CN101142318B - 细胞数目多核苷酸和多肽以及使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了蛋白CNR的多核苷酸和相关多肽。本发明提供了CNR基因的基因组序列。CNR负责控制细胞数目。

Description

细胞数目多核苷酸和多肽以及使用其的方法
发明领域
本发明总的来说涉及分子生物学的领域。 
发明背景 
许多植物的驯化已和产量的显著增加相关。天然群体中发生的大多数表型变异是连续的并且受多基因影响的作用。在驯化的植物中，负责产量上显著差异的特定基因的鉴定已成为农业研究中的重要焦点。 
一组影响产量的基因是细胞数目调节物基因，或CNR基因。发现一个包含所述特定基因家族的数量性状基因座(QTL)fw2.2和蕃茄中最高达30％的果实大小中的减少相关。这暗示着fw2.2可能是细胞分裂的负调节物。(Frary，等人，fw2.2：A Quantitative Trait LocusKey to the Evolution of Tomato Fruit Size，Science，第289卷，85-88，2000)。产生果实的植物在总的果实重量或收获指数(果实产量除以植物重量)中没有显著差异。果实大小的改变，如由fw2.2等位基因提供的，似乎是由于调节上的改变而非编码的蛋白的序列和结构的改变造成的。蕃茄植物中QTL效应的原因是在花发育早期表达的控制心皮细胞数目的单基因。进一步的研究表明fw2.2的主要效应在于控制子房和果实大小，而其他相关性表型效应是次要的。(Nesbitt，等人，fw2.2Directly Affects the Size of Developing Tomato Fruit，withSecondary Effects on Fruit Number and Photosynthate Distribution，Plant Physiology，第127卷，575-583，2001)。发现fw2.2基因通过在整个植物水平上修饰贮藏-供源(sink-source)关系来改变植物形态学，从而导致花序数目、果实数目和果实和花的败育率的改变。所述基因具有改变竞争果实中光合产物的潜能，从而对成熟时果实的大小产生重大影响。 
杂种优势是许多农作物植物产量和性能增加的重要机制。其特征在于产生增加的产量的植物生长和活力中的增加。该杂种优势的获得通常在这样的选择的亲本系的杂种后代中发生，所述亲本系可能另外 在产量性能上具有中等水平。这些亲本系通常是近交系和遗传性相对同质的系。尽管在几种农作物植物生产系统中使用了杂种优势，但其在玉米中的应用最广为人知。其在发达的世界中用于大多数玉米生产系统。其是杂交种子玉米工业的基础。 
杂种优势的完整机制仍然在研究中。尽管不意欲受任何一种理论的限制，但在此列出了提议的杂种优势机制。存在一种假说，所述假说想象通过蛋白功能、通过基因表达或通过其他方式的多个等位基因的互补。然而，其他非排他的理论想象较小组的关键基因，尤其是那些功能改变可能导致植物活力改变的基因。 
发明概述 
本发明提供了多核苷酸、相关多肽和本CNR序列的所有保守性修饰的变体。本发明提供了CNR基因的序列。 
调节植物中细胞数目的基因具有参与杂种优势的潜能。可明智地操作调节细胞数目的基因来获得杂种优势表型。杂种优势植物通常具有更粗壮和更大的体态。少数研究曾调查了该更大的大小的来源。由玉米生物学家T.A.Kiesselbach在1922年获得的一个关键的观察资料揭示，玉米杂种优势主要是由于细胞数目的增加而非细胞大小的增加产生的。(参见T.A Kiesselbach(1922).Corn Investigations.Bulletinof the Agricultural Experiment Station of Nebraska.ResearchBulletin No.20.The University of Nebraska.Lincoln，Nebraska U.S.A.Histological Effects of Inbreeding，pages96-102.)。具体地，Kiesselbach提到，“这些数据表明10.6％的因杂交而增加的大小来源于细胞大小的增加，而89.4％的增加的大小来源于增加的数目”。 
可将蕃茄基因Fw2.2定义为蕃茄心皮中细胞数目的负调节物。当该Fw2.2基因表达减少时，产生更大的蕃茄果实。已通过显微镜分析了果实并且显示更大的果实是由于细胞数目的增加而不是细胞大小的增加产生的。这与杂种优势的效应一致，因此蕃茄基因Fw2.2的玉米直向同源物是想要的。 
本发明鉴定了和包含蕃茄Fw2.2基因的基因家族相关的编码蛋白的玉米基因。这些基因可用于产生杂种优势表型。这样的表型可展现细胞数目的负调节的减小，从而导致产生更大(更多的细胞数目) 和更具活力的植物或植物的部分，最终导致产生增加的农作物植物产量。 
CNR(细胞数目调节物)基因中的每一个和该基因家族中的任何其他基因都可用于增加作物产量。CNR基因中的一个基因，ZmCNR02，是特别吸引人的基因，因为(a)其在氨基酸同一性上和蕃茄Fw2.2蛋白相似，和(b)其在多个组织中的天然表达和细胞数目的负调节一致，且因为其在成熟或正在成熟的组织中的表达增加，这将关闭新的细胞产生。 
CNR基因是细胞数目的负调节物，且其减少的表达导致增加的细胞数目、增加的活力和杂种优势表型。如果(通过基因敲除、突变、同源重组、反义、小RNA等)下调ZmCNR02基因，那么可产生增加的细胞数目。假定该下调不有害地影响发育中的正常平衡，那么可产生更大大小的、更具活力的植物。下调可以是部分或完全的，从而增加细胞数目而不打破发育的平衡，或者特定组织(例如胚乳)中的敲除或减少的表达可通过延长其细胞分裂时间段来导致产生更大的器官。除常规的杂种优势外可以使用这些方法，从而产生增加的产量增加。 
CNR02基因显示在不同组织中表达，并且可控制整个植物中的细胞数目。一般的杂种优势倾向于使整个植物而不仅仅是一个或成组的组织更具活力。因此，可使用具有广泛的发育表达模式的启动子来尝试需要减少所述基因表达(特别是ZmCNR02)的启动子的上述策略。这些启动子属于所谓的组成型启动子，一个示例是玉米遍在蛋白启动子。也可使用启动子将表达集中在一个或几个组织中(如果在植物发育的有限范围内认为想要的增加的细胞数目足够的话)。这些增强的目的组织包括例如，根(通过减少该处的基因或基因表达来增强根发育)、胚(更大的胚，包括影响整个种子的更高的油含量)、幼苗(幼苗活力，增加的中胚轴大小和延伸，以更成功地冒出土壤)、穗丝(增加的穗丝突出体，包括在干旱条件期间，或停止或与花粉供给(donation)同步化)、茎杆(增加围长，从而导致更大的茎杆强度)和其他目的植物组织。 
CNR基因功能和生长中的组织中的生长素以及镉具有关系。尽管不受任何特定理论的束缚，但仍存在影响植物细胞数目的CNR-型 基因的可能的分子/生理学作用模式。该假说未在公开的文献中出现，其使表面上看混乱或矛盾的信息和谐统一起来。 
CNR基因、生长、生长素作用和镉之间的联系导致下列理论化的作用模式。 
CNR基因通过生长素作用，即影响植物细胞生长的众所周知的植物激素，来影响细胞的数目，在某些情况下通过细胞数目来影响。在一般的金属结合能力中，镉也在生长素作用中起着作用，其中由镉进行的替代发生在本来是参与生长素结合或作用的锌离子的位置。随着组织成熟，CNR基因的表达可增加，以结合生长素并阻止组织的持续生长。通过该方式，CNR基因可结合生长素以帮助停止其生长促进作用。 
迄今尚未发现CNR基因是生长素结合蛋白的一个原因可能是部分地是因为其是膜结合的(且从而不太可能被分离)。另一个原因可能是因为其表达在正在成熟的组织中更高，所述成熟组织是其中生长素作用的模式经调查处于更低程度的区域。超表达CNR基因的植物可以是生长素抗性的和/或镉抗性的。生长素抗性和镉抗性可产生冲突，因为镉取代锌从而破坏了生长素结合活性。生长素抗性可以是指对生长素相关性除草剂的抗性。镉抗性在植物对毒性金属的抗性的某些环境中可以是有效的。CNR表达或活性的降低可导致生长素敏感性和/或镉敏感性。前者可导致增加的对生长素相关性生长的敏感性，这是生长素相关性除草剂的作用模式。当CNR基因影响生长素作用时，其可影响细胞的数目和细胞大小，如生长素所表现的那样。因此，尽管CNR基因影响细胞大小是Fw2.2基因的结果，并预期是调节这些基因的表达的总体作用，但不可排除对细胞大小的可能的伴随作用。 
在玉米中，fw2蕃茄基因家族具有至少12个与其相关成员，称为ZmCNR1-12(参见表1)。这些基因可用于在玉米植物中控制细胞数目。潜在的用途包括控制整个植物或农作物植物中特定器官的大小。这些基因也可用于控制种子和果实的大小。基因的正确控制可导致整个器官大小增加或减少或完全消除。任一结果可以是农艺学上有利的。尽管所述基因在其正常的野生型功能中一般可用作细胞数目的负调节物并从而用作器官大小的负调节物，但要认识到可通过明智地操 作基因表达的水平或时间选择、或通过改变或破坏基因的编码区来改变该功能。在该情况下，改变基因产物，即蛋白的功能。潜在的结果包括但不限于增加的叶大小、增加的根大小、增加的谷穗大小、增加的种子大小和雄花穗或至少具有功能性花粉的雄花穗的消除，所述增加的种子大小可包括增加的胚乳大小、胚和胚乳的相对大小的改变(其反过来导致种子中蛋白、油和淀粉的相对水平的改变)。 
RT-PCR数据显示在受精前，ZmCNR02在胚珠中高度表达，但受精后表达下降。这和参与负细胞数目调节的基因一致。该观察提出了进一步将该基因和相关基因用于农作物改良的方法。一个领域是在不依赖于受精的种子生产中。胚珠中负细胞数目调节(通过减少CNR表达和/或功能)的现象在不存在受精的情况下可产生种子或种子样形式。这些种子可在下一代存活以发芽，或其可用于作为食物、燃料和种子的其他正常消费作用的种子的生产。关于可影响农业工业的不依赖于受精的种子形式，存在许多可能的新的用途和优点。单倍体正日益用于杂种农作物(玉米)生产中的亲本系的生产。可鉴定作为单倍体的潜在的亲本植物，然后将其加倍成双倍体，以获得纯合亲本系而无需进行近亲交配。 
本发明的其他实施方案包括用于控制CNR或相关蛋白的功能、和用于减少这些蛋白的活性以表达这些蛋白的经修饰的非功能性形式的方法。这可通过封闭或竞争作用的位点来破坏所述基因的完整天然形式的功能。可使用CNR基因的启动子来将表达导向胚珠。应用包括用于如上所述在胚珠中和其他需要在胚珠中控制基因表达的区域中调节CNR或相关基因的方法。除了胚珠外，CNR基因在许多组织中表达，并且在正在成熟的或成熟的组织中表达增加。 
用于CNR和相关基因的一个应用包括通过控制细胞分裂来改变组织的形成。例如，控制功能性雄花穗形成是杂种玉米生产的一个重要方面。可将CNR基因可操作地连接至雄花穗、花药或绒毡层特异性启动子，从而控制这些组织的发育，导致雄性不育的改变。
表1 
  
序列ID编号 特征
SEQ ID NO：1 ZmCNR1多核苷酸
SEQ ID NO：2 ZmCNR1多肽
SEQ ID NO：3 ZmCNR2多核苷酸
SEQ ID NO：4 ZmCNR2多肽
SEQ ID NO：5 ZmCNR3多核苷酸
SEQ ID NO：6 ZmCNR3多肽
SEQ ID NO：7 ZmCNR4多核苷酸
SEQ ID NO：8 ZmCNR4多肽
SEQ ID NO：9 ZmCNR5多核苷酸
SEQ ID NO：10 ZmCNR5多肽
SEQ ID NO：11 ZmCNR6多核苷酸
SEQ ID NO：12 ZmCNR6多肽
SEQ ID NO：13 ZmCNR7多核苷酸
SEQ ID NO：14 ZmCNR7多肽
SEQ ID NO：15 ZmCNR8多核苷酸
SEQ ID NO：16 ZmCNR8多肽
SEQ ID NO：17 ZmCNR9多核苷酸
SEQ ID NO：18 ZmCNR9多肽
SEQ ID NO：19 ZmCNR10多核苷酸
SEQ ID NO：20 ZmCNR10多肽
SEQ ID NO：21 ZmCNR11多核苷酸
SEQ ID NO：22 ZmCNR11多肽
SEQ ID NO：23 ZmCNR12多核苷酸
SEQ ID NO：24 ZmCNR12多肽
SEQ ID NO：25 具有ORF识别(identificaton)的ZmCNR2多肽全长                         
SEQ ID NO：26 ZmCNR2可读框
SEQ ID NO：27 SEQ ID NO：26的ZmCNR2多肽翻译
SEQ ID NO：28 ZmCNR1启动子
  
SEQ ID NO：29 ZmCNR2启动子
SEQ ID NO：30 ZmCNR4启动子
SEQ ID NO：31 ZmCNR6启动子
SEQ ID NO：32 ZmCNR7启动子
SEQ ID NO：33 ZmCNR9启动子
SEQ ID NO：34 ZmCNR11启动子
SEQ ID NO：35 ZmCNR12启动子
SEQ ID NO：36 ZmCNR1MPSS优选的标记
SEQ ID NO：37 ZmCNR2MPSS优选的标记
SEQ ID NO：38 ZmCNR3MPSS优选的标记
SEQ ID NO：39 ZmCNR5MPSS优选的标记
SEQ ID NO：40 ZmCNR6MPSS优选的标记
SEQ ID NO：41 ZmCNR7和ZmCNR9MPSS优选的标记
SEQ ID NO：42 ZmCNR8MPSS优选的标记
SEQ ID NO：43 ZmCNR10MPSS优选的标记
SEQ ID NO：44 和蕃茄(Lycopersicon esculentum)fw2.2同源的ORF翻译                      
SEQ ID NO：45 蕃茄fw2.2
因此，在一个方面，本发明涉及包含编码CNR蛋白的分离的多核苷酸序列的分离的核酸。本发明的一个实施方案是包含这样的核苷酸序列的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列选自：(a)包含SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23的核苷酸序列；(b)编码包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24的氨基酸序列的核苷酸序列；和(c)包含和SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23的至少70％的序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码具有细胞数目调节物活性的多肽。 
本发明的组合物包括包含这样的氨基到序列的分离的多肽，所述氨基酸序列选自：(a)包含SEQ ID NO:；2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24的氨基酸序列和(b)包含和SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24的至少70％的序列同一性 的氨基酸序列，其中所述多肽具有细胞数目调节物活性。 
在另一个方面，本发明涉及包含如上所述的核酸的重组表达盒。另外，本发明涉及包含该重组表达盒的载体。此外，包含所述重组表达盒的载体可促进核酸在宿主细胞中的转录和翻译。本发明也涉及能够表达本发明的多核苷酸的宿主细胞。可使用许多宿主细胞，例如但不限于，微生物、哺乳动物、植物或昆虫。 
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的核酸的转基因植物或植物细胞.优选的包含本发明的多核苷酸的植物包括但不限于玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸芥子、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、蕃茄和稷。在另一个实施方案中，转基因植物是玉米植物或植物细胞.另一个实施方案是来自转基因植物的转基因种子.本发明的另一个实施方案包括包含可操作地连接至在植物中驱动表达的启动子的本发明的CNR多肽的植物.与对照植物相比，本发明的植物可具有改变的细胞数目.在一些植物中，在营养组织、生殖组织、或在营养组织和生殖组织中改变细胞数目.本发明的植物可具有下列表型中的至少一种，所述表型包括但不限于：增加的叶大小、增加的谷穗大小、增加的种子大小、增加的胚乳大小、胚和胚乳相对大小上的改变(这导致种子中蛋白、油和/或淀粉的相对水平的改变)、不存在雄花穗、不存在具有功能性花粉的雄花穗或增加的植物大小. 
