CN111748572B - 一种获得串联酶功能缺失突变体的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种获得串联酶功能缺失突变体的方法，EPSPS功能缺失的酵母突变体的方法及应用。所述重组酵母菌株通过生物基因工程的方法改变了酵母的Aro1基因，获得了只有EPSPS功能缺失的酵母突变体。

Description

一种获得串联酶功能缺失突变体的方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到重组改造酵母，产生相应的功能的酵母突变体，及其在研发，药物，化工等领域的应用。

背景技术

串联酶(tandem enzyme)是指由一条多肽链组成、具有两种或两种以上不同催化活性的蛋白质，也称为多功能酶(multifunctional enzyme)。它通常催化同一代谢通路中的连续多个反应步骤。

为了能在生物体内研究某个基因的功能或获得特异的突变体形式，一种常见的操作是创造相应基因的功能缺失突变体。例如在编码某一酶或蛋白的DNA序列中插入、缺失或改变一个或多个碱基序列，使得基因的DNA序列不能正确编码功能蛋白或产生没有功能的蛋白。而对于编码串联酶的基因，如果按上述方法去创造功能缺失突变体，往往会同时影响到所串联的两个或两个以上酶的活性，难以得到其中一个酶的功能丧失，而其他酶的活性正常的突变体，这样对于研究其中某一个酶的功能造成困难。

比如在酵母中Aro1基因所编码的Aro1蛋白，就是一个具有5个酶功能的串联酶，它具有莽草酸途径合成芳香族氨基酸通路中的五种酶的催化活性，分别为：

1.脱氢奎尼酸合成酶(3-dehydroquinate synthase，缩写DHQS，国际分类编号EC4.2.3.4)；

2.脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinate dehydratase，缩写DHQD，国际分类编号EC 4.2.1.10)；

3.莽草酸脱氢酶(Shikimate dehydrogenase，缩写SDH，国际分类编号EC1.1.1.25)；

4.莽草酸激酶(Shikimate kinase，缩写SK，国际系统分类编号EC 2.7.1.71)；

5.5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase，或5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，或EPSPsynthase，缩写EPSPS，国际分类编号EC 2.5.1.19)。

在酵母中，由于Aro1基因的结构特点，按照常规的方法，Aro1基因突变或者缺失后，会同时影响到上述多个其他酶的功能，无法获得只有EPSPS功能缺失的酵母突变体。酵母是一种单细胞真核生物，由于培养操作方便，常被作为模式真核生物用于研究当中，也常常用于医药，化工等等的研究和应用领域。

本发明的目的在于提供获得串联酶突变体的方法，得到只有一种酶功能缺失的突变体的方法和突变体，及其在研发、医药和化工等等领域的应用。

发明内容

本发明的研究人员在研发过程中，也发现此方法也可用于有类似结构的多基因串联成的开放的读码框(ORF)，利用本发明的方法在不影响其他串联基因功能的同时，获得特定基因功能缺失的生物突变体。

本发明的目的在于提供获得特定基因功能缺失的生物突变体的方法在于，在串联多基因的序列上，先确定与特定基因功能相关的基因片段的位置，用生物技术的方法将该序列片段删除或者增加一段碱基序列，此碱基序列的长度必须为3的倍数，或者仅改变该序列片段上的一个或者数个碱基，形成突变基因，该突变基因不能正确编码该基因片段，但不会影响其他功能基因序列的编码，最终仍然能够形成正确的ORF，除了与特定基因片段相关的功能缺失外，其他基因功能均能完整保留。从而可以获得该特定基因功能缺失的生物突变体。

本发明的目的在于提供获得特定基因功能缺失的酵母突变体的方法在于，在串联多基因的序列上，先确定与特定基因功能相关的基因片段的位置，用生物技术的方法将该序列片段删除或者增加一段碱基序列，此碱基序列的长度必须为3的倍数，或者仅改变该序列片段上的一个或者数个碱基，形成突变基因，该突变基因不能正确编码该基因片段，但不会影响其他功能基因序列的编码，最终仍然能够形成正确的ORF，除了与特定基因片段相关的功能缺失外，其他基因功能均能完整保留。从而可以获得该特定基因功能缺失的酵母突变体。

