTACGCTGC
D5-D：CCGCTCGAGTTAAGAGTATGGAGATCTA
D6-U：CCGCTCGAGATGGCTTCATCTGTCAGG
D6-D：AGCACGGGTATGAAGATC
分别以引物D4-U/D4-D、D5-U/D5-D和D6-U/D6-D进行上中下游定点PCR验证，其中上游引物D4-U/D4-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2000bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；中游引物D5-U/D5-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条4500bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；下游引物D6-U/D6-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2700bp左右的特异性条带，其大小与预期一致，改造菌P的阴性对照无条带，说明GA-TEF1P-PctMt-PGK1T-KanMX-PGK1P-VAAT-PGK1T-GB片段已成功重组到酿酒酵母CICC32315单倍体基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图13所示，为重组酿酒酵母验证结果。
图13中(a)中M为5000bpDNA Ladder Marker，其中泳道1为重组菌株P的上游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株2上游定点验证PCR产物；(b)中M为5000bp DNA LadderMarker，其中泳道1为重组菌株P的中游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株2中游定点验证PCR产物；(c)中M为5000bp DNA Ladder Marker，其中泳道1为重组菌株P的下游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株2下游定点验证PCR产物。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株2中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以其基因组作为模板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株2则能扩增得到该片段。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株P-PctMt-VAAT，提取酵母质粒进行PCR验证。
(7)HO基因的敲除同时二次整合丙酰辅酶A转移酶PctMt
以酵母α型单倍体菌株的基因组为模板，分别使用引物HA-U(SEQ ID NO:36)和HA-D(SEQ ID NO:37)PCR扩增得到484bp的上游同源臂的HA片段以及HB-U(SEQ ID NO:38)和HB-D(SEQ ID NO:39)扩增得到546bp的下游同源臂HB；以质粒Yep352-TPPK(PctMt)为模板，使用通用引物TP’-U(SEQ ID NO:40)和TP’-D(SEQ ID NO:41)PCR扩增得到大小为4460bp的TEF1P-PctMt-PGK1T-KanMX片段。以上PCR得到的三个片段HA、TEF1P-PctMt-PGK1T-KanMX和HB用醋酸锂化学转化法同时转化入步骤(6)得到的重组菌株P-PctMt-VAAT，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母重组菌株3。同源重组过程如图14所示。
重组酿酒酵母单倍体的验证：
根据酿酒酵母CICC32315重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，以生长较好单倍体转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组菌株。引物序列为：
D7-U：TTGCTACTATCACCCAC
D7-D：CGCTATTATCAGCCAAAG
D8-U：CAGCTGAAGCTTCGTACGCTGC
D8-D：CGTATTTCTACTCCAGC
分别以引物D7-U/D7-D和D8-U/D8-D进行上下游定点PCR验证，其中上游引物D7-U/D7-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条900bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；下游引物D8-U/D8-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2300bp左右的特异性条带，其大小与预期一致，菌株P-PctMt-VAAT的阴性对照无条带，说明HA-TEF1P-PctMt-PGKT-KanMX-HB片段已成功重组到酿酒酵母CICC32315单倍体基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图15所示，为重组酿酒酵母验证结果。
图15中(a)中M为5000bp DNA Ladder Marker，其中泳道1为菌株P-PctMt-VAAT的上游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株3上游定点验证PCR产物；(b)中M为5000bp DNALadder Marker，其中泳道1为菌株P-PctMt-VAAT的下游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株3下游定点验证PCR产物。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株3中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以其基因组作为模板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株3则能扩增得到该片段。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株dPctMt-VAAT，提取酵母质粒进行PCR验证。整个过程所用引物的序列如表1。
表1
实施例2：不同Pct与AAT基因组合菌株的构建
