CN113481219B - 一种FsCYP51基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种FsCYP51基因及其应用。本发明以甘蔗梢腐病菌甘蔗镰刀菌(Fusarium sacchari)为试验材料，根据基因组测序数据设计特异性引物克隆得到了FsCYP51基因全长和CDS全长。同时，根据克隆到的FsCYP51基因全长和CDS全长构建了多价HIGS植物表达载体，并利用基因枪介导的遗传转化方法将干扰片段成功转化至甘蔗受体材料，为研究FsCYP51基因功能和创制抗梢腐病甘蔗种质奠定基础。

Description

一种FsCYP51基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种FsCYP51基因及其应用。

背景技术

甘蔗(Saccharum officinarum L.)属禾本科甘蔗属植物，是我国最主要的糖料作物。甘蔗梢腐病(Pokkah boeng disease)是一种世界分布广泛的真菌性病害。甘蔗镰刀菌(Fusarium sacchari)是中国甘蔗梢腐病的主要病原菌之一。近几年由于甘蔗的连年种植以及新台糖系列等易感病品种的大面积推广，我国的甘蔗梢腐病呈现爆发的趋势，严重影响了甘蔗的生产和种植区经济的发展，已逐渐成为我国甘蔗的主要病害之一。因此对甘蔗梢腐病的防控将是甘蔗产业急需解决的问题。

甾醇14α-去甲基化酶(Sterol 14α-demethylase，P450_14DM，CYP51)属于细胞色素P450超家族成员，是生物细胞膜形成所需的一个非常重要的酶。CYP51的缺乏将导致细胞膜无法正常形成，最终导致真菌无法正常生长。目前研究人员已在多种病原真菌中发现了CYP51的同源基因，不同真菌的CYP51基因数目是不尽相同的，有的真菌仅含有CYP51A一种，某些真菌如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidμLans)、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)等有CYP51A和CYP51B两种，指状青霉(Penicillium digitatum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)等有CYP51A、CYP51B和CYP51C三种。

通过对CYP51同源基因的功能研究发现CYP51基因的功能非常丰富，在病原菌的抗药性、致病性、孢子产生等方面起着重要作用。例如在引起柑橘腐烂的指状青霉中，PdCYP51A和PdCYP51B基因会影响它的抗药性。在一些丝状真菌如烟曲霉菌、禾谷镰刀菌中发现的同源CYP51基因被证实与病原菌对DMI杀菌剂的敏感性有关，这可能是真菌抗DMI的一种新机制。在禾谷镰刀菌中，FgCYP51A和FgCYP51B都能编码14α-去甲基化酶，FgCYP51B同时对病原菌的子囊孢子形成起重要作用，FgCYP51C不编码14α-脱甲基化酶但对病原菌的完全毒力至关重要。

寄主诱导的基因沉默(Host-induced gene silencing，HIGS)是基于RNAi的一种新型抗病育种技术，通过在寄主植物中表达病原菌基因的dsRNA来沉默病原菌中靶标基因的表达达到抗病的效果。HIGS技术不仅可以用来研究病原菌重要致病基因功能，而且也是创制抗病转基因作物的一种新方法，在小麦条锈病、小麦赤霉病、水稻稻瘟病、香蕉枯萎病等的研究中有着充分的运用，但目前HIGS技术在甘蔗上的应用较少，因此建立适用于甘蔗梢腐病菌基因功能研究的HIGS体系是研究甘蔗梢腐病菌致病机制所必需的，也是创制抗病甘蔗新种制的一种快速有效的方法。

利用HIGS技术沉默病原菌CYP51基因表达可以提高转基因作物的抗病性。Koch等利用HIGS技术在拟南芥和大麦中表达了禾谷镰刀菌(F.graminearum)FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C基因串联片段的dsRNA，得到的转基因大麦和拟南芥对禾谷镰刀菌的抗性显著提高。目前关于甘蔗镰刀菌CYP51基因的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种FsCYP51基因及其CDS区序列。同时，根据克隆到的FsCYP51基因全长和CDS全长构建了多价HIGS植物表达载体，并利用基因枪介导的遗传转化方法将干扰片段成功转化至甘蔗受体材料，为研究FsCYP51基因功能和创制抗梢腐病甘蔗种质奠定基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种FsCYP51基因，所述FsCYP51基因的核苷酸序列如SEQ NO：1所示。

优选的，所述FsCYP51基因CDS区核苷酸序列如SEQ NO：2所示。

本发明还提供了一种FsCYP51基因编码的蛋白质，所述FsCYP51基因编码的蛋白质序列如SEQ NO：3所示。

本发明还进一步的提供了一种FsCYP51基因在培育抗梢腐病转基因甘蔗中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)是生物细胞膜合成所需的一个非常重要的酶，在病原菌的耐药性、致病性和生长繁殖等方面发挥着非常重要的作用。研究表明干扰真菌的CYP51基因表达导致其无法正常生长，显著降低其致病性。