本发明的目的在于提供获得EPSPS缺失的酵母突变体的方法在于，在Aro1基因上，先确定与EPSPS功能相关的基因片段的位置，是基因Aro1序列上从1198到2658的基因片段，用生物技术的方法将该序列片段删除或者增加一段碱基序列，此增加或者减少的碱基序列的长度必须为3的倍数，或者仅改变该序列片段上的一个或者数个碱基，形成突变基因，突变基因不能正确编码与EPSPS功能相关的基因片段，但不影响其他基因序列的编码，最终仍然能够形成正确的ORF，除了与EPSPS功能相关的功能缺失外，其他基因功能均能完整保留。从而可以获得EPSPS功能缺失的酵母突变体。

在本发明的一个实施例中，通过同源重组的方法，将酵母体内Aro1基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)的第1198-2658位的1461个碱基全部删除的方法获得了EPSPS功能缺失突变体。最终获得的突变体Aro1基因的序列变为如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一个实施例中，通过同源重组的方法，将酵母体内Aro1基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)的第1228-2595位的1368个碱基全部删除的方法获得了EPSPS功能缺失突变体。最终获得的突变体Aro1基因的序列变为如SEQ ID NO:3所示。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1：pCAS载体图

图2：YR11载体图

图3：载体YCplac22载体图

图4：YR45载体图

图5：实施例子1突变体在SC-H培养基的生长比较

图6:实施例子1突变体在SC-HFY培养基的生长比较

图7：实施例子2突变体在SC-H培养基的生长比较

图8：实施例子2突变体在SC-HFY培养基的生长比较

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但不限制本发明的专利范围。凡是利用本发明说明书或者附图内容所作的等效结构或者等效流程的变换，或者直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明使用研究人员最常使用的酵母菌株BY4741作为例子，使用其他类型的酵母菌株也在本发明范围之内。

YPAD培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，硫酸腺嘌呤0.1g/L，D-葡萄糖20g/L。固体培养基中还需加入琼脂粉20g/L。

SC-H培养基：YNB(含硫酸铵无氨基酵母氮源)6.7g/L，D-葡萄糖20g/L，L-天冬氨酸0.05g/L，L-异亮氨酸0.05g/L，L-甲硫氨酸0.05g/L，L-苯丙氨酸0.05g/L，L-脯氨酸0.05g/L，L-丝氨酸0.05g/L，L-酪氨酸0.05g/L，L-缬氨酸0.05g/L，L-腺嘌呤0.1g/L，L-精氨酸0.1g/L，L-半胱氨酸0.1g/L，L-组氨酸0.1g/L，L-亮氨酸0.1g/L，L-赖氨酸0.1g/L，L-苏氨酸0.1g/L，L-色氨酸0.1g/L，L-尿嘧啶0.1g/L，pH 5.6。固体培养基中还需加入琼脂粉20g/L。

SC-HFY培养基：含硫酸铵无氨基酵母氮源(YNB)6.7g/L，D-葡萄糖20g/L，L-天冬氨酸0.05g/L，L-异亮氨酸0.05g/L，L-甲硫氨酸0.05g/L，L-脯氨酸0.05g/L，L-丝氨酸0.05g/L，L-缬氨酸0.05g/L，L-腺嘌呤0.1g/L，L-精氨酸0.1g/L，L-半胱氨酸0.1g/L，L-亮氨酸0.1g/L，L-赖氨酸0.1g/L，L-苏氨酸0.1g/L，L-色氨酸0.1g/L，L-尿嘧啶0.1g/L，pH 5.6。固体培养基中还需加入琼脂粉20g/L。(不含L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸三种氨基酸的SC培养基)。

实施例1：用删除酵母体内Aro1基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)的第1198-2658位的1461个碱基的方法获得EPSPS功能缺失的酵母突变体。

本实施例通过同源重组的方法，将酵母体内Aro1基因(其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示)的第1198-2658位的1461个碱基全部删除的方法创造EPSPS功能缺失突变体。最终创造的突变体Aro1基因的序列变为如SEQ ID NO:2所示。具体的实验步骤分别进行详细说明。

1.1构建能在酵母体内造成Aro1基因特异位点双链断裂的载体。

采用常规生物技术方法，将pCAS载体(来源于http://www.addgene.org/；Addgene载体编号为60847)中的靶点序列(如图1所示)替换为gtaactttggctcttgttgg，构建成的载体名为YR11。(如图2所示)

1.2 PCR法合成同源重组序列。

以引物ScEPL-HAF1和ScEPL-HAR2互为模板和引物，进行PCR扩增，得到片断ScEPL-HA1，ScEPL-HA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