本发明构建了包含各种不同来源的丙酰辅酶A转移酶和醇酰基转移酶的组合的重组菌株，分别为丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctCp、真氧产碱杆菌H16的丙酰辅酶A转移酶基因PctRe、埃氏巨型球菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctMe、热醋穆尔氏菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctMt；酿酒酵母ATF1、EHT1和EEB1基因，草莓SAAT基因、VAAT基因、香瓜Mel2基因和猕猴桃AeAT9基因，得到具有不同乳酸乙酯产生能力的改造菌株；
其中，PctCp基因对应丙酰辅酶A转移酶的Protein_ID为CAB77207.1；PctRe的GeneID:4250134；PctMe基因对应丙酰辅酶A转移酶的Protein_ID为BAU59368.1；
ATF1基因的Gene ID为：854559；EHT1基因的Gene ID为：852476；EEB1基因的GeneID为：856010；SAAT基因对应醇酰基转移酶的Protein ID为AAG13130.1；Mel2基因对应醇酰基转移酶的Protein ID为Z70521.1；AeAT9基因对应醇酰基转移酶的Protein ID为AIC83789.1；
本发明根据上述Gene ID或Protein ID进行酿酒酵母密码子偏好性优化后进行基因合成，并采用如下方法进行构建重组菌：
1)参考实施例1中Yep352-TPPK(PctMt)的质粒构建，本实施例构建了包含丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctCp、真氧产碱杆菌H16的丙酰辅酶A转移酶基因PctRe、埃氏巨型球菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctMe的质粒，分别为：Yep352-TPPK(PctCp)、Yep352-TPPK(PctRe)和Yep352-TPPK(PctMe)；
2)参考实施例1中Yep352-PGK(VAAT)质粒的构建，本发明构建了包含酿酒酵母ATF1、EHT1和EEB1基因，草莓SAAT基因，香瓜Mel2基因和猕猴桃AeAT9基因的质粒，分别为：Yep352-PGK(ATF1)、Yep352-PGK(EHT1)、Yep352-PGK(EEB1)、Yep352-PGK(SAAT)、Yep352-PGK(Mel2)和Yep352-PGK(AeAT9)；
3)使用通用引物分别扩增得到带不同丙酰辅酶A转移酶的TEF1P-Pct-PGK1T-KanMX和不同醇酰基转移酶的PGK1P-AAT-PGK1T表达盒；
4)参考P-PctMt-VAAT菌株的构建过程，将不同TEF1P-Pct-PGK1T-KanMX和PGK1P-AAT-PGK1T表达盒组合对产乳酸的重组菌株P进行转化，得到不同乳酸乙酯产生能力的改造菌株，组合及结果如下表所示：
本发明还在黄酒酵母CGMCC NO2.1525，啤酒酵母W303-1A和BY-2菌株中构建了上述乳酸乙酯合成途径，乳酸乙酯产量较仅表达乳酸脱氢酶的菌株均可达到12.5-32.7％的提升。
实施例3：高产乳酸乙酯菌株的玉米水解液发酵实验
重组菌株和出发菌株分别同时进行玉米水解液发酵实验
1)发酵工艺路线图：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷却→过滤→接菌→发酵→蒸酒→测定指标；
2)工艺条件
浸泡条件：60～70℃，浸渍20min；液化条件：85～90℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化90min；糖化条件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20h；
3)配料：玉米粉1500g，水4500mL，静置放置20min，耐高温α-淀粉酶2×104U/mL，0.9ml，糖化酶1×105U/mL，3mL。
4)培养基配置
一级种子培养基：8°Brix玉米水解液，加入0.5％的酵母浸粉，分装5mL于试管，煮沸10min以灭菌。
二级种子培养基：12°Brix玉米水解液，加入0.5％的酵母浸粉，分装45mL于150mL三角瓶，105℃灭菌15min。
发酵培养基：准备18°Brix玉米水解液，分装135mL于250mL三角瓶中，105℃灭菌15min，晾至室温后加营养盐1mL(MgSO4 150g/L、KH2PO4 75g/L、尿素81g/L，过滤，4℃保存)。
挑取出发酿酒酵母菌株ɑ、重组菌株P、重组菌株P-PctMt-VAAT和重组菌株dPctMt-VAAT酵母细胞各一环，分别接入装有5mL一级种子培养基的试管中，30℃静置培养24h，按10％接种量接种到装有45mL二级种子培养基的150mL三角瓶中，30℃静置培养16h至对数期的后期，按10％接种量接种到玉米水解液发酵培养基，30℃静置发酵。每隔12h称重1次，当两次失重小于1g，发酵结束。发酵结束后取100mL醪液，加100mL水，蒸出100mL酒样。测定CO2累积排放量、酒精度和残还原糖等发酵性能指标，结果如表2，发酵5天后，重组菌株的酒精含量和残糖含量与出发菌株相比没有明显差别，可见本例中的基因敲除和过表达的操作不会对菌株基本发酵性能有不利影响。
表2亲本菌株和重组菌株的发酵性能测定
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
5)酿酒酵母玉米水解液发酵参数的测定
采用高效液相色谱法(HPLC)测定发酵液中的乙醇和葡萄糖的含量。HPLC的检测条件：Bio-Rad HPX-87H色谱柱，流动相为5mmol/L的硫酸，流速为0.6mL/min，柱温为65℃，检测器温度为45℃，采用示差折光检测器检测。将样品稀释一定的倍数后用0.22μm的滤膜过滤，进样量为20μL。采用外标法以色谱图的峰高进行定量。所有标准曲线R2值达到0.999以上方可使用。
表3亲本菌株和重组菌株的酸和醇的产量(单位g/L)
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
由表3可知，敲除PDC1同时过表达ldhL1的重组菌中，其获得了一定的乳酸产生能力，保证为后续乳酸乙酯的产生提供足量的乳酸；与出发株CICC32315相比，乙醇的产量没有显著下降。以Gal80作为整合位点，对丙酰辅酶A转移酶PctMt和醇酰基转移酶VAAT同时过表达及以HO作为整合位点再次过表达丙酰辅酶A转移酶PctMt，酸和醇的产量没有明显变化，乳酸含量达12g/L，乙醇的产量达70g/L，表明分子改造并没有明显影响其代谢性能，保证了产酒与产酸同步进行。
