CN115819528A - 一种桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桑黄bHLH类转录因子Pb‑bHLH6及其编码基因与应用，属于食用菌基因工程领域。桑黄bHLH类转录因子Pb‑bHLH6氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，并且公开了该编码基因在调控桑黄三萜合成中的用途。同时还公开了一种过表达重组载体，其包含转录因子Pb‑bHLH6编码基因序列。本发明通过量表达Pb‑bHLH6的转基因桑黄菌株(T)与野生型(WT)相比，三萜含量可提高10.37％，说明所获得的转录因子Pb‑bHLH6参与桑黄三萜生物合成的调控，在实际生产中应用有助于提高桑黄三萜含量。

Description

一种桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于食用菌基因工程领域，具体涉及一种桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6及其编码基因与应用。

背景技术

桑黄(Phellinus baumii)作为我国传统名贵中药材之一，在《药性论》、《本草纲目》和《神农本草经》等历代本草著作中均有明确记载。传统中医认为，桑黄味微苦、性寒，多用于治疗痢疾、盗汗、血崩、脾虚泄泻等症；桑黄现代药理研究始于1968年，Ikekaw等研究发现，桑黄提取物对小鼠肉瘤细胞(S180)的抑制率为96.7％，此后近几十年来，桑黄一直被推崇为是一种有益健康的中草药，目前已被国际公认为抗肿瘤效果最好的药用真菌之一，被称为“森林黄金”。近年来，国内外学者对桑黄的化学成分及药理作用进行了深入研究，已从桑黄中分离获得了多种化合物，其中桑黄三萜因具有抑制多种癌细胞生长以及抗衰老等活性被认为是桑黄主要的药效成分。然而自然界中桑黄三萜含量较低，其结构较为复杂，化学合成困难，这就极大限制了它在抗肿瘤等方面的应用。虽然通过添加外源物质能够在一定程度上促进桑黄三萜的生物合成，但是由于目前缺乏对桑黄三萜生物合成调控机理的了解，使得该方法三萜生物合成量低，靶向性不强，因此通过分子手段揭示桑黄三萜合成的转录调控机制，利用基因工程手段提高桑黄三萜含量可有效突破瓶颈。

虽然人类对萜类的认知越来越广，但萜类生物合成途径中存在多个限速酶且限速步骤难以确定，通过转录因子来调节基因表达量，从而促进萜类物质合成意义重大。据报道，bHLH转录因子与植物中萜类化合物的合成密切相关。例如，在拟南芥中，bHLH类转录因子MYC2与萜类合酶基因的启动子区域结合，催化倍半萜的形成。在黄花蒿中，bHLH1蛋白与青蒿素生物合成途径中ADS和CYP71AV1基因启动子中的E-box元件结合，调节青蒿素的生物合成。Chuang等在观赏性植物蝴蝶兰中过表达bHLH4和bHLH6都能增加蝴蝶兰挥发性单萜积累量，兰花香气随之显著提高；Mertens等研究发现另一种bHLH转录因子TSAR1/2可以结合HMGR1启动子元件，调控该基因表达以促进苜蓿三萜皂苷生物合成。关于桑黄三萜的生物合成，现已知是通过甲羟戊酸(Mevalonate，MVA)途径合成。到目前为止，较多的研究结果仍集中在代谢途径的关键酶，而对调控桑黄三萜合成的转录因子研究则非常有限。因此，为得到高产三萜桑黄，深入研究调控三萜合成的转录因子及其作用的分子机制显得尤其重要。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的是提供一种桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6及其编码基因，用于参与桑黄三萜生物合成的调控，可以显著提高桑黄三萜的含量。

本发明所采用的技术方案如下：一种桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，提供一种桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明的另一目的是提供如上所述的编码基因在调控桑黄三萜生物合成中的用途，在实际生产中应用有助于提高桑黄三萜的含量。

进一步，如上所述的用途将所述编码基因转入桑黄基因组中，并在转基因菌株中超量表达，能使桑黄三萜含量提高。

本发明的另一目的是提供一种过表达重组载体，其包含如上所述的转录因子Pb-bHLH6编码基因cDNA全长核苷酸序列。

进一步的，所述的过表达重组载体是将所述的桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6的编码基因插入pCAMBIA1301-gpd-gpd载体的BglⅡ酶切位点间所得。

本发明的另一目的是提供一种转基因菌株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将如上所述的过表达重组载体转入桑黄基因组中，筛选获得桑黄转基因菌株。

