CN117187292A - 一种利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法 - Google Patents
一种利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，属于基因工程技术领域。该方法选取番茄SlDHS2基因和SlAS基因负反馈调节的关键位点，进行定点突变；构建包含上述突变的番茄基因的瞬时表达载体；采用瞬时转化法，同时在本氏烟草中表达位点突变的2个表达载体。提取入渗烟草叶片的氨基酸，测定氨基酸含量的变化后发现，本发明通过定点突变植物莽草酸途径中的2个关键基因(DHS、AS)的关键位点，解除氨基酸负反馈调节作用，能够使植物超量合成2种芳香族必需氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸)，并进一步提高了另外4种必需氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)的含量，总体上显著提高了6种必需氨基酸的含量。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法。
背景技术
人体所需的8种必需氨基酸中有2种氨基酸(苯丙氨酸Phenylalanine，Phe、色氨酸Tryptophan，Trp)都是由植物芳香族氨基酸的莽草酸途径(Shikimate pathway)代谢合成的。因此，想要提高必需氨基酸的含量，可以利用植物的莽草酸途径进行改造和编辑。植物的莽草酸途径中有至少两个关键的节点受代谢产物的负反馈调节，分别是催化磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)和赤藓糖-4-磷酸(D-erythrose 4-phosphate，E4P)缩合的DAHP合成酶(DHS)，及催化分支酸(Chorismate)进入色氨酸合成途径的邻氨基苯甲酸合成酶(AS)。其中DHS受到下游产物色氨酸、分支酸及酪氨酸的负反馈调节，而AS也受到色氨酸含量的负反馈调节，因此正常情况下，植物体内无法形成大量的色氨酸等必需氨基酸。
研究发现，DHS基因与AS基因中存在一些负反馈调节的关键位点，在拟南芥等植物的突变体中负反馈调节可以被解除。在模式植物拟南芥中，找到了DHS基因的6个关键位点，对其进行定点突变后可解除下游不同物质的负反馈调节作用，而拟南芥突变体trp5中证明1个位点的突变就可以解除色氨酸对AS基因的负反馈调节作用，从而使下游色氨酸的含量显著提高。但是，在植物中，合理的利用DHS基因与AS基因中关键位点，对其进行突变，是否可以达到调节植物的莽草酸途径，提高必需氨基酸含量的目的，还需验证和研究。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的不足，并提供一种利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法。本发明选取番茄中SlDHS2基因的4个关键位点和SlAS基因的1个关键位点，对其进行定点突变，将突变后的基因序列构建到植物瞬时转化的表达载体中，对本氏烟草进行瞬时转化，提取转化后的本氏烟草叶片中的氨基酸，利用多反应监测模式(MRM)的方法测定氨基酸的含量，发现烟草叶片中6种必需氨基酸的含量均得到显著提高。
本发明所采用的具体技术方案如下：
本发明提供一种利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，包括以下步骤：
S1：选取番茄SlDHS2基因的4个关键位点和SlAS基因的1个关键位点，其中：
所述番茄SlDHS2基因的基因号为Solyc04g074480，将其CDS序列中第761个核苷酸由C突变为T，使编码的第254个氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸；第772个核苷酸由G突变为A，使编码的第258个氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸；第775个核苷酸由G突变A，使编码的第259个氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸；第781个核苷酸由G突变为A，使编码的第261个氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸；最终设计得到如SEQ ID NO.1所示的突变的番茄SlDHS2m序列；
所述番茄SlAS基因的基因号为Solyc06g006100，将其CDS序列中第997个核苷酸由G突变为A，使编码的第333个氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺，最终设计得到如SEQ IDNO.2所示的突变的番茄SlASm序列；