6)气相色谱法测定酯和醇的产量
气相色谱仪：Agilent 7890C；色谱柱：白酒专用柱，AT.LZP-930，230℃，50m×320μm×1μm；检测器：FID检测器，检测器温度：200℃；载气：高纯氮，流速5mL/min；检测条件：程序升温，50℃保持8min，5℃/min升到120℃,保持8min；进样口温度：200℃；进样量：1.0μL；分流方式：分流，分流比为10：1。
结果如表4，对酵母菌株进行产乳酸改造，菌株P母获得一定的乳酸乙酯产生能力，乳酸乙酯的产量达164.14mg/L；同时，引入两步酶催化反应后，重组菌株P-PctMt-VAAT的乳酸乙酯产量得到提高，达217.mg/L，与重组菌株P相比，提高了近33％；进一步提高PctMt的拷贝数得到重组菌株dPctMt-VAAT，其乳酸乙酯含量达353mg/L，较菌株P-PctMt-VAAT提高了近62％，较菌株P提高了近115％；主要高级醇(异丁醇、异戊醇、正丙醇、苯乙醇)含量为155.6mg/L，较出发菌株降低了约39.5％。
表4亲本菌株和重组菌株的高级醇和酯产量(单位mg/L)
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种酿酒酵母菌株高产乳酸乙酯的新途径及其应用
<130> 1
<141> 2018-05-18
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 954
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌()
<400> 1
atgccaaatc atcaaaaagt tgtgttagtc ggcgacggcg ctgttggttc tagttacgct 60
tttgccatgg cacaacaagg aattgctgaa gaatttgtaa ttgtcgatgt tgttaaagat 120
cggacaaagg gtgacgccct tgatcttgaa gacgcccaag cattcaccgc tcccaagaag 180
atttactcag gcgaatattc agattgtaag gacgctgact tagttgttat tacagccggt 240
gcgcctcaaa agcctggtga atcacgttta gacttagtta acaagaattt aaatatccta 300
tcatccattg tcaaaccagt tgttgactcc ggctttgacg gcatcttctt agttgctgct 360
aaccctgttg acatcttaac ttacgctact tggaaattct caggtttccc aaaggatcgt 420
gtcattggtt cagggacttc cttagactct tcacgtttac gcgttgcgtt aggcaaacaa 480
ttcaatgttg atcctcgttc cgttgatgct tacatcatgg gtgaacacgg tgattctgaa 540
tttgctgctt actcaactgc aaccatcggg acacgtccag ttcgcgatgt cgctaaggaa 600
caaggcgttt ctgacgaaga tttagccaag ttagaagacg gtgttcgtaa caaagcttac 660
gacatcatca acttgaaggg tgccacgttc tacggtatcg ggactgcttt aatgcggatt 720
tccaaagcca ttttacgtga tgaaaatgcc gttttaccag taggtgccta catggacggc 780
caatacggct taaacgacat ttatatcggg actccggctg tgattggtgg aactggtttg 840
aaacaaatca tcgaatcacc actttcagct gacgaactca agaagatgca agattccgcc 900
gcaactttga aaaaagtgct taacgacggt ttagctgaat tagaaaataa ataa 954
<210> 2
<211> 1584
<212> DNA
<213> 热醋穆尔氏菌( Moorella thermoacetica)
<400> 2
atgagaaggc cttcattcat gacaggtgaa gaggctgcaa aattgatttt cgacggtgca 60
gtcattgctt cagttggtat gactttggtt tcagcttctg aagaaatatt aaagggaatt 120
gaaaagaggt tcttggagac tggtcatcca agaaatttaa cattaattca ttctgcaggt 180
caatcaaata gagatagagg tattcaacat tatgctcacg aaggtttagt tactagaatt 240
attggttctc actggggttt acaaccaagg tggatggaaa tgatttcaaa taacaaagtt 300
gaagcttatt gcatgcctca gggtcagttg gctcagatat acaggtctgt cgcttgtgga 360
cagcctggta aattaacaaa aataggattg ggtactttcg tcgaccctag gattgagggt 420
ggtaaaatga acgaaagaac aaaacctttg gaagatttgg ttgaagtcgt tacattggat 480
ggtgaagagt acttgttgta taaaatacct ccaattgatt tcgttattat aagaggtact 540
actgcagatg agaacggtaa cattactact gaggaggagg gtatgaagtt ggaggtcttg 600
ccagcagtct tagcagctaa gagattcggt ggtaaggttt tgtgccaggt caaaagggtc 660
gctcaagctc acacattgca cccaaagcaa gtcgtcgttc caggtgtctt cgttgacgct 720
attgtcgtct gccagaaccc agatgaagac cacaggcaga catcatcttg ggtcttcgac 780
ccagcttatt gcggtgactt gagagtccca gtctctagaa ttgaaccatt gccattaaat 840