本发明的另一个实施方案可以是在基因组基因座上已被基因修饰的植物，其中所述基因组基因座编码本发明的CNR多肽。 
提供了用于在植物中增加CNR多肽的活性的方法。所述方法可包括将本发明的CNR多核苷酸导入植物。提供该多肽可减少植物组织中的细胞数目，从而调节组织生长和大小。 
提供了用于在植物中减少或消除CNR多肽的水平的方法。也可在特定的组织中减少或消除多肽的水平或活性，从而在所述组织中产生增加的细胞数目。减少CNR多肽的水平和/或活性增加了在相关组织中产生的细胞的数目。 
也提供了用于在植物中调节基因表达的方法和组合物。提供了包含启动子序列的多核苷酸(参见表1)。组合物包括包含这样的核苷酸序列的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列选自：(a)包含SEQ IDNO:28、29、30、31、32、33、34或35的核苷酸序列；和(b)包含 和SEQ ID NO：28、29、30、31、32、33、34或35的至少70％的序列同一性的核苷酸序列。组合物还包括具有这样的DNA构建体的植物和种子，所述构建体包含可操作地连接至本发明的启动子的目的核苷酸序列。在特定的实施方案中，DNA构建体被稳定地整合入植物的基因组中。所述方法包括将可操作地连接至本发明的启动子的目的核苷酸序列导入植物。 
附图简述 
图1.蕃茄Fw2-2(SEQ ID NO：45)和12个玉米基因翻译(SEQ IDNOS：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24)的聚簇系统树(Clustal Dendogram)。 
图2.蕃茄Fw2-2(SEQ ID NO：45)和12个玉米基因翻译(SEQ IDNOS：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24)的比对。 
图3.胚乳发育。通过MPSS数据所揭示的ZmCNR02基因表达的模式揭示，该基因在胚乳发育的早期阶段(在授粉后的早些天-DAP内)表达非常低，但随着胚乳成熟(更高的DAP)，CNR02的表达增加。因此胚乳中的该表达模式和CNR02在负调节细胞数目中的作用一致。 
图4A.胚发育。根据授粉后的天数(DAP)给种子胚发育评分。在30DAP后，ZmCNR02表达的模式朝向胚发育的结束升高，在45DAP时达到最高表达。这对应于细胞数目增长的完成期，该表达模式和ZmCNR02作为负细胞数目调节物的作用一致。 
图4B.不同玉米组织中ZmCNR02表达的RT-PCT分析。使用不同的玉米组织进行35个循环的RT-PCR，所述玉米组织包括胚乳(14DAP)、茎干顶端分生组织(shoot apical meristem)、果皮、幼苗、根、支柱根、成熟和未成熟的叶、未成熟的谷穗、未成熟的雄花穗、节(node)和胚珠。和Lynx MPSS特征分析(profiling)数据一致，主要在其中具有很少生长活性的组织例如成熟叶中检测该基因的表达。有趣地，在胚珠组织中检测到非常高的表达。胚珠(受精前)没有细胞分裂活性从而处于静息阶段。和在成熟的叶组织中的水平相比，ZmCNR02在胚珠中以非常高的水平表达。然而，紧在受精后、活性细胞分裂开始时，ZmCNR02表达急剧地降低至最低水平(通 过图3和4A中举例说明的早期胚和胚乳发育证明)。 
图5.叶发育。测定和发育中的玉米叶相关的几种样品。末成熟叶的基部区域(basal region)，即最具活性的细胞分裂的区域显示无ZmCNR02表达。相同未成熟叶的远端处于膨胀中和膨胀的部分显示少的但显而易见的ZmCNR02表达。来自幼小植物(V2)至中等阶段的叶(V7-V8)至成熟叶的完整的叶系列显示逐渐增高的ZmCNR02表达。该表达模式和与细胞数目的负控制相关的ZmCNR02一致；其表达在进行很少细胞分裂的叶阶段中最高。 
图6.心皮、穗丝发育和花粉。穗丝、子房壁和果皮和双子叶植物的花的心皮类似。在后两者中检测到ZmCNR02的表达。ZmCNR02表达由于穗丝和果皮表达而处于玉米′心皮′中。测定的果皮样品处于发育的相当晚的时期，且受到剩余的胚乳组织的危害。穗丝组织非常容易收集并就基因的表达对其进行测定。在幼小的正在生长的穗丝(仍然附着在子房上的那些穗丝)中，未检测到ZmCNR02的表达。然后，从一系列突出前(pre-emergent)穗丝到突出后(post-emergent)穗丝，并从那里到授粉后的系列，ZmCNR02的表达增加。为进行比较，提供了表明ZmCNR02表达的增加不是因花粉落在穗丝上而产生的花粉样品。在穗丝成熟时，特别是在其授粉后，细胞分裂减慢并停止。穗丝(心皮组织)中ZmCNR02表达的模式和负细胞数目调节物一致。 
图7.根和根分生组织。完整的根(具有分生组织)对根尖(富集的分生组织)的比较，显示ZmCNR02的表达在整个根部中高于在根尖中。在不活跃分裂的根的区域中ZmCNR02的表达具有更高的表达，并且根中的表达模式和细胞数目(分裂)的负调节物一致。 
图8.细胞分裂素处理。来自实验的数据显示，当加入10微摩尔的苄基腺嘌呤进行6小时时，ZmCNR02基因的表达在切断的玉米叶盘中下降，如通过MPSS转录物测定法所揭示的。该结果提供了额外的证据，即ZmCNR02的表达和在负调节细胞数目中的作用一致。已知诱导细胞数目(细胞分裂)的植物激素的加入导致ZmCNR02的表达降低，如根据该基因负调节细胞数目的假说所预期的。 
图9.ZmCNR02的表达和生长负相关：4种基因型中不同生长活性的叶切片的RT-PCR分析。从V3阶段的幼苗采集不同生长活性的 叶切片。以微管蛋白作为对照，多重进行ZmCNR02的RT-PCR分析。根据MPSS特征分析，RT-PCR分析在不同表达平台中证实了ZmCNR02的表达与生长和活性的负相关。在所有4种不同的受试基因型中都一致地看到了和生长的负相关关系，从而表明该基因在生长中不考虑遗传背景的一般作用。 
图10.近交亲本和其正反交杂种的成熟叶中的ZmCNR02的表达。这是使用成熟叶组织的RT-PCR测定法，其中修改PCR方案以增加被ZmCNR02的高表达竞争胜过(out-competed)的微管蛋白的扩增。该图充分地显示了在两种杂种中ZmCNR02的表达水平都显著地高于近交亲本。 
发明详述 
除非另外定义，此处所用的所有技术和科学术语均具有和本发明所属的领域内的技术人员通常理解的意思相同的意思。除非另外提到，此处所用或预期的技术是本领域技术人员熟知的标准方法。材料、方法和示例只是说明性的而不具限定性。通过举例说明来介绍下列内容，所述内容不是意欲用于限定本发明的范围的。 
现在将在下文中参考附图更全面地描述本发明，其中显示一些但不是所有的本发明的实施方案。事实上，这些发明可以以许多不同的形式体现，并且不应当被解释为局限于此处所示的实施方案；相反地，提供这些实施方案以便使本公开内容满足可适用的法律要求(applicable legal requirements)。同样的数字自始至终表示同样的元件。 
这些发明所属的领域内的技术人员在得到前述描述和相关附图中的教导后可认识到此处所示的本发明的许多修饰和其他实施方案。因此，要理解本发明不受限于公开的特定的实施方案，且修饰和其他实施方案预期包含于所附的权利要求的范围之内。尽管此处使用特定的术语，但其只以一般性和描述性意义使用而不用于限定的目的。 
除非另外指出，本发明的实践将使用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术学的常规技术，所述技术在本领域技术的范围之内。在文献中充分地解释了这些技 术。参见，例如，Langenheim和Thimann，BOTANY：PLANTBIOLOGY AND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS，John Wiley(1982)；CELL CULTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OFPLANTS，第1卷，Vasil，ed.(1984)；Stanier等人，THE MICROBIALWORLD，第5版，Prentice-Hall(1986)；Dhringra和Sinclair，BASICPLANT PATHOLOGY METHODS，CRC Press(1985)；Maniatis等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(1982)；DNA CLONING，第I和II卷，Glover，ed.(1985)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS，Gait，ed.(1984)；NUCLEICACID HYBRIDIZATION，Hames和Higgins，eds.(1984)；和the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Colowick和Kaplan，eds，AcademicPress，Inc.，San Diego，CA。 
可以其SI接受的形式表示单位、前缀和符号。除非另外指出，分别以5′至3′的方向从左至右书写核酸；以从氨基至羧基的方向从左至右书写氨基酸序列。数字范围包括界定范围的数字。此处可由其普遍已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示氨基酸。同样可通过其普遍接受的单字母代码表示核苷酸。通过参考完整的说明书来更全面地定义下面定义的术语。 
在描述本发明中，将使用下列术语，并且如下面所说明的定义所述术语。 
“微生物”是指任何微生物(包括真核和原核微生物)，例如真菌、酵弱、细菌、放线菌纲(actinomycetes)、藻类和原生动物、以及其他单细胞结构。 
“扩增的”是指使用至少一种核酸序列作为模板来构建核酸序列的多拷贝或与所述核酸序列互补的多拷贝。扩增系统包括聚合酶链反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见，例如，DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY：PRINCIPLESAND APPLICATIONS，Persing等人，eds.，American Society forMicrobiology，Washington，DC(1993)。扩增的产物称为扩增子。
术语“保守性修饰的变体”用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守性修饰的变体是指编码氨基酸序列的相同的或经保守性修饰的变体的核酸。因为遗传密码的简并性，所以存在大量功能上相同的核酸编码任何给定的氨基酸。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由密码子确定的每一个位置上，可将密码子改变成对应的所述密码子中的任何一个密码子而不改变被编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”并代表保守性修饰的变异中的一个种类。此处编码多肽的每一个核酸序列也描述了该核酸的每一个可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到可修饰核酸中的各密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcus rubens)，其中GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka等人，J.Gen.Microbiol.139：425-32(1993))以产生功能上相同的分子。因此，编码本发明的多肽的核酸的各沉默变异隐含在各所述多肽序列并在此引用作为参考。 
对于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，当改变导致使用化学相似的氨基酸的氨基酸置换时，在被编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的单个置换、缺失或加入是“保守性修饰的变体”。因此，可这样改变选自1至15的整数的氨基酸残基的任何数目。从而例如，可产生1、2、3、4、5、7或10个改变。保守性修饰的变体通常提供了和产生其的、未经修饰的多肽序列相似的生物学活性。例如，就其天然底物来说，底物特异性、酶活性或配体/受体的结合通常为天然蛋白的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守性置换表在本领域是熟知的。 
下列6组各包含相互之间为保守性置换的氨基酸： 
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)； 
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)； 
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)； 
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)； 
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和 
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。也参见，Creighton，PROTEINS，W.H.Freeman and Co.(1984)。
如此处所用的，“基本上由……组成”表示对于目的多核苷酸包含了另外的序列，其中另外的序列在严格杂交条件下不能选择性地和与该多核苷酸相同的cDNA杂交，且其中杂交条件包括在65℃下在0.1XSSC和0.1％十二烷基硫酸钠中的洗涤步骤。 
对于特定的核酸，“编码”或“被编码的”是指包含用于翻译成特定蛋白的信息。编码蛋白的核酸可在该核酸的被翻译的区域内包含非翻译序列(例如，内含子)，或可缺乏这些插入的非翻译序列(例如，如在cDNA中一样)。通过密码子的使用确定编码蛋白所依据的信息。一般地，使用“通用”遗传密码的核酸编码氨基酸序列。然而，可使用通用密码的变体，例如存在于一些植物、动物和真菌线粒体中、存在于细菌山羊枝原体(Mycoplasma caphcolum)中(Yamao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：2306-9(1985))、或纤毛虫大核(ciliate Macronucleus)中的变体，当使用这些生物表达核酸时。 
当通过合成制备或改变核酸时，可利用想要的宿主(所述核酸在其中表达)的已知的密码子偏好。例如，尽管本发明的核酸序列可在单子叶和双子叶植物物种中表达，但可修饰序列以解决单子叶植物或双子叶植物的特定的密码子偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已显示是不同的(Murray等人，NucleicAcids Res.17：477-98(1989)并在此引用作为参考)。因此，对于特定的氨基酸，玉米优选的密码子可来源于来自玉米的已知的基因序列。Murray等人(同上)的表4中列出了来自玉米植物的28个基因的玉米密码子选择。 
如此处所用的，“异源的”是指核酸是起源于外来物种的核酸，或如果来源于相同物种，其基本上是通过有意的人工干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行修饰的。例如，可操作地连接至异源结构基因的启动子来自这样的物种，该物种不同于产生结构基因的物种，如果来自相同的物种，一个或两个启动子基本上都从其原始的形式修饰而来。异源蛋白可起源于外来物种，或如果来自相同物种，基本上通过有意的人工干预从其原始形式修饰而来。 
“宿主细胞”是指包含本发明的异源核酸序列、包含载体和支持表达载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞例如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶或双子叶植物细胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、低芥酸芥子、大麦、稷和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉米宿主细胞。 
术语“杂交复合物”是指通过两条单链核酸序列选择性地相互杂交形成的双链体核酸结构。 
术语“导入的”在将核酸插入细胞的上下文中，是指“转染”或“转化”或“转导”以及包括核酸至真核或原核细胞中的整合，其中可将核酸整合入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，将其转化为自主复制子或进行瞬时表达(例如，转染的mRNA)。 
术语“分离的”是指材料，例如核酸或蛋白，所述材料大体上或基本上不含有在其天然发生的环境中发现的通常伴随或与其相互作用的组分。分离的材料任选地包含未和其天然环境中的材料一起被发现的材料。如此处所定义的，“分离”的核酸也称为“异源”核酸。除非另外指出，术语“CNR核酸”是指包含编码全长或部分长度的CNR多肽的多核苷酸(“CNR多核苷酸”)的核酸。 
如此处所用的，“核酸”包括以单链或双链形式存在的脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物，且除非另外限制，其包含具有天然核苷酸的基本性质的已知的类似物(例如，肽核酸)，所述基本性质在于其以和天然发生的核苷酸相似的方式和单链核酸杂交。 
“核酸文库”是指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含和基本上代表特定生物的基因组的整个被转录的级分。示例性核酸文库例如基因组和cDNA文库的构建，教导于标准的分子生物学参考资料中，例如Berger和Kimmel，GUIDE TO MOLECULAR CLONINGTECHNIQUES，from the series METHODS IN ENZYMOLOGY，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(1987)；Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版，第1-3卷(1989)；和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，Ausubel等人，eds，Current Protocols，a joint venturebetween Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.(1994Supplement)。 
如此处所用的，“可操作地连接”包括指第一序列例如启动子和 第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始和介导对应于第二序列的DNA的转录。一般地，可操作的连接是指被连接的核酸序列是邻接的，且在需要连接两个蛋白编码区时是邻接的且在相同的读框中。 
如此处所用的，术语“植物”包括表示完整的植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子和植物细胞以及其后代。植物细胞，如此处所用的，包括，但不限于，种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、茎干(shoots)、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明的方法的植物的种类，一般和可进行转化技术的高等植物的种类一样广泛，其包括单子叶和双子叶植物，所述所单子叶和双子叶植物包括来自这样的属的物种，该属为：南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、核桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食豆属(Onobrychis)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、鼠耳芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、Ciahorium、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、美人襟属(Salpiglossis)、香瓜属(Cucumis)、Browaalia、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉蜀黍(Zea mays)。 
如此处所用的，“产量”可指收获时谷物农作物的每英亩的蒲式耳，如针对谷物含水量(例如，玉米通常为15％)所调节的。(也指苜蓿产量、根混合产量(root compound yield)等)。收获时测量谷 物中的谷物含水量。将谷物的经调整的受试重量确定为以每蒲式耳磅数为单位的重量，其中在收获时针对谷物含水量水平对其进行调整。 
如此处所用的，“多核苷酸”是指脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或具有天然的核糖核苷酸的基本性质的其类似物，所述基本性质在于其类似物在严格杂交条件下和基本上与天然发生的核苷酸相同的核苷酸序列杂交和/或允许翻译成和天然发生的核苷酸翻译成的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然的或异源的结构或调节基因的全长序列或子序列。除非另外指出，所述术语是指特定的序列和其互补序列。因此，具有因稳定性或其他原因而被修饰的主链的DNA或RNA是和该术语在此处想要表示的意思相同的“多核苷酸”。此外，当在此处使用该术语时，包含罕见的碱基例如肌苷或经修饰的碱基例如三苯甲基化碱基的DNA或RNA(仅举两例)是多核苷酸。要认识到已对这样的DNA和RNA进行了大量的修饰，所述DNA和RNA用于本领域技术人员已知的许多用途目的。术语多核苷酸，当其在此处使用时，包括多核苷酸的这种化学、酶促或代谢上经修饰的形式以及病毒和细胞(除其他以外包括简单和复杂的细胞)的DNA和RNA特征的化学形式。 
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”此处可互换使用，以表示氨基酸残基的聚合物。该术语用于氨基酸聚合物，在所述聚合物中，一个或多个氨基酸是对应的天然发生的氨基酸的人工化学类似物，以及用于天然发生的氨基酸聚合物。 
如此处所用的“启动子”是指转录起始上游参与RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合以启动转录的DNA区域。“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子。示例性植物启动子包括，但不限于，从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌例如土壤杆菌(Agrobacterium)或根瘤菌(Rhizobium)中获得的启动子。实例是优选地在某些组织例如叶、根、种子、纤维、木质部导管(xylemvessels)、管胞或厚壁组织中启动转录的启动子。这些启动子被称为“组织优选的”。“细胞类型”特异性的启动子主要在一种或多种器官中的某些细胞类型，例如根或叶中的维管细胞中驱动表达。“诱导型的”或“可调节的”启动子是在环境控制下的启动子。可通过诱导型的启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧情况或光存在的情 况。另一种类型的启动子是受发育调节的启动子，例如，在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织优选的、细胞类型特异性的、受发育调节的和诱导型的启动子组成了“非组成型”启动子的种类。“组成型”启动子是在大多数环境条件下都具有活性的启动子。 
术语“CNR多肽”是指一种或多种氨基酸序列。该术语也包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如，前蛋白原或蛋白原)。“CNR蛋白”包括CNR多肽。除非另外指出，术语“CNR核酸”是指包含编码CNR多肽的多核苷酸(“CNR多核苷酸”)的核酸。 
如此处所用的，“重组体”是已通过异源核酸的导入而被修饰的细胞或载体或从经这样修饰的细胞衍生的细胞。因此，例如，重组细胞表达发现和该细胞的天然(非重组)形式中的形式不同的基因，或表达作为有意的人工干预的结果在其他情况下异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因；或可减少或消除天然基因的表达。如此处所用的，术语“重组”不包括通过天然发生的事件(例如，自发突变、天然转化/转导/转座)，例如无有意的人工干预而发生的事件，而产生的细胞或载体的改变。 
如此处所用的，“重组表达盒”是使用一系列特定的核酸元件重组或合成地产生的核酸构建体，所述元件允许在靶细胞中转录特定的核酸。可将重组表达盒整合入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段。一般地，除其他序列以外，表达载体的重组表达盒部分包括，待转录的核酸和启动子。 
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”此处可互换使用，以表示整合入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然发生的氨基酸并且，除非另外限定，可包括可以以和天然发生的氨基酸相同的方式起作用的天然氨基酸的已知类似物。 
术语“选择性杂交”是指在严格杂交条件下，核酸序列与特定的核酸靶序列杂交至可检测地高于其与非靶核酸序列杂交的程度(例如，至少为背景的2倍)，且基本上排除非靶核酸。选择性杂交序列相互之间通常具有大约至少40％的序列同一性，优选地60-90％的序列同一性，和最优选地100％的序列同一性(即，互补)。 