本发明以甘蔗梢腐病菌甘蔗镰刀菌(Fusarium sacchari)为试验材料，根据基因组测序数据设计特异性引物克隆得到了FsCYP51基因全长和CDS全长。生物信息学分析表明，该基因序列全长1947bp，编码区由两个内含子和三个外显子组成，CDS全长1554bp，编码517个氨基酸，编码蛋白理论相对分子量为58.61kDa。其编码蛋白的二级结构主要由α螺旋和无规卷曲构成，具有典型的CYP51保守结构域。预测其亚细胞定位于细胞膜，且存在两个跨膜区域。系统进化分析表明，FsCYP51基因属于CYP51C这一类，与串珠镰刀菌(F.verticillioides)的CYP51C基因亲缘关系最近。

同时，根据克隆到的基因全长和CDS全长构建了多价HIGS植物表达载体，并利用基因枪介导的遗传转化方法将干扰片段成功转化至甘蔗受体材料，为研究FsCYP51基因功能和创制抗梢腐病甘蔗种质奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为克隆基因电泳图；

图2为FsCYP51基因结构；

图3为FsCYP51蛋白的跨膜结构预测；

图4为FsCYP51蛋白氨基酸序列的磷酸化修饰预测；

图5为FsCYP51蛋白的结构分析(二级结构预测)；

图6为FsCYP51蛋白的结构分析(三级结构预测)；

图7为FsCYP51蛋白功能结构域分析；

图8为FsCYP51基因系统进化树分析；

图9为HIGS载体构建电泳图；

图10为转基因甘蔗植株PCR检测电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

材料：甘蔗梢腐病主要致病菌甘蔗镰刀菌(Fusarium sacchari)(出自：Lin,Z.,Xu,S.,Que,Y.,Wang,J.,Comstock,J.C.,&Wei,J.,et al.(2014).Species-specificdetection and identification of fusarium species complex,the causal agent ofsugarcane pokkah boeng in china.Plos One,9.)野生型菌株CNO-1由课题组分离获得，并对其进行了精细基因组测序与序列分析，获得了FsCYP51基因全长和CDS全长序列；易感梢腐病甘蔗品种“中蔗1号”由课题组提供。

试剂：反转录试剂盒、各类限制性核酸内切酶、T4-DNA连接酶、DNA Marker购自Takara(大连)公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购买自北京天根生化科技有限公司；引物合成、序列测序由上海生工生物工程公司完成；HIGS植物干扰表达载体pBWA(V)BU载体由课题组保存；用于RNA提取用的Trizol试剂购于上海生工公司；各类PCRMix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；平端克隆

-Blunt Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司；基因枪(Bio-Rad PDS-1000/He)及其耗材均购自Bio-Rad公司；其它试剂和耗材购自上海生工生物工程有限公司或国产分析纯试剂。

实施例1 基因组DNA和总RNA的提取及cDNA合成及甘蔗镰刀菌FsCYP51基因全长和CDS全长克隆

用SDS法提取甘蔗镰刀菌基因组DNA。使用Trizol法提取甘蔗镰刀菌总RNA。用1％琼脂糖凝胶电泳和超微量紫外分光光度计(Nanodrop)检测所提取的DNA和RNA的纯度和浓度。使用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技)进行cDNA合成，反应体系与程序参照试剂盒说明书进行。提取的基因组DNA用于基因全长克隆，逆转录得到的cDNA用于CDS全长克隆。

表1引物序列

注：小写字母序列表示限制性内切酶Aar I的识别位点(引物序列对应序列表中如SEQ NO：7～SEQ NO：20所示)

根据基因组测序的结果，用Primer Premier 5分别设计扩增基因全长的特异引物FsCYP51QC-F/R和扩增基因CDS的特异引物FsCYP51CDS-F/R(表1)。用引物FsCYP51QC-F/R和引物FsCYP51CDS-F/R分别以基因组DNA和cDNA为模板进行PCR，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收长度符合预期的条带，连接到克隆载体