ataagaaagg ttattggtag gagagcaatg atggagttag agcctgatgc aattattaat 900
ttgggtactg gtattccaaa cgatgtcgtc ggtccaatag cagctgaaga aggtattttg 960
gatgacatta ctattactgt cgagtctggt gtctacggtg gtattcctgc tggtggtatt 1020
gatttcggta ttgctaaaaa tacagatgct ttgataaggc acgacgacca gttcgatttc 1080
tacacaggtg caggtgtcga cttcactttt atgggtgctg gtgaaatgga cgctaatggt 1140
aatgtcaacg ctactaagat gggttctaga gctgctggtg ctggaggttt catagacatt 1200
actcaaggtg caaagcatgt tattttttgt tctactttca caacaggtgg attgaaggtc 1260
gacttcgtcg acggtaaggt caagattttg caggaaggtt ctattaagaa attagttaag 1320
caagttcaac aaatttcatt ctcaggtttg ttggcaagac aaaagaaaca aaaagttcat 1380
tttattacag agagagctgt cttcgaattg caggaagacg gtccagtctt ggtcgagatt 1440
gcaccaggaa ttgacttgga aaaagatgtt ttaaatcaaa tggagttcag gccaagaatt 1500
gctgagcctt taagggtcgg tgatccttgc atttacaatc aaggaaaata cggtttgaag 1560
gaaattattt cagctaaaaa ataa 1584
<210> 3
<211> 1368
<212> DNA
<213> 草莓 Fragaria vesca()
<400> 3
atgaacaaaa ttgaagtttc aattatttct aagcatacaa ttaaaccatc tacatcttct 60
tcaccattac agccatataa attgacattg ttggatcaat tgactccacc atcttacgtc 120
ccaatggtct tcttctatcc aataactggt ccagctgttt tcaatttgca aactttggca 180
gatttaaggc atgcattgtc tgaaacttta acattgtatt atccattatc tggtagagtc 240
aaaaataatt tgtatattga cgacttcgag gagggtgtcc catatttaga agctagggtt 300
aactgtgata tgaacgattt tttaagattg cctaaaatag aatgtttaaa tgaatttgtt 360
ccaattaagc cattttctat ggaagctatt tctgatgaaa gatacccatt gttgggtgtt 420
caagttaata ttttcaactc tggtatagca attggtgttt cagtttcaca taaattgatt 480
gatggaagaa cttctgattg ttttttaaag tcttggtgcg ctgttttcag gggttctaga 540
gataaaatta ttcatccaaa cttgtctcaa gcagctttgt tgtttccacc aagagatgat 600
ttaccagaaa agtatgcaag acagatggaa ggtttgtggt tcgtcggtaa gaaggtcgct 660
actaggaggt tcgtcttcgg tgctaaggct atatctgtca ttcaggatga ggctaagtct 720
gagtctgtcc caaagccatc tagggtccag gctgtcacat ctttcttatg gaaacatttg 780
attgctactt ctagagcttt gacttcaggt actacatcta ctagattgtc tattgcaaca 840
caagtcgtta atattagatc aagaagaaat atggaaactg tttgggataa cgcaattggt 900
aacttgattt ggttcgctcc agctattttg gaattatctc acacaacttt agaaatatct 960
gatttgaagt tatgtgattt agttaactta ttgaatggtt ctgttaaaca atgtaacggt 1020
gattacttcg aaactttcat gggtaaggaa ggttatggat ctatgtgcga atatttggat 1080
tttcaaagga caatgtcatc tatggaacca gctccagaaa tttacttgtt tacttcatgg 1140
actaacttct ttaatcaatt ggattttggt tggggtagga catcttggat tggtgttgct 1200
ggtaaaattg aatctgcttt ttgcaattta acaactttgg tcccaactcc atgcgacaca 1260
ggtattgagg cttgggtcaa tttggaggag gagaagatgg ctatgttgga gcaggaccca 1320
cagtttttgg ctttggcttc tcctaagact ttgatatcta gatattaa 1368
<210> 4
<211> 1479
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeCICC32315)
<400> 4
tctaactgat ctatccaaaa ctgaaaatta cattcttgat taggtttatc acaggcaaat 60
gtaatttgtg gtattttgcc gttcaaaatc tgtagaattt tctcattggt cacattacaa 120
cctgaaaata ctttatctac aatcatacca ttcttataac atgtcccctt aatactagga 180
tcaggcatga acgcatcaca gacaaaatct tcttgacaaa cgtcacaatt gatccctccc 240