表1：实施例1中所用的引物名称及序列

引物名称	引物核苷酸序列(5’-3’)
		ScEPL-HAF1	ggtaagtgctatggtgactccgctcaatttgttagcgatgaagacctgagatttattctaTCAAAGAAAAGCG
ScEPL-HAR2	tttacttatagtagttttgccagctgctctcatgccaataatgacaacgcttttctttgaTAGAATAAATCTCAGG
		ScEP-S2F	gacaagaaaaacgagggttcc
ScEP-S1R	tttgccagctgctctcatg

1.3转化酵母

使用1ug的载体YR11质粒和5ug的ScEPL-HA1以片断热激法转化酵母。转化后的酵母涂布于含有200mg/L G418的YPAD平板上。

1.4突变体的筛选

选取在1.3步骤中获得的平板上生长3天后的酵母菌落，用牙签挑取少量菌体作为模板，用引物ScEP-S2F和ScEP-S1R进行PCR扩增。扩增到的菌落用引物ScEP-S2F进行测序，从中筛选含与SEQ ID NO:3相同的序列，所得到的菌落就是Aro1基因的第1198-2658位的1461个碱基全部删除后的酵母菌株。只挑选能够扩增到约150bp长度片断的菌落。而不能扩增到150bp长度片断的菌落，或同时能扩增到约150bp和约1600bp长度片断的菌落均弃去。

1.5酵母中YR11载体质粒的去除

根据1.4的筛选结果，在1.3中的YPAD平板上挑取相对应的酵母突变体菌落，接于3～5mL的YPAD培养基中，30℃下过夜培养。用划线法将过夜培养的菌液划于YPAD平板上。再在此YPAD平板上挑取单菌落，接于3～5mL的YPAD培养基中，30℃过夜培养。用划线法将过夜培养的菌液同时分别划于YPAD平板和含有200mg/L G418的YPAD平板上。如果在YPAD平板上生长良好，而在含有G418的YPAD平板上不能生长，说明此菌中的YR11载体质粒已经去除，所获得的菌即为所需要的酵母突变体，是Aro1基因的第1198-2658位的1461个碱基全部删除后的酵母突变体。

实施例2：实施例1中获得的EPSPS缺失的酵母突变体的功能验证

采用常规将载体构建方法，将载体YCplac22(GenBank:X75455)中的Trp1用His3基因替换，并将酵母启动子TEF1和酵母终止子ADH1构建到多克隆位点处，形成载体YR45。在YR45载体的TEF1和ADH1之间插入不同来源的EPSPS构成表达不同来源的EPSPS的酵母表达载体。所选用的EPSPS包括来源于农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)CP4菌株的CP4-EPSPS，来源于水稻的EPSPS(OsE)，来源于酵母的ScEPL(Aro1中第1198-2658位的碱基序列，并在此序列之前加上起始密码子ATG，在之后加止终止密码子TGA，形成的序列如SEQ IDNO：5所示)。

表达有各个来源的EPSPS载体转入所获得的EPSPS缺失突变体中，同时将YR45载体也转入所获得的突变体和野生型酵母中作为对照。

所获得的转化酵母，选取单菌落，在3～5mL缺乏组氨酸的SC培养基(SC-H)中于30℃过夜培养。用划线法将过夜培养的菌液分别划于SC-H培养基和SC-HFY培养基(同时缺乏组氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸)平板上，30℃培养3天观察结果。

图5和图6中的模板如下所示：

野生型：内源EPSPS未敲除的酵母菌株，

YR45：EPSPS敲除后的酵母菌株中转入YR45载体，

CP4：EPSPS敲除后的酵母菌株中转入表达CP4-EPSPS的载体，

OsE：EPSPS敲除后的酵母菌株中转入表达水稻EPSPS的载体，

ScEPL：EPSPS敲除后的酵母菌株中转入表达酵母EPSPS的载体。

可以看到，在缺乏芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)的SC-HFY培养基中，所获得的突变体不能生长，而在表达不同来源的EPSPS后，在SC-H培养基中，突变体又能与野生型一样正常生长。这说明所获得的突变体仅Aro1中的EPSPS功能缺失，而Aro1中的其他4个酶活功能却没有受到影响。