-Blunt上，转化大肠杆菌(E.coli)Top10感受态细胞，PCR鉴定阳性克隆后提取质粒送上海生工测序。

结果：将提取的甘蔗镰刀菌总RNA和基因组DNA用Nanadrop测量浓度和纯度，结果显示提取的RNA的浓度在300ng/μL左右，A260/A280比值在1.9-2.1的范围内，DNA的浓度在700ng/μL左右，A260/A280比值在1.8-2.0的范围内，1％琼脂糖凝胶电泳显示提取的DNA和RNA的完整性较好，可以进行下一步实验。用引物FsCYP51QC-F/R以基因组DNA为模板进行基因全长扩增；用南京诺唯赞反转录试剂盒以RNA为模板进行cDNA合成，然后用引物FsCYP51CDS-F/R以得到的cDNA为模板进行CDS全长扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶(图1注：M:DNA Marker；1:CDS；2:基因全长Note:M:DNA Marker；1:CDS；2:The full length ofFsCYP51)，可以得到长度分别为2000bp左右的基因全长片段和1500bp左右的CDS全长片段，回收相应的片段连接到克隆载体，用M13通用引物对阳性重组质粒进行测序，结果显示克隆到的FsCYP51的基因全长和CDS全长与基因组的数据是一致的，FsCYP51基因全长1 947bp，CDS全长1 554bp，编码517个氨基酸。

实施例2 FsCYP51基因的生物信息学分析

利用在线分析工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)对FsCYP51蛋白序列进行分析；利用在线软件GSDS2.0(http://gsds.gao-lab.org/)对FsCYP51的基因结构进行分析；利用NCBI CDD分析FsCYP51蛋白的保守功能结构域；利用在线软件SignalP-5.0Server分析FsCYP51蛋白的信号肽；用在线分析软件NetPhos 3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)对FsCYP51蛋白潜在的磷酸化修饰位点进行预测；通过在线软件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_sopma.html)分析FsCYP51蛋白二级结构；利用在线软件Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id＝index)预测FsCYP51蛋白三级结构；利用在线工具TMHMM Server v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析FsCYP51蛋白可能的跨膜结构；运用在线工具CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)预测FsCYP51蛋白亚细胞定位；用FsCYP51蛋白序列在NCBI数据库中Blast并下载搜索到的常见镰刀菌CYP51蛋白序列，用MEGA 6软件采用邻近法(Neighbor-Joining，BootstrapReplications＝1000)构建系统进化树。

结果：1)FsCYP51基因结构分析及其编码蛋白的理化性质分析

将克隆到的FsCYP51基因全长和CDS全长通过在线软件GSDS2.0进行基因结构分析(图2FsCYP51基因结构)，结果显示FsCYP51基因编码区由三个外显子和两个内含子组成。利用ProtParam在线分析软件对FsCYP51蛋白氨基酸进行理化性质分析。FsCYP51蛋白由517个氨基酸组成，理论分子量为58.61kDa，理论等电点pI＝6.61。不稳定指数为42.87，说明该蛋白的稳定性较差。此外，脂肪族氨基酸指数达83.52，总平均亲水指数为-0.239，说明该蛋白为亲水性蛋白。利用程序ProtScale对FsCYP51蛋白氨基酸的亲水性进行在线分析，组成FsCYP51蛋白的氨基酸多为亲性氨基酸，表明该蛋白有较强的亲水性。

2)FsCYP51蛋白信号肽、跨膜结构及亚细胞定位预测

用在线工具TMHMM Serverv.2.0对FsCYP51蛋白的跨膜结构进行了预测(图3FsCYP51蛋白的跨膜结构预测)，发现在FsCYP51蛋白第26位至第45位氨基酸和第57位至第77位氨基酸可能是两个跨膜螺旋，由此推测FsCYP51蛋白为跨膜蛋白。通过SignalP-5.0对FsCYP51蛋白进行分析，发现其不含有信号肽，表明FsCYP51蛋白不是分泌型蛋白。通过在线工具CELLO v.2.5预测FsCYP51蛋白的亚细胞定位，预测结果显示FsCYP51蛋白定位在细胞质膜、溶酶体、细胞质、线粒体、叶绿体的可能性分别为1.953、0543、0.489、0.374、0.369，预测FsCYP51蛋白定位在细胞膜。

3)FsCYP51基因编码氨基酸磷酸化修饰的预测和分析

通过在线分析软件NetPhos 3.1Server将FsCYP51蛋白的氨基酸序列进行磷酸化修饰预测。结果显示，FsCYP51蛋白质的多个氨基酸位点可以发生潜在的磷酸化修饰，预测FsCYP51蛋白质中有20个Ser(丝氨酸)位点可发生磷酸化修饰，有17个Thr(苏氨酸)位点可发生磷酸化修饰，9个Tyr(酪氨酸)位点可发生磷酸化修饰(图4FsCYP51蛋白氨基酸序列的磷酸化修饰预测)。此外发现FsCYP51蛋白可能存在cdc2蛋白激酶的4个Ser和3个Thr磷酸化位点，而且可能存在蛋白激酶C(PKC)的4个Ser和7个Thr磷酸化位点，推测FsCYP51蛋白可能需要进行磷酸化修饰来激发其活性。