catccgttat cacaatgaca ggtgtcattt tgtgctctta tgggacgatc cttattaccg 300
ctttcatccg gtgatagacc gccacagagg ggcagagagc aatcatcacc tgcaaaccct 360
tctatacact cacatctacc agtgtacgaa ttgcattcag aaaactgttt gcattcaaaa 420
ataggtagca tacaattaaa acatggcggg cacgtatcat tgcccttatc ttgtgcagtt 480
agacgcgaat ttttcgaaga agtaccttca aagaatgggg tctcatcttg ttttgcaagt 540
accactgagc aggataataa tagaaatgat aatatactat agtagagata acgtcgatga 600
cttcccatac tgtaattgct tttagttgtg tatttttagt gtgcaagttt ctgtaaatcg 660
attaattttt ttttctttcc tctttttatt aaccttaatt tttattttag attcctgact 720
tcaactcaag acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc 780
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 840
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 900
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 960
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 1020
tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 1080
cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 1140
agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 1200
ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 1260
cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 1320
atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 1380
tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 1440
aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaac 1479
<210> 5
<211> 999
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeCICC32315)
<400> 5
tcatcggtat cttcgctata ttctttttag tcgaatttgc ggggagaaga tggatctatg 60
ctaaactaaa taggcatttg aaaaacgacg acgagttaca cgacatatcg ccatctttaa 120
atgagcaacc acactgggac ctcatagagg acgggtctcg ctggagtaaa tttttcaacg 180
ggataattaa gacgacaaga aggttcacga aatctttaat gaggtcttta gtcagaggca 240
ggaacagccg tcaagggggc ataagactac ggtcatcccc atctgcctct tcgtccagcc 300
ttgccaacag ggagttcttc agagacatgg aggctcaaaa cgaaattatt gacagcctag 360
acatcaatag tcatacaaca gaaagcgacc acccaacttt ggctgataat agcgtataaa 420
caatgcatac tttgtacgtt caaaatacaa tgcagtagat atatttatgc atattacata 480
taatacatat cacataggaa gcaacaggcg cgttggactt ttaattttcg aggaccgcga 540
atccttacat cacacccaat cccccacaag tgatccccca cacaccatag cttcaaaatg 600
tttctactcc ttttttactc ttccagattt tctcggactc cgcgcatcgc cgtaccactt 660
caaaacaccc aagcacagca tactaaattt cccctctttc ttcctctagg gtgtcgttaa 720
ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa aagagaccgc ctcgtttctt tttcttcgtc 780
gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt tctttttctt gaaaattttt ttttttgatt 840
tttttctctt tcgatgacct cccattgata tttaagttaa taaacggtct tcaatttctc 900
aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt acaacttttt ttacttcttg ctcattagaa 960
agaaagcata gcaatctaat ctaagtttta attacaaaa 999
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cgcggatccc gatagatcaa tttttttc 28
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
gcgtacgaag cttcagctgt aacgaacgca gaattttc 38
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
gaaaattctg cgttcgttac agctgaagct tcgtacgctg c 41