实施例3：用删除酵母体内Aro1基因(其核苷酸序列如序列1所示)的第1228-2595位的1368个碱基的方法获得EPSPS功能缺失的酵母突变体。

本实施例通过同源重组的方法，将酵母体内Aro1基因(其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示)的第1228-2595位的1368个碱基全部删除的方法创造EPSPS功能缺失突变体。最终创造的突变体Aro1基因的序列变为如SEQ ID NO:3所示。具体的实验步骤分别进行详细说明。

3.1构建能在酵母体内造成Aro1基因特异位点双链断裂的载体。

采用常规生物技术方法，将pCAS载体(来源于http://www.addgene.org/；Addgene载体编号为60847)中的靶点序列(如图1所示)替换为gtaactttggctcttgttgg，构建成的载体名为YR11。(如图2所示)

3.2PCR法合成同源重组序列

以引物ScEPL-HAF1和ScEPL-HAR2(如表2所示)互为模板和引物，进行PCR扩增，得到片断ScEP-HA1，ScEP-HA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

表2：实施例3中所用的引物名称及序列

引物名称	引物核苷酸序列(5’-3’)
		ScEP-HA1F	gttagcgatgaagacctgagatttattctaacagatgaaaccctcgtttaCCCCTTCAAGCATTCCGAAC
ScEP-HA1R	ctttttggatgtgcactctaaaggttctgcaccatctaatttggcacctaGTTCGGAATGCTTGAAGGGG
		ScEP-S2F	gacaagaaaaacgagggttcc
ScEP-S1R	tttgccagctgctctcatg

3.3转化酵母

使用1ug的载体YR11质粒和5ug的ScEP-HA1片断热激法转化酵母。转化后的酵母涂布于含有200mg/L G418的YPAD平板上。

3.4突变体的筛选

选取在3.3中获得的平板上生长3天后的酵母菌落，用牙签挑取少量菌体作为模板，用引物ScEP-S2F和ScEP-S1R进行PCR扩增。扩增到的菌落用引物ScEP-S2F进行测序，如果含与SEQ ID NO:6相同的序列，则所得到的菌落就是Aro1基因的第1228-2595位的1368个碱基全部删除的酵母菌株。只挑选能够扩增到约250bp长度片断的菌落。而不能扩增到250bp长度片断的菌落，或同时能扩增到约250bp和约1600bp长度片断的菌落均弃去。

3.5酵母中YR11载体质粒的去除

根据3.4的筛选结果，在3.3中的YPAD平板上挑取相对应的酵母突变菌落，接于3～5mL的YPAD培养基中，30℃过夜培养。用划线法将过夜培养的菌液划于YPAD平板上。再在此YPAD平板上挑取单菌落，接于3～5mL的YPAD培养基中，30℃过夜培养。用划线法将过夜培养的菌液同时分别划于YPAD平板和含有200mg/L G418的YPAD平板上。如果在YPAD平板上生长良好，而在含有G418的YPAD平板上不能生长，说明此菌中的YR11载体质粒已经去除，所获得的菌即为所需要的酵母体内Aro1基因的第1228-2595位的1368个碱基全部删除的突变体。

实施例4：实施例3中获得的EPSPS缺失的酵母突变体的功能验证

如实施例2中的方法构建表达有各个来源的EPSPS载体，并转入所获得的EPSPS缺失突变体中，同时将YR45载体也转入所获得的突变体和野生型酵母中作为对照。

所获得的转化酵母，选取单菌落，在缺乏组氨酸的SC培养基(SC-H)中于30℃过夜培养。用划线法将过夜培养的菌液分别划于SC-H培养基和SC-HFY培养基(同时缺乏组氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸)平板上，30℃培养3天观察结果。

图7和图8中的模板如下所示：

野生型：内源EPSPS未敲除的酵母菌株，

YR45：EPSPS敲除后的酵母菌株中转入YR45载体，

CP4：EPSPS敲除后的酵母菌株中转入表达CP4-EPSPS的载体，

OsE：EPSPS敲除后的酵母菌株中转入表达水稻EPSPS的载体，

ScEPL：EPSPS敲除后的酵母菌株中转入表达酵母EPSPS的载体。

可以看到，在缺乏芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)的SC-HFY培养基中，所获得的突变体不能生长，而在表达不同来源的EPSPS后，在SC-HFY培养基中，突变体又能与野生型一样正常生长。这说明所获得的突变体仅Aro1中的EPSPS功能缺失，而Aro1中的其他4个酶活功能却没有受到影响。