S2：基于植物瞬时表达载体pTE，分别结合突变的番茄SlDHS2m序列和突变的番茄SlASm序列，构建番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变的烟草瞬时表达载体，并转化大肠杆菌进行测序，得到包含正确位点突变序列的瞬时表达载体质粒pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm；
S3：采用瞬时转化法，将pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm载体质粒转入农杆菌中，同时在本氏烟草中表达pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm载体。
作为优选，所述S2中，植物瞬时表达载体pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm的构建方法如下：
S21：利用同源重组的方法，将突变位点设计至引物中，将突变的番茄SlDHS2m序列和突变的番茄SlASm序列分别分成2段进行PCR扩增，从而引入突变位点，所设计的引物如下：
使用引物SlDHS2-Q-1F、SlDHS2-Q-1R和SlDHS2-Q-2F、SlDHS2-Q-2R分别扩增序列如SEQ ID NO.3所示的SlDHS2m-1基因片段、序列如SEQ ID NO.4所示的SlDHS2m-2基因片段；使用引物SlAS-Q-1F、SlAS-Q-1R和SlAS-Q-2F、SlAS-Q-2R分别扩增序列如SEQ ID NO.5所示的SlASm-1基因片段以及序列如SEQ ID NO.6所示的SlASm-2基因片段；所述引物SlDHS2-Q-1F、SlDHS2-Q-1R、SlDHS2-Q-2F、SlDHS2-Q-2R、SlAS-Q-1F、SlAS-Q-1R、SlAS-Q-2F和SlAS-Q-2R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～14所示；
所述PCR扩增过程中，按照所设计的引物，以栽培番茄M82叶片的cDNA为模板，使用高保真酶KOD进行PCR扩增后回收纯化，扩增产物进行凝胶电泳分析检测后得到纯化的SlDHS2m-1基因片段、SlDHS2m-2基因片段、SlASm-1基因片段以及SlASm-2基因片段；
S22：基于植物瞬时表达载体pTE，采用反向PCR方法获得载体片段，具体方法如下：使用高保真酶KOD进行PCR扩增，模板采用pTE-HT空载质粒，所用引物为序列如SEQ IDNO.15所示的pTE-F和序列如SEQ ID NO.16所示的pTE-R；扩增产物进行凝胶电泳分析检测后回收纯化，得到纯化的pTE载体片段；
S23：使用同源重组的方法进行载体连接，具体方法如下：将纯化的SlDHS2m-1基因片段和SlDHS2m-2基因片段与pTE载体片段进行连接反应，得到第一连接液；将纯化的基因片段SlASm-1基因片段和SlASm-2基因片段与pTE载体片段进行连接反应，得到第二连接液；将所述第一连接液和第二连接液分别转入不同的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并置于含有卡那霉素的抗性LB培养基中培养，再对生长的菌落进行PCR鉴定，将PCR阳性的菌落振荡培养后提取质粒，进行测序，分别得到正确突变序列的瞬时表达载体质粒pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm。
进一步的，步骤S21中所述PCR扩增反应体系为：KOD高保真酶25uL，正向引物2uL，反向引物2uL，M82叶片cDNA：2uL，并加水至50uL；反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，65℃退火10s，68℃延伸30s，变性、退火、延伸36个循环，68℃延伸5min。
进一步的，步骤S22中所述PCR扩增反应体系为：KOD高保真酶25uL，正向引物2uL，反向引物2uL，稀释1000倍的pTE-HT空载质粒1uL，并加水至50uL；反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，68℃延伸2min10 s，变性、退火、延伸36个循环，68℃延伸5min。
进一步的，步骤S23中所述第一连接液的连接反应体系为：5μL 2×一步无缝克隆预混液，50ng纯化的SlDHS2m-1基因片段，50ng纯化的SlDHS2m-2基因片段，200ng纯化的pTE载体片段，加水至10μL；
所述第二连接液的连接反应体系为：5μL 2×一步无缝克隆预混液，50ng纯化的SlASm-1基因片段，50ng纯化的SlASm-2基因片段，200ng纯化的pTE载体片段，加水至10μL；所述连接反应程序均为：50℃，30min。
进一步的，步骤S23中所述的PCR鉴定的引物为序列如SEQ ID NO.17所示的pTE-HT-2F、序列如SEQ ID NO.18所示的Q-SlDHS2-2R和序列如SEQ ID NO.19所示的Q-SlAS-2R。