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ctagtctaga gcataggcca ctagtggat 29
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
cgggatccct tccgctttgc catt 24
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
acacaacttt ttgatgattt ggcattttga ttgatttgac tgtgttattt 50
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
tatcagatcc actagtggcc tatgcacttt cccaaacaac acct 44
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
ggaattccgt tggtagcagc agtc 24
<210> 14
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
aaataacaca gtcaaatcaa tcaaaatgcc aaatcatcaa aaagttg 47
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gaaaaaaatt gatctatcgt tatttatttt ctaattcagc 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
gctgaattag aaaataaata acgatagatc aatttttttc 40
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
taccgtaggt gttgtttggg aaagtgcata ggccactagt ggat 44
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
atctaatcta agttttaatt acaaaatgag aaggccttca ttcatg 46
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
tccccccggg ttatttttta gctgaaataa t 31
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
ccggaattct catcggtatc ttcgc 25
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
ctgtcatgaa tgaaggcctt ctcattttgt aattaaaact tagat 45
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
cgggatcctc taactgatct atccaaaact ga 32
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
gagatctgga attccgatct tgttttatat ttgttg 36
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
gaattccaga tctcctcgag ggatctgcga tagatcaat 39
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
acgcgtcgac gtaacgaacg cagaattttc 30
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
ggaattccag atctcctcga gatgaacaaa attgaagttt c 41
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
atctatcgca gatccctcga gttaatatct agatatcaa 39
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
tcaagataca gaacctcctc 20
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
aagaatatag cgaagatacc gatgacatta ggcacggttg a 41
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
taactcgaaa attctgcgtt cgttaaaatg gcggttggta c 41
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
gtggagccca tcatgttac 19
<210> 32
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
tcttcggtct caaccgtgcc taatgtcatc ggtatcttcg c 41
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
ttcagttttg gatagatcag ttagagcata ggccactagt ggatc 45
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
tatcagatcc actagtggcc tatgctctaa ctgatctatc caaaac 46
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 35
ttcgtagccg taccaaccgc cattttaacg aacgcagaat tttcg 45
<210> 36
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 36
gggcgttatt aggtgt 16
<210> 37
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 37
aagaatatag cgaagatacc gatgattcta cgcctgggat c 41
<210> 38
