CN110373341B

CN110373341B - 一种具有低产高级醇性能的啤酒酵母菌株及其构建方法

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Publication number: CN110373341B
Application number: CN201910669531.2A
Authority: CN
Inventors: 肖冬光; 王亚平; 孙中贯; 张翠英; 陈叶福; 杜丽平; 郭学武
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-07-24
Filing date: 2019-07-24
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2039-07-24
Also published as: CN110373341A

Abstract

本发明公开了一种具有低产高级醇性能的啤酒酵母菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域，本发明低产高级醇酿酒酵母菌株是通过调控啤酒酵母的生物素合成途径，敲除啤酒酵母出发菌株中具有促进啤酒酵母生物素合成功能的编码生物素合成的前体物质的基因全序列实现的，具体基因为基因为编码7,8‑二氨基‑壬酸氨基转移酶的BIO3基因和编码8‑氨基‑7‑氧壬酸乙酯载体蛋白的BIO5基因。所述低产高级醇啤酒酵母菌株在以小麦为原料的发酵培养基中发酵后，较亲本菌株的高级醇总量分别降低了16.85％和23.55％。本发明的菌株发酵性能及生长性能良好，未出现影响重组菌株生长性能或其他情况。

Description

一种具有低产高级醇性能的啤酒酵母菌株及其构建方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，具体涉及一种具有低产高级醇性能的啤酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术

啤酒中的风味物质主要有高级醇类、酯类、醛类等。其中，高级醇是形成啤酒风味和口感的重要的化学物质之一。适宜的高级醇含量具有使啤酒口感和香气丰满，酒体柔和协调的作用，但过量的高级醇是啤酒异杂味的主要来源，过量的正丙醇似醚臭、有苦味；过量的丁醇会构成啤酒典型的杂醇油臭味，同时产生不愉快的苦味；若戊醇超标则有腐败味和汗臭味；2-苯乙醇接近阈值时，有酯类的酸味，色醇和对羟基苯乙醇的含量超过8mg/L时，会产生强烈的酚味。

因而，在啤酒酿造过程中，应尽量控制高级醇类物质的形成。当前国内大部分啤酒生产厂家采用的是下面发酵法酿制小麦啤酒，由此而酿造的小麦啤酒在口味上不能很好的表现出其应有的特色，更接近于纯大麦啤酒。而上面发酵法酿制的小麦啤酒在口感及风味方面上更加具备国外传统意义上的小麦啤酒的具体特征。因此，发展上面发酵小麦啤酒已成为我国啤酒产业亟需解决的重大问题。而发展上面发酵小麦啤酒，首先要解决的就是高级醇含量过高的问题。小麦啤酒的高级醇含量一般高达300mg/L左右甚至更高，为大麦啤酒的三倍以上，饮后副作用明显，这是阻遏小麦啤酒发展的主要原因之一。工业上为了降低小麦啤酒中高级醇含量通常会增加酵母接种量，但是过高的酵母接种量会使酵母过早的进入衰亡期，发酵提前终止，这将导致啤酒发酵不充分，发酵度降低，严重影响啤酒风味物质的形成和品质；另一种方式是调节发酵麦汁中营养物质成分，发酵麦汁中，如缺乏镁盐、泛酸等营养物质时，酵母生长受到抑制，这也会导致发酵不充分，不仅影响啤酒产量，还会影响啤酒的品质。

文章《Function and regulation of yeast genes involved in higheralcohol and ester metabolism during beverage fermentation》中报道，高级醇能够抑制神经中枢，对交感神经和视觉神经等产生伤害，其麻醉作用要强于乙醇，其中，丙醇的毒性是乙醇的8.5倍，异丁醇为乙醇的8倍，异戊醇是乙醇的19倍；同时高级醇在人体内分解氧化速度慢，代谢停留时间长；这些因素导致了饮用高级醇含量过高的啤酒会引起饮用者口渴、头痛等症状，这也是导致饮用啤酒醉酒较慢、醉酒后较难醒酒的主要原因。过量的高级醇是啤酒异杂味的主要来源，过量的正丙醇似醚臭、有苦味；过量的丁醇会构成啤酒典型的杂醇油臭味，同时产生不愉快的苦味；若戊醇超标则有腐败味和汗臭味；高级醇类物质及其与乙酸反应生成的代谢衍生物，主要有乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯等，以及乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等酯类物质的含量和比值(醇酯比，高级醇与酯类含量之比)对啤酒的风味具有极其重要的影响和贡献。

啤酒中高级醇的代谢途径有两种：酿酒酵母合成高级醇的代谢途径主要有两条：一条是α-酮酸分解代谢途径称为埃尔利希途径，即氨基酸分解代谢途径；另一条为α-酮酸合成代谢途径称为哈里斯途径，即高级醇合成代谢途径。已有很多相关的报道针对这两条途径对高级醇的代谢进行调控，例如Park等以亮氨酸营养缺陷型LEU2基因缺失突变株为出发菌株，在敲除ALD6、BAT1基因的基础上过表达基因ILV2、ILV3、ILV5、ARO10、ADH2、LEU2、LEU3、LEU4，构建的突变株异戊醇的生成量较出发菌株提高了34倍。Eden等发现，编码氨基转移酶的BAT2基因缺失突变株对异丁醇和异戊醇生成量有较大的影响。这些育种大多是围绕下面发酵酵母进行的，而针对小麦啤酒所用的上面发酵酵母高级醇代谢相关基因的改造与育种却鲜有报道。现代小麦啤酒发酵中有很多工艺方法来降低高级醇含量，比如杨小兰在啤酒发酵中通过调整加糖浆方式降低高级醇含量，但是在实际的生产中，不同批次间调控效果差异较大，效果并不理想。因此关注酿酒酵母菌种，选育出具有适宜高级醇生成量的优良菌株是调控高级醇合成的最根本途径。

发明内容

本发明的目的是解决啤酒酵母菌株在小麦啤酒生产中产生高级醇较高的问题，通过调控啤酒酵母的生物素合成途径，构建低产高级醇的啤酒酵母菌株。

为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

本发明提供了一种通过敲除啤酒酵母出发菌株中具有促进啤酒酵母生物素合成功能的编码生物素合成的前体物质的基因全序列，获得低产高级醇的啤酒酵母菌株。

进一步地，所述基因为编码7,8-二氨基-壬酸氨基转移酶的BIO3基因。

进一步地，所述基因为编码8-氨基-7-氧壬酸乙酯载体蛋白的BIO5基因。

其中BIO3基因编码的7,8-二氨基-壬酸氨基转移酶能够催化s-腺苷蛋氨酸的脱氨反应，该酶在酿酒酵母氮代谢和信号转导中起关键作用。BIO5基因介导7- 酮-8-氨基壬酸的转运，7-酮-8-氨基壬酸是酿酒酵母合成生物素的必要前体物质。 BIO3和BIO5基因参与啤酒酵母生物素的合成途径，协同调控生物素的合成代谢。

所述BIO3基因其Gene ID为：855795，核苷酸序列见序列表中SEQ NO:1 所示。

所述BIO5基因，其Gene ID为：855793，核苷酸序列见序列表中SEQ NO:2 所示。

优选地，所述啤酒酵母出发菌株具体为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17，保藏编号为No.CICC1929。

本发明的另一目的是提供所述低产高级醇的啤酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)以所述出发菌株啤酒酵母的基因组为模板，扩增得到具有促进生物素合成功能的编码生物素合成的前体物质的基因的上、下游序列；