序列表

<110> 科稷达隆生物技术有限公司

<120> 一种获得特定基因功能缺失的生物突变体的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4767

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgcagt tagccaaagt cccaattcta ggaaatgata ttatccacgt tgggtataac 60

attcatgacc atttggttga aaccataatt aaacattgtc cttcttcgac atacgttatt 120

tgcaatgata cgaacttgag taaagttcca tactaccagc aattagtcct ggaattcaag 180

gcttctttgc cagaaggctc tcgtttactt acttatgttg ttaaaccagg tgagacaagt 240

aaaagtagag aaaccaaagc gcagctagaa gattatcttt tagtggaagg atgtactcgt 300

gatacggtta tggtagcgat cggtggtggt gttattggtg acatgattgg gttcgttgca 360

tctacattta tgagaggtgt tcgtgttgtc caagtaccaa catccttatt ggcaatggtc 420

gattcctcca ttggtggtaa aactgctatt gacactcctc taggtaaaaa ctttattggt 480

gcattttggc aaccaaaatt tgtccttgta gatattaaat ggctagaaac gttagccaag 540

agagagttta tcaatgggat ggcagaagtt atcaagactg cttgtatttg gaacgctgac 600

gaatttacta gattagaatc aaacgcttcg ttgttcttaa atgttgttaa tggggcaaaa 660

aatgtcaagg ttaccaatca attgacaaac gagattgacg agatatcgaa tacagatatt 720

gaagctatgt tggatcatac atataagtta gttcttgaga gtattaaggt caaagcggaa 780

gttgtctctt cggatgaacg tgaatccagt ctaagaaacc ttttgaactt cggacattct 840

attggtcatg cttatgaagc tatactaacc ccacaagcat tacatggtga atgtgtgtcc 900

attggtatgg ttaaagaggc ggaattatcc cgttatttcg gtattctctc ccctacccaa 960

gttgcacgtc tatccaagat tttggttgcc tacgggttgc ctgtttcgcc tgatgagaaa 1020

tggtttaaag agctaacctt acataagaaa acaccattgg atatcttatt gaagaaaatg 1080

agtattgaca agaaaaacga gggttccaaa aagaaggtgg tcattttaga aagtattggt 1140

aagtgctatg gtgactccgc tcaatttgtt agcgatgaag acctgagatt tattctaaca 1200

gatgaaaccc tcgtttaccc cttcaaggac atccctgctg atcaacagaa agttgttatc 1260

ccccctggtt ctaagtccat ctccaatcgt gctttaattc ttgctgccct cggtgaaggt 1320

caatgtaaaa tcaagaactt attacattct gatgatacta aacatatgtt aaccgctgtt 1380

catgaattga aaggtgctac gatatcatgg gaagataatg gtgagacggt agtggtggaa 1440

ggacatggtg gttccacatt gtcagcttgt gctgacccct tatatctagg taatgcaggt 1500

actgcatcta gatttttgac ttccttggct gccttggtca attctacttc aagccaaaag 1560

tatatcgttt taactggtaa cgcaagaatg caacaaagac caattgctcc tttggtcgat 1620

tctttgcgtg ctaatggtac taaaattgag tacttgaata atgaaggttc cctgccaatc 1680

aaagtttata ctgattcggt attcaaaggt ggtagaattg aattagctgc tacagtttct 1740

tctcagtacg tatcctctat cttgatgtgt gccccatacg ctgaagaacc tgtaactttg 1800

gctcttgttg gtggtaagcc aatctctaaa ttgtacgtcg atatgacaat aaaaatgatg 1860

gaaaaattcg gtatcaatgt tgaaacttct actacagaac cttacactta ttatattcca 1920

aagggacatt atattaaccc atcagaatac gtcattgaaa gtgatgcctc aagtgctaca 1980

tacccattgg ccttcgccgc aatgactggt actaccgtaa cggttccaaa cattggtttt 2040

gagtcgttac aaggtgatgc cagatttgca agagatgtct tgaaacctat gggttgtaaa 2100

ataactcaaa cggcaacttc aactactgtt tcgggtcctc ctgtaggtac tttaaagcca 2160

ttaaaacatg ttgatatgga gccaatgact gatgcgttct taactgcatg tgttgttgcc 2220

gctatttcgc acgacagtga tccaaattct gcaaatacaa ccaccattga aggtattgca 2280

aaccagcgtg tcaaagagtg taacagaatt ttggccatgg ctacagagct cgccaaattt 2340

ggcgtcaaaa ctacagaatt accagatggt attcaagtcc atggtttaaa ctcgataaaa 2400