4)FsCYP51蛋白二级结构、三级结构和功能结构域分析

将甘蔗梢腐病菌FsCYP51蛋白通过SOPM和Phyre2进行二级结构(图5二级结构预测)和三级结构分析(图6三级结构预测)，结果表明FsCYP51蛋白的二级结构有α螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲，分别占比47.97％、11.61％、3.09％和37.33％。因此FsCYP51蛋白的二级结构主要以α螺旋和无规卷曲的结构形式存在。利用NCBI的CDD功能分析FsCYP51蛋白的保守结构域(图7FsCYP51蛋白功能结构域分析)，发现在其第72位至第510位氨基酸序列之具有CYP51-like保守结构域，说明该蛋白属于p450家族中的CYP51蛋白。

5)FsCYP51基因系统进化树构建分析

为了解FsCYP51基因在镰刀菌中的进化情况，我们用FsCYP51蛋白序列在NCBI数据库中进行BLAST，下载了常见镰刀菌的CYP51蛋白。利用MEGA6选择邻近法构建系统进化树(图8FsCYP51基因系统进化树分析)。可以明显的看出系统进化树按照CYP51A、CYP51B和CYP51C这三类分为了3个分支，FsCYP51基因属于CYP51C这一类基因。其中F.sacchariCYP51(FsCYP51)与串珠镰刀菌F.verticillioides CYP51C、尖孢镰刀菌F.oxysporumCYP51C、顶腐病菌F.subglutinans CYP51C和层出镰刀菌F.proliferatum CYP51C基因在CYP51C类的同一小簇中，说明他们的同源性更高，表明这5个基因在进化关系上更为接近，物种进化关系较为密切。其中FvCYP51与FsCYP51的同源性最高，表明这两个真菌在物种进化过程中亲缘关系更近。

实施例3 FsCYP51基因HIGS植物表达载体的构建及基因枪介导HIGS表达载体遗传转化甘蔗

根据克隆到的FsCYP51的CDS序列和基因全长序列，选取FsCYP51基因CDS的两个特异区段和UTR区的一个区段(如SEQ NO：4～SEQ NO：6所示，其中，SEQ NO：6是UTR区片段)，并将这三个区段串联成一个片段作为HIGS靶标片段，串联片段由上海生工进行合成。结合RNAi植物表达载体上的酶切位点，利用Primer Premier 5设计了分别用于扩增正向靶标序列tgtf、反向靶标序列tgtr和连接它们的loop片段的引物tgtf-F/R、tgtr-F/R和loop-F/R(表1)，以合成的靶标片段为模板进行PCR，1.5％琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收相应的目的片段。将载体pBWA(V)BU用限制性内切酶Eco31 I酶切线性化，三个扩增回收目的片段用Aar I进行酶切，回收酶切产物。将三个酶切目的片段和线性化载体在同一反应中进行连接，连接体系：T4 DNALigase 1μL，10×Buffer 1μL，线性化pBWA(V)BU载体1μL，tgtF片段1μL，tgtR片段1μL，loop片段0.5μL，16℃连接过夜，转化Top10感受态细胞后，在含50mg/LKan的培养基平板上培养12-14h，随机挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，然后将阳性克隆扩大培养后提取质粒进行测序。

将测序验证正确的阳性克隆扩大培养，提取大量质粒。参考吴杨等(斑茅DREB2B基因遗传转化甘蔗的抗旱性研究[D].福州:福建农林大学,2009.)的方法转化甘蔗，利用基因枪在28英寸汞柱真空度，1100psi轰击压力和6cm轰击距离的条件下轰击甘蔗胚性愈伤组织，在含有G418的培养基经过筛选、分化和生根等一系列培养后得到抗性植株，用CTAB法提取抗性植株的基因组DNA，稀释基因组DNA浓度至50ng/μL，以此为模板，同时以构建好的干扰重组载体质粒为阳性对照，未转化的甘蔗植株基因组DNA为阴性对照，用于溶解DNA的ddH₂O作为空白对照，为了提高PCR检测的准确性，本发明根据干扰表达载体序列和靶标基因序列设计如表1中的tgtf-F/R和G418-F/R这两对引物进行PCR检测转基因植株，这两对引物扩增到的预期片段大小分别为645bp和1660bp。