(2)将步骤(1)所述基因的上、下游序列的DNA分子以及标记基因KanMX 转化至所述出发菌株中，得到重组菌株；

(3)采用Cre-LoxP报告基因挽救系统剔除所述重组菌株中的KanMX抗性基因，并丢失以此引入的pSH-Zeocin质粒；

(4)二倍体工业菌株重复步骤(1)-(3)。

进一步地，所述低产高级醇的啤酒酵母菌株的构建方法，是通过敲除所述 BIO3基因来实现的，包括如下步骤：

(1)以所述出发菌株啤酒酵母的基因组为模板，扩增得到BIO3基因的上、下游序列；

(2)将BIO3基因的上、下游序列的DNA分子以及标记基因KanMX转化至所述出发菌株中，得到重组菌株；

(3)采用Cre-LoxP报告基因挽救系统剔除重组后的基因工程菌中的KanMX 抗性基因，并丢失以此引入的pSH-Zeocin质粒；

(4)二倍体工业菌株重复步骤(1)-(3)。

更进一步地，所述低产高级醇的啤酒酵母菌株的构建方法，具体步骤如下：

1)以所述出发菌株啤酒酵母的基因组为模板，PCR扩增BIO3基因的上、

下游同源序列；

2)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到含有KanMX标记基因的PCR产物；

3)通过醋酸锂化学转化法，将步骤1)和2)获得的PCR产物转化到所述出发菌株中，用G418抗性平板筛选转化子，挑选在G418抗性平板上生长的转化子进行PCR验证，筛选获得阳性转化子，得到重组菌株S17-Δbio3；

4)利用Cre/loxP报告基因挽救系统，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到所述步骤3)的重组菌株中，PCR验证筛选得到剔除KanMX抗性标记的转化子，得到重组菌株S17-Δbio3-k。

5)将步骤4)所得重组菌株进行传代培养，以丢弃其中游离的pSH-Zeocin质粒，选取第4-5代及以上代数的菌株，从中提取酵母质粒并以此为模板，用引物进行PCR扩增，验证筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，得到重组菌株S17-Δbio3-k-p；

6)将步骤5)筛选获得的菌株进行第二个等位基因的敲除：

利用所述步骤3)中方法向所述步骤5)中得到的重组菌株中导入利用所述步骤1)和2)方法所获得的重组片段，筛选得第二个等位基因缺失的重组工业菌株，并按照所述步骤4)和5)方法去除KanMX抗性基因并丢弃pSH-Zeocin 质粒，得到一株双敲除BIO3基因的重组菌株S17-DΔbio3-k-p。

进一步地，所述步骤2)中，是以质粒pUG6为模板，以BIO3K-F(如SEQ NO:5所示)和BIO3K-R(如SEQ NO:6所示)为引物对PCR扩增GAT1基因一个等位敲除的oxP-KanMX3-loxP片段。

进一步地，所述低产高级醇的啤酒酵母菌株的构建方法，是通过敲除所述 BIO5基因来实现的，包括如下步骤：

(1)以所述出发菌株啤酒酵母的基因组为模板，扩增得到BIO5基因的上、下游序列；

(2)将BIO5基因的上、下游序列的DNA分子以及标记基因KanMX转化至所述出发菌株中，得到重组菌株；

(4)二倍体工业菌株重复步骤(1)-(3)。

1)以所述出发菌株啤酒酵母的基因组为模板，PCR扩增BIO5基因的上、

下游同源序列；

3)通过醋酸锂化学转化法，将步骤1)和2)获得的PCR产物转化到所述出发菌株中，用G418抗性平板筛选转化子，挑选在G418抗性平板上生长的转化子进行PCR验证，筛选获得阳性转化子，得到重组菌株S17-Δbio5；

4)利用Cre/loxP报告基因挽救系统，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到所述步骤3)的重组菌株中，PCR验证筛选得到剔除KanMX抗性标记的转化子，得到重组菌株S17-Δbio5-k。

5)将步骤4)所得基因工程菌株进行传代培养，以丢弃其中游离的pSH-Zeocin 质粒，选取第4-5代及以上代数的菌株，从中提取酵母质粒并以此为模板，用引物进行PCR扩增，验证筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，得到重组菌株S17-Δbio5-k-p；

6)将步骤5)筛选获得的菌株进行第二个等位基因的敲除：

利用步骤3)中所述方法向所述步骤5)中得到的菌株中导入利用所述步骤 1)和2)方法所获得的重组片段，筛选得第二个等位基因缺失的重组工业菌株，并按照所述步骤4)和5)方法去除KanMX抗性基因并丢弃pSH-Zeocin质粒，得到一株双敲除BIO3基因的重组菌株S17-DΔbio5-k-p。

进一步地，所述步骤2)中，是以质粒pUG6为模板，以BIO5K-F(如SEQ NO:29所示)和BIO5K-R(如SEQ NO:30所示)为引物对PCR扩增GAT1基因一个等位敲除的loxP-KanMX5-loxP片段。

本发明的另一目的是提供所述低产高级醇的啤酒酵母菌株的用途。

优选地，所述低产高级醇的啤酒酵母菌株在啤酒发酵中的用途。

本发明中，所述啤酒酵母S17来源于文章：Sun Z G,Wang M Q,Wang Y P, etal.Identification by comparative transcriptomics of core regulatory genes forhigher alcohol production in a top-fermenting yeast at different temperaturesin beer fermentation[J].2019.

所述pSH-Zeocin质粒来源于文章：Li W,Chen S J,Wang J H,et al.Geneticengineering to alter carbon flux for various higher alcohol productions bySaccharomyces cerevisiae for Chinese Baijiu fermentation[J].AppliedMicrobiology and Biotechnology,2018.(第4页表格中)

有益效果：

1.本发明提供的低产高级醇啤酒酵母菌株能够在保持良好发酵性能的前提下，抑制7,8-二氨基壬酸酸氨基转移酶和8-氨基-7-氧壬酸乙酯载体蛋白的表达，调控酵母代谢中生物素合成途径，达到了降低高级醇的效果，为酿造风味良好，口感独特的小麦啤酒奠定了理论基础。

2.本发明选育得到的酵母高级醇生成量降低。在经过小麦啤酒发酵后，原始菌株S17的高级醇生成量是296.0mg/L，本发明得到的双敲除BIO3基因的重组菌株S17-DΔbio3-k-p的高级醇生成量为272mg/L，相比较亲本菌株降低了 8.11％。本发明得到的双敲除BIO5基因的重组菌株S17-DΔbio5-k-p的高级醇生成量为226.3mg/L，相比较亲本菌株降低了23.55％。

本发明的菌株发酵性能及生长性能良好，未出现影响重组菌株生长性能或其他情况。此外该菌株除高级醇以外的其他风味物质的含量基本并未受到影响，完好地保留了啤酒中的风味物质。

特别地，本发明中双敲除BIO3基因的重组菌株S17-DΔbio3-k-p即实现了在降低高级醇的同时提升了酯类物质的含量，显著提高了啤酒的风味。

附图说明

图1为S17-DΔbio3-k-p同源重组菌株构建流程图；

图2为BIO3A、BIO3B、loxP-KanMX3-loxP片段的电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以酿酒酵母S17基因组为模板，BIO3A-F和BIO3A-R为引物对PCR扩增的结果(656bp单一条带)；2泳道是以酿酒酵母S17基因组为模板，BIO3B-F和BIO3B-R为引物对PCR扩增的结果(771bp单一条带)；3泳道是以质粒pUG6基因组为模板，BIO3K-F和 BIO3K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)；

图3为构建成功的酵母菌株S17-Δbio3的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以重组菌株S17-Δbio3的基因组为模板，BIO3-M1-U与BIO3-M1-D为引物对PCR扩增得到的片段(1357bp 单一片段)；2泳道是以重组菌株S17-Δbio3的基因组为模板，BIO3-M2-U与 BIO3-M2-D为引物对PCR扩增得到的片段(1814bp单一片段)；3泳道是以S17 的基因组为模板，BIO3-M1-U与BIO3-M1-D为引物对PCR扩增得到的结果；4 泳道是以S17基因组为模板，BIO3-M2-U与BIO3-M2-D为引物对PCR扩增得到的结果；

图4为S17-Δbio3剔除KanMX抗性基因重组菌株的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以重组菌株S17-Δbio3的基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2 泳道是以S17-Δbio3-k基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图5为S17-Δbio3-k菌株丢弃pSH-Zeocin质粒重组菌株的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以pSH-Zeocin质粒为模板， Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2泳道是以 S17-Δbio3-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图6为DBIO3A、DBIO3B、D-loxP-KanMX3-loxP片段的电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以酿酒酵母S17基因组为模板，DBIO3A-F和DBIO3A-R为引物对PCR扩增的结果(481bp单一条带)；2 泳道是以酿酒酵母S17基因组为模板，DBIO3B-F和DBIO3B-R为引物对PCR 扩增的结果(450bp单一条带)；3泳道是以质粒pUG6基因组为模板，DBIO3K-F 和DBIO3K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)；