术语“严格条件”或“严格杂交条件”是指这样的条件，在该条件下，探针将和其靶序列杂交至可检测地高于与其他序列的程度(例 如，至少为背景的2倍)。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境下可以不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格度，可鉴定可和探针最高达100％互补(同源探测)的靶序列。可选择地，可调整严格条件以允许序列中存在一些错配，这样可检测更低程度的相似性(异源探测)。最优地，探针在长度上大约为500个核苷酸，但在长度上可进行从少于500个核苷酸至等于靶序列的整个长度的大范围的变化。 
一般地，严格条件是这样的条件，在该条件下，盐浓度低于大约1.5M Na离子，通常在pH7.0至8.3下为大约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度为至少大约30℃，对于长探针(例如，超过50个核苷酸)温度为至少大约60℃。也可通过加入去稳定剂例如甲酰胺或Denhardt′s来获得严格条件。示例性低严格度条件包括在37℃下使用30至35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液的杂交、和在50至55℃下在1X至2XSSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中的洗涤。示例性中等严格度条件包括在37℃下在40至45％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中的杂交，和在55至60℃下在0.5X至1XSSC中的洗涤。示例性高严格度条件包括在37℃下在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中的杂交，和在60至65℃下在0.1XSSC中的洗涤。特异性一般是杂交后洗涤的函数，临界因子是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，Tm可根据Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-84(1984)的等式：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L近似估算；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是杂交物以碱基对表示的长度。Tm是这样的温度(在确定的离子强度和pH下)，即在该温度下，50％的互补靶序列和优选地匹配的探针杂交。对于各1％的错配，Tm下降大约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件，以使和需要的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有≥90％的同一性的序列，则可将Tm降低10℃。一般地，选择严格条件，使之比在确定的离子强度和pH下的特定序列和其互补物的热解链温度(Tm)低大约5℃。然而，高度严格条件可在低于热解链温度(Tm)1、2、 3或4℃的情况下使用杂交和/或洗涤；中等严格条件可在低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃的情况下使用杂交和/或洗涤；低严格条件可在低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的情况下使用杂交和/或洗涤。通过使用等式、杂交和洗涤组合物以及需要的Tm，本领域技术人员将理解，可固有地描述杂交和/或洗涤溶液的严格度的变化。如果需要的错配程度导致低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，则优选地增加SSC浓度以使可以使用更高的温度。核酸杂交的详尽的指南见于Tijssen，LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY-HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES，第I部分，第2章，“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays，”Elsevier，New York(1993)；和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第2章，Ausubel等人，eds，Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork(1995)。除非另外提出，在本申请中，高度严格度定义为65℃下在4XSSC、5X Denhardt′s(500ml水中5g Ficoll、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清清蛋白)、0.1mg/ml煮沸的鲑精DNA和25mM磷酸钠中的杂交，和在65℃下0.1XSSC、0.1％SDS中的洗涤。 
如此处所用的，“转基因植物”是指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般地，所述异源多核苷酸被稳定地整合入基因组中，从而所述多核苷酸可被传递至连续世代。可将异源多核苷酸单独地或作为重组表达盒的部分整合入基因组。此处所用的“转基因”包括其基因型已由于异源核酸的存在而被改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其包括最初这样改变的转基因和通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因产生的转基因。此处所用的术语“转基因”不包括通过常规的植物育种方法或通过天然发生的事件，例如随机异花受精、非重组体病毒感染(non-recombinant viralinfection)、非重组体细菌转化(non-recombinant bacterialtransformation)、非重组体转座(non-recombinant transposition)或自发突变产生的基因组(染色体或染色体外的)的改变。 
如此处所用的，“载体”是指用于宿主细胞转染和在其中可插入多核苷酸的核酸。载体通常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸 转录。 
使用下列术语以描述2个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参照序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性的百分比”和(e)“基本上同一”。 
如此处所用的，“参照序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参照序列可以是特定序列的亚群或整体；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段、或完整的cDNA或基因序列。 
如此处所用的，“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续的和特定的区段，在所述区段中可将多核苷酸序列与参照序列比较，且其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分，和参照序列(其不包含添加或缺失)相比，可包含添加或缺失(即，缺口)以便进行两个序列的最优比对。一般地，比较窗口在长度上为至少20个连续核苷酸，且任选地可为30、40、50、100或更长。本领域技术人员理解为了避免由于在多核苷酸序列中包含缺口引起的和参照序列的高相似性，通常引入缺口罚分并将其从匹配的数目中减去。 
用于比较的核苷酸和氨基酸序列的比对的方法在本领域内是熟知的。Smith和Waterman，Adv.Appl.Math2：482(1981)的局部同源性算法(local homology algorithm)(BESTFIT)可进行用于比较的序列的最优比对；通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-53(1970)的同源性比对算法(GAP)；通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性搜索方法(Tfasta和Fasta)；通过这些算法的计算机化实施，所述计算机化实施包括但不限于：Intelligenetics，Mountain View，California的PC/Gene程序中的CLUSTAL；Wisconsin Genetics Software Package，第8版(可从Genetics Computer Group(
Figure S05828987720070301D00021133934QIETU
programs(Accelrys，Inc.，SanDiego，CA))商购获得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。由Higgins和Sharp，Gene73：237-44(1988)；Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-3(1989)；Corpet等人，Nucleic Acids Res.16：10881-90(1988)；Huang等人，Computer Applications in theBiosciences8：155-65(1992)，和Pearson等人，Meth.Mol.Biol.24：307-31(1994)详尽地描述了CLUSTAL程序。用于多个序列的最优全局性比对的优选的程序是PileUp(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.， 25：351-60(1987)，其和由Higgins和Sharp，CABIOS5：151-53(1989)描述的方法相似，且在此引用作为参考)。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的BLASTN；用于核苷酸查询序列对蛋白数据库序列的BLASTX；用于蛋白查询序列对蛋白数据库序列的BLASTP；用于蛋白查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTN；用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTX。参见CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，第19章，Ausubel等人，eds.，GreenePublishing and Wiley·Interscience，New York(1995)。 
GAP使用Needleman和Wunsch(同上)的算法以发现使匹配的数目最大化和使缺口的数目最小化的两个完全序列的比对。GAP考虑所有可能的比对和缺口位置并产生具有最大匹配的碱基数目和最少缺口的比对。其允许在匹配的碱基单位中提供缺口生成罚分(gapcreation penalty)和缺口延伸罚分(gap extension penalty)。对于其插入的各缺口，GAP必须利用匹配的缺口生成罚分数目。如果选择大于0的缺口延伸罚分，则对于插入的各缺口，GAP必须，此外，利用缺口长度乘以缺口延伸罚分。Wisconsin Genetics SoftwarePackage的第10版中的缺省缺口生成罚分值和缺口延伸罚分值分别为8和2。缺口生成和缺口延伸罚分可表示为选自0至100的整数组的整数。因此，例如，缺口生成和缺口延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。 
GAP提供了最佳比对的家族的一个成员。可存在许多该家族的成员，但其他成员都不具有更好的质量。GAP显示了4个比对的品质因数：质量、比率、同一性和相似性。质量是经最大化以比对序列的度量标准。比率是质量除以较短的片段中碱基的数目。百分比同一性是实际匹配的符号的百分比。百分比相似性是相似的符号的百分比。忽略跨越缺口的符号。当一对符号的评分矩阵值高于或等于0.50(相似性阈值)时，给相似性评分。Wisconsin Genetics SoftwarePackage的第10版中使用的评分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))。 
除非另外指出，此处提供的序列同一性/相似性值是指使用BLAST2.0程序组，使用缺省参数获得的值(Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997))。 
如本领域技术人员所理解的，BLAST检索假定蛋白可被作为随机序列建模。然而，许多实际的蛋白包含非随机序列的区域，所述区域可以是同聚序列段、短周期重复序列(short-period repeats)或富含一个或多个氨基酸的区域。可能在非相关蛋白之间对这种低复杂度区域进行比对，即使蛋白的其他区域完全相异。可使用许多低复杂度过滤器程序(filter programs)来减少这些低复杂度比对。例如，可单独地或组合地使用SEG(Wooten和Federhen，Comput.Chem.17：149-63(1993))和XNU(Claverie和States，Comput.Chem.17：191-201(1993))的低复杂度过滤器。 
如此处所用的，两个核酸或多肽序列背景中的“序列同一性”或“同一性”是指当在特定的比较窗口上就最大的对应进行比对时，两个序列中的相同的残基。当序列同一性的百分比用于表示蛋白时，要认识到不相同的残基位点通常是通过保守性氨基酸置换产生的差异，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，并因而不改变分子的功能特性。当序列的差异在于保守性置换时，可向上调整百分比序列同一性以校正置换的保守性质。其不同在于这种保守性置换的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行该调整的方法对本领域技术人员来说是熟知的。通常这包括给作为部分而非完全错配的保守性置换评分，从而增加了百分比序列同一性。因此，例如，当赋予相同的氨基酸1的分值时和给非保守性置换赋予0的分值时，给保守性置换赋予0和1之间的分值。根据例如Meyers和Miller，Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17(1988)的算法，例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，美国)中实施的算法，计算保守性置换的评分。 
如此处所用的，“序列同一性的百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列确定的值，其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分，当和用于两个序列的最佳比对的参照序列(其不包含添加或缺失)相比较时，可包含添加或缺失(即，缺口)。通过如下方法来计算百分比，即确定这样的位置(在该位置上，两个序列上存在相同的核酸碱基或氨基酸残基)数目以产生匹配的位置的数目，将匹配的 位置的数目除以比较的窗口中位置的总数目并将该结果乘以100以产生序列同一性的百分比。 
术语多核苷酸序列的“基本同一性”是指多核苷酸包含这样的序列，该序列，通过使用所述比对程序中的一个程序，利用标准参数，和参照序列相比，具有50-100％的序列同一性，优选地至少50％的序列同一性，优选地至少60％的序列同一性，优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％，和最优选地至少95％的同一性。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框架定位等，可恰当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白的对应的同一性。对于这些目的，氨基酸序列的基本同一性通常是指55-100％，优选地至少55％，优选地至少60％，更优选地至少70％、80％、90％和最优选地至少95％的序列同一性。 
核苷酸序列基本相同的另一个指标是两个分子在严格条件下是否相互杂交。遗传密码的简并性允许存在许多导致编码相同氨基酸的核苷酸序列中的多样性的氨基酸置换，因此，DNA序列可能编码相同的多肽，但在严格条件下不能相互杂交。该现象可在例如当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸的拷贝时发生。两个核酸序列基本上相同的一个指标是，第一核酸编码的多肽和由第二核酸编码的多肽发生免疫学交叉反应。 
肽背景中的术语“基本同一性”显示肽包含这样的序列，该序列在特定的比较窗口上和参照序列具有55-100％的序列同一性，优选地至少55％的序列同一性，优选地60％，优选地70％，更优选地80％，最优选地至少90％或95％的序列同一性。优选地，使用Needleman和Wunsch(同上)的同源性比对算法进行最佳比对。两个肽序列基本相同的指标是一个肽和抗第二个肽产生的抗体发生免疫反应。因此，例如当两个肽的差异只在于保守性置换时，肽基本上和第二个肽相同。此外，当肽和第二个肽的差异在于非保守性改变时，如果抗体识别的表位基本相同，那么肽和第二个肽可基本相同。除了不相同的残基位置的差异可在于保守性氨基酸变化外，“基本相似”的肽共有如上指出的序列。 
本发明公开了CNR多核苷酸和多肽。本发明的新的核苷酸和蛋白具有这样的表达模式，该表达模式表明其调节细胞数目，并从而在 植物的发育中起着重要作用。所述多核苷酸在各种植物组织中表达。因此所述多核苷酸和多肽为操纵植物发育以改变种子和营养组织的发育、时间选择或组成提供了机会。这可用于产生不育植物、无种子植物或具有改变的胚乳组成的植物。 
核酸 
除其他以外，本发明提供了包含CNR多核苷酸的RNA、DNA的分离的核酸和其类似物和/或嵌合物。 
本发明也包括经最优化以在不同生物中表达的多核苷酸。例如，为了在玉米植物中表达多核苷酸，可根据Murray等人(同上)改变序列以解决特定的密码子偏好和改变GC含量。在Murray等人(同上)的表4中列出了来自玉米植物的28个基因的玉米密码子选择。 
本发明的CNR核酸包含分了这样的分离的CNR多核苷酸，该多核苷酸包含： 
(a)编码CNR多肽的多核苷酸和其经保守性修饰的和多态性变体； 
(b)和(a)或(b)的多核苷酸具有至少70％的序列同一性的多核苷酸； 
(c)(a)或(b)的多核苷酸的互补序列。 
核酸的构建 
可使用(a)标准的重组方法、(b)合成技术或其组合制备本发明的分离的核酸。在一些实施方案中，从真菌或细菌克隆、扩增或以其他方式构建本发明的多核苷酸。 
核酸可常规地包含除了本发明的多核苷酸以外的序列。例如，可将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入核酸以帮助多核苷酸的分离。同样，可插入可翻译的序列以帮助本发明的被翻译的多核苷酸的分离。例如，六组氨酸标记序列提供了纯化本发明的蛋白的便利方法。本发明的核酸-不包括多核苷酸序列-任选地是用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体、连接物或接头。可向这种克隆和/或表达序列中加入额外的序列以在克隆和/或表达中最优化其功能，从而帮助多核苷酸的分离或促进多核苷酸至细胞的导入。一般 地，减去其的本发明的多核苷酸的长度的本发明的核酸的长度小于20千碱基对，通常少于15kb和经常少于10kb。克隆载体、表达载体、连接物和接头的用途在本领域内是熟知的。示例性核酸包括这种载体如：M13、λZAP Express、λZAP II、λgt10、λgt11、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II、λDASH II、λEMBL3、λEMBL4、pWE15、SuperCos1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3′SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI和II、pOPRSVI CAT、pOPI3CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、λMOSSlox和λMOSElox。用于本发明的任选的载体，包括但不限于，λZAP II和pGEX。关于各种核酸的描述，参见，例如Stratagene Cloning Systems，Catalogs1995，1996，1997(La Jolla，CA)；和，Amersham Life Sciences，Inc，Catalog′97(Arlington Heights，IL)。 
用于构建核酸的合成方法 
也可通过这样的方法通过直接的化学合成制备本发明的分离的核酸，所述方法是例如Narang等人，Meth.Enzymol.68：90-9(1979)的磷酸三酯法、Brown等人，Meth.Enzymol.68：109-51(1979)的磷酸二酯法、Beaucage等人，Tetra.Letts.22(20)：1859-62(1981)的二乙基亚磷酰胺法、Beaucage等人(同上)描述的使用例如自动化合成仪例如Needham-VanDevanter等人，NucleicAcidsRes.12:6159-68(1984)中描述的自动化合成仪的固体亚磷酰胺三酯法、和美国专利号4,458,066的固体支持物法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。可通过和互补序列杂交或可使用单链作为模板利用DNA聚合酶进行聚合将其转变成双链DNA。本领域技术人员将认识到，尽管DNA的化学合成被限定为大约100个碱基的序列，但可通过连接较短的序列获得更长的序列。 
UTR和密码子偏好 
一般地，已发现翻译效率被RNA的5′非编码区或非翻译区(5′ UTR)中的特定序列元件调节。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，Nucleic Acids Res.15：8125(1987))和5<G>7甲基GpppGRNA帽结构(Drummond等人，Nucleic Acids Res.13：7375(1985))。负元件包括稳定的分子内5′UTR茎-环结构(Muesing等人，Cell48：691(1987))和AUG序列或5′UTR中的合适AUG之后的短可读框(Kozak，同上，Rao等人，Mol.andCell.Biol.8：284(1988))。因此，本发明提供了用于调节异源编码性序列的翻译的5′和/或3′UTR区。 
此外，可修饰本发明的多核苷酸的多肽编码性片段以改变密码子选择。可使用经改变的密码子选择以改变翻译效率和/或最优化编码序列，以在需要的宿主中进行表达或最优化异源序列中的密码子选择以在玉米中进行表达。可使用可商购获得的软件包例如可从University of Wisconsin Genetics Computer Group.获得的“CodonPreference”在统计学上分析本发明的多核苷酸的编码区中的密码子选择。见Devereaux等人，NucleicAcids Res.12：387-395(1984))或MacVector4.1(Eastman Kodak Co.，New Haven，Conn.)。因此，本发明提供了本发明的多核苷酸中的至少一种的编码区的密码子选择频率特征。可用于确定密码子选择频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可以是从3至此处提供的本发明的多核苷酸的数目的任一整数。任选地，多核苷酸可以是全长序列。用于统计学分析的序列的示例性数目可以是至少1、5、10、20、50或100。 
序列改组 
本发明提供了用于使用本发明的多核苷酸进行序列改组的方法和由此产生的组合物。序列改组描述于PCT公开号96/19256。也参见，Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-9(1997)；和Zhao等，Nature Biotech16：258-61(1998)。一般地，序列改组提供了用于产生具有想要的可被选择或筛选的特征的多核苷酸的文库的方法。从相关序列多核苷酸的群体产生重组多核苷酸的文库，所述相关序列多核苷酸群体包含具有基本序列同一性和可在体外或体内同源重组的序列区域。经序列重组的多核苷酸的群体包含具有需要的或有利的特征并且可通过合适的选择或筛选方法选择的多核苷酸的亚群体。所述特征可以是能够在筛选系统中被选择或检测的任何特征或属性，且包括 如下特性：编码的蛋白，转录元件，控制转录、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、翻译或基因或转基因的其他表达特性的序列，复制元件，蛋白结合元件等，例如提供可选择或可检测的性质的任何特性。在一些实施方案中，选择的特征可以是改变的高于此处提供的野生型蛋白的Km和/或Kcat。在其他实施方案中，从序列改组产生的蛋白或多核苷酸具有大于非改组的野生型多核苷酸的配体结合亲和力。在其他实施方案中，通过序列改组产生的蛋白或多核苷酸，当和非改组野生型多核苷酸相比时，可具有改变的pH最适值。这些性质中的增加可为野生型值的至少110％、120％、130％、140％或大于150％。 
重组表达盒 