结果：根据干扰载体pBWA(V)BU和多价靶标片段的序列，设计了三对带有酶切位点的引物(表1)。以含有多价靶标序列的克隆载体为模板进行PCR扩增正向靶标序列(tgtF)和反向靶标序列(tgtR)(图9A注：M:DNA Marker；A,B:目的片段扩增；1-8:tgtf；9-15:tgtr；8,16,24:阴性对照；C:菌液PCR检测；25-28:Pubiseq-F/loop-R；30-33:loop-F/NOSseq-R；阴性对照)，以含有loop序列的干扰载体pBWA(V)BU为模板扩增loop序列(图9B)。将上述PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，分别切胶纯化回收大小符合的条带，可获得带有相应酶切位点的大小分别为645bp、645bp和200bp的正向靶标片段、反向靶标片段和loop片段。测量纯度和浓度后，将载体pBWA(V)BU用限制性内切酶Eco31 I酶切线性化，三个扩增回收目的的片段用Aar I进行酶切，回收酶切产物。将三个酶切目的片段和线性化载体在同一反应中进行连接，然后转化Top10感受态细胞。

根据载体序列和loop序列设计分别设计了用来检测正向靶标序列(Pubiseq-F/loop-R)和反向靶标序列的两组引物(表1)。随机选取若干个转化后在抗性平板上长出的单菌落进行菌液PCR鉴定，预期扩增的片段大小分别为929bp和960bp，电泳结果(图9C)与预期的大小一致。提取阳性菌液质粒，用限制性内切酶酶Eco32I进行酶切验证，酶切产物电泳结果与预期结果一致。提交阳性质粒至上海生工测序，测序结果与预期一致，FsCYP51基因HIGS植物表达载体构建成功，可用于遗传转化甘蔗研究。

转基因植株的PCR鉴定：用改良CTAB法提取的抗性植株基因组DNA，以其为模板，同时分别以重组干扰载体作为阳性对照，以未转基因甘蔗为阴性对照，以用于溶解基因组DNA的ddH2O为空白对照，用引物tgtf-F/R和G418-F/R进行PCR检测。引物tgtf-F/R和引物G418-F/R的PCR产物电泳结果显示分别有8株(图10A注：A:引物tgtf-F/R；B:引物G418-F/R；M：DNAmarker(DL2000)；1-17：再生的G418抗性植株；18：重组质粒DNA(阳性对照)；19：未转化植株(阴性对照)；20：双蒸水(空白对照))和7株(图10B)抗性植株的基因组DNA扩增到了相应预期大小的条带，而阴性对照和空白对照没有对应的电泳条带，综合两对引物的PCR鉴定均为阳性的结果，表明HIGS载体上的外源DNA片段已整合到甘蔗基因组中。

讨论：CYP51首次是从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分离获得，并且在动物(大鼠)、植物(高粱)、细菌(结核分枝杆菌)中相继被发现，是分布最广的P450家族成员。目前研究者已在多种病原镰刀菌如禾谷镰刀菌(F.graminearum)、串珠镰刀菌(F.verticillioides)和尖胞镰刀菌(F.oxysporum)等中发现了CYP51A、CYP51B、CYP51C这三个同源基因。研究表明CYP51C基因是镰刀菌属物种特有的，可以作为鉴定镰刀菌属的一个特殊标记基因。本发明根据对分离得到的甘蔗梢腐病菌Fusarium sacchari野生型菌株CNO-1的基因组测序结果，成功克隆到甘蔗梢腐病菌FsCYP51基因全长和CDS全长，对其序列进行了相关的生物信息学分析。

本发明对FsCYP51蛋白的亲水性、蛋白理化性质、氨基酸磷酸化修饰、蛋白二级结构、蛋白跨膜结构、亚细胞定位预测以及系统进化树等进行预测或分析。氨基酸的亲疏水性可以反映蛋白质的折叠情况，在潜在的跨膜区域会出现疏水区，在保持蛋白质的三级结构上起重要作用，而且蛋白的亲疏水性图谱可为蛋白跨膜区域的鉴定提供参考。蛋白跨膜结构域为膜蛋白与膜脂相结合的主要部位。FsCYP51蛋白氨基酸多为亲水性氨基酸，结构上最主要是α螺旋。通过结合蛋白亲水性分析和跨膜结构预测结果，说明FsCYP51蛋白可能为跨膜蛋白，这与禾谷镰刀菌中的研究是一致的。亚细胞定位预测结果显示FsCYP51蛋白可能定位在细胞膜中，这也符合其为膜结合蛋白的特征。

研究表明禾谷镰刀菌(F.graminearum)中的三个CYP51基因有着不同的功能，FgCYP51A和FgCYP51B编码14α-脱甲基酶，FgCYP51B同时对病原菌的子囊孢子形成起重要作用，FgCYP51C不编码14α-脱甲基酶但对病原菌的完全毒力至关重要。而在甘蔗镰刀菌F.sacchari中只鉴定到一个CYP51基因，经过序列比对和系统进化树分析，可以看出FsCYP51属于CYP51C这一类基因，这与其为镰刀菌的鉴定结果是一致的。FsCYP51与FvCYP51C的同源性最高，达到了84.53％，这也符合这两个物种更为接近的亲缘关系。