图7为成功敲除BIO3第二个等位基因的酵母菌株验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以重组菌株S17-DΔbio3的基因组为模板，DBIO3-M1-F与DBIO3-M1-R为引物对PCR扩增得到的片段(1396 bp单一片段)；2泳道是以S17-Δbio3-k的基因组为模板，DBIO3-M1-F与 DBIO3-M1-R为引物对PCR扩增得到的结果；3泳道是以重组菌株S17-DΔbio3 的基因组为模板，DBIO3-M2-F与DBIO3-M2-R为引物对PCR扩增得到的片段 (1328bp单一片段)；4泳道是以S17-Δbio3-k基因组为模板，DBIO3-M2-F与 DBIO3-M2-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图8为S17-DΔbio3菌株剔除KanMX抗性基因的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以重组菌株S17-DΔbio3的基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)； 2泳道是以S17-DΔbio3-k基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图9为S17-DΔbio3-k菌株丢弃pSH-Zeocin质粒的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以pSH-Zeocin质粒为模板， Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2泳道是以 S17-DΔbio3-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图10为S17-DΔbio5-k-p同源重组菌株构建流程图；

图11为BIO5A、BIO5B、loxP-KanMX5-loxP片段的电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以酿酒酵母S17基因组为模板，BIO5A-F和BIO5A-R为引物对PCR扩增的结果(674bp单一条带)；2泳道是以酿酒酵母S17基因组为模板，BIO5B和BIO5B为引物对PCR扩增的结果(432bp单一条带)；3泳道是以质粒pUG6基因组为模板，BIO5K-F和BIO5K-R 为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)；

图12为构建成功的酵母菌株S17-Δbio5的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以重组菌株S17-Δbio5的基因组为模板，BIO5-M1-U与BIO5-M1-D为引物对PCR扩增得到的片段(1418bp 单一片段)；2泳道是以重组菌株S17-Δbio5的基因组为模板，BIO5-M2-U与 BIO5-M2-D为引物对PCR扩增得到的片段(1574bp单一片段)；3泳道是以S17 的基因组为模板，BIO5-M1-U与BIO5-M1-D为引物对PCR扩增得到的结果；4 泳道是以S17基因组为模板，BIO5-M2-U与BIO5-M2-D为引物对PCR扩增得到的结果；

图13为S17-Δbio5剔除KanMX抗性基因重组菌株的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以重组菌株S17-Δbio5的基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2 泳道是以S17-Δbio5-k基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图14为S17-Δbio5-k丢弃pSH-Zeocin质粒重组菌株的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2泳道是以 S17-Δbio5-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图15为DBIO5A、DBIO5B、D-loxP-KanMX5-loxP片段的电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以酿酒酵母S17基因组为模板，DBIO5A-F和DBIO5A-R为引物对PCR扩增的结果(471bp单一条带)；2 泳道是以酿酒酵母S17基因组为模板，DBIO5B-F和DBIO5B-R为引物对PCR 扩增的结果(463bp单一条带)；3泳道是以质粒pUG6基因组为模板，DBIO5K-F 和DBIO5K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)；

图16为成功敲除BIO5第二个等位基因的酵母菌株验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以重组菌株S17-DΔbio5的基因组为模板，DBIO5-M1-F与DBIO5-M1-R为引物对PCR扩增得到的片段(1224 bp单一片段)；2泳道是以S17-Δbio5-k的基因组为模板，DBIO5-M1-F与 DBIO5-M1-R为引物对PCR扩增得到的结果；3泳道是以重组菌株S17-DΔbio5 的基因组为模板，DBIO5-M2-F与DBIO5-M2-R为引物对PCR扩增得到的片段 (815bp单一片段)；4泳道是以S17-Δbio5-k基因组为模板，DBIO5-M2-F与 DBIO5-M2-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图17为S17-DΔbio5菌株剔除KanMX抗性基因的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000DNA marker；1泳道是以重组菌株S17-DΔbio5的基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)； 2泳道是以S17-DΔbio5-k基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图18为S17-DΔbio5-k菌株丢弃pSH-Zeocin质粒的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以pSH-Zeocin质粒为模板， Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2泳道是以 S17-DΔbio5-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果。

图19为重组菌株的发酵工艺路线图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所使用的啤酒酵母是可以采用任何来源的啤酒酵母菌株。

实施例1：双敲除BIO3基因的啤酒酵母菌株的构建

出发菌株啤酒酵母S17通过同源重组的方法构建重组基因工程菌株。

根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述实施例1 中各引物。

表1双敲除BIO3基因所需PCR引物

重组菌株主要构建过程如下(S17-DΔbio3-k-p同源重组菌株构建流程图参照附图1)：

1)BIO3基因一个等位基因敲除所需片段的扩增

以啤酒酵母S17的基因组为模板，BIO3A-F和BIO3A-R为引物对PCR扩增BIO3基因敲除所需的上游同源序列BIO3A片段，长度为656bp；以啤酒酵母S17的基因组为模板，以BIO3-F和BIO3-R为引物对PCR扩增BIO3基因敲除所需的下游同源序列BIO3B片段，长度为771bp；以质粒pUG6为模板，以 BIO3K-F和BIO3K-R为引物对PCR扩增BIO3基因敲除的所需的loxP-KanMX3-loxP片段，长度为1663bp，其中BIO3A、BIO3B、loxP-KanMX3-loxP 片段的电泳图参照附图2。

2)BIO3基因一个等位基因敲除重组酵母菌株的构建

将扩增得到的三个片段进行PCR纯化回收后，用醋酸锂转化法将其转化到啤酒酵母菌株中，挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。

3)BIO3基因一个等位基因敲除重组酵母菌株的验证

根据啤酒酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：BIO3-M1-U，BIO3-M1-D，BIO3-M2-U，BIO3-M2-D，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到1356bp条带(核苷酸序列如 SEQ NO:51所示)，下游验证得到1814bp条带(核苷酸序列如SEQ NO:52所示)，说明三个片段已成功整合到啤酒酵母菌株S17中，即S17中BIO3的一个等位基因被成功敲除，命名为S17-Δbio3，其验证电泳图参照附图3所示。

4)重组菌株S17-Δbio3中KanMX抗性基因的剔除

将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到步骤3)得到的重组菌株中，涂布于含100μg/mL的Zeocin抗性YEPD平板上，30℃避光培养36h。挑取长势较好个头较大的菌落，接种于YEPD液体培养基中，用酵母质粒提取试剂盒提取质粒后，PCR验证pSH-Zeocin是否导入成功。将已成功导入pSH-Zeocin质粒的重组菌株接入到半乳糖诱导液态培养基中培养4-5h，然后稀释涂布在普通YEPD 平板上。挑出单菌落点接于不含抗性的YEPD平板上，再影印到含有G418抗性的YEPD培养基上。在YEPD上生长而在含有G418的平板上不生长即为所得到的菌株。提取酵母基因组，并利用引物K-F和K-R通过PCR验证KanMX抗性基因无条带。说明S17-Δbio3菌株剔除KanMX抗性基因成功。命名为 S17-Δbio3-k，其验证电泳图参照附图4所示。

5)重组菌株S17-Δbio3-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃

将已剔除KanMX抗性基因的重组菌株S17-Δbio3-k接种于装有新鲜YEPD 液体培养基的试管中，每12h转接一次，转接次数一般为7～9次。提取转接培养后的酵母基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F和Zn-R为引物，对重组菌株进行PCR验证，与未传代转化子对照，通过PCR验证筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-Δbio3-k-p，其验证电泳图参照附图5所示。