本发明还提供了包含本发明的核酸的重组表达盒。可使用编码本发明的需要的多核苷酸的核酸序列，例如编码长度足以编码本发明的活性蛋白的多肽的cDNA或基因组序列，构建可被导入需要的宿主细胞的重组表达盒。重组表达盒通常包含本发明的可操作地连接至这样的转录起始调节序列的多核苷酸，所述调节序列可指导所述多核苷酸在预期的宿主细胞例如经转化的植物的组织中转录。 
例如，植物表达载体可包含(1)在5′和3′的调节序列的转录控制下的经克隆的植物基因和(2)显性选择标记。如果想要，这些植物表达载体也可包含，启动子调节区(例如，赋予诱导型的或组成型的、受环境或发育调节的或细胞或组织特异性/选择性的表达的启动子调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。 
可使用在再生的植物的所有组织中指导本发明的多核苷酸表达的植物启动子片段。这些启动子在此处称为“组成型”启动子，且其在大多数环境条件下和发育或细胞分化状态下是有活性的。组成型启动子的实例包括来源于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′-或2′-启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利号5,683,439)、Nos启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如描述于Odell等人，Nature313：810-2(1985)中的、水稻肌动蛋白 (McElroy等人，Plant Cell163-171(1990))、遍在蛋白(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1992)和Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-89(1992))、pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81：581-8(1991))、MAS(Velten等人，EMBOJ.3：2723-30(1984))、和玉米H3组蛋白(Lepetit等人，Mol.Gen.Genet.231：276-85(1992)；和Atanassvoa等人，Plant Journal2(3)：291-300(1992))、ALS启动子，如PCT申请号WO96/30530中所描述的、和来自本领域技术人员已知的各种植物基因的其他转录起始区。对于本发明，遍在蛋白是用于在单子叶植物中表达的优选的启动子。 
可选择地，植物启动子可指导本发明的多核苷酸在特定的组织中表达或另外可在更精确的环境或发育的控制之下。这些启动子在此处被称为“诱导型的”启动子。可影响通过诱导型启动子进行的转录的环境条件包括病原体攻击、厌氧条件或光的存在。诱导型启动子的实例是Adh1启动子，其通过低氧或冷应激进行诱导；Hsp70启动子，其通过热应激进行诱导；和PPDK启动子，其通过光诱导。 
发育控制下的启动子的实例包括这样的启动子，该启动子只在或优选地在某些组织例如叶、根、果实、种子或花中启动转录。启动子的操作也可依赖于其在基因组中的位置而变化。因此，诱导型启动子可在某些位置变成完全组成型的或部分组成型的启动子。 
如果需要表达多肽，则一般需要包含多核苷酸编码区的3′末端的多腺苷酸化区域。多腺苷酸化区域可来源于各种植物基因或来自T-DNA。要加入的3′末端序列可来源于，例如，胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶基因，或可选择地来自另一种植物基因，或较不优选地来自任何一种其他的真核基因。这些调节元件的实例包括，但不限于，3′末端和/或多腺苷酸化区域，例如根癌土壤杆菌胭脂氨酸合酶(nos)基因(Bevan等人，Nucleic Acids Res.12：369-85(1983))、马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil等人，Nucleic Acids Res.14：5641-50(1986)和An等人，Plant Cell1：115-22(1989))、和CaMV19S基因(Mogen等人，Plant Cell2：1261-72(1990))的3′末端和/或多腺苷酸化区域。 
可将内含子序列加至部分编码序列的5′非翻译区或编码序列以增加在细胞溶胶中积累的成熟信息(mature message)的量。已显示，植物和动物表达构建体中的转录单位中的可剪接内含子的包含在 mRNA和蛋白水平上都将基因的表达增加最高达1000倍(Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-200(1987))。当置于转录单位的5′末端附近时，该基因表达的内含子增强作用通常最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途在本领域是已知的。一般参见，THE MAIZEHANDBOOK，第116章，Freeling和Walbot，eds.，Springer，NewYork(1994)。 
植物信号序列，包括，但不限于，将蛋白靶向植物细胞的细胞外基质的编码信号肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos等人，J.Biol.Chem.264：4896-900(1989))，例如白花丹叶烟草扩延基因(Nicotianaplumbaginifolia extension gene)(DeLoose等人，Gene99：95-100(1991))、将蛋白靶向液泡的信号肽，例如甘薯贮藏蛋白(sporamin)基因(Matsuka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：834(1991))和大麦凝集素基因(Wilkins等人，Plant Cell，2：301-13(1990))、导致蛋白分泌的信号肽，例如PRIb(Lind等人，Plant Mol.Biol.18：47-53(1992))或大麦α淀粉酶(BAA)(Rahmatullah等人，Plant Mol.Biol.12：119(1989)，且在此处引用作为参考)的信号肽、或将蛋白靶向质体的信号肽，例如油菜籽烯酰基ACP还原酶的信号肽(Verwaert等人，PlantMol.Biol.26：189-202(1994))可用于本发明。融合至CNR多核苷酸的大麦α淀粉酶信号序列是用于在本发明的玉米中表达的优选的构建体。 
包含来自本发明的多核苷酸的序列的载体一般包含标记基因，该标记基因赋予植物细胞可选择的表型。一般地，选择标记基因编码抗生素抗性，其中合适的基因包括编码对抗生素壮观霉素抗性的基因(例如，aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码对除草剂(其作用抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用)特别是磺酰脲类除草剂的抗性的基因(例如，包含导致该抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂，例如膦丝菌素或草铵膦抗性的基因(例如，bar基因)、或本领域已知的其他这样的基因。bar基因编码对除草剂草铵膦的抗性，而ALS 基因编码对除草剂绿黄隆的抗性。 
用于高等植物中基因表达的一般载体在本领域是熟知的，且包括从由Rogers等人，Meth.Enzymol.153：253-77(1987)描述的根癌土壤杆菌的肿瘤诱导性(Ti)质粒衍生的载体。这些载体是植物整合载体，因为转化后，所述载体将载体DNA的部分整合入宿主植物的基因组中。此处所用的示例性根癌土壤杆菌载体是Schardl等人，Gene61：1-11(1987)，和Berger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6(1989)的质粒pKYLX6和pKYLX7。另一个此处所用的载体是可从CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)购得的质粒pBI101.2。 
宿主细胞中蛋白的表达 
通过使用本发明的核酸，人们可在经重组工程改造的细胞例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或优选地植物细胞中表达本发明的蛋白。所述细胞在非天然条件(例如，在质量、组成、位置和/或时间上)下产生蛋白，因为其已通过人工干预在遗传上进行了改变以这样做。 
预期本领域技术人员了解可获得的用于表达编码本发明的蛋白的核酸的许多表达系统。不试图详细地描述已知用于在原核生物或真核生物中表达蛋白的各种方法。 
简而言之，一般通过可操作地将例如DNA或cDNA连接至启动子(其是组成型的或诱导型的)，然后将其整合入表达载体来实现编码本发明的蛋白的分离的核酸的表达。所述载体适合在原核生物或真核生物中复制和整合。一般的表达载体包含用于调节编码本发明的蛋白的DNA的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为获得已克隆的基因的高水平表达，需要构建这样的表达载体，该表达载体最少包含指导转录的强启动子，例如遍在蛋白，用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子。组成型启动子被分类为提供一系列组成型表达。因此，一些为弱组成型启动子，而其他的为强组成型启动子。一般地，“弱启动子”意欲指以低水平驱动编码序列表达的启动子。“低水平”意欲指以大约1/10,000的转录物至大约1/100,000的转录物至大约1/500,000的转录物的水平。相反地，“强启动子”以“高水平”、或大约1/10转录物至大约1/100转录物至大约1/1,000 转录物驱动编码序列表达。 
本领域技术人员将认识到，可对本发明的蛋白进行修饰而不减少其生物学活性。可产生一些修饰以帮助克隆、表达靶向分子或将靶向分子整合入融合蛋白。这些修饰对于本领域技术人员来说是熟知的，且包括，例如，在氨基末端加上甲硫氨酸以提供起始位点，或将额外的氨基酸(例如，多组氨酸)置于任一末端以产生方便地定位的限制位点或终止密码子或纯化序列。 
在原核生物中的表达 
可将原核细胞用作用于表达的宿主。原核生物最通常以各种大肠杆菌株为代表；然而，也可使用其他微生物株。此处定义的包含用于转录起始的启动子、任选地具有操纵基因以及核糖体结合位点序列的普遍使用的原核控制序列，包括这种普遍使用的启动子，如β内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang等人，Nature198：1056(1977))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，NucleicAcids Res.8：4057(1980))和λ衍生的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等人，Nature292：128(1981))。在大肠杆菌中转染的DNA载体中包含选择标记也是有用的。这种标记的实例包括限定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。 
选择载体以使得能够将目的基因导入合适的宿主细胞。细菌载体一般是质粒或噬菌体来源。用噬菌体载体颗粒感染或用裸露的噬菌体载体DNA转染合适的细菌细胞。如果使用质粒载体，则用质粒载体DNA转染细菌细胞。使用芽孢杆菌属物种(Bacillussp.)和沙门氏菌属物种(Salmonella)表达本发明的蛋白的表达系统是可获得的(Palva等人，Gene22：229-35(1983)；Mosbach等人，Nature302：543-5(1983))。购自Pharmacia的pGEX-4T-1质粒载体是用于本发明的优选的大肠杆菌表达载体。 
在真核生物中的表达 
各种真核表达系统例如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞对于本领域技术人员来说是已知的。如下面所简单解释的，本发明可在这些真核系统中表达。在一些实施方案中，经转化/转染的植物细 胞，如下文中讨论的，被用作用于产生本发明的蛋白的表达系统。 
酵母中异源蛋白的合成是熟知的。Sherman等人，METHODS INYEAST GENETICS，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)是受到广泛承认的工作，其描述了可获得的用于在酵母中产生蛋白的各种方法。用于真核生物蛋白生产的两种广泛使用的酵母是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)。用于在糖酵母和毕赤氏酵母中表达的载体、株和方案在本领域中是已知的并且可从商业提供商(例如，Invitrogen)商购获得。合适的载体通常具有需要的表达控制序列，例如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶，以及复制起点、终止序列等。 
本发明的蛋白一旦表达，就可通过裂解细胞并对裂解物或沉淀使用标准的蛋白分离技术来从酵母中分离。可通过使用蛋白印迹技术或其他标准的免疫测定技术中的放射免疫测定来完成纯化过程的监控。 
也可将编码本发明的蛋白的序列连接至各种用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物的表达载体。哺乳动物细胞系统通常以单层细胞的形式存在，尽管也可使用哺乳动物细胞悬浮液。在本领域已开发了能够表达完整蛋白的许多合适的宿主细胞系，且其包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，例如复制起点、启动子(例如，CMV启动子、HSVtk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen等人，Immunol.Rev.89：49(1986))和必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如，SV40大T Ag多腺苷酸化添加位点)和转录终止子序列。用于本发明的蛋白生产的其他动物细胞可从例如美国模式培养物保藏中心的细胞系和杂交瘤目录(American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines andHybridomas)(第7版，1992)获得。 
用于在昆虫细胞中表达本发明的蛋白的合适的载体通常衍生自SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、粘虫、蛾和果蝇(Drosophila)细胞系例如Schneider细胞系(参见，例如，Schneider，J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65(1987))。 
如同酵母一样，当使用高等动物或植物宿主细胞时，一般将多腺 苷酸化或转录终止子序列整合入载体。终止子序列的实例是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。也可包含用于转录物的准确剪接的序列。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，J.Virol.45：773-81(1983))。此外，可将在宿主细胞中控制复制的基因序列整合入载体，例如在牛乳头瘤病毒类型载体中发现的载体(Saveria-Campo，“Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic CloningVector”，于DNA CLONING：A PRACTICAL APPROACH，第II卷，Glover，ed.，IRL Press，Arlington，VA，pp.213-38(1985))。 
此外，可使用置于合适的植物表达载体中的CNR的基因转化植物细胞。然后可从植物愈伤组织中分离多肽或可使用转化细胞再生转基因植物。可收获这种转基因植物，并可将合适的组织(例如，种子或叶)接受大规模蛋白提取和纯化技术。 
植物转化方法 
用于将外来基因导入植物的许多方法是已知的并且可用于将CNR多核苷酸插入宿主植物，所述方法包括生物学和物理植物转化方案。参见，例如，Miki等人，″Procedure for Introducing ForeignDNA into Plants，″in METHODS IN PLANT MOLECULARBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，Glick和Thompson，eds.，CRCPress，Inc.，Boca Raton，pp.67-88(1993)。选择的方法随宿主植物的变化而变化，且包括化学转染法例如磷酸钙、微生物介导的基因转移例如土壤杆菌(Horsch等人，Science227：1229-31(1985))、电穿孔、显微注射和生物弹射击轰击(biolistic bombardment)。 
用于植物细胞或组织转化以及植物的再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并且是可获得的。参见，例如，Gruber等人，″Vectors for Plant Transformation，″in METHODS IN PLANTMOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，同上，pp.89-119。 
可通过一般用于直接递送入细胞的一种或多种技术将分离的多核苷酸或多肽导入植物。这些方案可依赖于被靶向以进行基因修饰的生物、细胞、植物或植物细胞(即单子叶或双子植物)的类型而变化。转化植物细胞的合适方法包括显微注射法(Crossway等人(1986) Biotechniques4：320-334；和美国专利6,300,543)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606，直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722)和弹道粒子加速(参见，例如，Sanford等人，美国专利号4,945,050；WO91/10725和McCabe等人(1988)Biotechnology6：923-926)。也参见，Tomes等人，Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via MicroprojectileBombardment，pp.197-213 in Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Fundamental Methods，eds.O.L.Gamborg&G.C.Phillips.Springer-Verlag BerlinHeidelberg New York，1995；美国专利5,736,369(分生组织)；Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology8：736-740(水稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology6：559-563(玉米)；WO91/10725(玉米)；Klein等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology8：833-839；和Gordon-Kamm等人(1990)Plant Cell2：603-618(玉米)；Hooydaas-Van Slogteren&Hooykaas(1984)Nature(London)311：763-764；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人(1985)InThe Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.G.P.Chapman等人，pp.197-209.Longman，NY(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant CellReports9：415-418；和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(颈须介导的转化(whisker-mediatedtransformation))；美国专利号5,693,512(超声处理)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant CellReports12：250-255；和Christou&Ford(1995)Annals of Botany75：407-413(水稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotech.14：745-750；土壤杆菌介导的玉米转化(美国专利5,981,840)；碳化硅须晶(siliconcarbide whisker)法(Frame等人(1994)PlantJ.6：941-948)；激光法(Guo等人(1995)Physiologia Plantarum93：19-24)；超声处理法(Bao等人(1997)Ultrasound in Medicine&Biology23：953-959；Finer& Finer(2000)Lett Appl Microbiol.30：406-10；Amoah等人(2001)JExp Bot52：1135-42)；聚乙二醇法(Krens等人(1982)Nature296：72-77)；可使用电穿孔(Fromm等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：5824-5828)和显微注射(Crossway等人(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185)转化的单子叶植物和双子叶植物细胞的原生质体；所有文献在此引用作为参考。 
土壤杆菌介导的转化 
用于将表达载体导入植物的最广泛使用的方法基于土壤杆菌的天然转化系统。根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)是遗传转化植物细胞的植物病原性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。参见，例如Kado，Crit.Rev.PlantSci.10:1(1991)。在Gruber等人，同上；Miki等人，同上；和Moloney等人，Plant Cell Reports8：238(1989)中提供了用于土壤杆菌介导的基因转移的土壤杆菌载体系统和方法的描述。 
类似地，可将基因分别插入来自根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌的Ti或Ri质粒的T-DNA区域。因此，可如上使用这些质粒构建表达盒。已知许多这样的控制序列，当所述控制序列偶联至异源编码序列并转化入宿主生物时，其在基因表达上显示保真性(相对于原始编码性序列的组织/器官特异性)。参见，例如，Benfey和Chua，Science244：174-81(1989)。用于这些质粒的特别合适的控制序列是用于各种靶植物中基因的组成型叶特异性表达的启动子。其他有用的控制序列包括来自胭脂氨酸合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，其可从美国模式培养物保藏中心获得并命名为ATCC67238。如果使用这样的系统，则来自Ti或Ri质粒的毒性(vir)基因也必须和T-DNA部分一起存在或以二元体系的形式存在，在所述二元体系中，vir基因存在于分开的载体中。该系统、用于其中的载体以及转化植物细胞的方法描述于美国专利号4,658,082、1986年10月1日提交的美国专利申请号913,914，如在1993年11月16日授权的美国专利号5,262,306中引用的、和Simpson等人，Plant Mol.Biol.6：403-15(1986)(也在′306专利中被引用)，所有 参考资料都以其全文在此引用作为参考。 
一旦构建，就可将这些质粒置入发根土壤杆菌和根癌土壤杆菌，且这些载体用于转化通常对镰孢属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染易感的植物物种的细胞.本发明也预期几种其他的转基因植物，包括但不限于，大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、甘蓝、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、瓜和胡椒。根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌的选择依赖于由其转化的植物。一般地，根癌土壤杆菌对于转化是优选的生物.大部分双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如，百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对使用根癌土壤杆菌的感染易感.发根土壤杆菌也具有广泛的宿主范围，包括大部分双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员.现在转化单子叶植物可获得一定的成功.欧洲专利申请号604662A1公开了使用土壤杆菌转化单子叶植物的方法.欧洲申请号672752A1公开了使用未成熟胚的盾片，用土壤杆菌转化单子叶植物的方法，Ishida等人讨论了通过将未成熟胚暴露于根癌土壤杆菌中来转化玉米的方法(Nature Biotechnology 14：745-50(1996)). 