甘蔗镰刀菌中没有CYP51A和CYP51B这两个基因，我们推测FsCYP51这个基因的功能可能会更加丰富，不仅仅编码14α-脱甲基酶，可能还与病原菌致病性、毒力、子囊孢子形成等密切相关，这将是我们下一步研究的重点，所以我们构建了HIGS植物表达载体，并成功转化甘蔗，为进一步探究甘蔗镰刀菌中CYP51基因的功能和创制抗梢腐病的转基因甘蔗打下基础。同时HIGS技术在甘蔗抗梢腐病研究中的应用还未见报道，本发明是首次在甘蔗中转入甘蔗梢腐病菌重要基因干扰片段来进行HIGS试验，具有重要的理论意义与应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广西大学

<120> 一种FsCYP51基因及其应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1947

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcgcctgct ccagccgcaa atcgttcgat agtgctgacc agcaatttct ttttgttgag 60

aaaactctcc aaatttttta tcaccagcac gcattgaagg ccatcatcga tggaagtctt 120

ctacagcaat tggcggtctc tcccgctatc attctctgtc ccaataactg ctcttttcat 180

catcgtcatc gcgacagtca ccaacgtcat caagcagctc tggttcccga atcctcaccg 240

ccctccagtc gtatttcaca tctttccact gatcggcagc acagtccagt atggaatcga 300

tccgtataaa ttcttcttcg attgccaggc caagtatgga gattgtttca cgtttatcct 360

gctgggaaaa tccacgactg tctttctggg accgaagggc aatgacttca tcctgaatgg 420

gaaacatgcg gatcttaatg ctgaggatgt gtatgggaaa cttacgacgc ctgtttttgg 480

gaaggaggtt gtttatgatt gctctaatgc tagattcatg gatcagaaga gggtaggtcg 540

acggccatta gataaagaat gacatgctga tggtgcatcg ttagcttctt aagcttggtc 600

tcacgactga ctctttgcga tgctacatcc ccaaattcgt caaagaagtc gaagactacg 660

tcgccacctc aacctacttc aaaggcaaca ctggcattgt caacatcacc gaagtaatgg 720

ccgagattac aatctacacc gcatcagggt ctctcctcgg caacgaagtc cgctccatgt 780

tcgacagcac attcgcaagg ctctaccgtc acctcgatga tggtttccag ccaatcaact 840

tcgtcatgcc cggtcttcct ctaccacaga acttccgtcg cgatcatgct cgtaaagtaa 900

tggaagagct tttcagcgac atcatacgca aacgtcgtga gactggcaat caaggtgatg 960

agactgacat ggtttggacg cttatgaatg ccaagtacaa agatggcgag gatctaccag 1020

atcatcatgc ggcgaggatg ttgattgcta ttcttatggg tggacagcat aacacagccg 1080

caagtggtgc ttggcttctt ctcaacctcg cgcataaacc gcatttggtc aaggaactgt 1140

acgacgaaca ggttgaagtt ttggggtcac cgcaacagcc gttgacgtgg gagaacttgc 1200

agaaattgac actgaatgga caggtcatca aggagactct acgtcttcac agccccattc 1260

actctattct ccgacaggtc aagtcaccta tgcgagttcc aggtacagac tgggttgttc 1320

cgccatcaca tacacttctc gcctcacctg gtacgcaagc acgatctgag gagttcttcc 1380

ctcgacctat ggaatgggat cctcatcgct gggacaagat tgagtctctc gacgacgcca 1440

agaatgggga gacggttgat tatgggtttg ggatgatgaa caagtctgta agtagtccat 1500

atctgccgtt tggagcagga cgacatcgct gcgttgggga gaactacgcg tatgcacagc 1560

tcggcgcgat tatcgcaacg tttgtgagac tgcttcatat tgagcagcct gatcctaagg 1620

cacctcttcc tgcgcctgac tattcggtaa gaggccctcc tgagactaaa ccattctttc 1680

tgatcaatca tctagtcaat gttttctcga cctatgaacc cagccgtcat ccgatggact 1740

agccgcaaca ctgaaactga ttagaagctt aagagcgaga tagaaaagct actttgtata 1800

gcgcagtata gtagaaagca agtcctcagc cctgtcatca aatcccatta cctcctgaac 1860

ctggagctgt gccatggacg gtgtccagaa agtagaataa taaacaagta gctgacgtgg 1920

agtgcaccgc tattgtgtta aacctga 1947

<210> 2

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaagtct tctacagcaa ttggcggtct ctcccgctat cattctctgt cccaataact 60