6)BIO3基因第二个等位基因敲除所需片段的扩增

以啤酒酵母S17的基因组为模板，以DBIO3A-F和DBIO3A-R为引物，PCR 扩增BIO3基因第二个等位敲除所需的上游同源序列DBIO3A片段，长度为481 bp。以啤酒酵母S17的基因组为模板，以DBIO3B-F和DBIO3B-R为引物，PCR 扩增BIO3基因第二个等位敲除所需的下游同源序列DBIO3B片段，长度为450 bp。以质粒pUG6为模板DBIO3K-F和DBIO3K-R为引物，PCR扩增BIO3基因第二个等位敲除所需的D-loxP-KanMX3-loxP片段，长度为1663bp，其中DBIO3A、DBIO3B、D-loxP-KanMX3-loxP片段的电泳图参照附图6所示。

7)BIO3基因第二个等位基因敲除重组酵母菌株的构建

通过醋酸锂化学转化法，将BIO3基因第二个等位敲除所需的上游同源序列DBIO3A片段、下游同源序列DBIO3B片段和D-loxP-KanMX3-loxP片段转化重组菌株S17-Δbio3-k-p中。挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。

8)BIO3基因第二个等位基因敲除重组酵母菌株的验证

根据酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：DBIO3-M1-U/DBIO3-M1-D和DBIO3-M2-U/DBIO3-M2-D，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到1397bp条带(核苷酸序列如 SEQ NO:53所示)，下游验证得到1328bp条带(核苷酸序列如SEQ NO:54所示)，说明三个片段已成功整合到重组菌株S17-Δbio3-k-p中，且整合位置正确。即出发菌株S17中BIO3的第二个等位基因被成功敲除，命名为S17-DΔbio3，其验证电泳图参照附图7所示。

9)重组菌株S17-DΔbio3中KanMX抗性基因的剔除

利用Cre/loxP报告基因挽救系统，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到含有KanMX抗性基因的酿酒酵母菌株阳性转化子S17-DΔbio3中，按照步骤4) 中方法，以K-F和K-R为引物，通过PCR验证筛选获得剔除KanMX抗性标记的转化子，命名为S17-DΔbio3-k，其验证电泳图如图8所示。

10)重组菌株S17-DΔbio3-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃

通过多次转接传代培养丢失游离的pSH-Zeocin质粒。提取经多次转接传代后的重组菌株S17-DΔbio3-k的基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F 和Zn-R为引物，通过PCR验证，筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-DΔbio3-k-p，其验证电泳图如图9所示。

实施例2：双敲除BIO5基因的啤酒酵母菌株的构建

根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述实施例2 中各引物。

表2双敲除BIO5基因所需PCR引物

重组菌株主要构建过程如下(S17-DΔbio5-k-p同源重组菌株构建流程图参照附图10所示)：

1)BIO5基因一个等位基因敲除所需片段的扩增

以啤酒酵母S17的基因组为模板，BIO5A-F和BIO5A-R为引物对PCR扩增 BIO5基因敲除所需的上游同源序列BIO5A片段，长度为674bp；以啤酒酵母 S17的基因组为模板，以BIO5-F和BIO5-R为引物对PCR扩增BIO5基因敲除所需的下游同源序列BIO5B片段，长度为432bp；以质粒pUG6为模板，以 BIO5K-F和BIO5K-R为引物，PCR扩增BIO5基因敲除的所需的loxP-KanMX5-loxP片段，长度为1663bp，其中BIO5A、BIO5B、loxP-KanMX5-loxP 片段的电泳图参照附图11所示。

2)BIO5基因一个等位基因敲除重组酵母菌株的构建

3)BIO5基因一个等位基因敲除重组酵母菌株的验证

根据啤酒酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：BIO5-M1-U，BIO5-M1-D，BIO5-M2-U，BIO5-M2-D，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到1418bp条带(核苷酸序列如 SEQ NO:55所示)，下游验证得到1574bp条带(核苷酸序列如SEQ NO:56所示)，说明三个片段已成功整合到啤酒酵母菌株S17中，即S17中BIO5的一个等位基因被成功敲除，命名为S17-Δbio5，其验证电泳图参照附图12所示。

4)重组菌株S17-Δbio5中KanMX抗性基因的剔除

将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到步骤3)得到的重组菌株中，涂布于含100μg/mL的Zeocin抗性YEPD平板上，30℃避光培养36h。挑取长势较好个头较大的菌落，接种于YEPD液体培养基中，用酵母质粒提取试剂盒提取质粒后，PCR验证pSH-Zeocin是否导入成功。将已成功导入pSH-Zeocin质粒的重组菌株接入到半乳糖诱导液态培养基中培养4-5h，然后稀释涂布在普通YEPD 平板上。挑出单菌落点接于不含抗性的YEPD平板上，再影印到含有G418抗性的YEPD培养基上。在YEPD上生长而在含有G418的平板上不生长即为所得到的菌株。提取酵母基因组，并利用引物K-F和K-R通过PCR验证KanMX抗性基因无条带。说明S17-Δbio5菌株剔除KanMX抗性基因成功。命名为 S17-Δbio5-k，其验证电泳图参照附图13所示。

5)重组菌株S17-Δbio5-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃

将已剔除KanMX抗性基因的重组菌株S17-Δbio5-k接种于装有新鲜YEPD 液体培养基的试管中，每12h转接一次，转接次数一般为7～9次。提取转接培养后的酵母基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F和Zn-R为引物，对重组菌株进行PCR验证，与未传代转化子对照，通过PCR验证筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-Δbio5-k-p，其验证电泳图参照附图14所示。

6)BIO5基因第二个等位基因敲除所需片段的扩增

以啤酒酵母S17的基因组为模板，以DBIO5A-F和DBIO5A-R为引物，PCR 扩增BIO5基因第二个等位敲除所需的上游同源序列DBIO5A片段，长度为471 bp。以啤酒酵母S17的基因组为模板，以DBIO5B-F和DBIO5B-R为引物，PCR 扩增BIO5基因第二个等位敲除所需的下游同源序列DBIO5B片段，长度为463 bp。以质粒pUG6为模板DBIO5K-F和DBIO5K-R为引物，PCR扩增BIO5基因第二个等位敲除所需的D-loxP-KanMX5-loxP片段，长度为1663bp，其中DBIO5A、DBIO5B、D-loxP-KanMX5-loxP片段的电泳图参照附图15所示。

7)BIO5基因第二个等位基因敲除重组酵母菌株的构建

通过醋酸锂化学转化法，将BIO5基因第二个等位敲除所需的上游同源序列DBIO5A片段、下游同源序列DBIO5B片段和D-loxP-KanMX5-loxP片段转化重组菌株S17-Δbio5-k-p中。挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。

8)BIO5基因第二个等位基因敲除重组酵母菌株的验证

根据酵母重组位点两端的基因序列和插入的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：DBIO5-M1-U/DBIO5-M1-D和DBIO5-M2-U/DBIO5-M2-D，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到1224bp条带(核苷酸序列如 SEQ NO:57所示)，下游验证得到815bp条带(核苷酸序列如SEQ NO:58所示)，说明三个片段已成功整合到重组菌株S17-Δbio5-k-p中，且整合位置正确。即出发菌株S17中BIO5的第二个等位基因被成功敲除，命名为S17-DΔbio5，其验证电泳图参照附图16所示。

9)重组菌株S17-DΔbio5中KanMX抗性基因的剔除

利用Cre/loxP报告基因挽救系统，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到含有KanMX抗性基因的酿酒酵母菌株阳性转化子S17-DΔbio5中，按照步骤4) 中方法，以K-F和K-R为引物，通过PCR验证筛选获得剔除KanMX抗性标记的转化子，命名为S17-DΔbio5-k，其验证电泳图参照附图17所示。

10)重组菌株S17-DΔbio5-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃

通过多次转接传代培养丢失游离的pSH-Zeocin质粒。提取经多次转接传代后的重组菌株S17-DΔbio5-k的基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F 和Zn-R为引物，通过PCR验证，筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-DΔbio5-k-p，其验证电泳图参照附图18所示。