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 38
tatcagatcc actagtggcc tatgcgggaa caacttcaca gaatg 45
<210> 39
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 39
gcacctgcgt tgtta 15
<210> 40
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 40
ggtaggttag atcccaggcg tagaatcatc ggtatcttcg c 41
<210> 41
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 41
caaaacattc tgtgaagttg ttcccgcata ggccactagt ggatc 45
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 42
atcgtcgacc ccacacacca tagcttca 28
<210> 43
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 43
gcggtcgaca gcttgcaaat taaagcctt 29

Claims (9)

1.一种酿酒酵母高产乳酸乙酯的方法，其特征在于，通过将乳酸脱氢酶基因ldh、丙酰辅酶A转移酶基因Pct与醇酰基转移酶基因AAT同时在酿酒酵母中异源表达来实现；
所述乳酸脱氢酶基因为来自植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1，其Gene ID为：1061886，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示；
所述乳酸脱氢酶ldh基因的异源表达是通过替换酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因PDC1实现的。
2.一株高产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，以酿酒酵母为出发菌株，通过过表达乳酸脱氢酶基因ldh，同时异源表达丙酰辅酶A转移酶基因Pct和醇酰基转移酶基因AAT获得，所述丙酰辅酶A转移酶基因Pct为单拷贝表达或双拷贝表达；
所述乳酸脱氢酶基因为来自植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1，其Gene ID为：1061886，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示；
所述乳酸脱氢酶ldh基因的异源表达是通过替换酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因PDC1实现的。
3.如权利要求2所述的一株高产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述所述丙酰辅酶A转移酶基因Pct为来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctCp、真氧产碱杆菌H16的丙酰辅酶A转移酶基因PctRe或来自埃氏巨型球菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctMe；
其中，PctCp基因对应丙酰辅酶A转移酶的Protein_ID为CAB77207.1；PctRe的Gene ID:4250134；PctMe基因对应丙酰辅酶A转移酶的Protein_ID为BAU59368.1。
4.如权利要求2所述的一株高产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述所述丙酰辅酶A转移酶基因Pct为来自热醋穆尔氏菌的丙酰辅酶A转移酶基因PctMt，其GeneID为3833054，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:2所示。
5.如权利要求2所述的一株高产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述醇酰基转移酶基因AAT为来自酿酒酵母的ATF1、EHT1或EEB1基因、草莓的SAAT基因、香瓜的Mel2基因或猕猴桃的AeAT9基因；
其中，ATF1基因的Gene ID为：854559；EHT1基因的Gene ID为：852476；EEB1基因的GeneID为：856010；SAAT基因对应醇酰基转移酶的Protein ID为AAG13130.1；Mel2基因对应醇酰基转移酶的Protein ID为Z70521.1；AeAT9基因对应醇酰基转移酶的Protein ID为AIC83789.1。
6.如权利要求2所述的一株高产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述所述醇酰基转移酶基因AAT为来自草莓的醇酰基转移酶基因VAAT，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:3所示。
7.如权利要求2所述的一株高产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。
8.如权利要求2所述的一株高产乳酸乙酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，其特征在于，构建步骤如下：
(1)产乳酸酿酒酵母菌株的构建
以酿酒酵母为出发菌株，异源过表达乳酸脱氢酶基因ldh；
所述乳酸脱氢酶ldh基因的异源表达是通过替换酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因PDC1实现的；
(2)两步酶法产乳酸乙酯酿酒酵母菌株的构建
用强启动子TEF1P和PGK1P分别对丙酰辅酶A转移酶基因Pct和醇酰基转移酶基因AAT在上述产乳酸酵母菌株中进行强表达；
所述丙酰辅酶A转移酶基因Pct与醇酰基转移酶基因AAT的异源过表达是通过替换转录调节因子Gal80基因实现的；
丙酰辅酶A转移酶基因Pct进行二次拷贝表达时的整合位点为HO基因。
9.权利要求2所述高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株在酿酒过程中高产乳酸乙酯中的应用。
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