进一步的，如上所述的桑黄转基因菌株与野生型相比，桑黄三萜含量提高。

本发明的优点及有益效果：本发明的过表达Pb-bHLH6基因的桑黄菌株可以显著提高桑黄三萜的含量，提高10.37％，结果表明转录因子Pb-bHLH6参与桑黄三萜生物合成的调控，在实际生产中应用有助于提高桑黄三萜的含量，该基因可作为重要的基因资源，在桑黄培育基因工程中得到应用。

附图说明

图1是桑黄Pb-bHLH6基因的PCR扩增电泳图，M：DL2000 DNA marker；1：Pb-bHLH6基因cDNA全长扩增结果；

图2是桑黄Pb-bHLH6蛋白三级结构预测图；

图3是桑黄pCAMBIA1301-gpd-gpd-Pb-bHLH6过表达载体的构建；

图4是转基因桑黄菌株和野生型菌株的潮霉素抗性基因PCR检测，M：DL2000 DNAmarker；T：转基因桑黄菌株；WT：野生型桑黄菌株；

图5是转基因桑黄菌株与野生型菌株的总三萜含量比较，WT：野生型桑黄菌株；T：转基因桑黄菌株。

具体实施方式

本发明提供了一种桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6，以桑黄DL101菌株RNA反转录的cDNA为模版，通过设计引物、基因扩增、序列测定，获得了Pb-bHLH6基因全长序列，并确定了它的核苷酸序列和氨基酸序列；进一步将Pb-bHLH6基因构建到表达载体pCAMBIA1301-gpd-gpd中，并转化根癌农杆菌EHA105，采用根癌农杆菌介导桑黄的遗传转化来鉴定Pb-bHLH6的功能。下面举例对本发明做进一步的说明：

1、桑黄Pb-bHLH6基因的克隆

对桑黄菌种DL101(该桑黄菌DL101，Phellinus baumii DL101，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮政编码：430072，保藏日期为2011年4月25日，保藏编号为：CCTCC No：M 2011137)采用PDA培养基进行活化，25℃培养8～10d，收集桑黄菌丝体，并使用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒对桑黄菌丝体总RNA进行提取，经检测合格的RNA样品，按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)试剂盒说明书将RNA样品反转录为cDNA，置于-20℃保存备用。

根据本实验室测得的桑黄转录组数据库分析、筛选得到Pb-bHLH6基因，根据基因全长序列设计一对克隆引物：正向引物序列F1为：5ˊ-ATGGCTACAATGCCGCTGCT-3ˊ；反向引物序列R1为：5ˊ-CTATGGCTCGTCTTCGTCGTC-3ˊ。以上述-20℃保存的桑黄cDNA为模板，采用100μL体系进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物如图1所示，与预测大小相符，PCR产物经胶回收纯化后分别与pMD18-T载体(TaKaRa，大连)连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，进行测序。结果表明，Pb-bHLH6含有一个1140bp的开放阅读框(ORF)，编码379个氨基酸。

2、桑黄Pb-bHLH6基因的生物信息学分析

采用ExPASy服务器上的ProtParam tool软件对Pb-bHLH6基因编码的氨基酸序列进行分子量大小、等电点等理化性质分析，结果显示其分子量为41.1kDa，等电点为5.97；对该蛋白的保守结构域预测显示Pb-bHLH6蛋白属于basic Helix Loop Helix(bHLH)domainsuperfamily；采用ExPASy服务器上的ProtScale软件对氨基酸的亲/疏水性分析，Pb-bHLH6蛋白中亲水性氨基酸数量多于疏水性氨基酸，属于亲水性蛋白；分别使用在线工具TMHMMServer v.2.0和SignalP 5.0server对蛋白的跨膜区和信号肽进行分析，结果表明Pb-bHLH6蛋白不具跨膜结构，不含信号肽；通过ExPASy服务器上的GOR在线软件对Pb-bHLH6蛋白进行二级结构预测，表明Pb-bHLH6蛋白的主要组成部分包括29.82％的α-螺旋、2.90％的β转角、10.55％的延伸链和56.73％的无规卷曲组成；通过生物信息软件Expasy对桑黄Pb-bHLH6蛋白进行三级结构预测，使用SWISS-MODEL数据库预测构建桑黄Pb-bHLH6转录因子蛋白的三级结构模型(图2)。将得到的cDNA序列进行Blastx比对，结果表明，该序列与地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea)、真姬菇(Lyophyllum shimeji)、香菇(Lentinula edodes)bHLH转录因子的相似性分别为71.98％、65.89％、62.89％。