gatttgaagg ttccttccga ctcttctgga cctgtcggtg tatgcacata tgatgatcat 2460

cgtgtggcca tgagtttctc gcttcttgca ggaatggtaa attctcaaaa tgaacgtgac 2520

gaagttgcta atcctgtaag aatacttgaa agacattgta ctggtaaaac ctggcctggc 2580

tggtgggatg tgttacattc cgaactaggt gccaaattag atggtgcaga acctttagag 2640

tgcacatcca aaaagaactc aaagaaaagc gttgtcatta ttggcatgag agcagctggc 2700

aaaactacta taagtaaatg gtgcgcatcc gctctgggtt acaaattagt tgacctagac 2760

gagctgtttg agcaacagca taacaatcaa agtgttaaac aatttgttgt ggagaacggt 2820

tgggagaagt tccgtgagga agaaacaaga attttcaagg aagttattca aaattacggc 2880

gatgatggat atgttttctc aacaggtggc ggtattgttg aaagcgctga gtctagaaaa 2940

gccttaaaag attttgcctc atcaggtgga tacgttttac acttacatag ggatattgag 3000

gagacaattg tctttttaca aagtgatcct tcaagacctg cctatgtgga agaaattcgt 3060

gaagtttgga acagaaggga ggggtggtat aaagaatgct caaatttctc tttctttgct 3120

cctcattgct ccgcagaagc tgagttccaa gctctaagaa gatcgtttag taagtacatt 3180

gcaaccatta caggtgtcag agaaatagaa attccaagcg gaagatctgc ctttgtgtgt 3240

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gaggctgtag aggtcagagt agaccatttg gctaattact ctgctgattt cgtgagtaaa 3360

cagttatcta tattgcgtaa agccactgac agtattccta tcatttttac tgtgcgaacc 3420

atgaagcaag gtggcaactt tcctgatgaa gagttcaaaa ccttgagaga gctatacgat 3480

attgccttga agaatggtgt tgaattcctt gacttagaac taactttacc tactgatatc 3540

caatatgagg ttattaacaa aaggggcaac accaagatca ttggttccca tcatgacttc 3600

caaggattat actcctggga cgacgctgaa tgggaaaaca gattcaatca agcgttaact 3660

cttgatgtgg atgttgtaaa atttgtgggt acggctgtta atttcgaaga taatttgaga 3720

ctggaacact ttagggatac acacaagaat aagcctttaa ttgcagttaa tatgacttct 3780

aaaggtagca tttctcgtgt tttgaataat gttttaacac ctgtgacatc agatttattg 3840

cctaactccg ctgcccctgg ccaattgaca gtagcacaaa ttaacaagat gtatacatct 3900

atgggaggta tcgagcctaa ggaactgttt gttgttggaa agccaattgg ccactctaga 3960

tcgccaattt tacataacac tggctatgaa attttaggtt tacctcacaa gttcgataaa 4020

tttgaaactg aatccgcaca attggtgaaa gaaaaacttt tggacggaaa caagaacttt 4080

ggcggtgctg cagtcacaat tcctctgaaa ttagatataa tgcagtacat ggatgaattg 4140

actgatgctg ctaaagttat tggtgctgta aacacagtta taccattggg taacaagaag 4200

tttaagggtg ataataccga ctggttaggt atccgtaatg ccttaattaa caatggcgtt 4260

cccgaatatg ttggtcatac cgctggtttg gttatcggtg caggtggcac ttctagagcc 4320

gccctttacg ccttgcacag tttaggttgc aaaaagatct tcataatcaa caggacaact 4380

tcgaaattga agccattaat agagtcactt ccatctgaat tcaacattat tggaatagag 4440

tccactaaat ctatagaaga gattaaggaa cacgttggcg ttgctgtcag ctgtgtacca 4500

gccgacaaac cattagatga cgaactttta agtaagctgg agagattcct tgtgaaaggt 4560

gcccatgctg cttttgtacc aaccttattg gaagccgcat acaaaccaag cgttactccc 4620

gttatgacaa tttcacaaga caaatatcaa tggcacgttg tccctggatc acaaatgtta 4680

gtacaccaag gtgtagctca gtttgaaaag tggacaggat tcaagggccc tttcaaggcc 4740

atttttgatg ccgttacgaa agagtag 4767

<210> 2

<211> 3306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtgcagt tagccaaagt cccaattcta ggaaatgata ttatccacgt tgggtataac 60