实施例3：重组菌株S17-DΔbio3-k-p、S17-DΔbio5-k-p小麦啤酒发酵实验

1)发酵工艺路线图(参照附图19所示)：

2)工艺条件：粉碎条件：粉碎度以没有整粒的小麦麦芽为宜，粉碎程度不易过细，以免造成过滤压力过大；液化、糖化条件：粉碎后的小麦麦芽以料水比 1:4的比例加入30℃的温水，充分搅拌均匀后，放置于恒温水浴锅中，30℃保持30min，以2.0℃/min升温至65℃，保持90min，迅速升温至78℃，保持 10min。糖化过程中每隔5min充分搅拌一次；过滤条件：糖化后的小麦麦芽汁趁热过滤，并用75℃的热水洗糟3次；煮沸条件：将过滤液放置于电磁炉上蒸煮，沸腾后40min加入3‰的苦味酒花(以麦芽重量计)，煮沸时间为70min；冷却条件：自然冷却至室温；离心条件：4000r/min离心5min；麦汁浓度调整条件：调整糖度为12°P；灭菌条件：115℃灭菌20min。

3)配料：小麦麦芽：500g；加水2000mL；酒花1.5g；酵母接种量：10％ w/v，于20℃静置发酵。。

按上述发酵工艺对啤酒酵母出发菌株S17和选育菌株S17-DΔbio3-k-p以及 S17-DΔbio5-k-p菌株进行小麦啤酒发酵实验；发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵96h时，出发菌株S17和选育菌株S17-DΔbio3-k-p以及 S17-DΔbio5-k-p菌株的失重不再减小，认为发酵结束，停止培养；；测定发酵液的失重、酒精度、残糖、真正发酵度以及主要香气成分含量。以失重、酒精度、残糖、真正发酵度表征其综合性能，结果见表3。主要香气成分含量结果见表4。

4)GC分析测定高级醇和酯含量：发酵液经蒸馏后，酒样进行气相色谱分析，色谱条件为：毛细管色谱柱LZP-930，50m×320μm×1.0μm，载气为纯度为99.99％的氮气，分流比1:10。进样口温度200℃，检测器温度200℃，进样量1μL。采用程序升温，50℃保持8min，5℃/min升温，升温至150℃，保持 15min。为保持数据的准确性，每个样品进样两次，取平均值。在同一色谱条件下，用已知的高级醇类和酯类标准品色谱峰的保留时间与样品中高级醇类物质色谱峰的保留时间对照进行分析。

表3表明：小麦啤酒发酵实验时，本发明所获得的啤酒酵母菌株与初始的原菌相比，发酵性能没有太大变化。这说明本发明中分别双敲除BIO3基因和双敲除BIO5基因，没有对啤酒酵母S17的发酵性能产生影响。

表3小麦原料啤酒发酵的发酵性能

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值

表4表明：就各个高级醇的生成量来看，与原始菌株S17相比，重组菌株 S17-DΔbio3-k-p除正丙醇和异戊醇之外的几种高级醇生成量均有明显降低；重组菌株S17-DΔbio5-k-p的各个高级醇含量均有明显下降。就总高级醇生成量来看，原始菌株S17的高级醇生成量是296.0mg/L，本发明得到的双敲除BIO3基因的重组菌株S17-DΔbio3-k-p的高级醇生成量为246.1mg/L，相比较亲本菌株降低了 16.85％。本发明得到的双敲除BIO5基因的重组菌株S17-DΔbio5-k-p的高级醇生成量为226.3mg/L，相比较亲本菌株降低了23.55％。这说明本发明得到的菌株可以在很大程度上降低小麦啤酒酒中高级醇的含量，为优化啤酒口感，提供了理论基础。

表4小麦原料啤酒发酵的主要香气成分含量(mg/L)

针对此次试验三株菌株酿造的小麦啤酒进行了感官品评(评委由本实验室四位啤酒专家组成)，表5表明：与原始菌株S17相比，本发明得到的双敲除BIO3 基因的重组菌株S17-DΔbio3-k-p和双敲除BIO5基因的重组菌株S17-DΔbio5-k-p 通过上面发酵制得的小麦啤酒的口感有明显提高，饮后上头现象得到改善。这说明本发明得到的菌株可以在很大程度上优化啤酒口感。

表5：小麦原料啤酒发酵的品评结果

此外经测定，啤酒酵母S17所产乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量分别为27.5mg/L 以及5.5mg/L，总量为33mg/L。本发明中双敲除BIO3基因的重组菌株 S17-DΔbio3-k-p的乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量分别为29.9mg/L以及5.2mg/L，总量为35.1mg/L，较出发菌株S17提高了6.42％。本发明中双敲除BIO5基因的重组菌株S17-DΔbio3-k-p的乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量与出发菌株S17含量相近，并无明显差异。需要说明的是小麦啤酒的醇酯比过高会对啤酒的口感产生不好的影响，一方面在适当降低高级醇的生成量，可显著提升啤酒的口感，在此基础上，如能继续保持或者提高酯类物质含量会更进一步地提高啤酒的口感。

本发明中双敲除BIO5基因的重组菌株S17-DΔbio5-k-p即实现了在降低高级醇的基础上，保持了酯类(乙酸乙酯、乙酸异戊酯)的产量，由此说明通过基因的敲出没有对重组菌株中除高级醇以外的其他风味物质(如酯类物质)的含量产生影响，完好地保留了啤酒中的风味物质。

而本发明中双敲除BIO3基因的重组菌株S17-DΔbio3-k-p即实现了在降低高级醇的同时提升了酯类物质的含量，显著提高了啤酒的风味。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种具有低产高级醇性能的啤酒酵母菌株及其构建方法

<130> 2019

<141> 2019-07-24

<160> 58

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1443

<212> DNA

<213> 啤酒酵母 S17()

<400> 1

atgtcccaag aaatttcata tacaccagat gtcgcggaac tgctagactt tgataaaaaa 60

catatttggc atccttatac gtcattgagt tcaccattga acgtttatcc ggtaaagagt 120

gctcacggat gcaagctggt gttggatacc gactcaccag tggacgtcga ggtgatcgac 180

gccatgtcgt cgtggtggtg tgttattcac gggtacaata atccagaact aaatgaggcc 240

cttaccaagc agatgttaaa gttttctcac gtccttcttg gtggattcac ccataaagga 300

gctgtgaatc tagtccaaaa acttttaaaa gtgattgatg aaccctcttt gcagtactgt 360

ttcctcgcag attctggctc agtagcagtg gaagtagctt tgaagatggc tttacaatca 420

aacatgtcag gggaagctac taaaaataga acaaagtttt tgacaatcaa gaacgggtat 480

catggtgata catttggcgc tatgagtgtt tgtgatcctg agaattctat gcatcatatc 540

tacaacgatc gactcagtga gaacatcttc gcccaagctc cctctattgt cgatggcctt 600

ccaaccagcc agaacggttt cgaggaccat tggaatgcag aagaagttac cgatctcaag 660

aagcaatttg aattgcatag tgataagatc tgtgctgtga ttttggagcc tatcttacag 720

ggtgcaggag gtttgcgacc ataccatcca cagttcttaa tcgaagttca gaaactatgt 780

aaccaatacg acgttttatt catcatggac gagattgcta caggatttgg tagaacaggt 840

gagattttcg cattcaagca ctgtcaaaaa taccaggacc aacatggcat cagtccttcc 900

gatcagatca aagttgttcc tgacatattg tgcgttggga agggcttaac cagtggatat 960

atgactatga gtgcagtggt agtcaacgac aaagttgctt ccagaatctc ttctccaaat 1020

agccctactg gtggctgctt catgcatggc cccaccttca tgggcaatgc cctggcatgc 1080

agtgtggcag aaaagtctat ggatatacta ctgcgtggcg agtggagaaa acaagtgtct 1140

gcaattgaaa accaaattta tagagaacta taccagtaca tcaagaaccc agataatggg 1200

ctcattggaa ctgttgttaa gcgtgtgtca gttattggag ctgtaggtat cgtagagcta 1260

tacaagaaga cagatcccga gtggttccag aaaaagttta tatccaaggg agtacatatc 1320

cgacctttca actgcctgtg ttacattatg ccaccatatg tgatcacgac agaggaattg 1380

acgaaggtta atcaagtctt gattgaagta ttacatgagt ggaaatccca cataaaccaa 1440

tga 1443

<210> 2

<211> 1686

<212> DNA

<213> 啤酒酵母 S17()