作为优选，采用所述瞬时转化法，表达pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm载体的具体方法如下：将所述瞬时表达载体质粒pTE-SlDHS2m、pTE-SlASm转入农杆菌GV3101感受态细胞中，并置于含有卡那霉素和利福平抗性的LB培养基中培养，将生长的菌落进行PCR鉴定，PCR鉴定所用的引物为序列如SEQ ID NO.17所示的pTE-HT-2F、序列如SEQ ID NO.18所示的Q-SlDHS2-2R和序列如SEQ ID NO.19所示的Q-SlAS-2R；
将所述PCR阳性的农杆菌活化、扩培后得到包含瞬时表达载体pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm的农杆菌菌液；按照菌液实际OD值计算各菌液需用体积，进行混匀：使各菌液终OD为0.5，且实际浓度比例为1:1；离心后收集农杆菌，随后进行洗涤、重悬、离心、收集沉淀重悬，得到农杆菌侵染液；将所述农杆菌侵染液注射到植物叶片内。
作为优选，完成所述S3步骤后，采集入渗的烟草叶片，提取氨基酸，利用多反应监测模式MRM方法测定烟草叶片中的氨基酸含量的变化。
进一步的，所述采集入渗的烟草叶片，提取氨基酸的方法如下：
待注射4-5天后，采集入渗的烟草叶片，液氮冷冻后，磨碎，于-80℃保存；称取100mg研磨后的样品，向其中加入400uL同位素标记氨基酸提取缓冲液，涡旋10秒，90℃加热10min，在冰上冷却5min，在4℃以13000×g离心10min；收集上清液，通过低结合亲水0.45μm过滤器过滤至液相进样瓶中，-20℃暂时保存。
进一步的，所述多反应监测模式MRM方法测定烟草叶片中的氨基酸含量的变化，具体如下：
使用三重四极杆质谱仪SCIEX Triple Quad 5500+对氨基酸进行分离测定，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm 2.1x50 mm；流动相A：10mM甲酸铵，0.2％v/v甲酸水，流动相B：乙腈，流速：0.4mL/min；柱温：40℃；洗脱过程：0-2min将流动相B由90％降至85.5％，2-5min将流动相B由85.5％降至54％，5-7min将流动相B由54％降至10％，7-8min将流动相B保持10％，8-9min将流动相B由10％升至90％，9-10min将流动相B保持90％；
设定最佳母离子、子离子、驻留时间、去簇电压DP和碰撞电压CE，利用多反应监测MRM获得峰面积，MRM峰面积与每次运行前后测量的已知标准浓度的校准图进行比较，计算各氨基酸的浓度。
本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
本发明通过定点突变植物莽草酸途径中的2个关键基因(DHS、AS)的关键位点，解除氨基酸负反馈调节作用的合理设计，使番茄SlDHS2基因和SlAS基因的氨基酸负反馈调节作用被打破，过表达番茄SlDHS2、SlAS基因位点突变的序列，可以在植物中合成大量的色氨酸、苯丙氨酸等人体必需氨基酸，极大地提高了植物的营养价值。
根据实验数据，采用本发明提供的方法，烟草叶片中色氨酸Trp的含量由4.46ug/g升高至1687.68ug/g，苯丙氨酸Phe的含量由7.08ug/g提高至2183.22ug/g，均提高300多倍；亮氨酸Leu、异亮氨酸Ileu、缬氨酸Val的含量也均提高了3～5倍；苏氨酸Thr的含量也从及微量提高至20.78ug/g，也得到了极显著提高。
附图说明
图1为番茄SlDHS2基因的CDS序列及关键位点突变；
图2为番茄SlAS基因的CDS序列及关键位点突变；
图3为番茄SlDHS2m基因和SlASm基因片段及pTE载体片段PCR扩增图，其中(a)为番茄SlDHS2m基因片段，(b)为SlASm基因片段，(c)为pTE载体片段；
图4为不同实验烟草叶片中6种必需氨基酸含量的对比图，其中(a)～(f)分别为色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
实施例1
本实施例提供了一种利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，具体步骤如下：
1.番茄SlDHS2基因和SlAS基因关键位点的选取与突变序列设计
(1)选取番茄SlDHS2基因的4个关键位点，对其进行定点突变，番茄SlDHS2的基因号为Solyc04g074480，CDS序列全长1626bp，选取的4个关键位点分别为：将CDS序列中第761个核苷酸由C突变为T，使编码的第254个氨基酸由丙氨酸A突变为缬氨酸V；第772个核苷酸由G突变为A，使编码的第258个氨基酸由甘氨酸G突变为精氨酸R；第775个核苷酸由G突变A，使编码的第259个氨基酸由甘氨酸G突变为精氨酸R；第781个核苷酸由G突变为A，使编码的第261个氨基酸由丙氨酸A突变为苏氨酸T。最终选定上述4个关键位点后，即可设计得到突变的番茄SlDHS2m序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，番茄SlDHS2基因的CDS序列及关键位点突变可参见图1。