一旦转化，就可使用这些细胞再生转基因植物。例如，可通过使这些植物产生伤口，然后将载体引入伤口部位来用这些载体感染整个植物。可使植物的任何部位产生伤口，包括叶、茎和根。可选择地，可用这些载体接种以外植体形式存在的植物组织，例如子叶组织或叶盘，并在促进植物再生的条件下进行培养。可将通过用发根土壤杆菌或根癌土壤杆菌(其含有编码串珠镰孢菌素降解酶的基因)接种植物组织转化的根或茎用作通过体细胞胚胎发生(somaticembryogenesis)或器官发生再生串珠镰孢菌素抗性的转基因植物的植物组织的来源。用于再生植物组织的这些方法的实例公开于Shahin，Theor.Appl.Genet.69：235-40(1985)；美国专利号4,658,082；Simpson，等人，同上；1986年10月1日提交的美国专利申请号913,913和913,914，如在1993年11月16日授权的美国专利号5,262,306中所引用的，所有公开内容在此引用作为参考。 
直接基因转移
尽管事实上土壤杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类农作物物种和裸子植物通常一直难以使用该基因转移模式，即使最近已在水稻中获得一些成功(Hiei等人，ThePlant Journal6：271-82(1994))。已开发了几种植物转化的方法，统称为直接基因转移，作为土壤杆菌介导的转化的另外的选择。 
植物转化的一般可用的方法是微粒介导的转化，其中在测量为大约1至4μm的微粒表面上携带有DNA。用将微粒加速至300至600m/s的速度的生物弹射击装置将表达载体导入植物组织，所述速度足以穿透植物细胞壁和细胞膜(Sanford等人，Part.Sci.Technol.5：27(1987)；Sanford，Trends Biotech6：299(1988)；Sanford，Physiol.Plant79：206(1990)；和Klein等人，Biotechnology10：268(1992))。 
用于将DNA物理递送至植物的另一种方法是Zang等人，BioTechnology9：996(1991)中描述的靶细胞的超声处理。可选择地，已使用脂质体或原生质球融合体将表达载体导入植物。参见，例如，Deshayes等人，EMBOJ.4：2731(1985)；和Christou等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3962(1987)。也已报导了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸进行的DNA至原生质体的直接摄入。参见，例如，Hain等人，Mol.Gen.Genet.199：161(1985)；和Draper等人，PlantCell Physiol.23：451(1982)。 
也已描述原生质体和完整的细胞以及组织的电穿孔。参见，例如，Donn等人，于Abstracts of the VIIth Int’l.Congress on Plant Celland Tissue Culture IAPTC，A2-38，p.53(1990)；D′Halluin等人，PlantCell4：1495-505(1992)；和Spencer等人，Plant Mol.Biol.24：51-61(1994)中。 
增加CNR多肽的活性和/或水平 
提供了增加本发明的CNR多肽的活性和/或水平的方法。可通过给植物提供CNR多肽来获得本发明的CNR多肽的水平和/或活性中的增加。可通过将编码CNR多肽的氨基酸序列导入植物，将编码CNR多肽的核苷酸序列导入植物或可选择地通过修饰编码本发明的CNR多肽的基因组基因座来提供CNR多肽。 
如本说明书其他地方所讨论的，用于向植物中提供多肽的许多方 法是本领域已知的，其包括，但不限于，多肽至植物内的直接导入、将编码具有细胞数目调节物活性的多肽的多核苷酸构建体导入植物(短暂地或稳定地)。也要认识到，本发明的方法可使用不能在经转化的植物中指导蛋白或RNA的表达的多核苷酸。因此，可通过改变编码CNR多肽的基因或其启动子来增加CNR多肽的水平和/或活性。参见，例如，Kmiec，美国专利5,565,350；Zarling等人，PCT/US93/03868。因此提供了携带CNR基因中的突变的诱变的植物，其中所述突变增加了CNR基因的表达或增加了编码的CNR多肽的细胞数目调节物活性。 
降低CNR多肽的活性和/或水平 
通过用这样的表达盒转化植物细胞来提供减少或消除本发明的CNR多肽的活性的方法，所述表达盒表达抑制CNR多肽表达的多核苷酸。该多核苷酸可通过阻止CNR信使RNA的转录或翻译直接地，或通过编码抑制编码CNR多肽的CNR基因的转录或翻译的多肽间接地抑制CNR多肽的表达。用于在植物中抑制或消除基因的表达的方法在本领域中是熟知的，且可在本发明中使用任何这样的方法来抑制CNR多肽的表达。 
根据本发明，如果CNR多肽的蛋白水平低于这样的植物中的相同CNR多肽的蛋白水平的70％，那么CNR多肽的表达是被抑制的，所述植物是未经抑制该CNR多肽表达的基因修饰或诱变处理的植物。在本发明的特定的实施方案中，本发明的经修饰的植物中的CNR多肽的蛋白水平低于这样植物中的相同CNR多肽的蛋白水平的60％、低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％或低于2％，所述植物不是突变体或未经抑制该CNR多肽表达的基因修饰。可通过例如测定植物细胞或植物中表达的CNR多肽的水平直接地，或通过例如测量植物细胞或植物中CNR多肽的细胞数目调节物活性或通过测量植物中细胞数目间接地测量CNR多肽的表达水平。在本说明书的其他地方描述了用于进行该测定的方法。 
在本发明的其他实施方案中，通过用这样的表达盒转化植物细胞来减少或消除CNR多肽的活性，所述表达盒包含编码抑制CNR多肽的活性的多肽的多核苷酸。如果CNR多肽的细胞数目调节物活性 低于这样的植物中的相同CNR多肽的细胞数目调节物活性的70％，那么根据本发明，CNR多肽的细胞调节物活性被抑制，所述植物未接受抑制该CNR多肽的细胞数目调节物活性的修饰。在本发明的特定实施方案中，本发明的经修饰的植物中的CNR多肽的细胞数目调节物活性低于这样的植物中的相同CNR多肽的细胞数目调节物活性的60％、低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％或低于5％，所述植物未接受被抑制该CNR多肽的表达的修饰。当通过本说明书其他地方描述的测定法不能检测到CNR多肽的细胞数目调节物活性时，根据本发明，CNR多肽的该活性被“消除”。在本说明书的其他地方描述了确定CNR多肽的细胞数目调节物活性的方法。 
在其他实施方案中，可通过破坏编码CNR多肽的基因减少或消除CNR多肽的活性。本发明包括这样的经诱变处理的植物，该植物在CNR基因中携带突变，其中该突变减少CNR基因的表达或抑制编码的CNR多肽的细胞数目调节物活性。 
因此，可使用许多方法减少或消除CNR多肽的活性。此外，可使用超过一种方法减少单个CNR多肽的活性。下面提供了减少或消除CNR多肽的表达的非限定性实例。 
1.基于多核苷酸的方法： 
在本发明的一些实施方案中，用能够表达抑制本发明的CNR多肽表达的多核苷酸的表达盒转化植物。此处使用的术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，为了本发明的目的，能够表达抑制至少一种CNR多肽表达的多核苷酸的表达盒是这样的表达盒，该表达盒能够产生抑制本发明的至少一种CNR多肽的转录和/或翻译的RNA分子。来自DNA分子的蛋白或多肽的“表达”或“产生”是指产生蛋白或多肽的编码序列的转录和翻译，而来自RNA分子的蛋白或多肽的“表达”或“产生”是指产生蛋白或多肽的RNA编码序列的翻译。 
下面提供了抑制CNR多肽表达的多核苷酸的实例。 
i.有义抑制/共抑制
在本发明的一些实施方案中，可通过有义抑制或共抑制来获得CNR多肽的表达的抑制。对于共抑制，设计表达盒以使之表达对应于“有义”方向的编码CNR多肽的信使RNA的全部或部分的RNA分子。所述RNA分子的超表达可导致天然基因的减少的表达。因此，筛选用共抑制表达盒转化的多个植物系以鉴定显示CNR多肽表达的最大抑制作用的那些植物系。 
用于共抑制的多核苷酸可对应于编码CNR多肽的序列的全部或部分、CNR多肽转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或部分、或编码CNR多肽的转录物的编码序列和非翻译区的全部或部分。在一些其中多核苷酸包含CNR多肽的编码区的全部或部分的实施方案中，设计表达盒以使之除去所述多核苷酸的起始密码子，从而将不翻译蛋白产物。 
可使用共抑制来抑制植物基因的表达以产生这样的植物，该植物具有不可检测的由这些基因编码的蛋白的蛋白水平。参见，例如，Broin等人(2002)Plant Cell14：1417-1432。也可将共抑制在相同的植物中用于抑制多个蛋白的表达。参见，例如，美国专利号5,942,657。用于使用共抑制在植物中抑制内源基因的表达的方法描述于Flavell等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3490-3496；Jorgensen等人(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973；Johansen和Carrington(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin等人(2002)Plant Cell14：1417-1432；Stoutjesdijk等人(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu等人(2003)Phytochemistry63：753-763；和美国专利号5,034,323、5,283,184和5,942,657；其各自在此引用作为参考。可通过在表达盒中在有义序列3′和多腺苷酸化信号5’的位置包括poly-dT区来增加共抑制的功效。参见，美国专利公开号20020048814，此处引用作为参考。一般地，这样的核苷酸序列和内源基因的转录物的序列的具有相当大的序列同一性，最优地大于大约65％的序列同一性，更最优地大于大约85％的序列同一性，最为最优地大于大约95％的序列同一性。参见，美国专利号5,283,184和5,034,323；此处引用作为参考。 
ii.反义抑制 
在本发明的一些实施方案中，可通过反义抑制获得CNR多肽的 表达的抑制。关于反义抑制作用，设计表达盒以使其表达和编码CNR多肽的信使RNA的全部或部分互补的RNA分子。反义RNA分子的超表达可导致天然基因的减少的表达。因此，筛选用反义抑制表达盒转化的多个植物系以鉴定显示CNR多肽表达的最大抑制作用的系。 
用于反义抑制的多核苷酸可对应于编码CNR多肽的序列的互补物的全部或部分、CNR转录物的5′和/或3′非翻译区的互补物的全部或部分、或编码CNR多肽的转录物的编码序列和非翻译区的互补物的全部或部分。此外，所述反义多核苷酸可以和靶序列完全互补(即，和靶序列的互补物100％同一)或部分互补(即，低于和靶序列的互补物的100％的同一性)。可使用反义抑制在相同的植物中抑制多个蛋白的表达。参见，例如，美国专利号5,942,657。此外，可使用反义核苷酸的部分来破坏靶基因的表达。一般地，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。在例如Liu等人(2002)Plant Physiol.129：1732-1743和美国专利号5,759,829和5,942,657(其每一个都在此引作参考)中描述了使用反义抑制来抑制植物中内源基因的表达的方法。可通过在表达盒内在反义序列3′和多腺苷酸化信号5′的位置包括poly-dT区来增加反义抑制的功效。参见，美国专利公开号20020048814，此处引用作为参考。 
iii.双链RNA干扰 
在本发明的一些实施方案中，可通过双链RNA(dsRNA)干扰获得CNR多肽的表达的抑制。对于dsRNA干扰，在相同的细胞中表达有义RNA分子(如上述用于共抑制的RNA分子)和完全或部分地和所述有义RNA分子互补的反义RNA分子，从而导致对应的内源信使RNA的表达的抑制。 
可通过设计包含有义序列和反义序列两者的表达盒来实现有义和反义分子的表达。可选择地，可使用有义和反义序列的分开的表达盒。然后筛选用一个或多个dsRNA干扰表达盒转化的多个植物系以鉴定显示CNR多肽表达的最大抑制的植物系。在Waterhouse等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13959-13964，Liu等人(2002)Plant Physiol.129:1732-1743，和WO99/49029、WO99/53050、WO 99/61631和WO00/49035(其各自在此引用作为参考)中描述了使用dsRNA干扰抑制内源植物基因的表达的方法。 
iv.发夹结构RNA干扰和包含内含子的发夹结构RNA干扰 
在本发明的一些实施方案中，可通过发夹结构RNA(hpRNA)干扰或包含内含子的发夹结构RNA(ihpRNA)干扰获得CNR多肽的表达的抑制。这些方法在抑制内源基因的表达上是高度有效的。参见，Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38和在其中引用的参考文献。 
对于hpRNA干扰，设计表达盒以使之表达自身杂交以形成包含单链环区域和碱基配对的茎的发夹结构的RNA分子。碱基配对的茎区域包含对应于这样的内源信使RNA的全部或部分的有义序列和完全或部分地与所述有义序列互补的反义序列，所述内源信使RNA编码其表达要被抑制的基因。可选择地，碱基配对的茎区域可对应于控制要被抑制的基因的表达的启动子序列的部分。因此，分子的碱基配对的茎区域通常确定RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源基因的表达上是高度有效的，且其诱导的RNA干扰可遗传给随后的植物世代。参见，例如，Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990；Stoutjesdijk等人(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；和Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38。在例如Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990；Stoutjesdijk等人(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini等人BMC Biotechnology3：7，和美国专利公开号20030175965(其各自在此引用作为参考)中描述了使用hpRNA干扰抑制或沉默基因的表达的方法。已由Panstruga等人(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140(此处引用作为参考)描述了用于测定hpRNA构建体在体内沉默基因表达的效率的瞬时测定。 
对于ihpRNA，干扰分子具有和hpRNA的结构相同的一般结构，但该RNA分子额外地包含能够在表达ihpRNA的细胞中被剪接的内含子。使用内含子使发夹RNA分子中的环的大小在剪接后变得最小，且这增加了干扰的功效。参见，例如，Smith等人(2000)Nature 407：319-320。事实上，Smith等人显示了使用ihpRNA介导的干扰的100％的内源基因表达的抑制。在例如Smith等人(2000)Nature407：319-320；Wesley等人(2001)PlantJ.27：581-590；Wang和Waterhouse(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Helliwell和Waterhouse(2003)Methods30：289-295，和美国专利公开号20030180945(其各自在此引用作为参考)中描述了使用ihpRNA干扰抑制内源植物基因的表达的方法。 
也可这样设计用于hpRNA干扰的表达盒，从而使有义序列和反义序列不对应于内源RNA。在该实施方案中，有义和反义序列侧翼连接这样的环序列，该环序列包含对应于靶基因内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因此，正是环区域确定了RNA干扰的特异性。参见，例如，WO02/00904，Mette等人(2000)EMBO J19：5194-5201；Matzke等人(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227；Scheid等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA99：13659-13662；Aufsaftz等人(2002)Proc.Nat′l.Acad.Sci.99(4)：16499-16506；Sijen等人，Curr.Biol.(2001)11：436-440)，此处引用作为参考。 
v.扩增子介导的干扰 
扩增子表达盒包含从植物病毒衍生的序列，该序列包含靶基因的全部或部分但通常不包含天然病毒的基因的全部。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列允许转录产物指导其自身的复制。由扩增子产生的转录物相对于靶序列(即，CNR多肽的信使RNA)可以是有义或反义的。在例如Angell和Baulcombe(1997)EMBOJ.16：3675-3684，Angell和Baulcombe(1999)PlantJ.20：357-362，以及美国专利号6,646,805(其各自在此引用作为参考)中描述了使用扩增子抑制内源植物基因的表达的方法。 
vi.核酶 
在一些实施方案中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是催化性RNA或其具有对于CNR多肽的信使RNA是特异性的核酶活性。因此，所述多核苷酸导致内源信使RNA的降解，从而导致CNR多肽 的减少的表达。该方法描述于例如美国专利号4,987,071，此处引用作为参考。 
vii.小干扰RNA或微小RNA 
在本发明的一些实施方案中，可通过表达编码微小RNA(miRNA)的基因通过RNA干扰来获得CNR多肽的表达的抑制。miRNA是由大约22个核糖核苷酸组成的调节剂。miRNA在抑制内源基因的表达上是高度有效的。参见，例如Javier等人(2003)Nature425：257-263，此处引用作为参考。 
对于miRNA干扰，设计表达盒以表达根据内源miRNA基因建模的RNA分子。该miRNA基因编码形成这样的发夹结构的RNA，该发夹结构包含和另一个内源基因(靶序列)互补的22个核苷酸的序列。为抑制CNR表达，22-核苷酸序列选自CNR转录物序列并以有义方向包含所述CNR序列的22个核苷酸和与该有义序列互补的对应的反义序列的21个核苷酸。miRNA分子在抑制内源基因的表达上高度有效，且其诱导的RNA干扰可遗传给植物的随后世代。 
2.基因表达的基于多肽的抑制 
在一个实施方案中，多核苷酸编码结合编码CNR多肽的基因的锌指蛋白，从而导致该基因的减少的表达。在特定的实施方案中，该锌指蛋白结合CNR基因的调节区。在其他实施方案中，锌指蛋白结合编码CNR多肽的信使RNA，并阻止其翻译。已在例如美国专利号6,453,242中描述了选择被锌指蛋白靶向的位点的方法，且在例如美国专利公开号20030037355中描述了使用锌指蛋白在植物中抑制基因表达的方法，各参考文献在此引用作为参考。 
3.蛋白活性的基于多肽的抑制 
在本发明的一些实施方案中，多核苷酸编码结合至少一种CNR多肽并减少该CNR多肽的细胞数目调节物活性的抗体。在另一个实施方案中，该抗体的结合导致通过细胞质量控制机制(cellular qualitycontrol mechanisms)产生的增加的抗体-CNR复合物的周转。植物细胞中抗体的表达和植物细胞中通过抗体的表达和抗体与蛋白的结合 产生的分子途径的抑制在本领域是熟知的。参见，例如，Conrad和Sonnewald(2003)Nature Biotech.21：35-36，在此引用作为参考。 
4.基因破坏 
在本发明的一些实施方案中，通过破坏编码CNR多肽的基因来减少或消除CNR多肽的活性。可通过本领域已知的任何方法破坏编码CNR多肽的基因。例如，在一个实施方案中，通过转座子标记来破坏基因。在另一个实施方案中，通过使用随机或定向诱变(targetedmutagenesis)来诱变植物来破坏基因，然后筛选具有减少的细胞数目调节物活性的植物。 
i.转座子标记技术 
在本发明的一个实施方案中，使用转座子标记来减少或消除一种或多种CNR多肽的CNR活性。转座子标记包括在内源CNR基因内插入转座子以减少或消除CNR多肽的表达。“CNR基因”意指编码本发明的CNR多肽的基因。 
在该实施方案中，通过将转座子插入编码CNR多肽的基因的调节区或编码区来减少或消除一种或多种CNR多肽的表达。可使用存在于外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子或CNR基因的任何一种其他的调节序列中的转座子来减少或消除被编码的CNR多肽的表达和/或活性。 
用于植物中特定基因的转座子标记的方法在本领域中是熟知的。参见，例如，Maes等人(1999)TrendsPlant Sci.4：90-96；Dharmapuri和Sonti(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59；Meissner等人(2000)PlantJ.22：265-274；Phogat等人(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai等人(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；Fitzmaurice等人(1999)Genetics153：1919-1928)。此外，在Bensen等人(1995)Plant Cell7：75-84；Mena等人(1996)Science274：1537-1540；和美国专利号5,962,764(其各自在此引用作为参考)中已描述了用于选择经选择的基因中的Mu插入的TUSC方法。
ii.具有减少的活性的突变植物 
在本领域也已知用于减少或消除植物中内源基因的表达的另外的方法，且所述方法可类似地用于本发明。这些方法包括诱变的其他形式，例如甲磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变和以反求遗传学意义(使用PCR)用于鉴定其中内源基因已被缺失的植物系的快中子缺失诱变。关于这些方法的实例参见Ohshima等人(1998)Virology243：472-481；Okubara等人(1994)Genetics137：867-874；和Quesada等人(2000)Genetics154：421-436；其各自在此引用作为参考。此外，用于筛选化学诱导的突变的快速和自动化的方法，即使用选择的PCR产物的变性HPLC或选择性内切核酸酶消化的TILLING(定向诱导的基因组局部损害(Targeting Induced Local Lesions In Genomes))也适用于本发明。参见McCallum等人(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457，此处引用作为参考。 
影响基因表达或干扰被编码的蛋白的功能(细胞数目调节物活性)的突变在本领域是熟知的。基因外显子内的插入突变通常导致无效突变体。保守残基中的突变在抑制被编码的蛋白的细胞数目调节物活性上特别有效。已描述了适合用于目的在于消除细胞数目调节物活性的诱变的植物CNR多肽的保守性残基。可按照熟知的方法分离这些突变体，且可通过遗传杂交堆积不同CNR基因座中的突变。参见，例如，Gruis等人(2002)Plant Cell14：2863-2882。 
在本发明的另一个实施方案中，可使用显性突变体触发由于基因倒位(gene inversion)和重复的基因座的重组引起的RNA沉默。参见，例如，Kusaba等人(2003)Plant Cell15：1455-1467。 
本发明包括用于减少或消除一种或多种CNR多肽的活性的另外的方法。用于在植物中改变或突变基因组核苷酸序列的其他方法的实例在本领域中是已知的，且包括，但不限于，RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA：DNA修复载体、混合的双链体寡核苷酸、自身互补(self-complementary)RNA：DNA寡核苷酸以及重组剂寡核苷酸(recombinogenic oligonucleobase)的使用。所用的这些载体和方法在本领域是已知的。参见，例如，美国专利号5,565,350、5,731,181、5,756,325、5,760,012、5,795,972和5,871,984；其各自在此引用作为参考。也参见，WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821 和Beetham等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8774-8778；其各自在此引用作为参考。 
iii.调节细胞数目调节物活性 
在特定的方法中，通过增加植物中CNR多肽的水平或活性来减少植物中细胞数目调节物的水平和/或活性。在本说明书中的其他地方讨论了用于在植物中增加CNR多肽的水平和/或活性的方法。简而言之，这些方法包括给植物提供本发明的CNR多肽，并从而增加CNR多肽的水平和/或活性。在其他实施方案中，可通过下述方法来提供编码CNR多肽的CNR核苷酸序列，将包含本发明的CNR核苷酸序列的多核苷酸导入植物，表达该CNR序列，增加CNR多肽的活性，并从而减少植物中或植物的部分中的组织细胞的数目。在其他实施方案中，将被导入植物的CNR核苷酸构建体稳定地整合入植物的基因组。 
在其他方法中，通过减少植物中CNR多肽的水平和/或活性来增加植物组织中细胞的数目。在本说明书中的其他地方详细地公开了这些方法。在一个这样的方法中，将CNR核苷酸序列导入植物，且所述CNR核苷酸序列的表达减少了CNR多肽的活性，并从而增加了植物中或植物的部分中的细胞数目。在其他实施方案中，将被导入植物的CNR核苷酸构建体稳定地整合入植物的基因组。 
如上所述，本领域技术人员将认识到用于在植物中调节细胞数目调节物的水平/活性的合适的启动子。已在本说明书中的其他地方公开了该实施方案中的示例性启动子。 
因此，本发明还提供了这样的植物，当和对照植物组织的细胞的数目相比时，该植物具有经改变的细胞数目。在一个实施方案中，本发明的植物具有增加的本发明的CNR多肽的水平/活性，并因而在植物组织中具有减少的细胞数目。在其他实施方案中，本发明的植物具有减少或消除水平的本发明的CNR多肽，且因此在植物组织中有增加的细胞数目。在其他实施方案中，这些植物已将包含本发明的CNR核苷酸序列(其被可操作地连接至在植物细胞中驱动表达的启动子)的核酸分子稳定地整合入其基因组。
iv.调节根发育 
提供了用于在植物中调节根发育的方法。“调节根发育”是指当和对照植物相比时，植物根发育中的任何改变。根发育中的这些改变包括，但不限于，初生根的生长速率、根鲜重、侧根和不定根的形成程度、维管结构系统(vasculature system)、分生组织的发育或径向扩展(radial expansion)中的改变。 
提供了用于调节植物中根发育的方法。所述方法包括在植物中调节CNR多肽的水平和/或活性。在一个方法中，向植物提供本发明的CNR序列。在另一个方法中，通过将包含本发明的CNR核苷酸序列的多核苷酸导入植物，表达该CNR序列，并从而改变根发育，来提供本CNR核苷酸序列。在其他方法中，将导入植物的CNR核苷酸构建体稳定地导入植物的基因组。 
在其他方法中，通过改变植物中CNR多肽的水平或活性来调节根的发育。CNR活性的减少可导致对根发育的下列改变中的至少一种或多种改变，包括，但不限于，和对照植物相比，更大的根分生组织、增强的根生长、增大的径向扩展、增加的维管结构系统、增加的根分枝、更多的不定根和/或根鲜重的增加。 