attcatgacc atttggttga aaccataatt aaacattgtc cttcttcgac atacgttatt 120

tgcaatgata cgaacttgag taaagttcca tactaccagc aattagtcct ggaattcaag 180

gcttctttgc cagaaggctc tcgtttactt acttatgttg ttaaaccagg tgagacaagt 240

aaaagtagag aaaccaaagc gcagctagaa gattatcttt tagtggaagg atgtactcgt 300

gatacggtta tggtagcgat cggtggtggt gttattggtg acatgattgg gttcgttgca 360

tctacattta tgagaggtgt tcgtgttgtc caagtaccaa catccttatt ggcaatggtc 420

gattcctcca ttggtggtaa aactgctatt gacactcctc taggtaaaaa ctttattggt 480

gcattttggc aaccaaaatt tgtccttgta gatattaaat ggctagaaac gttagccaag 540

agagagttta tcaatgggat ggcagaagtt atcaagactg cttgtatttg gaacgctgac 600

gaatttacta gattagaatc aaacgcttcg ttgttcttaa atgttgttaa tggggcaaaa 660

aatgtcaagg ttaccaatca attgacaaac gagattgacg agatatcgaa tacagatatt 720

gaagctatgt tggatcatac atataagtta gttcttgaga gtattaaggt caaagcggaa 780

gttgtctctt cggatgaacg tgaatccagt ctaagaaacc ttttgaactt cggacattct 840

attggtcatg cttatgaagc tatactaacc ccacaagcat tacatggtga atgtgtgtcc 900

attggtatgg ttaaagaggc ggaattatcc cgttatttcg gtattctctc ccctacccaa 960

gttgcacgtc tatccaagat tttggttgcc tacgggttgc ctgtttcgcc tgatgagaaa 1020

tggtttaaag agctaacctt acataagaaa acaccattgg atatcttatt gaagaaaatg 1080

agtattgaca agaaaaacga gggttccaaa aagaaggtgg tcattttaga aagtattggt 1140

aagtgctatg gtgactccgc tcaatttgtt agcgatgaag acctgagatt tattctatca 1200

aagaaaagcg ttgtcattat tggcatgaga gcagctggca aaactactat aagtaaatgg 1260

tgcgcatccg ctctgggtta caaattagtt gacctagacg agctgtttga gcaacagcat 1320

aacaatcaaa gtgttaaaca atttgttgtg gagaacggtt gggagaagtt ccgtgaggaa 1380

gaaacaagaa ttttcaagga agttattcaa aattacggcg atgatggata tgttttctca 1440

acaggtggcg gtattgttga aagcgctgag tctagaaaag ccttaaaaga ttttgcctca 1500

tcaggtggat acgttttaca cttacatagg gatattgagg agacaattgt ctttttacaa 1560

agtgatcctt caagacctgc ctatgtggaa gaaattcgtg aagtttggaa cagaagggag 1620

gggtggtata aagaatgctc aaatttctct ttctttgctc ctcattgctc cgcagaagct 1680

gagttccaag ctctaagaag atcgtttagt aagtacattg caaccattac aggtgtcaga 1740

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gaacaaactg agaatttgac tccaatctgt tatggttgtg aggctgtaga ggtcagagta 1860

gaccatttgg ctaattactc tgctgatttc gtgagtaaac agttatctat attgcgtaaa 1920

gccactgaca gtattcctat catttttact gtgcgaacca tgaagcaagg tggcaacttt 1980

cctgatgaag agttcaaaac cttgagagag ctatacgata ttgccttgaa gaatggtgtt 2040

gaattccttg acttagaact aactttacct actgatatcc aatatgaggt tattaacaaa 2100

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gacgctgaat gggaaaacag attcaatcaa gcgttaactc ttgatgtgga tgttgtaaaa 2220

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caattgacag tagcacaaat taacaagatg tatacatcta tgggaggtat cgagcctaag 2460

gaactgtttg ttgttggaaa gccaattggc cactctagat cgccaatttt acataacact 2520

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cctctgaaat tagatataat gcagtacatg gatgaattga ctgatgctgc taaagttatt 2700