(2)选取番茄SlAS基因的1个关键位点，对其进行定点突变，番茄SlAS的基因号为Solyc06g006100，CDS序列全长1764bp，选取的1个关键位点为：将CDS序列中第997个核苷酸由G突变为A，使编码的第333个氨基酸由天冬氨酸D突变为天冬酰胺N。最终选定上述1个关键位点后，即可设计得到突变的番茄SlASm序列，其序列如SEQ ID NO.2所示，番茄SlAS基因的CDS序列及关键位点突变可参见图2。
2.构建包含突变的番茄SlDHS2基因和SlAS基因的烟草瞬时表达载体
(1)利用同源重组的方法，将上一步骤中选取的突变位点设计至引物中，将突变的番茄SlDHS2m序列和突变的番茄SlASm序列各自分成2段进行扩增，从而引入突变位点，具体的引物设计如下：
使用引物SlDHS2-Q-1F、SlDHS2-Q-1R和SlDHS2-Q-2F、SlDHS2-Q-2R分别扩增所述突变的SlDHS2m序列中分拆出的SlDHS2m-1(含1个突变位点，序列如SEQ ID NO.3所示)和SlDHS2m-2(含3个突变位点，序列如SEQ ID NO.4所示)序列。使用引物SlAS-Q-1F、SlAS-Q-1R和SlAS-Q-2F、SlAS-Q-2R分别扩增所述突变的番茄SlASm序列中分拆出的SlASm-1(不含突变位点，序列如SEQ ID NO.5所示)和SlASm-2(含1个突变位点，序列如SEQ ID NO.6所示)序列。上述涉及到的引物SlDHS2-Q-1F、SlDHS2-Q-1R、SlDHS2-Q-2F、SlDHS2-Q-2R、SlAS-Q-1F、SlAS-Q-1R、SlAS-Q-2F和SlAS-Q-2R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～14所示。
在本实施例中，具体的PCR扩增方法如下：以栽培番茄(Solanum lycopersicum)M82叶片的cDNA为模板，按照上述设计的SEQ ID NO.7～14所示的引物，使用高保真酶KOD进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为：KOD高保真酶25uL，正向引物2uL，反向引物2uL，M82叶片cDNA：2uL，并加水至50uL；反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，65℃退火10s，68℃延伸30s，变性、退火、延伸36个循环，68℃延伸5min。
PCR扩增SlDHS2m-1和SlDHS2m-2序列后，需对产物进行凝胶电泳分析检测后回收纯化，得到纯化的基因片段SlDHS2m-1和SlDHS2m-2。同样的，扩增SlASm-1和SlASm-2序列后，需对产物进行凝胶电泳分析检测后回收纯化，得到纯化的基因片段SlASm-1和SlASm-2，具体PCR扩增产物的凝胶电泳分析结果图如图3(a)和图3(b)所示。
(2)烟草瞬时表达载体片段采用反向PCR方法，基于植物瞬时表达载体(本发明中记为pTE)使用高保真酶KOD进行PCR扩增，模板采用pTE-HT空载质粒(在本实施例中，植物瞬时表达载体pTE采用pEAQ载体，因此对应的模板pTE-HT空载质粒采用pEAQ-HT载体质粒)，所用正向和反向引物分别为pTE-F和pTE-R。pTE-F和pTE-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
本实施例中使用高保真酶KOD进行PCR扩增的反应体系为：KOD高保真酶25uL，正向引物2uL，反向引物2uL，稀释1000倍的pTE载体片段1uL，并加水至50uL；反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，68℃延伸2min10 s，变性、退火、延伸36个循环，68℃延伸5min。扩增产物进行凝胶电泳分析检测后回收纯化，得到纯化的载体片段pTE，PCR扩增产物的凝胶电泳分析结果图具体如图3(c)所示。
(3)利用同源重组的方法进行载体连接，具体方法如下：
将纯化的基因片段SlDHS2m-1和SlDHS2m-2与所述载体片段pTE进行连接反应，得到第一连接液。第一连接液的连接反应体系为：5μL 2×一步无缝克隆预混液，50ng纯化的基因片段SlDHS2m-1，50ng纯化的基因片段SlDHS2m-2，200ng pTE载体片段，加水至10μL。
将纯化的基因片段SlASm-1和SlASm-2与所述载体片段pTE进行连接反应，得到第二连接液。第二连接液的连接反应体系为：5μL 2×一步无缝克隆预混液(Toroivd OneStep Fusion Cloning Mix)，50ng纯化的基因片段SlASm-1，50ng纯化的基因片段SlASm-2，200ng pTE载体片段，加水至10μL。