<400> 2

atgaacagag taggggcagt gttcctattt gtatatgaaa gaaatttttt tttgtctatt 60

gttccagatc gtcacaggac ggaaataaga atgtctagtt cagaaaggtc agaagtcaag 120

tttgacaagc actttaattg gtggtcccta ttaggtatcg cgttctcatt aagttgctca 180

tgggtcggta tctcagcgtc gatggccgtt ggtattgcca gtggagggcc actgcttatc 240

atctatgggt tgataattgc tgcttttttc agtctcatgt gtggtatatc tctgggagat 300

tttgctgcta tcctgccaaa cagcagcggt ggttcatttt gggttcttaa aatgttggaa 360

caagaatcag tcactttgaa aacccctgag tacgaggacc cttctgacga tgatgaagaa 420

gtgttcctcg agaattattg tcaaactttc aacgtggaag tttcttctaa atttcaaaag 480

gtttcttcca tggttgtagg gttgctgaac tatttcggtg ccatttttac taccgcaagt 540

atctgctcat ctttgtcaat gagctgtatc ggtattcata agttgttgca tccggactac 600

gagttaaagc actggcatgt ttttgtgggt tacgagtgta tcaatgccgt tttgacactt 660

ttcaacattt attcaactcc gttgccctat atctctcagt ttgggctcta tacgtctcta 720

ttgtctttcg ccatgacttt cattatttgt attgtttcaa gatctgacaa caccgtagac 780

ccatggccca aagcttctaa tatatttggg agctttgata atcaaacagg ctggaattcg 840

tctggaatgg cgtttgttgt cggtttggtc aatccgatct gggcatttgt tggcattgac 900

tctgctacgc acatgattga tgaagtgggt tatagtaagt cacgtttctt agttcccaaa 960

gttattatca ctaccatcat tgtgggcttt gtaactagtt ttatttattg cgttggtttg 1020

tttttctgca tcactgacca aacggcagtc gttgagtcta ttttacctat cgtagaaata 1080

ttttaccagg ccactggtaa taggaatctc agtgtcttcc tgcaatgtat gtgtatcaca 1140

acaggttttg tttcaggcat tgcaagtgga acctggcaaa gtcgaatcct ccaatcattc 1200

gggaaaagtt acgcaccatt ttataaagag ggttccttgg gaaacaaatc cttgaagaag 1260

ctagcagtgt tgacacctgg gtttaagtct ccattatatg cccatttttt gtcacaaata 1320

tgtgtaacga taattggctg tatatttatg ggatctagta ccgctttcaa cgcaattatc 1380

actgcatgca tcaccctgtt actaatgtcg tacgcagttc cttcttttat attcctgttc 1440

gttattaaaa aggaaaaatt cattcataga atcgagagtg acgtaaattg tgtcagcagg 1500

cctaaccgtc gtcgtatgtc tatgattcct catattatat gtattctatg gaccttgttc 1560

tgcctggtat ttttatcttt cccatataca ctaccggtta ctgcaggaaa catgaattac 1620

acctcagtag tgtatgcagt agttttctgc attatcagca tcgttgtttt ccctacatgc 1680

atctaa 1686

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ctcaagccat tatcgcaaag 20

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cctgcagcgt acgaagcttc agctgaatcc cgctggtagt tcg 43

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cgaactacca gcgggattca gctgaagctt cgtacgctgc agg 43

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgtgaatagt tactgcgggc ataggccact agtggatctg ata 43

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tatcagatcc actagtggcc tatgcccgca gtaactattc aca 43

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ctcctggtca cgtaagat 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gtcaacagcg caattcgt 18

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

cctgcagcgt acgaagcttc agctgtaaag ccatcttcaa agc 43

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

gctttgaaga tggctttaca gctgaagctt cgtacgctgc agg 43

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

ggtttatgtg ggatttccgc ataggccact agtggatctg ata 43

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

tatcagatcc actagtggcc tatgcggaaa tcccacataa acc 43

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

agcctataat atcccatct 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

acattcttat ttccgtcctg 20

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

cagtggcaaa tcctaacc 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

atttcgtctc gctcaggc 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ttccgatacg ctcattac 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

tgtctcggag tcaccttg 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

cgatagattg tcgcacct 18

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

atttcgtctc gctcaggc 18

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

tagttactgc ggataggt 18

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

cagctgaagc ttcgtacgc 19

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

gcataggcca ctagtggatc tg 22

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

cccacacacc atagcttca 19

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

agcttgcaaa ttaaagcctt 20

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

ggcgaggtct ttagttta 18

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

cctgcagcgt acgaagcttc agctgatcga aagtcctggt caa 43

<210> 29

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

ttgaccagga ctttcgatca gctgaagctt cgtacgctgc agg 43

<210> 30

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

ttgcaaggct ttcatcaggc ataggccact agtggatctg ata 43

<210> 31

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

tatcagatcc actagtggcc tatgcctgat gaaagccttg caa 43

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

ttggtcgtag aaggagcc 18

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

tttgtgcagt tgagatag 18

<210> 34

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

cctgcagcgt acgaagcttc agctgttcta tggaccttgt tct 43

<210> 35

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

agaacaaggt ccatagaaca gctgaagctt cgtacgctgc agg 43

<210> 36

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

ggttgtaggg ttgctgaagc ataggccact agtggatctg ata 43

<210> 37

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

tatcagatcc actagtggcc tatgcttcag caaccctaca acc 43

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

tcacaggacg gaaataag 18

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

cggatttagt gtttacttg 19

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

gtttatgttc ggatgtgat 19

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

gactaaactg gctgacgg 18

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

tggaaagctg catactgg 18

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

ctgcttgacc aggacttt 18

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

atggtcggaa gaggcata 18

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

atgcgtcaat cgtatgtg 18

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

cacaatgtac tacggcac 18

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

cagctgaagc ttcgtacgc 19

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

gcataggcca ctagtggatc tg 22

<210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

cccacacacc atagcttca 19

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 50

agcttgcaaa ttaaagcctt 20

<210> 51

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 51

acattcttat ttccgtcctg tgacgatctg gaacaataga caaaaaaaaa tttctttcat 60

atacaaatag gaacactgcc cctactctgt tcataccatg ctacttatat atagctgatg 120

aaagccttgc aactttttta tttaaactat tctacgtctt gttgggtcat taatgactcc 180

accgatggca gttcatgcaa ctccatatcc tgatcatgtg ccgtagtaca ttgtgcaacc 240

tgtgccataa tattgacacc gaacttcttc agggcctgca cgttgccttc attcggttcc 300

ccattgagaa tgaccccaaa aaggtggctt ctcaagccat tatcgcaaag atgattccaa 360

gtcagcaatg tatgattcag agtccctagc ccgctgcgtg ccacgacaac tacgtacact 420

ggatggccgc tagtctcaat cagatgttta attagatccg tcgtaatttc caatttacga 480

gtgataggaa cgcaaacccc gccggctcct tctacgacca atggattctc tgcgctccac 540

tcttcaggaa ctacgaaatc caacaacctg atgtcgacat taggttcgta ctccatggcc 600

tggagcggag atagaggctt ctgcagcgca taagtgggcg tgaatatagg tggttgccaa 660

gttgatgcgg ctattttgaa atttttcaat gtctcggagt caccttgatc tgactcaatt 720

ccagtttgta cgggtttcca gtatgcagct ttccatttgt gtaccaataa tgttgataca 780

aaggttttac caacatcagt gtctgtaccg gtgacgaata caattggttg ttgttcttgt 840

tgttgagatt tgctgttcat gacctgtgcg ctagtgattt tttgagttct tttcactggc 900

ctacttgtgg aaaaaagtat atctctttat atacttcagt aaacgaacta ccagcgggat 960

tcagctgaag cttcgtacgc tgcaggtcga caacccttaa tataacttcg tataatgtat 1020

gctatacgaa gttattaggt ctagagatct gtttagcttg cctcgtcccc gccgggtcac 1080

ccggccagcg acatggaggc ccagaatacc ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca 1140