如此处所用的，“根生长”包括单子叶和双子叶植物两者中在根的不同发育阶段组成根系统的不同部分的生长的所有方面。要理解，增强的根生长可由其部分(包括初生根、侧根、不定根等)的一部分或多个部分的增强的生长产生。 
用于测量根系统中的这些发育的改变的方法在本领域中是已知的。参见，例如，美国申请号2003/0074698和Werner等人(2001)PNAS18：10487-10492，两者都在此引用作为参考。 
如上所述，本领域技术人员将认识到适合用于在植物中调节根发育的合适的启动子。用于本实施方案的示例性启动子包括组成型启动子和根优选的启动子。已在本说明书中的其他地方公开了示例性根优选的启动子。 
通过减少CNR多肽的活性和/或水平刺激根生长和增加根的质量也用于提高植物的可站立性(standability)。术语“对倒伏的抗性”或“可站立性”是指植物将其自身固定至土壤的能力。对于具有直立或半直立生长习性的植物，该术语也指在不利(环境)条件下保持直 立姿势的能力。该性状涉及根系统的大小、深度和形态学。此外，通过减少CNR多肽的水平和/或活性刺激根生长和增加根的质量也用于在体外促进外植体的繁殖。 
此外，由于减少的CNR活性的水平和/或活性产生的更高的根生物量生产对产量具有直接的影响，且对由根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物产生的化合物的生产具有间接影响。根培养物中产生的引人注意的化合物的一个实例是紫草宁，其产量可通过所述方法被有利地提高。 
因此，本发明还提供了这样的植物，当和对照植物的根发育比较时，该植物具有改变的根发育。在一些实施方案中，本发明的植物具有增加的本发明的CNR多肽的水平/活性，且具有增加的根生长和/或根生物量。在其他实施方案中，这些植物已将包含本发明的CNR核苷酸序列(其可操作地连接至在植物细胞中驱动表达的启动子)的核酸分子稳定地整合入其基因组。 
v.调节茎干和叶发育 
也提供了用于在植物中调节茎干和叶发育的方法。“调节茎干和/或叶发育”意指植物茎干和/或叶的发育中的任何改变。茎干和/或叶发育中的这些改变包括，但不限于，茎干分生组织发育、叶数目、叶大小、叶和茎维管结构、节间长度和叶衰老中的改变。如此处所用的，“叶发育”和“茎干发育”包括在单子叶和双子叶植物中在其发育的不同阶段分别组成叶系统和茎干系统的不同部分的生长的所有方面。用于测量茎干和叶系统中这些发育改变的方法在本领域中是已知的。参见，例如Werner等人(2001)PNAS98：10487-10492和美国申请号2003/0074698，其各自在此引用作为参考。 
用于在植物中调节茎干和/或叶发育的方法包括调节本发明的CNR多肽的活性和/或水平。在一个实施方案中，提供了本发明的CNR序列。在其他实施方案中，可通过将包含本发明的CNR核苷酸序列的多核苷酸导入植物，表达该CNR序列，并从而改变茎干和/或叶的发育，来提供CNR核苷酸序列。在其他实施方案中，将被导入植物的CNR核苷酸构建体稳定地整合入植物的基因组。 
在特定的实施方案中，通过在植物中增加CNR多肽的水平和/ 或活性来调节茎干或叶的发育。CNR活性的增加可导致茎干和/或叶发育中的下列改变中的至少一种或多种改变，包括，但不限于，当和对照植物相比时，减少的叶数目、减少的叶表面、减少的维管、更短的节间和矮化的生长(stunted growth)、以及延缓的叶衰老。 
如上所述，本领域技术人员将认识到用于调节植物的茎干和叶发育的合适的启动子。用于该实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、茎干优选的启动子、茎干分生组织优选的启动子和叶优选的启动子。已在本说明书中的其他地方公开了示例性启动子。 
植物中不断增加的CNR活性和/或水平导致更短的节间和矮化的生长。因此，本发明的方法用于产生矮小植物(dwarf plants)。此外，如上所述，调节植物中CNR的活性调节了根和茎干的生长。因此，本发明还提供了用于改变根/茎干比率的方法。还可通过减少植物中CNR多肽的水平和/或活性来调节茎干或叶的发育。 
因此，本发明还提供了这样的植物，当和对照植物相比时，该植物有经调节的茎干和/或叶的发育。在一些实施方案中，本发明的植物具有增加的本发明的CNR多肽的水平/活性。在其他实施方案中，本发明的植物具有减少的本发明的CNR多肽的水平/活性。 
vi.调节生殖组织发育 
提供了用于调节生殖组织发育的方法。在一个实施方案中，提供了用于在植物中调节花发育的方法。“调节花发育”意指当和这样的对照植物相比时，植物的生殖组织的结构中的任何改变，在所述对照植物中，CNR多肽的活性或水平未被调节。“调节花发育”还包括当和这样的对照植物相比时，植物的生殖组织的发育的时间选择中的任何变化(即，延迟的或加速的花发育时间选择)，在所述对照植物中CNR多肽的活性或水平未被调节。肉眼可见的改变可包括生殖器官的大小、形状、数目或位置、这些结构形成的发育时间段、或在环境应激的时期维持或进行通过开花过程的能力中的改变。肉眼可见的改变可包括构成生殖器官的细胞的类型或形状的改变。 
用于在植物中调节花发育的方法包括在植物中调节CNR的活性。在一个方法中，提供了本发明的CNR序列。可通过将包含本发明的CNR核苷酸序列的多核苷酸导入植物，表达该CNR序列，并从而改变花发育，来提供CNR核苷酸序列。在其他实施方案中，将 被导入植物的CNR核苷酸构建体稳定地整合入植物的基因组。 
在特定的实施方案中，通过增加植物中CNR多肽的水平或活性来调节花发育。CNR活性的增加可导致花发育中的下列改变中的至少一种或多种改变，包括，但不限于，当和对照植物相比时，延迟的开花、减少的花数目、部分雄性不育和减少的结实率(seed set)。诱导延迟的开花或抑制开花可用于增加饲料农作物例如苜蓿的产量。用于测量花发育中的这些发育变化的方法在本领域是已知的。参见，例如，Mouradov等人(2002)The Plant Cell S111-S130，此处引用作为参考。 
如上所述，本领域技术人员将认识到用于调节植物的花发育的合适的启动子。用于本实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、茎干优选的启动子和花序优选的启动子。 
在其他方法中，通过减少本发明的CNR序列的水平和/或活性来调节花发育。这些方法可包括将CNR核苷酸序列导入植物，从而减少CNR多肽的活性。在其他方法中，将被导入植物的CNR核苷酸构建体稳定地整合入植物的基因组。减少本发明的CNR序列的表达可在应激期间调节花发育。已在本说明书中的其他地方描述了这些方法。因此，本发明还提供了这样的植物，当和对照植物的花发育相比时，该植物具有经调节的花发育。组成包括具有减少的本发明的CNR多肽的水平/活性和具有改变的花发育的植物。组成也包括具有减少的本发明的CNR多肽的水平/活性的植物，其中所述植物在应激期间保持或进行通过开花过程。 
也提供了用于使用本发明的CNR序列增加种子大小和/或重量的方法。该方法包括在植物或植物的部分例如种子中增加CNR序列的活性。种子大小和/或重量的增加包括种子的增加的大小或重量和/或一个或多个种子部分(包括，例如，胚、胚乳、种皮、糊粉或子叶)的大小或重量中的增加。 
如上所述，本领域技术人员将认识到用于增加种子大小和/或种子重量的合适的启动子。用于本实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、种子优选的启动子、胚优选的启动子和胚乳优选的启动子。 
用于在植物中减少种子大小和/或种子重量的方法包括在植物中 增加CNR活性。在一个实施方案中，可通过将包含本发明的CNR核苷酸序列的多核苷酸导入植物，表达该CNR序列，并从而减少种子重量和/或大小，来提供CNR核苷酸序列。在其他实施方案中，将被导入植物的CNR核苷酸构建体稳定地整合入植物的基因组。 
还认识到，增加种子大小和/或重量也可伴随幼苗的生长速度的增加或早期活力的增加。如此处所用的，术语“早期活力”是指在早期发育过程中植物快速生长的能力，且涉及萌发后充分发育的根系统和充分发育的光合器的成功确立。此外，种子大小和/或重量的增加也可导致当与对照相比时植物产量的增加。 
因此，本发明还提供了这样的植物，当和对照植物相比时，该植物具有增加的种子重量和/或种子大小。在其他实施方案中，也提供了具有增加的活力和植物产量的植物。在一些实施方案，本发明的植物具有减少的本发明的CNR多肽的水平/活性且具有增加的种子重量和/或种子大小。在其他实施方案中，这些植物已将包含本发明的CNR核苷酸序列(其可操作地连接至在植物细胞中驱动表达的启动子)的核酸分子整合入其基因组。 
vii.使用CNR启动子多核苷酸的方法 
本发明中公开的包含CNR启动子的多核苷酸和其变体和片段，当和DNA构建体装配从而使所述启动子可操作地连接至包含目的多核苷酸的核苷酸序列时，用于任何宿主细胞，优选地植物细胞的基因操作。通过该方式，将本发明的CNR启动子多核苷酸和用于在目的宿主细胞中表达的目的多核苷酸序列一起提供于表达盒中。如下面实施例2中所述，在多种组织中表达本发明的CNR启动子序列，从而该启动子序列可用于调节目的多核苷酸的时间和/或空间表达。 
合成的杂交启动子区域在本领域是已知的。这些区域包含一个多核苷酸(其可操作地连接至另一个多核苷酸的启动子元件)的上游启动子元件。在本发明的实施方案中，通过这样的合成的杂交启动子控制异源序列的表达，该杂交启动子包含可操作地连接至来自异源启动子的上游启动子元件的本发明的CNR启动子序列或其变体或片段。已鉴定了参与植物防卫系统的上游启动子元件，且该元件可用于产生合成的启动子。参见，例如，Rushton等人(1998)Curr.Opin.Plant Biol.1：311-315。可选择地，合成的CNR启动子序列可包含在CNR启动子序列中发现的上游启动子元件的重复。 
要认识到，本发明的启动子序列可和其天然CNR编码序列一起使用。可使用包含可操作地连接其天然CNR基因的CNR启动子的DNA构建体转化任何目的植物，以产生需要的表型改变，例如调节细胞数目、调节根、茎干、叶、花和胚发育、应激耐受性和本说明书中其他地方描述的任何其他表型。 
此处公开的启动子核苷酸序列和方法用于在宿主植物中调节任何异源核苷酸序列的表达以改变植物的表型。表型的各种改变是有重要意义的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制等。可通过在植物中提供异源产物的表达或内源产物的增加的表达来获得这些结果。可选择地，可通过在植物中减少一种或多种内源产物，特别是酶或辅因子的表达来获得所述结果。这些改变导致转化的植物的表型改变。 
目的基因反映参与农作物发育的基因的商业市场和益处。目的农作物和市场发生改变，且随着发展中国家开放世界市场，也将出现新的农作物和技术学。此外，随着我们对农艺性状和特征例如产量和杂种优势的理解增加，用于转化的基因的选择将随之改变。目的基因的一般分类包括，例如，参与信息的基因，例如锌指，参与通讯的基因，例如激酶，和参与管家的基因例如热激蛋白。例如，转基因的更具体的分类，包括编码农艺学重要性状、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征的基因和商业产品。目的基因一般包括参与油、淀粉、糖类或营养物新陈代谢的基因和影响核大小、蔗糖加载(sucroseloading)等的基因。 
在某些实施方案中，可将本发明的核酸序列和其他目的多核苷酸序列组合(“堆积”)使用以产生具有需要的表型的植物。产生的组合可包括目的多核苷酸中的任何一种或多种的多拷贝。本发明的多核苷酸可和任何基因或基因的组合堆积以产生具有多种需要的性状组合的植物，包括但不限于动物饲料所需的性状，例如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)、平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专利号5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409)、大麦高赖氨酸(Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)、和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人(1988)Gene71：359；和Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.12：123))、增加的可消化性(digestibility)(例如，经修饰的贮藏蛋白(2001年11月7日提交的美国申请系列号10/053,410)；和硫氧还蛋白(2001年12月3日提交的美国申请系列号10/005,429))，其公开内容在此引用作为参考。也可将本发明的多核苷酸和这样的性状堆积，所述性状是昆虫、疾病或杀虫剂抗性所需的性状(例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白(美国专利号5,366,892、5,747,450、5,737,514、5723,756、5,593,881；Geiser等人(1986)Gene48：109)、凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol.Biol.24：825)、串珠镰孢菌素解毒基因(美国专利号5,792,931)、无毒性和疾病抗性基因(Jones等人(1994)Science266：789；Martin等人(1993)Science262：1432；Mindrinos等人(1994)Cell78:1089)、导致杀虫剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体例如S4和/或Hra突变、谷氨酰胺合酶的抑制剂例如膦丝菌素或草铵膦(例如，bar基因)、和草甘膦抗性(EPSPS基因))、和加工或加工产物所需的性状，例如高油(例如，美国专利号6,232,529)、经修饰的油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544、WO94/11516))、经修饰的淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))、和聚合物或生物塑料(bioplastics)(例如，美国专利号5.602,321；β-酮硫解酶(ketothiolase)、聚羟丁酸合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸(polyhydroxyalkanoates)(PHAs)的表达)，其公开内容在此引用作为参考。人们也可将本发明的多核苷酸和影响农艺性状或转化技术性状的多核苷酸组合，所述农艺性状是例如雄性不育(例如，参见美国专利号5.583,210)、茎强度、开花时间，所述转化技术性状是例如细胞周期调节或基因寻靶(例如WO99/61619、WO00/17364、WO99/25821)，其公开内容在此引用作为参考。 
在一个实施方案中，目的序列提高植物生长和/或农作物产量。例如，目的序列包括导致提高的初生根或侧根系统的农艺学重要的基因。这些基因包括，但不限于，营养物/水转运蛋白和生长诱导物(growth induces)。这些基因的实例包括，但不限于，玉米质膜 H+-ATP酶(MHA2)(Frias等人(1996)Plant Cell8：1533-44)、AKT1，即鼠耳芥(Arabidopsis)中的钾摄取装置的组分(Spalding等人(1999)J Gen Physiol113：909-18)、在根端细胞中激活细胞分裂周期的RML基因(Cheng等人(1995)Plant Physiol108：881)、玉米谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya等人(1994)Plant Mol Biol26：1935-46)和血红蛋白(Duff等人(1997)J.Biol.Chem27：16749-16752，Arredondo-Peter等人(1997)Plant Physiol.115：1259-1266；Arredondo-Peter等人(1997)Plant Physiol114：493-500和其中引用的参考资料)。目的序列也可用于表达负面影响根发育的基因的反义核苷酸序列。 
此外，除了使用常规育种方法外，还可从基因上改变农艺学重要性状，例如油、淀粉和蛋白的含量。改变包括增加油酸、饱和和不饱和油的含量，增加赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸，和淀粉的修饰。Hordothionin蛋白的修饰描述于美国专利号5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中，此处引用作为参考。另一个实例是富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白，所述蛋白由描述于美国专利号5,850,016中的大豆2S清蛋白和描述于Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106中的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂编码，其公开内容在此引用作为参考。 
可通过定点诱变制备编码性序列的衍生物以在被编码的多肽中增加预先选择的氨基酸的水平。例如，从大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂衍生编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因，1996年11月1日提交的美国申请系列号08/740,682，和WO98/20133，其公开内容在此引用作为参考。其他蛋白包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，例如来自向日葵种子(Lilley等人(1989)Proceedings of the World Congress onVegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs，ed.Applewhite(American Oil Chemists Society，Champaign，Illinois)，pp.497-502；此处引用作为参考)、玉米(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人(1988)Gene71：359；两者在此引用作为参考)和水稻(Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.12：123，此处引用作为参考)的蛋白。其他农艺学重要的基因编码乳汁(latex)、Floury2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。 
昆虫抗性基因可编码对大大地减少产量的害虫的抗性，所述害虫 是例如根虫、切根虫、欧洲玉米螟(European Corn Borer)等。这些基因包括，例如，苏云金杆芽孢菌毒蛋白基因(美国专利号5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene48：109)等。 
编码疾病抗性性状的基因包括解毒基因，例如抗fumonosin(美国专利号5,792,931)、无毒性(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones等人(1994)Science266：789；Martin等人(1993)Science262：1432；和Mindrinos等人(1994)Cell78：1089)等。 
除草剂抗性性状可包括编码对抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂，特别是磺酰脲类除草剂抗性的基因(例如，包含导致这些抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂例如膦丝菌素或草铵膦的抗性的基因(例如，bar基因)、或本领域已知的其他这样的基因。bar基因编码对除草剂草铵膦的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，且ALS-基因突变体编码对除草剂绿黄隆的抗性。 
也可在表达盒中编码不育性基因，且该基因提供了对物理去雄花穗(detasseling)的替代方案。以该方式使用的基因的实例包括雄性组织优选的基因和具有雄性不育表型的基因例如QM，描述于美国专利号5,583,210。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的基因。 
谷物的质量反映于如下性状，例如饱和和不饱和的油的水平和种类、必需氨基酸的质量和量以及纤维素的水平。在美国专利号5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中描述了玉米中经修饰的hordothionin蛋白。 
也可在可增加例如用于乙醇生产的淀粉、或提供蛋白表达的一个或多个基因上编码商业性状。经转化的植物的另一个重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，例如美国专利号5,602,321中所描述的。基因例如β-酮硫解酶、PHB酶(聚羟丁酸合酶)、和乙酰乙酸辅酶A还原酶(参见Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸(PHAs)的表达。 
外源产物包括植物的酶和产物以及来自其他来源(包括原核生物 和其他真核生物)的产物。这些产物包括酶、辅因子、激素等。可增加蛋白的水平，特别是具有提高的氨基酸分配以改善植物的营养价值的经修饰的蛋白的水平。这可通过表达具有增加的氨基酸含量的这些蛋白来获得。 
可通过参考下列非限定性实施例来更好地理解本发明。本领域技术人员将认识到，可在不背离此处公开的和请求保护的本发明的精神和范围的情况下进行本发明的其他实施方案。 
实施例 
实施例1.CNR序列的分离 
使用用于鉴定基因家族的所有成员的常规方法搜索目的CNR基因。制备了诸如蛋白序列的基因家族的所有已知成员的不同组。该数据包括来自其他物种的序列。针对所有的玉米序列数据组搜索这些物种，并鉴定重叠命中值(overlapping hit)的非冗余组。分开地，人们处理任一目的基因的核苷酸序列，且针对数据库进行搜索，且检索到所有重叠命中值的非冗余组。然后将蛋白命中值组和核苷酸命中值比较。如果基因家族完全，那么所有蛋白命中值都包含于核苷酸命中值中。基因的CNR家族由12个成员构成。 
实施例2.CNR序列分析 
本发明的CNR多肽和蕃茄fw2.2多肽(SEQ ID NO：45)具有共同的特征。本发明的基因和蕃茄fw2.2之间的关系显示于表2。
表2 
  
    基因 和Fw2-2 的百分比同一性     和Fw2-2的百分比相 似性     
ZmCNR02 53.59 62.98
ZmCNR10 49.69 62.58
ZmCNR09 47.43 58.29
ZmCNR03 46.71 59.28
ZmCNR01 46.6 57.59
ZmCNR07 46.11 58.89
ZmCNR04 41.1 55.83
ZmCNR11 41.1 55.21
ZmCNR12 36.2 49.08
ZmCNR05 33.7 48.91
ZmCNR08 27.9 35.19
ZmCNR06 21.34 30.54
此外，在图1和2中分别提供了蕃茄fw2.2序列(SEQ ID NO：2)和12个玉米基因翻译物的聚簇系统树和比对。 
实施例3.使用MPSS进行的玉米中CNR的表达模式 
MPSS表示大规模平行特征测序(Massively Parallel SignatureSequencing)，即由Lynx Therapeutics，Inc.of Hayward，California发明和商业化的技术。已在由Brenner等人(Nature Biotechnol.[2000]18：630-634，和PNAS[2000]97：1665-1670)提供的出版物中描述了MPSS和相关技术。和SAGE(基因表达系列分析)一样，MPSS从mRNA内的确定位置产生短序列特征，且在给定的文库中这些特征的相对冗余代表了该基因表达的定量估计。MPSS特征在长度上为17bp，且在鼠耳芥中可独特地鉴定超过95％的所有基因。 
将CNR序列和MPSS数据进行匹配，并处理(curated)匹配标 记(GATC-17聚体)。理想地，用于基因的正确标记存在于正链上，靠近但正好在多腺苷酸尾的上游，且其是基因特异性的。当超过一个标记匹配基因时，人们通常选择最靠近多酰苷酸尾的那个，其通常也是具有最高基因表达的一个。当标记匹配超过一个基因时，正确的基因联系(correct gene association)通常是具有最符合由MPSS数据揭示的表达模式的EST分布的联系。 
各种CNR序列的表达揭示： 
ZmCNR1微弱地在各种组织中表达-在茎和雄花穗小穗中最一致 
ZmCNR2更强烈地在各组织中表达，并显现为穗丝优选的 
ZmCNR3是显示强花粉优选的表达的组中的唯一成员 
ZmCNR4的表达不可检测 
ZmCNR5微弱地在各种组织中表达 
ZmCNR6强烈地在许多组织中-但不在花粉中-表达，在种子组织中表达相当丰富 
ZmCNR7和9在各种组织中表达，但却是穗丝优选的 
ZmCNR8适度地在各种组织中表达，具有倾向于雄花穗小穗的偏倚性。 
涉及ZmCNR02的特异性组织表达数据
胚乳发育-由MPSS数据揭示的ZmCNR02基因表达的模式显示所述基因的表达在胚乳发育的早期阶段(授粉后的早些天-DAP中)非常低，但当胚乳成熟时(更高的DAP)，如图3中所示ZmCNR02的表达增加。因此胚乳中表达的该模式和ZmCNR02在负调节细胞数目中的作用一致。 
胚发育-根据授粉后天数(DAP)给种子胚发育评分。在30DAP后，ZmCNR02的表达模式在趋向胚发育的结束方向上升高，在45DAP时呈现最高表达，参见图4A。这对应于细胞数目生长的完成期，该表达模式和ZmCNR02作为负细胞数目调节物的作用相一致。 
胚珠发育-图4B举例说明来自使用不同玉米组织进行的35个循环的RT-PCR的结果，所述组织包括胚乳(14DAP)、茎端分生组织、果皮、幼苗、根、支柱根、成熟和未成熟叶、未成熟谷穗、未成熟雄 花穗、节和胚珠。和Lynx MPSS特征分析数据一致，主要在这样的组织中检测到该基因的表达，在所述组织中，存在低的生长活性，例如成熟的叶。有趣地，在胚珠组织中检测到非常高的表达。胚珠(受精前)没有细胞分裂活性并处于静息阶段(rest stage)。ZmCNR02以非常高的水平在胚珠中表达，可与成熟叶组织中的水平相当。然而，在刚受完精、活性细胞分裂开始时，ZmCNR02的表达急剧地下降至最低水平，如在早期胚胎和胚乳发育中所显示的(参见图3和4A中显示的表达)。 
叶发育-测定和图5中所示的发育中的玉米叶子相关的几个样品。未成熟的基部区域，最活跃的细胞分裂区域，显示无ZmCNR02的表达。相同未成熟叶的远端处于膨胀中和膨胀的部分显示少的但显而易见的ZmCNR02表达。来自幼小植物(V2)至中等阶段叶子(V7-V8)至成熟叶子的完整叶子系列显示逐渐升高的ZmCNR02表达。该表达模式和ZmCNR02与细胞数目的负控制相关一致；其表达在正在进行很少细胞分裂的叶阶段中最高。 
心皮、穗丝发育和花粉-穗丝、子房壁和果皮与双子叶植物花的心皮类似。在后两者中检测到ZmCNR02的表达。ZmCNR02的表达由于穗丝和果皮的表达而处于玉米的‘心皮’中。测定的果皮样品处于发育中相当晚的时期，且受到剩余的胚乳组织的危害。穗丝组织非常容易收集并就基因的表达对其进行测定。在幼小的正在生长的穗丝(仍然附着至子房的那些穗丝)中，未检测到ZmCNR02的表达。然后，从一系列突出前至突出后的穗丝，并从那里到授粉后的系列，ZmCNR02的表达增加。为进行比较，提供了表明ZmCNR02表达的增加并非因花粉落在穗丝上而产生的花粉样品。当穗丝成熟时，特别是在对其授粉后，细胞分裂减慢并停止。穗丝(心皮组织)中ZmCNR02的表达模式和负细胞数目调节物相一致，参见图6。 