上述第一连接液和第二连接液的连接反应程序均为：50℃，30min。完成连接反应后，将第一连接液和第二连接液分别转入不同的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并接种含有卡那霉素(50mg/L)抗性LB平板培养基中，于37℃倒置培养18h。挑选生长的菌落进行PCR鉴定，所用引物为pTE-HT-2F、Q-SlDHS2-2R(SlDHS2m序列)和Q-SlAS-2R(SlASm序列)，PCR鉴定过程的引物pTE-HT-2F、Q-SlDHS2-2R和Q-SlAS-2R的序列分别如SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19所示。将PCR阳性的菌落振荡培养后提取质粒，进行测序，分别得到正确突变序列的瞬时表达载体质粒pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm。
3.瞬时转化法转化至本氏烟草
采用瞬时转化法，将上述瞬时表达载体质粒pTE-SlDHS2m、pTE-SlASm转入农杆菌(Agrobacterium)GV3101感受态细胞中，并接种至含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(25mg/L)抗性的LB平板培养基中，于28℃倒置培养2～3d。挑选生长的菌落进行PCR鉴定，所用引物为pTE-HT-2F、Q-SlDHS2-2R(SlDHS2m序列)和Q-SlAS-2R(SlASm序列)。PCR鉴定过程的引物pTE-HT-2F、Q-SlDHS2-2R和Q-SlAS-2R分别如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示。
将PCR阳性的农杆菌在含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(25mg/L)抗性的LB平板培养基中活化，将新活化的单克隆接种到含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(25mg/L)抗性的LB液体培养基中，28℃条件下200rpm振荡培养至OD600为1.0～1.2。按照实际OD值计算出的各菌液体积并进行混匀(使各菌液终OD为0.5，且实际浓度比例为1:1)。
将上述农杆菌菌液经过离心(5000rpm，室温)收集农杆菌菌体，用30ml重悬液(含有10mM的MgCl2，10mM的MES)洗涤一次农杆菌菌体，重悬后再次离心，收集菌液。所得沉淀用12ml重悬液(含有10mM的MgCl2，10mM的MES，200uM的乙酰丁香酮AS)重悬，制成侵染液。室温放置2h后，将侵染液装入注射器内，从叶片下表皮注射到本氏烟草(Nicotianabenthamiana)叶片内(顶端以下3-5片)。注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。
本实施例中的上述过程中，所有用到的引物SEQ ID NO.7～19的核苷酸序列以及各自的用途汇总于表1中。
表1引物序列
4.利用多反应监测模式(MRM)方法测定烟草叶片中的氨基酸含量的变化
(1)将侵染液注射本氏烟草4-5天后，采集入渗的烟草叶片，液氮冷冻后，磨碎，于-80℃保存。称取100mg研磨后的样品，向其中加入400uL同位素标记氨基酸提取缓冲液(HLAEB，使用Stable Isotope Labeled Amino Acid Mix Solution1(Sigma)稀释、配置而成，具体成分见表2)，涡旋10秒，90℃加热10min，在冰上冷却5min，在4℃以13000×g离心10min，将上清液转移到1.5mL的新管中，通过低结合亲水0.45μm离心式聚四氟乙烯(PTFE)过滤器过滤至液相进样瓶中，-20℃暂时保存。
表2同位素标记氨基酸提取缓冲液成分表
(2)使用三重四极杆质谱仪SCIEX Triple Quad 5500+对氨基酸进行分离测定，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μa 2.1x50mm；流动相A：10mM甲酸铵，0.2％(v/v)甲酸水，流动相B：乙腈，流速：0.4mL/min，柱温：40℃，洗脱过程：0-2min将流动相B由90％降至85.5％，2-5min将流动相B由85.5％降至54％，5-7min将流动相B由54％降至10％，7-8min将流动相B保持10％，8-9min将流动相B由10％升至90％，9-10min将流动相B保持90％。
(3)利用多反应监测模式(MRM)方法测定烟草叶片中的氨基酸含量的变化，具体为：采用同位素稀释法定量，提取氨基酸时使用同位素标记氨基酸提取缓冲液，设定最佳母离子、子离子、驻留时间、去簇电压(DP)和碰撞电压(CE)，利用多反应监测(MRM)获得峰面积，具体设置参数见表3。
MRM峰面积与每次运行前后测量的已知标准浓度的校准图进行比较，计算各氨基酸的浓度。