ggggcatgat gtgactgtcg cccgtacatt tagcccatac atccccatgt ataatcattt 1200

gcatccatac attttgatgg ccgcacggcg cgaagcaaaa attacggctc ctcgctgcag 1260

acctgcgagc agggaaacgc tcccctcaca gacgcgttga attgtcccca cgccgcgccc 1320

ctgtagagaa atataaaagg ttaggatttg ccactg 1356

<210> 52

<211> 1814

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 52

atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt 60

tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataagctttt 120

gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt 180

tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata 240

ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg 300

gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat 360

gctcgatgag tttttctaat cagtactgac aataaaaaga ttcttgtttt caagaacttg 420

tcatttgtat agttttttta tattgtagtt gttctatttt aatcaaatgt tagcgtgatt 480

tatatttttt ttcgcctcga catcatctgc ccagatgcga agttaagtgc gcagaaagta 540

atatcatgcg tcaatcgtat gtgaatgctg gtcgctatac tgctgtcgat tcgatactaa 600

cgccgccatc cagtgtcgaa aacgagctct cgagaaccct taatataact tcgtataatg 660

tatgctatac gaagttatta ggtgatatca gatccactag tggcctatgc ccgcagtaac 720

tattcacaag accttgaatg tagtaaacga tgtctatata acttaatatt gtgtaagatc 780

ttacaagatg tactgggccc aggcttttca cggggatcaa accgttgctc tcctagatga 840

gaaaacgctt tgccatcaca ctgaagtagc atgggcagta ttttccctcg aatattgtta 900

ttatcaaagc aagcaatatc agcagtagtt tttatttcaa catataagat cacctatgtt 960

gcaatctctg caaaattagt aatgttaccc tccaagtaat tgtatgacct ctcttctgaa 1020

ggtaaacatt gcgcctcttt gtttaaagca gcagcactag tttatcatgg tttcgttacc 1080

taggaaagga tcggtagtgc tatgtaacac ttggaaaaga tgaaatttgt taacatgaaa 1140

ttgagtccct tgtgttaagg taaaagtgcc atctttaaaa acgtactctg caaaaaatgg 1200

tattgcgcat acgaagaatt aagaaactgg caccattgat cttcacatca ttgttgtctc 1260

tcattgttct ttttagggtc taccgacagt atccattctc cgaccatttc gaaacacgca 1320

gagaagatga tcgctctggc aacgtgcact gcttttctag actgcgtcaa atagaggaat 1380

atgaaaagcc ggaattgaca agtaaattct atgaaccgaa tagatggaaa tcttttatat 1440

cttacgtgac caggagtcgc aaggatgtga aaactgtgtc ccgatcgcta tccaatttgg 1500

atttgtatca aaaatgctca aaagaaatcc gtgctgatca ggatatttcc cttcttcata 1560

gcatagaaac caagttgttc ccatatataa acttcacagc cctaaatagt gaacaatctc 1620

ataatttttg gcctgttcat acccgatttg atggaacaaa gtaccgtgga caggtattac 1680

aattttcttc tgagaacaat tcgttcattg gaacttcacc cattgaattc aaggctagcg 1740

aacctttttg ggagaactgg ttgaattcag ctcttcaaag gaattcaaaa ggtgtggtaa 1800

tgagcgtatc ggaa 1814

<210> 53

<211> 1397

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 53

tgtctcggag tcaccttgat ctgactcaat tccagtttgt acgggtttcc agtatgcagc 60

tttccatttg tgtaccaata atgttgatac aaaggtttta ccaacatcag tgtctgtacc 120

ggtgacgaat acaattggtt gttgttcttg ttgttgagat ttgctgttca tgacctgtgc 180

gctagtgatt ttttgagttc ttttcactgg cctacttgtg gaaaaaagta tatctcttta 240

tatacttcag taaacgaact accagcggga ttttattttg ttttgcccaa taattttgaa 300

ttataaatag ccattgtttg tatatttcat tttcttttgg tcgggaggat gtcaacagcg 360

caattcgttt tctattgcta ggataacaac taatgtccca agaaatttca tatacaccag 420

atgtcgcgga actgctagac tttgataaaa aacatatttg gcatccttat acgtcattga 480

gttcaccatt gaacgtttat ccggtaaaga gtgctcacgg atgcaagctg gtgttggata 540

ccgactcacc agtggacgtc gaggtgatcg acgccatgtc gtcgtggtgg tgtgttattc 600

acgggtacaa taatccagaa ctaaatgagg cccttaccaa gcagatgtta aagttttctc 660

acgtccttct tggtggattc acccataaag gagctgtgaa tctagtccaa aaacttttaa 720

aagtgattga tgaaccctct ttgcagtact gtttcctcgc agattctggc tcagtagcag 780

tggaagtagc tttgaagatg gctttacagc tgaagcttcg tacgctgcag gtcgacaacc 840

cttaatataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat taggtctaga gatctgttta 900