3、桑黄Pb-bHLH6基因的功能鉴定

对Pb-bHLH6基因编码区进行克隆，以桑黄cDNA为模板，根据Pb-bHLH6编码区设计引物并分别引入BglⅡ酶切位点，

FB：GGAagatctATGGCTACAATGCCGCTGCT

RB：GGAagatctCTATGGCTCGTCTTCGTCGTC，

其中小写字母为引入的BglⅡ酶切位点。

将pCAMBIA1301-gpd-gpd重组质粒(前期已将pCAMBIA1301载体上的两个CaMV35Spromoter替换为香菇gpd promoter)用限制性内切酶BglⅡ进行单酶切后切胶回收，与同样经过BglⅡ单酶切的Pb-bHLH6基因编码区的纯化产物采用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒进行测序。

将上述测序结果正确的质粒，采用冻融法转入根癌农杆菌EHA105感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性克隆，即获得Pb-bHLH6过表达载体pCAMBIA1301-gpd-gpd-Pb-bHLH6，构建过程如图3所示。Pb-bHLH6过表达载体通过农杆菌介导法转化桑黄原生质体，主要步骤为：将上述验证含有重组质粒pCAMBIA1301-gpd-gpd-Pb-bHLH6的农杆菌菌液加入LB培养基，于28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5～0.6后，离心收集菌体，沉淀用IM(诱导培养基)重悬，28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.2～0.3；每10⁶～10⁷个桑黄原生质体与200μL上述农杆菌混合，同时添加乙酰丁香酮(终浓度为0.2mM)，置于25℃共培养36h；用0.6M甘露醇洗涤一次，离心收集菌体后再加入1ml 0.6M甘露醇溶解沉淀，取200μl涂布于再生抗性培养基(含20μg/ml潮霉素)上，28℃避光倒置培养。以经潮霉素筛选的抗性菌株基因组DNA为模板，以野生型菌株基因组DNA为阴性对照，以引物HygF：CGATCGACAGATCCGGTCGGCA和HygR：GTGCTTGACATTGGGGAGTTTAG进行PCR反应，结果如图4所示，扩增片段大小与预期相符，表明目的基因已成功转入桑黄中。

将鉴定出的转基因菌株(T)和野生型菌株(WT)分别接种于PD液体培养基，25℃，180r/min振荡培养6d后收集菌丝体，将收集的菌丝体置于60℃温箱中烘干至恒重，备用。

(1)标准曲线的绘制

准确称取10.0mg白桦酯醇标准品，加95％乙醇溶解定容至50mL，摇匀，作为标准溶液。分别精密吸取对照品溶液0μL、200μL、400μL、600μL、800μL、1mL于具塞试管中，70℃水浴挥去溶剂。加入新配制的5％香草醛—冰醋酸溶液0.20mL，再加入高氯酸0.80mL摇匀，于70℃恒温水浴20min，迅速冷却，用乙酸乙酯定容至5mL，摇匀，在551nm处测定吸光值。以0号管为对照，以白桦酯醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)菌丝体总三萜含量测定

准确称取60℃烘干至恒重的菌丝体粉末0.1g，加入2mL的60％乙醇超声提取30min(100W，40kHz)。吸取提取后的桑黄总三萜乙醇提取物溶液0.1mL于具塞试管中，水浴挥去溶剂，其他步骤与(1)相同，在551nm下测定吸光度，以不加样品溶液作空白对照，用标准曲线回归方程计算出样品总三萜含量。

结果表明，与野生型菌株相比，转基因桑黄菌株的总三萜含量提高10.37％(如图5所示)。

Claims (8)

1.一种桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求2所述的一种桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6编码基因在调控桑黄三萜合成中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，将所述编码基因转入桑黄基因组中，并在转基因菌株中超量表达，能使桑黄总三萜含量提高。

5.一种过表达重组载体，其特征在于，其包含权利要求2所述的转录因子Pb-bHLH6编码基因cDNA全长核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的过表达重组载体，其特征在于：所述的过表达重组载体是将所述的桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH6的编码基因插入pCAMBIA1301-gpd-gpd载体的Bgl Ⅱ酶切位点间所得。

7.一种转基因菌株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将权利要求5所述的过表达重组载体转入桑黄基因组中，筛选获得桑黄转基因菌株。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的桑黄转基因菌株与野生型相比，桑黄总三萜含量提高。

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