表3 MRM的设置参数：电喷雾光离(正离子模式)
对比例1
本对比例提供一种构建包含突变的番茄SlDHS2m序列和原始番茄SlAS基因的瞬时表达载体质粒的方法，并采用上述瞬时表达载体质粒侵染烟草。具体如下：
如实施例1中步骤1、步骤2中的操作，将番茄SlDHS2基因的4个关键位点的进行突变，得到突变的番茄SlDHS2m序列；使用SlAS-Q-1F、SlAS-Q-2R，以栽培番茄M82的叶片cDNA为模板，扩增SlAS基因的原始全长CDS，不进行突变。构建包含突变的番茄SlDHS2m序列(含4个突变位点)的烟草瞬时表达载体pTE-SlDHS2m，和包含正常番茄SlAS基因(不突变)的烟草瞬时表达载体pTE-SlAS。
如实施例1中步骤3和4中操作，将上述烟草瞬时表达载体pTE-SlDHS2m和pTE-SlAS转化至GV3101农杆菌，并侵染本氏烟草。利用多反应监测模式(MRM)方法进行氨基酸含量的测定，与实施例1进行比较。
对比例2
本对比例提供一种构建包含原始番茄SlDHS2基因和突变的番茄SlASm序列的瞬时表达载体质粒的方法，并采用上述瞬时表达载体质粒侵染烟草。具体如下：
如实施例1中步骤1中的操作，将番茄SlAS基因的1个关键位点的进行突变，得到突变的番茄SlASm序列；使用引物SlDHS2-Q-1F、SlDHS2-Q-2R，以栽培番茄M82的叶片cDNA为模板扩增SlDHS2基因的全长CDS，不进行突变。构建包含原始番茄SlDHS2基因(不突变)的烟草瞬时表达载体pTE-SlDHS2，和突变的番茄SlASm序列(含1个突变位点)的烟草瞬时表达载体pTE-SlASm。
如实施例1中步骤3和4中操作，将上述烟草瞬时表达载体pTE-SlDHS2和pTE-SlASm转化至GV3101农杆菌，并侵染本氏烟草。利用多反应监测模式(MRM)方法进行氨基酸含量的测定，结果与实施例1进行比较。
对比例3
本对比例提供一种构建包含原始番茄SlDHS2基因和原始番茄SlAS基因的瞬时表达载体质粒的方法，并采用上述瞬时表达载体质粒侵染烟草。具体如下：
结合实施例1的步骤1、步骤2，使用SlDHS2-Q-1F、SlDHS2-Q-2R，以栽培番茄M82的叶片cDNA为模板扩增SlDHS2基因的全长CDS，不进行突变；使用SlAS-Q-1F、SlAS-Q-2R，以栽培番茄M82的叶片cDNA为模板扩增SlAS基因的全长CDS，不进行突变。构建包含原始番茄SlDHS2基因(不突变)的烟草瞬时表达载体pTE-SlDHS2，和包含原始的番茄SlAS基因(不突变)的烟草瞬时表达载体pTE-SlAS。
如实施例1中步骤3和4中操作，将上述烟草瞬时表达载体pTE-SlDHS2和pTE-SlAS转化至GV3101农杆菌，并侵染本氏烟草。利用多反应监测模式(MRM)方法进行氨基酸含量的测定，结果与实施例1进行比较。
对比例4
本对比例将pTE-HT空载质粒转化至GV3101农杆菌，并侵染本氏烟草。利用多反应监测模式(MRM)方法进行氨基酸含量的测定，结果与实施例1进行比较。具体操作步骤如实施例1步骤3和步骤4。
对比例5
本对比例采集未侵染的野生型本氏烟草叶片，并如实施例1的步骤4方法，利用多反应监测模式(MRM)方法对野生型本氏烟草叶片进行氨基酸含量的测定，结果与实施例1进行比较。
实施例1以及对比例1～5检测的6种必需氨基酸含量如图4所示。
从实验结果可知，对比例4中注射pTE-HT空载体后各种氨基酸的含量与对比例5中的野生型本氏烟草含量接近，差异较小。
实施例1中注射包含突变的番茄SlDHS2m序列和SlASm序列的瞬时表达载体的烟草叶片中，6种必需氨基酸的含量则均显著提高，高于对比例4(注射pTE-HT空载体)，其中，色氨酸Trp的含量由4.46ug/g升高至1687.68ug/g，苯丙氨酸Phe的含量由7.08ug/g提高至2183.22ug/g，均提高300多倍；亮氨酸Leu、异亮氨酸Ileu、缬氨酸Val的含量分别从2.42ug/g提高至10.87ug/g，3.55ug/g提高至16.81ug/g，8.19ug/g提高至25.06ug/g，提高了3-5倍。在对比例4(注射pTE-HT空载体)中，苏氨酸Thr的含量极低，但在实施例1中的含量却提高至20.78ug/g，含量也得到了极显著提高。
其余几组对比例中，仅注射包含1个突变基因或不进行位点突变原始的SlDHS2和SlAS基因的瞬时表达载体的烟草叶片中，进行过表达后，烟草叶片中的6种氨基酸的含量也略有升高，但含量升高不显著，均低于实施例1中的含量。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：选取番茄SlDHS2基因的4个关键位点和SlAS基因的1个关键位点，其中：