根和根分生组织-完整的根(具有分生组织)和根尖(富含分生组织)的比较，如图7中所示，显示了ZmCNR02的表达在整个根部高于在根尖。在不活跃分裂的根区域中ZmCNR02表达具有更高的表达，和根中的表达模式和细胞数目(分裂)的负调节物相一致。 
细胞分裂素处理-当加入10微摩尔苄基腺嘌呤进行6小时时，来自实验的数据显示ZmCNR02基因的表达，在切断的玉米叶盘中下 降，如通过MPSS转录物测定所揭示的，且所述数据显示于图8中。该实验和对照样品使用： 
玉米叶盘，Ctrl-[来自R1植物的谷穗叶(cerca L9)的叶盘，盘直径5mm。在25℃下培养6小时]。 
玉米叶盘，+BA-[来自R1植物的谷穗叶(cerca L9)的叶盘，盘直径5mm。在25℃下于10微摩尔苄基腺嘌呤中培养6小时]。 
该结果提供了另外的证据，该证据表明ZmCNR02的表达和在负调节细胞数目中的作用相一致。已知诱导细胞数目(细胞分裂)的植物激素的加入导致ZmCNR02的表达降低，如根据该基因负调节细胞数目的假说所预期的。 
实施例4.转基因植物的转化和再生 
用包含可操作地连接至干旱诱导的RAB17启动子(Vilardell等人(1990)Plant Mol Biol14：423-432)的CNR序列和选择标记基因PAT的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟玉米胚，所述选择标记基因PAT赋予对杀虫剂双丙氨酰膦的抗性。可选择地，在分开的质粒上提供该选择标记基因。如下进行转化。培养基配方如下。 
靶组织的制备：
剥除谷穗的壳并在30％的Clorox漂白剂(bleach)加0.5％Micro去污剂中进行表面灭菌20分钟，并用无菌水漂洗2次。切开未成熟的胚，将胚轴面朝下(盾片侧面朝上)放置，每皿25个胚，置于560Y培养基上进行4小时，然后在制剂中在2.5-cm的靶区内排列以用于轰击。 
DNA的制备：
制备包含可操作地连接至遍在蛋白启动子的CNR序列的质粒载体。如下使用CaCl2沉淀方法将该质粒DNA加包含PAT选择标记的质粒DNA一起沉淀在1.1μm(平均直径)钨沉淀上： 
100μl在水中制备的钨颗粒 
10μl(1μg)溶于Tris EDTA缓冲液中的DNA(1μg总DNA) 
100μl2.5M CaCl2
10μl0.1M亚精胺 
按顺序将各试剂加入钨颗粒悬浮液中，同时保持在多管涡旋器(multitube vortexer)上。短暂地超声处理最终的混合物并使之在恒定的涡旋下温育10分钟。在沉淀期后，短暂地离心管，取出液体，用500ml100％的乙醇洗涤，并离心30秒。再取出液体，向最终的钨颗粒沉淀中加入105μl100％的乙醇。为进行基因枪轰击技术，短暂地超声处理钨/DNA颗粒，并将10μl点样在各巨载体的中心并让其在轰击前干燥大约2分钟。 
基因枪处理
在基因枪#HE34-1或#HE34-2中在水平#4上轰击样品平板。所有样品接受了650PSI的单次射击，总共10个采自各管的制备的颗粒/DNA的等分试样。 
后续处理：
轰击后，将胚保持在560Y培养基上进行2天，然后转移至含有3mg/升双丙氨酰膦的560R选择培养基，且每2周传代培养一次。在大约10周的选择后，将选择抗性的愈伤组织克隆转移至288J培养基中以启动植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4周)，将充分发育的体细胞胚转移至用于萌发的培养基并转移至光照培养室。大约7-10天后，将发育中的小植株转移至管中的272V不含激素的培养基中进行7-10天直至充分确立小植株。然后将植物转移至装有盆栽土壤的浅箱(flats)(等同于2.5＂的罐)中的插入物中并在生长箱中生长1周，随后在温室中再生长1至2周，然后转移至经典的600罐(classic600pots)(1.6加仑)中并培养至成熟。监控植物并就增加的干旱耐受性对其评分。测量提高的干旱耐受性的测定在本领域是常规的，且包括，例如，在干旱条件下，当和在相同环境条件下的对照玉米植物相比时，增加的核-抽穗容量(kernel-earring capacity)产量。可选择地，可就分生组织发育中的调节(即，谷穗上小穗形成的减少)监控经转化的植物。参见，例如，Bruce等人(2002)Journal ofExperimental Botany53：1-13。
轰击和培养基：
轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基盐(basal salts)(SIGMAC-1416)、1.0ml/l Eriksson氏维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(在用KOH调整至pH5.8后用D-I H2O使体积达到某一值(broughtto volume))、2.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(在用D-I H2O使体积达到某一值后加入)和8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/lEriksson氏维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l2，4-D(在用KOH调整至pH5.8后用D-IH2O使体积达到某一值)、3.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(在用D-I H2O使体积达到某一值后加入)和0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨酰膦(都在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。 
植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS维生素母液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇、和0.40g/l甘氨酸，用抛光的(polished)D-I H2O使体积达到某一值)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l0.1mM脱落酸(在调整至pH5.6后用抛光的D-I H2O使体积达到某一值)、3.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(在用D-I H2O使体积达到某一值后加入)、和1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨酰膦(在将培养基灭菌并冷却至60℃后加入)。不含激素的培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/l MS维生素母液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇、和0.40g/l甘氨酸，用抛光的D-I H2O使体积达到某一值)、0.1g/l肌醇、和40.0g/l蔗糖(在调整至pH5.6后用抛光的D-I H2O使体积达到某一值)、和6g/l细菌培养用琼脂(在用抛光的D-I H2O使体积达到某一值后加入)，灭菌并冷却至60℃。 
实施例5.土壤杆菌介导的转化 
对于使用本发明的CNR序列的反义序列进行的玉米的土壤杆菌介导的转化，优选地使用Zhao的方法(美国专利号5,981,840、和PCT专利公开号WO98/32326；其内容在此引用作为参考)。简而言之，从 玉米分离未成熟胚并将胚和土壤杆菌的悬浮液接触，其中所述细菌能够将反义CNR序列转移至至少一个未成熟胚的至少一个细胞中(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，优选地将未成熟胚浸没于土壤杆菌悬浮液中以启动接种。将胚和土壤杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。优选地在感染步骤后将未成熟胚在固体培养基上进行培养。在该共培养期后，预期任选的“静息(resting)”步骤。在该静息步骤中，在至少一种已知抑制土壤杆菌生长的抗生素存在而无植物转化体的选择剂加入的情况下温育胚(步骤3：静息步骤)。优选地，在具有抗生素但无选择剂的固体培养基上培养未成熟胚，以除去土壤杆菌或进行经感染的细胞的静息期。然后，将接种的胚在含有选择剂的培养基上进行培养，并回收正在生长的经转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，在具有选择剂的固体培养基上培养所述未成熟胚，从而导致经转化的细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生为植物(步骤：再生步骤)，且优选地将选择培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生植物。监控植物并就分生组织发育的调节对其评分。例如，茎干和花分生组织的大小和外观的改变和/或叶、花和/或果实的增加的产量。 
实施例6.玉米叶组织中ZmCNR02表达的分析 
根据生长活性的玉米叶切片系列的收集： 
从V3阶段的幼苗收集不同生长活性的叶切片。收集完全展开的第1、第2、第3叶的叶片并作为成熟的叶组织混合在一起。取出这3片叶的叶鞘并丢弃。然后从基部至顶端将剩下的螺环组织(whorltissue)(大部分叶组织)切片为： 
1.0-6mm：大部分细胞分裂区(包括茎干顶端分生组织) 
2.6-20mm：大部分细胞膨胀区 
3.20mm-顶部：过渡区(transition zone) 
4.成熟叶：如上所述具有低生长活性的完全展开的叶片 
5.具有正在生长的和成熟的叶组织的混合物的完整幼苗 
这些组织的生长活性按1>2>3>4排列。#5是混合物。图9显示以微管蛋白作为对照的ZmCNR02多重RT-PCR分析。根据该数据产生两个要点：
1.ZmCNR02的表达(显示为ZmCNR02/微管蛋白的比率)和生长活性成负相关，从样品#1至#4不断增加。 
2.该趋势和在所有四种基因型中看到的一致，所述基因型包括近交种和其正反交杂种B73、Mo17、B73/Mo17和Mo17/B73。 
图10是使用成熟叶组织的重复RT-PCR测定，其中我们必须修饰PCR方案以增加被ZmCNR02的高表达竞争胜过的微管蛋白的扩增。该图充分地显示ZmCNR02在两个杂种中的表达水平都显著高于近交亲本，这和杂种生长更快和比近交种更具活力相一致。 
实施例7.大豆胚的转化 
如下所述用包含可操作地连接至遍在蛋白启动子的反义CNR序列的质粒轰击大豆胚。为诱导体细胞胚，在26℃下，在光照或黑暗中，在合适的琼脂培养基上培养从大豆栽培品种A2872的经表面灭菌的、未成熟的种子切下的长度为3-5mm的子叶6至10周。然后切割产生次生胚的体细胞胚并将其置于合适的液体培养基中。在重复选择作为早期球形期的胚增殖的体细胞胚簇后，如下所述维持悬浮液。 
可使用16:8小时白天/夜晚时间表的开花期光照，在26℃、150rpm下在旋转振荡器上将大豆胚发生悬浮培养物维持在35ml液体培养基中。每隔两周，通过将大约35mg的组织接种至35ml液体培养基中来对培养物进行传代。 
然后通过基因枪轰击(Klein等人(1987)Nature(London)327：70-73，美国专利号4,945,050)的方法转化大豆胚发生悬浮培养物。可将Du Pont Biolistic PDS1000/HE仪(氦改型(helium retrofit))用于这些转化。 
可用于促进大豆转化的选择标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人(1985)Nature313：810-812)、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌；Gritz等人(1983)Gene25：179-188)和来自根癌土壤杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂氨酸合酶基因的3’区域组成。以限制片段的方式分离包含可操作地连接至遍在蛋白启动子的反义CNR序列的表达盒。然后将该片段插入携带有标记基因的载体的单一限制位点。 
向50μl60mg/ml1μm的金颗粒悬浮液中加入(按顺序)：5μlDNA (1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)和50μl CaCl2(2.5M)。然后搅拌颗粒制剂3分钟，在微量离心机(microfuge)中离心10秒，并取出上清液。然后在400μl70％的乙醇中洗涤DNA包被的颗粒一次并重悬浮于40μl无水乙醇中。可超声处理DNA/颗粒悬浮液3次，每次1秒。然后将5微升DNA包被的金颗粒装载至各巨载体盘上 
将大约300-400mg2周龄的悬浮培养物置于空的60x15mm的培养皿中，并用移液器从组织中取出残留的液体。对于每一次转化实验，通常轰击大约5-10个平板的组织。将膜破裂压(Membranerupture pressure)设置在1100psi，并将小室抽真空至28英寸汞柱的真空。将组织放置在离阻滞筛(retaining screen)约3.5英寸的位置并轰击3次。轰击后，可将组织分成两半并放回液体中，并如上所述进行培养。 
轰击后5至7天，可用新配的培养基更换液体培养基，且轰击后11至12天用含有50mg/ml潮霉素的新配培养基进行更换。可每周一次更新该选择培养基。轰击后7至8周，可观察到绿色转化组织从未转化的、坏死的胚发生簇中长出。取出分离的绿色组织并将其接种入单个瓶中以产生新的、克隆繁殖的、经转化的胚发生悬浮培养物。可将各新系作为独立的转化事件进行处理。然后可将这些悬浮液传代和作为未成熟胚簇维持，或通过单个体细胞胚的成熟和萌发再生成完整的植株。 
实施例8.向日葵分生组织转化 
如下所述用包含反义CNR序列(其可操作地连接至遍在蛋白启动子)的表达盒转化向日葵分生组织(也参见欧洲专利号EP0486233，此处引用作为参考，和Malone-Schoneberg等人(1994)Plant Science103：199-207)。使用单小麦穗脱粒机(single wheat-head thresher)对成熟向日葵种子(向日葵(Helianthus annuus L.))进行脱壳。在20％Clorox漂白溶液(每50ml溶液加入2滴Tween20)中对种子进行表面灭菌30分钟。用无菌蒸馏水漂洗种子两次。 
通过由Schrammeijer等人(Schrammeijer等人(1990)Plant CellRep.9：55-60)描述的方法的修改方法制备分裂的胚轴外植体。在进行表面灭菌方法后让种子在蒸馏水中吸涨60分钟。然后折断各种子的 子叶，从而在胚轴的平面上产生干净的破裂(fracture)。在切割根尖后，在初叶之间纵向对切外植体。将两个半部切面朝上放置在GBA培养基上，该培养基由Murashige和Skoog矿质元素(Murashige等人(1962)Physiol.Plant，15：473-497)、Shepard′s维生素添加剂(Shepard(1980)in Emergent Techniques for the GeneticImprovement of Crops(University of Minnesota Press，St.Paul，Minnesota)、40mg/l硫酸腺嘌呤、30g/l蔗糖、0.5mg/l6-苄基-氨基嘌呤(BAP)、0.25mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/l赤霉酸(GA3)、pH5.6和8g/lPhytagar组成。 
在土壤杆菌处理之前将外植体接受微粒轰击(Bidney等人(1992)Plant Mol.Biol.18：301-313)。将30至40个外植体以环形置于60X20mm平板的中心以进行该处理。将大约4.7mg1.8mm的钨微粒重悬浮于25ml无菌TE缓冲液(10mM Tris HCl、1mM EDTA、pH8.0)中，且每次轰击使用1.5ml的等分试样。在PDS
Figure S05828987720070301D000681
颗粒加速装置中，通过置于样品上方2cm处的150mm nytex screen轰击各平板两次。 
在所有转化实验中使用无害(disarmed)根癌土壤杆菌株EHA105。通过由Holsters等人(1978)Mol.Gen.Genet.163：181-187描述的冻融技术将包含这样的表达盒的二元质粒载体导入土壤杆菌株EHA105，所述表达盒包含可操作地连接至遍在蛋白启动子的CNR基因。该质粒还包含卡那霉素选择标记基因(即，nptII)。在具有维持细菌株和二元质粒所必需的合适的抗生素的液体YEP培养基(10gm/l酵母提取物、10gm/l细菌培养用蛋白胨和5gm/l NaCl、pH7.0)中生长(28℃下和100RPM连续搅拌下)用于植物转化实验的细菌过夜。当其达到大约0.4至0.8的OD600时使用悬浮液。沉淀土壤杆菌细胞并以0.5的终OD600重悬浮于由12.5mM MES pH5.7、1gm/lNH4Cl和0.3gm/lMgSO4组成的接种培养基。 
将新轰击的外植体置于土壤杆菌悬浮液中，混合，并安静地放置30分钟。然后将外植体转移至GBA培养基上，且使用26℃和18小时的白天，将切面朝下进行共培养。在3天的共培养后，将外植体转移至补充有250mg/l氨噻肟头孢和50mg/l硫酸卡那霉素的374B(缺少生长调节物和1％的减少的蔗糖水平的GBA培养基)。在选择培养 基上培养外植体2至5周，然后转移至缺少卡那霉素的新配374B培养基上进行1至2周的继续发育。将具有分化的、抗生素抗性的生长区域但仍未产生适合切除的茎干的外植体转移至含有250mg/l氨噻肟头孢的GBA培养基中以进行第2个3天的植物激素处理。通过ELISA就NPTII的存在和通过测定分生组织发育中的调节(即，茎干和花分生组织的大小和外形的改变)就转基因表达的存在对来自绿色、卡那霉素抗性的茎干的叶子样品进行测定。 
将NPTII-阳性的茎干移植至
Figure S05828987720070301D000691
杂种6440的体外生长的向日葵幼苗根状茎。将经表面灭菌的种子在48-0培养基(半浓度的Murashige和Skoog盐、0.5％蔗糖、0.3％脱乙酰吉兰糖胶、pH5.6)中萌发并在所述的用于外植体培养的条件下进行培养。取出幼苗的上部部分，在下胚轴中产生1cm的垂直切片，并将转化的茎干插入切口。用石蜡膜包裹整个区域以固定茎干。在一周的体外培养后，可将移植的植物转移至土壤中。将土壤中的移植物保持在高湿度条件下，然后慢慢适应温室环境。通过NPTII ELISA和/或通过叶提取物的CNR活性分析鉴定温室中成熟的T0植物(亲本世代)的经转化的部分，同时将收获自NPTII-阳性的T0植物的转基因种子通过少部分干种子子叶的CNR活性分析来鉴定。 
可选择的向日葵转化方案使得能够回收转基因后代而不使用化学选择压力。将种子脱壳并在20％Clorox漂白溶液(每100ml溶液加入2至3滴Tween20)中表面灭菌20分钟，然后用蒸馏水漂洗3次。让经灭菌的种子在26℃黑暗下在用水弄湿的滤纸上吸涨20小时。取出子叶和根基(root radical)，在黑暗处将分生组织外植体在374E(由MS盐、Shepard维生素、40mg/l硫酸腺嘌呤、3％蔗糖、0.5mg/l6-BAP、0.25mg/lIAA、0.1mg/lGA和0.8％Phytagar、pH5.6组成的GBA培养基)中培养24小时。取出初生叶以暴露顶端分生组织，将大约40个外植体以顶端圆顶(apical dome)朝上置于374M(含有1.2％Phytagar的GBA培养基)的中心2cm的圆内，然后在黑暗中在培养基上培养24小时。 
将大约18.8mg1.8μm的钨颗粒重悬浮于150μl无水乙醇中。超声处理后，将其8μl滴在巨载体表面的中心上。在26mm Hg氦枪真空下在第一架中用650psi的破裂盘(rupture disc)轰击各平板2次。
通过前面所述的冻融技术将目的质粒导入根癌土壤杆菌株EHA105。在28℃下，在50μg/l卡那霉素存在的情况下，将在液体YEP培养基(10g/l酵母提取物、10g/l细菌培养用蛋白胨和5g/lNaCl、pH7.0)中过夜生长的细菌的沉淀重悬浮于接种培养基(12.5mM2mM2-(N-吗啉代)乙磺酸、MES、1g/l NH4Cl和0.3g/l MgSO4、pH5.7)以达到OD600为4.0的终浓度。将经颗粒轰击的外植体转移至GBA培养基(374E)，且将一滴细菌悬浮液直接置于分生组织的顶部。将外植体在培养基上共培养4天，之后将外植体转移至374C培养基(具有1％蔗糖而无BAP、IAA、GA3和补充以250μg/ml氨噻肟头孢的GBA)。在16小时的白天和26℃的温育条件下在培养基上培养小植株大约2周。 
就分生组织发育中的调节(即，茎干和叶分生组织的大小和外形的改变)筛选来自2周的374C培养基中的培养物的外植体(大约2cm长)。在鉴定阳性(即，CNR表达减少)外植体后，丢弃不能展示CNR活性降低的茎干，并将每一个阳性外植体再细分成节外植体(nodalexplants)。一个节外植体包含至少一个潜在的节。将节区段在GBA培养基上培养3至4天以促进来自各节的辅助芽(auxiliary bud)的形成。然后将其转移至374C培养基并让其再发育4周。分离发育中的芽并在374C培养基上再培养4周。再次通过合适的蛋白活性测定法筛选来自各新回收的茎干的混合的叶样品。此时，一般已将从单个节回收的阳性茎干富集在转基因部分(该部分在节培养之前的最初的测定中被检测到)。 
将回收的对于减少的CNR表达呈阳性的茎干移植至Pioneer杂种6440的体外生长的向日葵幼苗根状茎。按下列的方式制备根状茎。将种子脱壳并在20％Clorox漂白溶液(每100ml溶液加入2至3滴Tween20)中进行表面灭菌20分钟，然后用蒸馏水漂洗3次。将经灭菌的种子在用水弄湿的滤纸上萌发3天，然后将其转移至48培养基(半浓度的MS盐、0.5％蔗糖、0.3％脱乙酰吉兰糖胶、pH5.0)并在26℃下在黑暗中生长3天，然后在16小时白天的培养条件下进行温育。取出幼苗的上部部分，在各下胚轴中产生垂直切片，并将转化的茎干插入V型切口。用石蜡膜包裹切口区域。在培养基上培养一周后，将移植的植物转移至土壤。在头两个星期中，将其保持在高 湿度条件下以使之适应温室环境。 
实施例9.CNR序列的变体 
A.不改变被编码的氨基酸序列的CNR的变体核苷酸序列 
使用CNR核苷酸序列产生具有这样的可读框的核苷酸序列的变体核苷酸序列，当和对应的SEQ ID NO的最初的未改变的ORF核苷酸序列相比时，该可读框的核苷酸序列具有大约70％、75％、80％、85％、90％和95％的核苷酸序列同一性。使用标准的密码子表产生这些功能性变体。尽管所述变体的核苷酸序列被改变，但由可读框编码的氨基酸序列没有改变。 
B.CNR多肽的变体氨基酸序列 
产生CNR多肽的变体氨基酸序列。在该实例中，改变一个氨基酸。具体地，考察可读框以确定合适的氨基酸改变。通过参考蛋白比对(和来自各种物种的其他直向同源物和其他基因家族成员比对)来选择要改变的氨基酸。选择的氨基酸被认为不是在高选择压下的(非高度保守的)并且很容易被具有相似化学性质(即相似的功能性侧链)的氨基酸置换的氨基酸。使用图2中所示的蛋白比对，可改变合适的氨基酸。一旦鉴定被靶向的氨基酸，就进行下列C部分中所述的方法。使用该方法产生具有大约70％、75％、80％、85％、90％和95％的核苷酸序列同一性的变体。 
C.CNR多肽的额外的变体氨基酸序列 
在该实施方案中，产生相对于参照蛋白序列具有80％、85％、90％和95％的同一性的人工蛋白序列。该后面的尝试需要根据图2中所示的比对来鉴定保守区和可变区，然后明智地使用氨基酸置换表。下面更详细地讨论这些部分。 
很大程度上，基于CNR蛋白中或其他CNR多肽中的保守性区域确定哪些氨基酸序列被改变。基于序列比对，可能被改变的CNR多肽的各区域以小写字母表示，而保守区域由大写字母表示。认识到，可在下面的保守区域中产生保守性置换而不改变功能。此外，本领域技术人员将理解本发明的CNR序列的功能性变体可在保守结构域中具有较少的非保守性氨基酸改变。 
然后产生和原始序列不同的、在80-85％、85-90％、90-95％和 95-100％的同一性区间内的人工蛋白序列。靶向这些区间的中点，自由范围(liberallatitude)为例如正或负1％。通过定制的Perl script来完成氨基酸置换。在下面的表3中提供置换表。 
表3.置换表 
  
      氨基酸 强相似和        最佳置换 要改变的次序的等级     注释
  L，V 1 50：50置换
  I，V 2 50：50置换
V I，L 3 50：50置换
A G 4  
G A 5  
D E 6  
E D 7  
W Y 8  
Y W 9  
S T 10  
T S 11  
K R 12  
R K 13  
N Q 14  
Q N 15  
F Y 16  
 M     17 第1个甲硫氨酸不能改变
H   Na 无好的置换
C   Na 无好的置换
P   Na 无好的置换
首先，鉴定不应当被改变的蛋白中的任何保守性氨基酸并将其 “划分出(mark off)”以和置换隔开。当然自动地向该列表中加入起始甲硫氨酸。然后，进行改变。 
在任何情况下都不改变H、C和P。从N末端扫向C末端，首先对异亮氨酸进行改变。然后是亮氨酸，按这样顺着列表进行下去直至获得需要的靶。可产生中间数目的置换(interim numbersubstitutions)从而不导致改变的逆转。该表以1-17的顺序排列，这样从改变如所需的那样多的异亮氨酸开始，然后改变亮氨酸，依此进行下去直至甲硫氨酸。很明显，许多氨基酸通过该方式不必进行改变。L、I和V将包含两个可选择的最优置换的50:50置换。 
以输出的形式写出变体氨基酸序列。使用Perl script计算百分比同一性。通过使用该程序，产生和SEQ ID NO：3、6、10或14的起始的未改变的ORF核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％的氨基酸同一性的CNR多肽的变体。 
实施例10.转基因玉米植物 
产生包含在遍在蛋白启动子的控制之下的ZmCNR01构建体的25个T0转基因玉米植物。在温室条件中使这些转基因植物生长。发现25个植物中各植物在其整个发育过程中一直抑制生长。生长抑制的程度和该转基因的拷贝数相关。具有更高拷贝数的转基因植物在植物生长中具有相应的减少。具有1、2和4个该转基因拷贝的转基因玉米植物在植物高度上分别显示大约30-50％、60-70％和80-90％的减少。这些转基因植物也包含减小的器官和组织大小，包括更小的雄花穗、谷穗和叶。器官和组织生长中的减少可和减少的细胞数目相关。 
实施例11.转基因玉米愈伤组织 
表达在遍在蛋白启动子的控制下的ZmCNR02基因的转基因玉米愈伤组织在细胞(愈伤组织)培养中展示显著的被抑制的生长。预期和这些愈伤组织相关的个体植物具有植物大小中的减小和/或减少的器官和组织大小。转基因植物的进一步评价将为比较提供更一致的遗传背景。ZmCNR01愈伤组织在愈伤组织的生长中不揭示相同特性的减少，但转基因植物揭示相同特性的减少。所述两个基因的表达上 的差异和蛋白作用强度或对基因功能的组织应答相关。 
ZmCNR01和ZmCNR02的结果一起表明这些基因能够负调节玉米组织生长。尽管蕃茄FW2.2的一般假定的功能，即负细胞数目调节功能，和组织大小中的相关的减小，明显地在这些玉米基因中得到保持，但这些实验证明，在非常不同的植物和植物结构中，和在与蕃茄果实心皮的特定例子截然不同的各种组织中展现了细胞数目/组织大小的控制。因此，该信息证明ZmCNR01和ZmCNR02、和可能其他玉米ZmCNR基因，可用于控制举例说明的组织生长。 
本说明书中的所有出版物和专利申请都表明了本发明所属的领域内的技术人员的水平。所有出版物和专利申请都在此引用作为参考，就如同各单个的出版物或专利申请被具体地和单个地引用作为参考一样。 
已通过参考各种具体的和优选的实施方案和技术描述了本发明。然而，应当理解可产生许多变化和修饰而仍在本发明的精神和范围之内。
序列表
<110>Pioneer Hi-Bred International，Inc.