gcttgcctcg tccccgccgg gtcacccggc cagcgacatg gaggcccaga ataccctcct 960

tgacagtctt gacgtgcgca gctcaggggc atgatgtgac tgtcgcccgt acatttagcc 1020

catacatccc catgtataat catttgcatc catacatttt gatggccgca cggcgcgaag 1080

caaaaattac ggctcctcgc tgcagacctg cgagcaggga aacgctcccc tcacagacgc 1140

gttgaattgt ccccacgccg cgcccctgta gagaaatata aaaggttagg atttgccact 1200

gaggttcttc tttcatatac ttccttttaa aatcttgcta ggatacagtt ctcacatcac 1260

atccgaacat aaacaaccat gggtaaggaa aagactcacg tttcgaggcc gcgattaaat 1320

tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca 1380

ggtgcgacaa tctatcg 1397

<210> 54

<211> 1328

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 54

atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt 60

tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataagctttt 120

gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt 180

tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata 240

ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg 300

gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat 360

gctcgatgag tttttctaat cagtactgac aataaaaaga ttcttgtttt caagaacttg 420

tcatttgtat agttttttta tattgtagtt gttctatttt aatcaaatgt tagcgtgatt 480

tatatttttt ttcgcctcga catcatctgc ccagatgcga agttaagtgc gcagaaagta 540

atatcatgcg tcaatcgtat gtgaatgctg gtcgctatac tgctgtcgat tcgatactaa 600

cgccgccatc cagtgtcgaa aacgagctct cgagaaccct taatataact tcgtataatg 660

tatgctatac gaagttatta ggtgatatca gatccactag tggcctatgc ggaaatccca 720

cataaaccaa tgatatacga tctcatcaag tcatttgcca aggaattctt atttcttgcg 780

taaaatgcat tcttttacgc tattatttat attgatataa ctcaaaataa aaaatttatg 840

gttatttatt ctagcggacc tttatatctt acttttctta tcataaaact atgtcgaagc 900

ctgctgcaca agagaaaatt gactagttca gggcaagaac gtatcacagg aagtacgagt 960

tgagaaatct ggaccgaaat ggtccgtggt cgcctacccg ccttctgtgc catcacggta 1020

ctctcttcta tgttctccca ttagcgctag ttacactcct cagcagctga cacatctcac 1080

gatcctatct tttatttatt atgagaagaa cggaaaagat gggatattat aggctcagct 1140

tactcttcaa gcaactactg ttgaaccggg tcgtacaact catacctttg aaccctctgg 1200

taaatttttc cggcagagtc aagattatta ttgaggcaaa cctgtaaatt tccttcagca 1260

tttgattatc ttccgctact tgaaattttg cactatatct tcctctatta acctatccgc 1320

agtaacta 1328

<210> 55

<211> 1418

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 55

cggatttagt gtttacttgc tattcttcta gtttcaaata aataagataa taagggatgt 60

caacttggta gtaatagcat gaaatagtat cgtaaaatta aggatgctag cgctttcgac 120

aacaaaatgg gcttgtttta tttttgcaga ggaggttcag taaatattac ctcagagact 180

gatacagata attctttctt attcgactgc gtatttatct ttatcgttta gattgaagac 240

aatagacaat taaatgaatc tatagaaagg ttaggaaata gtctaaacta ctatggtttg 300

ttaacggcga ggtctttagt ttaattttct gtctggaaaa taactttatc ctaaaaagaa 360

aattttcatc aactgcaact ttttttgtta tgcttttgtt ctcgctaggc gaaagctccc 420

taaaaatatc cgtagaattt catatgacac aaccaggcct tgatgtaaac gtcaaactac 480

acatttctca aagcttagag agctgatgca tgaaattttt gcattgtgtg gtattatatg 540

tgacttaaga aagtaattgt acatcataag agagaaaaat tctgttcaga gaagaactat 600

ttgaatatat tttaaaagat aaaaaaatgt cttggcaaaa ataagtaagt aatgaaaaag 660

aaattttctc gaagaaaaaa atgaaaaaaa tgactaagta ctcaatatcc ttgattttct 720

agttttcatt ttcctcaaaa aaacttgtcc acattcattc tctgaatcgt tcttctttgg 780

tatatactat catgcgaata cgtctttttt cttttgatat taaaatatct acagactatt 840

ttgtgcacct ataaaataaa ttttgtcatg acttgtaatt ttcccataat cgggactatt 900

taaggaccaa aaatacactt tcgcccaact tgctgcttga ccaggacttt cagctgaagc 960

ttcgtacgct gcaggtcgac aacccttaat ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag 1020

ttattaggtc tagagatctg tttagcttgc ctcgtccccg ccgggtcacc cggccagcga 1080

catggaggcc cagaataccc tccttgacag tcttgacgtg cgcagctcag gggcatgatg 1140

tgactgtcgc ccgtacattt agcccataca tccccatgta taatcatttg catccataca 1200

ttttgatggc cgcacggcgc gaagcaaaaa ttacggctcc tcgctgcaga cctgcgagca 1260

gggaaacgct cccctcacag acgcgttgaa ttgtccccac gccgcgcccc tgtagagaaa 1320

tataaaaggt taggatttgc cactgaggtt cttctttcat atacttcctt ttaaaatctt 1380

gctaggatac agttctcaca tcacatccga acataaac 1418

<210> 56

<211> 1574

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 56

gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc 60

ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccggcaa aacagcattc caggtattag 120

aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt 180

tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc 240

aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 300

atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg 360

attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat 420

taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca 480

tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat 540

atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt 600

tctaatcagt actgacaata aaaagattct tgttttcaag aacttgtcat ttgtatagtt 660

tttttatatt gtagttgttc tattttaatc aaatgttagc gtgatttata ttttttttcg 720

cctcgacatc atctgcccag atgcgaagtt aagtgcgcag aaagtaatat catgcgtcaa 780

tcgtatgtga atgctggtcg ctatactgct gtcgattcga tactaacgcc gccatccagt 840

gtcgaaaacg agctctcgag aacccttaat ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag 900

ttattaggtg atatcagatc cactagtggc ctatgcatga aagccttgca acttttttat 960

ttaaactatt ctacgtcttg ttgggtcatt aatgactcca ccgatggcag ttcatgcaac 1020

tccatatcct gatcatgtgc cgtagtacat tgtgcaacct gtgccataat attgacaccg 1080

aacttcttca gggcctgcac gttgccttca ttcggttccc cattgagaat gaccccaaaa 1140

aggtggcttc tcaagccatt atcgcaaaga tgattccaag tcagcaatgt atgattcaga 1200

gtccctagcc cgctgcgtgc cacgacaact acgtacactg gatggccgct agtctcaatc 1260

agatgtttaa ttagatccgt cgtaatttcc aatttacgag tgataggaac gcaaaccccg 1320

ccggctcctt ctacgaccaa tggattctct gcgctccact cttcaggaac tacgaaatcc 1380

aacaacctga tgtcgacatt aggttcgtac tccatggcct ggagcggaga tagaggcttc 1440

tgcagcgcat aagtgggcgt gaatataggt ggttgccaag ttgatgcggc tattttgaaa 1500

tttttcaatg tctcggagtc accttgatct gactcaattc cagtttgtac gggtttccag 1560

tatgcagctt tcca 1574

<210> 57

<211> 1224

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 57

ctgcttgacc aggactttcg ataatctcct aattacacta gctagttttt acttgttatg 60

gtttgtgcag ttgagatagc tcagtaaaat ggctttatgt gttctgatct tataatgaat 120

cgtaatcgaa atccacatat ttcattcata ctgacggaga ataggttaag cgctgctgct 180

atggtaccta cttttactct ttgtggtgtg cgattagttt tgtaatacaa gggtacttct 240

ggtaataaat atacaattat tttatgaaac tatgatacag gagggcagaa gttctgacga 300

tagagctaca aaaggtagta tcgacctagg aatttataag gactgttttt ctttcaacag 360

catcttagat gcatgtaggg aaaacaacga tgctgataat gcagaaaact actgcataca 420

ctactgaggt gtaattcatg tttcctgcag taaccggtag tgtatatggg aaagataaaa 480

ataccaggca gaacaaggtc catagaacag ctgaagcttc gtacgctgca ggtcgacaac 540

ccttaatata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta ttaggtctag agatctgttt 600

agcttgcctc gtccccgccg ggtcacccgg ccagcgacat ggaggcccag aataccctcc 660

ttgacagtct tgacgtgcgc agctcagggg catgatgtga ctgtcgcccg tacatttagc 720

ccatacatcc ccatgtataa tcatttgcat ccatacattt tgatggccgc acggcgcgaa 780

gcaaaaatta cggctcctcg ctgcagacct gcgagcaggg aaacgctccc ctcacagacg 840

cgttgaattg tccccacgcc gcgcccctgt agagaaatat aaaaggttag gatttgccac 900

tgaggttctt ctttcatata cttcctttta aaatcttgct aggatacagt tctcacatca 960

catccgaaca taaacaacca tgggtaagga aaagactcac gtttcgaggc cgcgattaaa 1020

ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc 1080

aggtgcgaca atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca 1140

tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actggctgac 1200

ggaatttatg cctcttccga ccat 1224

<210> 58

<211> 815

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 58

atgcgtcaat cgtatgtgaa tgctggtcgc tatactgctg tcgattcgat actaacgccg 60

ccatccagtg tcgaaaacga gctctcgaga acccttaata taacttcgta taatgtatgc 120

tatacgaagt tattaggtga tatcagatcc actagtggcc tatgcttcag caaccctaca 180

accatggaag aaaccttttg aaatttagaa gaaacttcca cgttgaaagt ttgacaataa 240

ttctcgagga acacttcttc atcatcgtca gaagggtcct cgtactcagg ggttttcaaa 300

gtgactgatt cttgttccaa cattttaaga acccaaaatg aaccaccgct gctgtttggc 360

aggatagcag caaaatctcc cagagatata ccacacatga gactgaaaaa agcagcaatt 420

atcaacccat agatgataag cagtggccct ccactggcaa taccaacggc catcgacgct 480

gagataccga cccatgagca acttaatgag aacgcgatac ctaataggga ccaccaatta 540

aagtgcttgt caaacttgac ttctgacctt tctgaactag acattcttat ttccgtcctg 600

tgacgatctg gaacaataga caaaaaaaaa tttctttcat atacaaatag gaacactgcc 660

cctactctgt tcataccatg ctacttatat atagctgatg aaagccttgc aactttttta 720

tttaaactat tctacgtctt gttgggtcat taatgactcc accgatggca gttcatgcaa 780

ctccatatcc tgatcatgtg ccgtagtaca ttgtg 815

Claims

1.一种低产高级醇的啤酒酵母菌株的用途，其特征在于，所述菌株是CICC 1929敲除了核苷酸序列如SEQ NO:1或SEQ NO:2所示的基因，所述用途是所述菌株在小麦发酵制备啤酒中的用途。