所述番茄SlDHS2基因的基因号为Solyc04g074480，将其CDS序列中第761个核苷酸由C突变为T，使编码的第254个氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸；第772个核苷酸由G突变为A，使编码的第258个氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸；第775个核苷酸由G突变A，使编码的第259个氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸；第781个核苷酸由G突变为A，使编码的第261个氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸；最终设计得到如SEQ ID NO.1所示的突变的番茄SlDHS2m序列；
所述番茄SlAS基因的基因号为Solyc06g006100，将其CDS序列中第997个核苷酸由G突变为A，使编码的第333个氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺，最终设计得到如SEQ ID NO.2所示的突变的番茄SlASm序列；
S2：基于植物瞬时表达载体pTE，分别结合突变的番茄SlDHS2m序列和突变的番茄SlASm序列，构建番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变的烟草瞬时表达载体，并转化大肠杆菌进行测序，得到包含正确位点突变序列的瞬时表达载体质粒pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm；
S3：采用瞬时转化法，将pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm载体质粒转入农杆菌中，同时在本氏烟草中表达pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm载体。
2.根据权利要求1所述的利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，所述S2中，植物瞬时表达载体pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm的构建方法如下：
S21：利用同源重组的方法，将突变位点设计至引物中，将突变的番茄SlDHS2m序列和突变的番茄SlASm序列分别分成2段进行PCR扩增，从而引入突变位点，所设计的引物如下：
使用引物SlDHS2-Q-1F、SlDHS2-Q-1R和SlDHS2-Q-2F、SlDHS2-Q-2R分别扩增序列如SEQID NO.3所示的SlDHS2m-1基因片段、序列如SEQ ID NO.4所示的SlDHS2m-2基因片段；使用引物SlAS-Q-1F、SlAS-Q-1R和SlAS-Q-2F、SlAS-Q-2R分别扩增序列如SEQ ID NO.5所示的SlASm-1基因片段以及序列如SEQ ID NO.6所示的SlASm-2基因片段；所述引物SlDHS2-Q-1F、SlDHS2-Q-1R、SlDHS2-Q-2F、SlDHS2-Q-2R、SlAS-Q-1F、SlAS-Q-1R、SlAS-Q-2F和SlAS-Q-2R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～14所示；
所述PCR扩增过程中，按照所设计的引物，以栽培番茄M82叶片的cDNA为模板，使用高保真酶KOD进行PCR扩增后回收纯化，扩增产物进行凝胶电泳分析检测后得到纯化的SlDHS2m-1基因片段、SlDHS2m-2基因片段、SlASm-1基因片段以及SlASm-2基因片段；
S22：基于植物瞬时表达载体pTE，采用反向PCR方法获得载体片段，具体方法如下：使用高保真酶KOD进行PCR扩增，模板采用pTE-HT空载质粒，所用引物为序列如SEQ ID NO.15所示的pTE-F和序列如SEQ ID NO.16所示的pTE-R；扩增产物进行凝胶电泳分析检测后回收纯化，得到纯化的pTE载体片段；
S23：使用同源重组的方法进行载体连接，具体方法如下：将纯化的SlDHS2m-1基因片段和SlDHS2m-2基因片段与pTE载体片段进行连接反应，得到第一连接液；将纯化的基因片段SlASm-1基因片段和SlASm-2基因片段与pTE载体片段进行连接反应，得到第二连接液；将所述第一连接液和第二连接液分别转入不同的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并置于含有卡那霉素的抗性LB培养基中培养，再对生长的菌落进行PCR鉴定，将PCR阳性的菌落振荡培养后提取质粒，进行测序，分别得到正确突变序列的瞬时表达载体质粒pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm。
3.根据权利要求2所述的利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，步骤S21中所述PCR扩增反应体系为：KOD高保真酶25uL，正向引物2uL，反向引物2uL，M82叶片cDNA：2uL，并加水至50uL；反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，65℃退火10s，68℃延伸30s，变性、退火、延伸36个循环，68℃延伸5min。