gctcttttca tcatcgtcat cgcgacagtc accaacgtca tcaagcagct ctggttcccg 120

aatcctcacc gccctccagt cgtatttcac atctttccac tgatcggcag cacagtccag 180

tatggaatcg atccgtataa attcttcttc gattgccagg ccaagtatgg agattgtttc 240

acgtttatcc tgctgggaaa atccacgact gtctttctgg gaccgaaggg caatgacttc 300

atcctgaatg ggaaacatgc ggatcttaat gctgaggatg tgtatgggaa acttacgacg 360

cctgtttttg ggaaggaggt tgtttatgat tgctctaatg ctagattcat ggatcagaag 420

aggcttctta agcttggtct cacgactgac tctttgcgat gctacatccc caaattcgtc 480

aaagaagtcg aagactacgt cgccacctca acctacttca aaggcaacac tggcattgtc 540

aacatcaccg aagtaatggc cgagattaca atctacaccg catcagggtc tctcctcggc 600

aacgaagtcc gctccatgtt cgacagcaca ttcgcaaggc tctaccgtca cctcgatgat 660

ggtttccagc caatcaactt cgtcatgccc ggtcttcctc taccacagaa cttccgtcgc 720

gatcatgctc gtaaagtaat ggaagagctt ttcagcgaca tcatacgcaa acgtcgtgag 780

actggcaatc aaggtgatga gactgacatg gtttggacgc ttatgaatgc caagtacaaa 840

gatggcgagg atctaccaga tcatcatgcg gcgaggatgt tgattgctat tcttatgggt 900

ggacagcata acacagccgc aagtggtgct tggcttcttc tcaacctcgc gcataaaccg 960

catttggtca aggaactgta cgacgaacag gttgaagttt tggggtcacc gcaacagccg 1020

ttgacgtggg agaacttgca gaaattgaca ctgaatggac aggtcatcaa ggagactcta 1080

cgtcttcaca gccccattca ctctattctc cgacaggtca agtcacctat gcgagttcca 1140

ggtacagact gggttgttcc gccatcacat acacttctcg cctcacctgg tacgcaagca 1200

cgatctgagg agttcttccc tcgacctatg gaatgggatc ctcatcgctg ggacaagatt 1260

gagtctctcg acgacgccaa gaatggggag acggttgatt atgggtttgg gatgatgaac 1320

aagtctgtaa gtagtccata tctgccgttt ggagcaggac gacatcgctg cgttggggag 1380

aactacgcgt atgcacagct cggcgcgatt atcgcaacgt ttgtgagact gcttcatatt 1440

gagcagcctg atcctaaggc acctcttcct gcgcctgact attcgtcaat gttttctcga 1500

cctatgaacc cagccgtcat ccgatggact agccgcaaca ctgaaactga ttag 1554

<210> 3

<211> 517

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Val Phe Tyr Ser Asn Trp Arg Ser Leu Pro Leu Ser Phe Ser

1 5 10 15

Val Pro Ile Thr Ala Leu Phe Ile Ile Val Ile Ala Thr Val Thr Asn

20 25 30

Val Ile Lys Gln Leu Trp Phe Pro Asn Pro His Arg Pro Pro Val Val

35 40 45

Phe His Ile Phe Pro Leu Ile Gly Ser Thr Val Gln Tyr Gly Ile Asp

50 55 60

Pro Tyr Lys Phe Phe Phe Asp Cys Gln Ala Lys Tyr Gly Asp Cys Phe

65 70 75 80

Thr Phe Ile Leu Leu Gly Lys Ser Thr Thr Val Phe Leu Gly Pro Lys

85 90 95

Gly Asn Asp Phe Ile Leu Asn Gly Lys His Ala Asp Leu Asn Ala Glu

100 105 110

Asp Val Tyr Gly Lys Leu Thr Thr Pro Val Phe Gly Lys Glu Val Val

115 120 125

Tyr Asp Cys Ser Asn Ala Arg Phe Met Asp Gln Lys Arg Leu Leu Lys

130 135 140

Leu Gly Leu Thr Thr Asp Ser Leu Arg Cys Tyr Ile Pro Lys Phe Val

145 150 155 160

Lys Glu Val Glu Asp Tyr Val Ala Thr Ser Thr Tyr Phe Lys Gly Asn

165 170 175

Thr Gly Ile Val Asn Ile Thr Glu Val Met Ala Glu Ile Thr Ile Tyr

180 185 190

Thr Ala Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asn Glu Val Arg Ser Met Phe Asp