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tggttaggta tccgtaatgc cttaattaac aatggcgttc ccgaatatgt tggtcatacc 2820

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gagtag 3306

<210> 3

<211> 3399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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attcatgacc atttggttga aaccataatt aaacattgtc cttcttcgac atacgttatt 120

tgcaatgata cgaacttgag taaagttcca tactaccagc aattagtcct ggaattcaag 180

gcttctttgc cagaaggctc tcgtttactt acttatgttg ttaaaccagg tgagacaagt 240

aaaagtagag aaaccaaagc gcagctagaa gattatcttt tagtggaagg atgtactcgt 300

gatacggtta tggtagcgat cggtggtggt gttattggtg acatgattgg gttcgttgca 360

tctacattta tgagaggtgt tcgtgttgtc caagtaccaa catccttatt ggcaatggtc 420

gattcctcca ttggtggtaa aactgctatt gacactcctc taggtaaaaa ctttattggt 480

gcattttggc aaccaaaatt tgtccttgta gatattaaat ggctagaaac gttagccaag 540

agagagttta tcaatgggat ggcagaagtt atcaagactg cttgtatttg gaacgctgac 600

gaatttacta gattagaatc aaacgcttcg ttgttcttaa atgttgttaa tggggcaaaa 660

aatgtcaagg ttaccaatca attgacaaac gagattgacg agatatcgaa tacagatatt 720

gaagctatgt tggatcatac atataagtta gttcttgaga gtattaaggt caaagcggaa 780

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agtattgaca agaaaaacga gggttccaaa aagaaggtgg tcattttaga aagtattggt 1140

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gaagaaattc gtgaagtttg gaacagaagg gaggggtggt ataaagaatg ctcaaatttc 1740

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cctactgata tccaatatga ggttattaac aaaaggggca acaccaagat cattggttcc 2220

catcatgact tccaaggatt atactcctgg gacgacgctg aatgggaaaa cagattcaat 2280

caagcgttaa ctcttgatgt ggatgttgta aaatttgtgg gtacggctgt taatttcgaa 2340

gataatttga gactggaaca ctttagggat acacacaaga ataagccttt aattgcagtt 2400

aatatgactt ctaaaggtag catttctcgt gttttgaata atgttttaac acctgtgaca 2460

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ggtaacaaga agtttaaggg tgataatacc gactggttag gtatccgtaa tgccttaatt 2880

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aacaggacaa cttcgaaatt gaagccatta atagagtcac ttccatctga attcaacatt 3060

attggaatag agtccactaa atctatagaa gagattaagg aacacgttgg cgttgctgtc 3120

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tgtaaaataa ctcaaacggc aacttcaact actgtttcgg gtcctcctgt aggtacttta 960

aagccattaa aacatgttga tatggagcca atgactgatg cgttcttaac tgcatgtgtt 1020

gttgccgcta tttcgcacga cagtgatcca aattctgcaa atacaaccac cattgaaggt 1080

attgcaaacc agcgtgtcaa agagtgtaac agaattttgg ccatggctac agagctcgcc 1140

aaatttggcg tcaaaactac agaattacca gatggtattc aagtccatgg tttaaactcg 1200

ataaaagatt tgaaggttcc ttccgactct tctggacctg tcggtgtatg cacatatgat 1260

gatcatcgtg tggccatgag tttctcgctt cttgcaggaa tggtaaattc tcaaaatgaa 1320

cgtgacgaag ttgctaatcc tgtaagaata cttgaaagac attgtactgg taaaacctgg 1380

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ttagagtgca catccaaaaa gaactga 1467

<210> 6

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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cattccgaac taggtgccaa attagatggt gcagaacctt tagagtgcac atccaaaaa 119

Claims (3)

1.获得EPSPS功能缺失的酵母突变体的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

1）通过同源重组的方法，将酵母体内核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的Aro1基因的第1198-2658位的1461个碱基，或第1228-2595位的1368个碱基全部删除；

2）根据第一步中确定的EPSPS基因片段筛选酵母突变体；

所述突变体不能正确编码与EPSPS功能相关的基因片段，但不会影响Aro1其他功能基因序列的编码。

2.根据权利要求1所述的方法获得的酵母突变体。

3.权利要求2所述的酵母突变体在酵母中的EPSPS的功能鉴定中的应用。

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