4.根据权利要求2所述的利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，步骤S22中所述PCR扩增反应体系为：KOD高保真酶25uL，正向引物2uL，反向引物2uL，稀释1000倍的pTE-HT空载质粒1uL，并加水至50uL；反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火10s，68℃延伸2min10 s，变性、退火、延伸36个循环，68℃延伸5min。
5.根据权利要求2所述的利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，步骤S23中所述第一连接液的连接反应体系为：5μL2×一步无缝克隆预混液，50ng纯化的SlDHS2m-1基因片段，50ng纯化的SlDHS2m-2基因片段，200ng纯化的pTE载体片段，加水至10μL；
所述第二连接液的连接反应体系为：5μL 2×一步无缝克隆预混液，50ng纯化的SlASm-1基因片段，50ng纯化的SlASm-2基因片段，200ng纯化的pTE载体片段，加水至10μL；所述连接反应程序均为：50℃，30min。
6.根据权利要求2所述的利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，步骤S23中所述的PCR鉴定的引物为序列如SEQ ID NO.17所示的pTE-HT-2F、序列如SEQ ID NO.18所示的Q-SlDHS2-2R和序列如SEQ ID NO.19所示的Q-SlAS-2R。
7.根据权利要求1所述的利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，采用所述瞬时转化法，表达pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm载体的具体方法如下：将所述瞬时表达载体质粒pTE-SlDHS2m、pTE-SlASm转入农杆菌GV3101感受态细胞中，并置于含有卡那霉素和利福平抗性的LB培养基中培养，将生长的菌落进行PCR鉴定，PCR鉴定所用的引物为序列如SEQ ID NO.17所示的pTE-HT-2F、序列如SEQ ID NO.18所示的Q-SlDHS2-2R和序列如SEQ ID NO.19所示的Q-SlAS-2R；
将所述PCR阳性的农杆菌活化、扩培后得到包含瞬时表达载体pTE-SlDHS2m和pTE-SlASm的农杆菌菌液；按照菌液实际OD值计算各菌液需用体积，进行混匀：使各菌液终OD为0.5，且实际浓度比例为1:1；离心后收集农杆菌，随后进行洗涤、重悬、离心、收集沉淀重悬，得到农杆菌侵染液；将所述农杆菌侵染液注射到植物叶片内。
8.根据权利要求1所述的利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，完成所述S3步骤后，采集入渗的烟草叶片，提取氨基酸，利用多反应监测模式MRM方法测定烟草叶片中的氨基酸含量的变化。
9.根据权利要求8所述的利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，所述采集入渗的烟草叶片，提取氨基酸的方法如下：
待注射4-5天后，采集入渗的烟草叶片，液氮冷冻后，磨碎，于-80℃保存；称取100mg研磨后的样品，向其中加入400uL同位素标记氨基酸提取缓冲液，涡旋10秒，90℃加热10min，在冰上冷却5min，在4℃以13000×g离心10min；收集上清液，通过低结合亲水0.45μm过滤器过滤至液相进样瓶中，-20℃暂时保存。
10.根据权利要求8所述的利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，所述多反应监测模式MRM方法测定烟草叶片中的氨基酸含量的变化，具体如下：
使用三重四极杆质谱仪SCIEX Triple Quad 5500+对氨基酸进行分离测定，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm 2.1x50 mm；流动相A：10mM甲酸铵，0.2％v/v甲酸水，流动相B：乙腈，流速：0.4mL/min；柱温：40℃；洗脱过程：0-2min将流动相B由90％降至85.5％，2-5min将流动相B由85.5％降至54％，5-7min将流动相B由54％降至10％，7-8min将流动相B保持10％，8-9min将流动相B由10％升至90％，9-10min将流动相B保持90％；
设定最佳母离子、子离子、驻留时间、去簇电压DP和碰撞电压CE，利用多反应监测MRM获得峰面积，MRM峰面积与每次运行前后测量的已知标准浓度的校准图进行比较，计算各氨基酸的浓度。
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