195 200 205

Ser Thr Phe Ala Arg Leu Tyr Arg His Leu Asp Asp Gly Phe Gln Pro

210 215 220

Ile Asn Phe Val Met Pro Gly Leu Pro Leu Pro Gln Asn Phe Arg Arg

225 230 235 240

Asp His Ala Arg Lys Val Met Glu Glu Leu Phe Ser Asp Ile Ile Arg

245 250 255

Lys Arg Arg Glu Thr Gly Asn Gln Gly Asp Glu Thr Asp Met Val Trp

260 265 270

Thr Leu Met Asn Ala Lys Tyr Lys Asp Gly Glu Asp Leu Pro Asp His

275 280 285

His Ala Ala Arg Met Leu Ile Ala Ile Leu Met Gly Gly Gln His Asn

290 295 300

Thr Ala Ala Ser Gly Ala Trp Leu Leu Leu Asn Leu Ala His Lys Pro

305 310 315 320

His Leu Val Lys Glu Leu Tyr Asp Glu Gln Val Glu Val Leu Gly Ser

325 330 335

Pro Gln Gln Pro Leu Thr Trp Glu Asn Leu Gln Lys Leu Thr Leu Asn

340 345 350

Gly Gln Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Ser Pro Ile His Ser

355 360 365

Ile Leu Arg Gln Val Lys Ser Pro Met Arg Val Pro Gly Thr Asp Trp

370 375 380

Val Val Pro Pro Ser His Thr Leu Leu Ala Ser Pro Gly Thr Gln Ala

385 390 395 400

Arg Ser Glu Glu Phe Phe Pro Arg Pro Met Glu Trp Asp Pro His Arg

405 410 415

Trp Asp Lys Ile Glu Ser Leu Asp Asp Ala Lys Asn Gly Glu Thr Val

420 425 430

Asp Tyr Gly Phe Gly Met Met Asn Lys Ser Val Ser Ser Pro Tyr Leu

435 440 445

Pro Phe Gly Ala Gly Arg His Arg Cys Val Gly Glu Asn Tyr Ala Tyr

450 455 460

Ala Gln Leu Gly Ala Ile Ile Ala Thr Phe Val Arg Leu Leu His Ile

465 470 475 480

Glu Gln Pro Asp Pro Lys Ala Pro Leu Pro Ala Pro Asp Tyr Ser Ser

485 490 495

Met Phe Ser Arg Pro Met Asn Pro Ala Val Ile Arg Trp Thr Ser Arg

500 505 510

Asn Thr Glu Thr Asp

515

<210> 4

<211> 211

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgtcttca cctttatcct cttcggtcga aaagtcgttg cctgtcttgg tgttgatggc 60

aatgactttg ttctcaacag tcgaattcaa gacgcaaacg ccgaagaaat ctacggtcca 120

ttgacaacgc ctgtctttgg tagcgatgtc gtatacgatt gcccaaactc gaagctcatg 180

gagcaaaaga aatttgtcaa gtttggtctt a 211

<210> 5

<211> 242

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acttcatgct tcactgggct cctctcccct ggaaccgcaa gcgcgaccat gcccagcgca 60

ctgttgccaa gatttacatg gacaccatta aggagcgacg cgcaaaggac aacgatgaca 120

ccgagcacga tatgatgaag catctcatga actctactta caagaacggc acccctgtcc 180

ctgaccatga ggtcgcccac atgatgattg ctctcctcat ggctggccag cactcttctt 240

ct 242

<210> 6

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgactcttt gcgatgctac atccccaaat tcgtcaaaga agtcgaagac tacgtcgcca 60

cctcaaccta cttcaaaggc aacactggca ttgtcaacat caccgaagta atggccgaga 120

ttacaatcta caccgcatca gggtctctcc tcggcaacga agtccgctcc atgttcgaca 180

gcacattcgc aa 192

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggaagtct tctacagcaa t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctaatcagtt tcagtgttgc g 21

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atcgcctgct ccagcc 16

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaggtttaa cacaatagcg gtg 23

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagtcacctg caaaacaacg atgtcttcac ctttatcct 39

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgatcacctg caaaattgcg aatgtgctgt cgaac 35

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cagtcacctg caaaagcaac ctgcaggtct agtttttct 39

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgatcacctg caaaagcccg ggctctgtaa ctatc 35

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagtcacctg caaaagggct tgcgaatgtg ctgtcgaac 39

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagtcacctg caaaatacag atgtcttcac ctttatcct 39

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cctgccttca tacgctattt atttgcttgg 30

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caagaccggc aacaggattc aatc 24

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

caacatggtg gagcacgac 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

actcgagctt gtcgatcgac 20

Claims (4)

1.一种FsCYP51基因，其特征在于，所述FsCYP51基因的核苷酸序列如SEQ NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的一种FsCYP51基因，其特征在于，所述FsCYP51基因CDS区核苷酸序列如SEQ NO：2所示。

3.权利要求1或2所述FsCYP51基因编码的蛋白质，其特征在于，所述FsCYP51基因编码的蛋白质序列如SEQ NO：3所示。

4.权利要求1或2所述FsCYP51基因在培育抗梢腐病转基因甘蔗中的应用。

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