<120>细胞数目多核苷酸和多肽以及使用其的方法
<130>1874-PCT
<150>60/583,340
<151>2004-06-28
<160>45
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>910
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>1
actcgagtcg agtcttgccg acctggggcc tgctgcgcct ggatgaagag ctgtgctgag  60
agaatcatta aagcagcacc gggtccttgc tttgcgcgtt gctgttcgca taaacaagag 120
atcctagttc tactcccaag caatgtatcc gtcagcccct ccggacgcgt ataacaagtt 180
cagcgccggg gctccgccaa cggcgccgcc gccgccggca gcgtaccacc agcagcagca 240
gcagcacgga gcgaacatgg acacttcacg ccccggcggc gggctgagga aatggtccac 300
cggcctcttc cactgcatgg acgacccggg gaactgtctc atcacatgcc tgtgcccctg 360
cgtcacgttc gggcaggtcg ctgacatcgt ggacaagggc acctgcccat gtatcgcgag 420
cggactggtg tacgggctca tctgcgcgtc gacggggatg gggtgcctgt actcgtgcct 480
ctaccggtcc aagctgaggg ccgagtacga cctggacgaa ggggagtgcc cggacatcct 540
ggtgcactgc tgctgcgagc acctggctct gtgccaagag taccgcgagc tcaagaaccg 600
cggcttcgac ctggggatcg gctgggaggc taacatggac cggcagaggc gaggagttgc 660
cggcggcggc gcggtgatgg gggcgccgcc ggccataccg ctgggcatga ttaggtagat 720
gattgattga tgcggtggca gaacttgctt tcgtggttct tttgtttgac tatgtaatgt 780
atcttcgttt ccatcgattc tatgtaattt aactgtccct ttttttggct ctctattgtg 840
gaggacgctg ggtgtgaata gcactgtttt ggatgggttt gtgattggtc taaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa                                                        910
<210>2
<211>191
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>2
Met Tyr Pro Ser Ala Pro Pro Asp Ala Tyr Asn Lys Phe Ser Ala Gly
 1               5                  10                  15
Ala Pro Pro Thr Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Tyr His Gln Gln Gln
            20                  25                  30
Gln Gln His Gly Ala Asn Met Asp Thr Ser Arg Pro Gly Gly Gly Leu
        35                  40                  45
Arg Lys Trp Ser Thr Gly Leu Phe His Cys Met Asp Asp Pro Gly Asn
    50                  55                  60
Cys Leu Ile Thr Cys Leu Cys Pro Cys Val Thr Phe Gly Gln Val Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ile Val Asp Lys Gly Thr Cys Pro Cys Ile Ala Ser Gly Leu Val
                85                  90                  95
Tyr Gly Leu Ile Cys Ala Ser Thr Gly Met Gly Cys Leu Tyr Ser Cys
            100                 105                 110
Leu Tyr Arg Ser Lys Leu Arg Ala Glu Tyr Asp Leu Asp Glu Gly Glu
        115                 120                 125
Cys Pro Asp Ile Leu Val His Cys Cys Cys Glu His Leu Ala Leu Cys
    130                 135                 140
Gln Glu Tyr Arg Glu Leu Lys Asn Arg Gly Phe Asp Leu Gly Ile Gly
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ala Asn Met Asp Arg Gln Arg Arg Gly Val Ala Gly Gly Gly
                165                 170                 175
Ala Val Met Gly Ala Pro Pro Ala Ile Pro Leu Gly Met Ile Arg
            180                 185                 190
<210>3
<211>813
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>3
gcacaaggca ataaataaaa agcccaacgc tgggctccgc tagctctcgg tctctctgga  60
gtctggactc gcctccacgg ctccaccatg tatcccaagg cggcagacga aggtgcgcag 120
ccgctggcca cgggcatccc cttcagcggc ggcggcggct actaccaggc gggcggcgcg 180
atggcggcgg cgttcgcggt gcaggcgcag gcgcccgtcg ccgcctggtc caccgggctc 240
tgcaactgct tcgacgactg ccacaactgc tgcgtgacgt gcgtgtgccc gtgcatcacg 300
ttcgggcaga ccgcggagat catcgaccgg ggctccacgt cctgcggcac cagcggggcg 360
ctgtacgcgc tcgtcatgct gctcaccggc tgtcagtgcg tctactcctg cttctaccgc 420
gccaagatgc gcgcgcagta cggcctccag gtgagcccct gctccgactg ctgcgtgcac 480
tgctgctgcc agtgctgcgc gctctgccag gagtaccgcg agctcaagaa gcgaggcttc 540
gacatgagca taggatggca tgcgaacatg gagaggcagg ggcgcgccgc cgccgccgtg 600
ccgccgcaca tgcatcctgg gatgacccgc tgacgctctg ccgctcgcct cacttctgct 660
gaggaaatca agtgatttgg tattggtccg ctcccagcag gcagtatcaa ctactgtaac 720
caatccatga tctgtatgcg gtatcgggct gaactgatac tttatggact tgttgcttca 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa                              813
<210>4
<211>181
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>4
Met Tyr Pro Lys Ala Ala Asp Glu Gly Ala Gln Pro Leu Ala Thr Gly
 1               5                  10                  15
Ile Pro Phe Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Ala Gly Gly Ala Met
            20                  25                  30
Ala Ala Ala Phe Ala Val Gln Ala Gln Ala Pro Val Ala Ala Trp Ser
        35                  40                  45
Thr Gly Leu Cys Asn Cys Phe Asp Asp Cys His Asn Cys Cys Val Thr
    50                  55                  60
Cys Val Cys Pro Cys Ile Thr Phe Gly Gln Thr Ala Glu Ile Ile Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gly Ser Thr Ser Cys Gly Thr Ser Gly Ala Leu Tyr Ala Leu Val
                85                  90                  95
Met Leu Leu Thr Gly Cys Gln Cys Val Tyr Ser Cys Phe Tyr Arg Ala
            100                 105                 110
Lys Met Arg Ala Gln Tyr Gly Leu Gln Val Ser Pro Cys Ser Asp Cys
        115                 120                 125
Cys Val His Cys Cys Cys Gln Cys Cys Ala Leu Cys Gln Glu Tyr Arg
    130                 135                 140
Glu Leu Lys Lys Arg Gly Phe Asp Met Ser Ile Gly Trp His Ala Asn
145                 150                 155                 160
Met Glu Arg Gln Gly Arg Ala Ala Ala Ala Val Pro Pro His Met His
                165                 170                 175
Pro Gly Met Thr Arg
            180
<210>5
<211>836
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>5
cgaccacctg cgctgccgct gccgtgccaa gtcgccgggc aagctccgga tcggggcgcg 60
cgcgcgcggg gccgccgccg ccgccattat attgggttat tagttaggcc agctggtcat 120
tgcatcggag agatgtatcc ggccactacg ccctacgaga cggcgtccgg ggtgggcgtg 180
gcgccggtgg ccggcttgtt ccccgtcgcc ggagaggcca gggagtggtc gtcgaggctc 240
ctggactgct tcgacgactt cgacatctgc tgcatgacgt tttggtgccc gtgcatcacg 300
ttcgggcgga cggcggagat cgtggaccac ggcatgacgt cgtgcgggac gagcgcggcg 360
ctgttcgcgc tgatccagtg gctgtcgggg tcgcagtgca cgtgggcctt ctcctgcacg 420
taccgcacca ggctgcgcgc gcagcacggg ctccccgagg cgccctgcgc cgacttcctc 480
gtccacctct gctgcctcca ctgcgcgctc tgccaggagt acagggagct aaaggcgcgc 540
ggctacgagc ccgtcctcgg ctgggagttc aacgcccaga gggccgccgc cggcgtcgcc 600
atgtgcccgc cggcctcgca ggggatgggg cgctgatcat ccgtcgacca gccagccagc 660
ccgtcggggt ttgattcatg tctccgatct gttggttcat gcatgcatgt ctccatttaa 720
ttcatctgtt catatattca tgtctccaga tccagacggt acatataata atatattcag 780
ttgttttacg taaaatcgag aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa     836
<210>6
<211>167
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>6
Met Tyr Pro Ala Thr Thr Pro Tyr Glu Thr Ala Ser Gly Val Gly Val
 1               5                  10                  15
Ala Pro Val Ala Gly Leu Phe Pro Val Ala Gly Glu Ala Arg Glu Trp
            20                  25                  30
Ser Ser Arg Leu Leu Asp Cys Phe Asp Asp Phe Asp Ile Cys Cys Met
        35                  40                  45
Thr Phe Trp Cys Pro Cys Ile Thr Phe Gly Arg Thr Ala Glu Ile Val
    50                  55                  60
Asp His Gly Met Thr Ser Cys Gly Thr Ser Ala Ala Leu Phe Ala Leu
65                  70                  75                  80
Ile Gln Trp Leu Ser Gly Ser Gln Cys Thr Trp Ala Phe Ser Cys Thr
                85                  90                  95
Tyr Arg Thr Arg Leu Arg Ala Gln His Gly Leu Pro Glu Ala Pro Cys
            100                 105                 110
Ala Asp Phe Leu Val His Leu Cys Cys Leu His Cys Ala Leu Cys Gln
        115                 120                 125
Glu Tyr Arg Glu Leu Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Pro Val Leu Gly Trp
    130                 135                 140
Glu Phe Asn Ala Gln Arg Ala Ala Ala Gly Val Ala Met Cys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gln Gly Met Gly Arg
                165
<210>7
<211>527
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>7
agtatcaatt atcataacct ccgactccga cgatctgaac tgtgaagatg agcacttatc  60
caccgccgac gggggaatgg accaccggcc tctgtggctg cttcagcgac tgcaagagct 120
gttgcctgtc gttcttgtgc ccgtgtatcc cgttcggaca ggtggcagag gtcttggaca 180
agggcatgac atcctgtggt ctggccggcc tcctctactg tttgctgctg catgccgggg 240
tggctgtggt cccgtgccac tgcatctaca cctgcaccta ccgtcgcaag ctccgggcgg 300
cgtacgacct gccgccggag ccgtgcgccg attgctgcgt ccacatgtgg tgcgggccat 360
gcgccatctc ccagatgtac cgggagctca agaacagagg cgccgacccg gccatgggta 420
ggcagccagc cttctctctc tctctcacca gtcactgccg tttctttctg aaatcaaaat 480
attaccatat cataaaaaaa aattggcgca ccgttaaata cggataa               527
<210>8
<211>159
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>8
Met Ser Thr Tyr Pro Pro Pro Thr Gly Glu Trp Thr Thr Gly Leu Cys
 1               5                  10                  15
Gly Cys Phe Ser Asp Cys Lys Ser Cys Cys Leu Ser Phe Leu Cys Pro
            20                  25                  30
Cys Ile Pro Phe Gly Gln Val Ala Glu Val Leu Asp Lys Gly Met Thr
        35                  40                  45
Ser Cys Gly Leu Ala Gly Leu Leu Tyr Cys Leu Leu Leu His Ala Gly
    50                  55                  60
Val Ala Val Val Pro Cys His Cys Ile Tyr Thr Cys Thr Tyr Arg Arg
65                  70                  75                  80
Lys Leu Arg Ala Ala Tyr Asp Leu Pro Pro Glu Pro Cys Ala Asp Cys
                85                  90                  95
Cys Val His Met Trp Cys Gly Pro Cys Ala Ile Ser Gln Met Tyr Arg
            100                 105                 110
Glu Leu Lys Asn Arg Gly Ala Asp Pro Ala Met Gly Arg Gln Pro Ala
        115                 120                 125
Phe Ser Leu Ser Leu Thr Ser His Cys Arg Phe Phe Leu Lys Ser Lys
    130                 135                 140
Tyr Tyr His Ile Ile Lys Lys Asn Trp Arg Thr Val Lys Tyr Gly
145                 150                 155
<210>9
<211>1009
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>9
aattcctgcc cgggcgggcg tagaggcgaa gcattcgttg gggacgaacg tttagggccg  60
gggatcgggg aacacgaggc tgcgcgttgg cgcaagcaag caaattttgg gtcctagctt 120
gaaggactgc catctttttt ttttgggatg gctggaaaag gaagctatgt acctccacaa 180
tatattccct tatacagcct agataccgaa gaggatcgtg tccctgccgt ggaagagaac 240
catgctacgc gccctaaact aaaccaggat ccaacacaat ggtcatctgg catctgtgcc 300
tgttttgatg acccccagag ctgttgtatt ggtgcgactt gcccctgttt cctttttgga 360
aagaatgcac aattcttggg atctggaact cttgctggat catgcactac acattgcatg 420
ttgtggggcc ttctcacaag tctatgctgt gtatttactg gaggtctagt attagcagtt 480
ccaggatctg ccgttgcttg ttatgcttgc ggatatcgca gtgcactaag aacaaagtac 540
aatcttccgg aagcaccctg tggcgatttg acgacacact tattctgtca cttgtgtgct 600
atatgccagg agtacaggga gatccgtgag agaacaggca gtggctcctc accagctcct 660
aatgtgactc cacctccagt tcagacgatg gatgagcttt gatctttaac tgatatgaat 720
gtatgttatc tgacaaactt tggtgtgtgg cctggtggct agtgctgcct ttgcctgttg 780
gcattttgac atatttttgt tcttgggctc tcacaacgct gctatgttgt ttgtagagtt 840
gtaaacacgg gttttgaact agtgaaccac tgacagttca cggaagttgt aaacacagtt 900
gtaccatgga actgtagtag aattattaag tgtatttttt tttggctatt tatattggtg 960
agaggatggg aagggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa            1009
<210>10
<211>184
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>10
Met Ala Gly Lys Gly Ser Tyr Val Pro Pro Gln Tyr Ile Pro Leu Tyr
 1               5                  10                  15
Ser Leu Asp Thr Glu Glu Asp Arg Val Pro Ala Val Glu Glu Asn His
            20                  25                  30
Ala Thr Arg Pro Lys Leu Asn Gln Asp Pro Thr Gln Trp Ser Ser Gly
        35                  40                  45
Ile Cys Ala Cys Phe Asp Asp Pro Gln Ser Cys Cys Ile Gly Ala Thr
    50                  55                  60
Cys Pro Cys Phe Leu Phe Gly Lys Asn Ala Gln Phe Leu Gly Ser Gly
65                  70                  75                  80
Thr Leu Ala Gly Ser Cys Thr Thr His Cys Met Leu Trp Gly Leu Leu
                85                  90                  95
Thr Ser Leu Cys Cys Val Phe Thr Gly Gly Leu Val Leu Ala Val Pro
            100                 105                 110
Gly Ser Ala Val Ala Cys Tyr Ala Cys Gly Tyr Arg Ser Ala Leu Arg
        115                 120                 125
Thr Lys Tyr Asn Leu Pro Glu Ala Pro Cys Gly Asp Leu Thr Thr His
    130                 135                 140
Leu Phe Cys His Leu Cys Ala Ile Cys Gln Glu Tyr Arg Glu Ile Arg
145                 150                 155                 160
Glu Arg Thr Gly Ser Gly Ser Ser Pro Ala Pro Asn Val Thr Pro Pro
                165                 170                 175
Pro Val Gln Thr Met Asp Glu Leu
            180
<210>11
<211>976
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>11
gcaaggccgg ggtcggcagc agaggggagc agagagatct cattctccga tccgcccagg  60
ccaccatggc ggaggatgct acgagcagcc acccgtcacg ctacgtcaag ctcaccaagg 120
accaggacgc ccccgccgag gacatccgcc ccggcgagct caaccagcca gttcacgtcc 180
cgcagctcga aggccggagg tgtagcgagt gcggtcaggt cctgcccgag agctacgagc 240
cgcccgccga cgagccctgg accaccggga tcttcggatg caccgatgac ccagagacct 300
gccgaactgg attgttttgc ccctgcgtgc tgtttgggcg caacgttgag gctgttaggg 360
aggacatccc ttggacaact ccttgcgtgt gccatgctgt attcgttgaa ggagggatca 420
cgctggcgat tctgacggcg atatttcacg gtgttgatcc gaggacgtca ttcctgattg 480
gagaaggtct ggtgttcagc tggtggttat gtgctaccta cactggcatc ttccgccagg 540
ggcttcagag gaaatatcat ctcaagaact ctccgtgtga cccatgcatg gtccactgct 600
gcttgcactg gtgtgccaac tgccaggagc atcgcgagag gacgggacgg cttgcagaga 660
acaacgcagt gcccatgacg gttgtgaacc cgcctccggt gcaagagatg agcatgctgg 720
aggaggtgga ggagaaggga gcagagaaga gtgaacacga tgatgtggag gtcattcctc 780
tatagataat agggtcggag tccgagtgag gatagcacta gcagcatcag atgacgatca 840
caacttctgg tcattcctct atagttagtt agttattgat ctttcaacaa caaaatgtgg 900
tggtgtggca actgtccatt tttattatcc caaataataa tactgtacta cgttacggcc 960
caaaaaaaaa aaaaaa                                                 976
<210>12
<211>239
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>12
Met Ala Glu Asp Ala Thr Ser Ser His Pro Ser Arg Tyr Val Lys Leu
 1               5                  10                  15
Thr Lys Asp Gln Asp Ala Pro Ala Glu Asp Ile Arg Pro Gly Glu Leu
            20                  25                  30
Asn Gln Pro Val His Val Pro Gln Leu Glu Gly Arg Arg Cys Ser Glu
        35                  40                  45
Cys Gly Gln Val Leu Pro Glu Ser Tyr Glu Pro Pro Ala Asp Glu Pro
    50                  55                  60
Trp Thr Thr Gly Ile Phe Gly Cys Thr Asp Asp Pro Glu Thr Cys Arg
65                  70                  75                  80
Thr Gly Leu Phe Cys Pro Cys Val Leu Phe Gly Arg Asn Val Glu Ala
                85                  90                  95
Val Arg Glu Asp Ile Pro Trp Thr Thr Pro Cys Val Cys His Ala Val
            100                 105                 110
Phe Val Glu Gly Gly Ile Thr Leu Ala Ile Leu Thr Ala Ile Phe His
        115                 120                 125
Gly Val Asp Pro Arg Thr Ser Phe Leu Ile Gly Glu Gly Leu Val Phe
    130                 135                 140
Ser Trp Trp Leu Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Ile Phe Arg Gln Gly Leu
145                 150                 155                 160
Gln Arg Lys Tyr His Leu Lys Asn Ser Pro Cys Asp Pro Cys Met Val
                165                 170                 175
His Cys Cys Leu His Trp Cys Ala Asn Cys Gln Glu His Arg Glu Arg
            180                 185                 190
Thr Gly Arg Leu Ala Glu Asn Asn Ala Val Pro Met Thr Val Val Asn
        195                 200                 205
Pro Pro Pro Val Gln Glu Met Ser Met Leu Glu Glu Val Glu Glu Lys
    210                 215                 220
Gly Ala Glu Lys Ser Glu His Asp Asp Val Glu Val Ile Pro Leu
225                 230                 235
<210>13
<211>801
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>13
cggacgcgtg gggtgaacgc gagagccgac cgtctcagtg tgcgcgcgaa gaagagaagg  60
aggaggagga ggaggaagaa gaagaagaat gtatccggcc aagcccaccg tcgcgaccgc 120
cagcgagccg gtaaccggga tggcggcgcc gccggtgacc ggcatcccca tcagcagccc 180
cggccccgcc gtcgcggcca gccagtggtc ctcgggcctc tgcgcctgct tcgacgactg 240
cggcctctgc tgcatgacgt gctggtgccc gtgcgtgacg ttcgggcgga tcgcggaggt 300
cgtggaccgc ggcgcgacgt cgtgcgcggc cgcgggggcc atctacacgc tgctggcctg 360
cttcacgggg ttccagtgcc actggatcta ctcctgcacg taccgctcca agatgcgcgc 420
gcagctgggg ctccccgacg tcggctgctg cgactgctgc gtccacttct gctgcgagcc 480
gtgcgcgctc tgccagcagt acagggagct cagggcacgc ggcttggacc ccgcgctcgg 540
ctgggacgtc aacgcccaga aggcggccaa taataacgcc ggcgccggca tgacgatgta 600
cccgccgacg gcgcagggga tgggccgcta attacgctac cagctccatc ggtaaactca 660
tatgttgttg tgttgtgtca gccagatcat cgcgtacgta cgggtatact tgtgatatgt 720
aatgtcaggg accggcatgc ccatgtgttt caagatattt cacgttcaag tcctttctgt 780
ctgctcacta tccgaatgaa a                                           801
<210>14
<211>180
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>14
Met Tyr Pro Ala Lys Pro Thr Val Ala Thr Ala Ser Glu Pro Val Thr
 1               5                  10                  15
Gly Met Ala Ala Pro Pro Val Thr Gly Ile Pro Ile Ser Ser Pro Gly
            20                  25                  30
Pro Ala Val Ala Ala Ser Gln Trp Ser Ser Gly Leu Cys Ala Cys Phe
        35                  40                  45
Asp Asp Cys Gly Leu Cys Cys Met Thr Cys Trp Cys Pro Cys Val Thr
    50                  55                  60
Phe Gly Arg Ile Ala Glu Val Val Asp Arg Gly Ala Thr Ser Cys Ala
65                  70                  75                  80
Ala Ala Gly Ala Ile Tyr Thr Leu Leu Ala Cys Phe Thr Gly Phe Gln
                85                  90                  95
Cys His Trp Ile Tyr Ser Cys Thr Tyr Arg Ser Lys Met Arg Ala Gln
            100                 105                 110
Leu Gly Leu Pro Asp Val Gly Cys Cys Asp Cys Cys Val His Phe Cys
        115                 120                 125
Cys Glu Pro Cys Ala Leu Cys Gln Gln Tyr Arg Glu Leu Arg Ala Arg
    130                 135                 140
Gly Leu Asp Pro Ala Leu Gly Trp Asp Val Asn Ala Gln Lys Ala Ala
145                 150                 155                 160
Asn Asn Asn Ala Gly Ala Gly Met Thr Met Tyr Pro Pro Thr Ala Gln
                165                 170                 175
Gly Met Gly Arg
            180
<210>15
<211>1103
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>15
gtccccttcc ctcgcctcgc gttaggtagc ctgcttccga cccgcacatc tccctccggt   60
tctcgccatg ggcgccggcg ccaacaacca cgaggagtcg agccccctca tcccagctgc  120
ggttgccgcc cccgcggacg agaagccccc gcaggctccg gcgccggagg ccgccaatta  180
ctatgccgac ggggtcccgg tcgtgatggg cgagcccgtg tcggcccacg ccttcggcgg  240
cgtcccgcgg gagagctgga actccgggat cctctcctgc ctcggccgca acgacgagtt  300
ctgcagcagc gacgtcgaag tgtgtcttct tggaacggta gcaccatgtg tgctctatgg  360
tagcaatgtt gagaggcttg ctgctggaca aggcacattt gcaaacagct gtttgcctta  420
cactgggctg tatttgcttg ggaactctct ctttgggtgg aactgccttg ccccatggtt  480
ctctcatccc actcgtactg ctattcgaca acgctacaat cttgagggta gctttgaggc  540
tttcaccagg caatgtgggt gctgcggcga tctggtcgag gacgaggaga ggcgtgagca  600
cctagaggcc gcctgtgacc ttgcgaccca ctacctctgc cacccctgcg ccctctgcca  660
ggagggtcgc gagctgcgcc gcagggttcc ccaccctgga ttcaacaatg ggcactccgt  720
ctttgtcatg atgccgccca tggagcagac catggggcgt ggcatgtgag ctattccacc  780
accttccctg ccctagtttt atctgtgctt cccgtggttt atcatctgct gctgttggcc  840
ttgatgtgtg atgtgtcgtt tgttcgtcag taaatacgag tttgtgatat gaggtcgtgc  900
tgggaacttt ggattgtttg cttcttatcg actgcagttt ggattctgaa cagtcactta  960
tctcctgtgt tactgtgttt gtacggtggt cctcgatggg cctgtaaatg tgaaatgcat 1020
ttcgtcgtaa cttaggcccc gtttcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa                                         1103
<210>16
<211>233
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>16
Met Gly Ala Gly Ala Asn Asn His Glu Glu Ser Ser Pro Leu Ile Pro
 1               5                  10                  15
Ala Ala Val Ala Ala Pro Ala Asp Glu Lys Pro Pro Gln Ala Pro Ala
            20                  25                  30
Pro Glu Ala Ala Asn Tyr Tyr Ala Asp Gly Val Pro Val Val Met Gly
        35                  40                  45
Glu Pro Val Ser Ala His Ala Phe Gly Gly Val Pro Arg Glu Ser Trp
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Ile Leu Ser Cys Leu Gly Arg Asn Asp Glu Phe Cys Ser
65                  70                  75                  80
Ser Asp Val Glu Val Cys Leu Leu Gly Thr Val Ala Pro Cys Val Leu
                85                  90                  95
Tyr Gly Ser Asn Val Glu Arg Leu Ala Ala Gly Gln Gly Thr Phe Ala
            l00                 105                 110
Asn Ser Cys Leu Pro Tyr Thr Gly Leu Tyr Leu Leu Gly Asn Ser Leu
        115                 120                 125
Phe Gly Trp Asn Cys Leu Ala Pro Trp Phe Ser His Pro Thr Arg Thr
    130                 135                 140
Ala Ile Arg Gln Arg Tyr Asn Leu Glu Gly Ser Phe Glu Ala Phe Thr
145                 150                 155                 160
Arg Gln Cys Gly Cys Cys Gly Asp Leu Val Glu Asp Glu Glu Arg Arg
                165                 170                 175
Glu His Leu Glu Ala Ala Cys Asp Leu Ala Thr His Tyr Leu Cys His
            180                 185                 190
Pro Cys Ala Leu Cys Gln Glu Gly Arg Glu Leu Arg Arg Arg Val Pro
        195                 200                 205
His Pro Gly Phe Asn Asn Gly His Ser Val Phe Val Met Met Pro Pro
    210                 215                 220
Met Glu Gln Thr Met Gly Arg Gly Met
225                 230
<210>17
<211>873
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>17
gaattaagcg agcgccggcc gaggcagaca caacccgcag caacaacttg catcggcacg  60
gacgaccgat tgagagcctc ggcgttcgta cgccacgcca ccaagagact ctgtgcaaca 120
agtgaaggga cgaaatgtat ccggccaagc ccgccgcctc ctccagccag ccagcggccg 180
agatggcgca gccggtggtc ggcatcccca tcagcagccc cggcgcggtc gcggtcgggc 240
cggtcgtcgg caagtggtcc tccggcctct gcgcctgctc cgacgactgc ggcctctgct 300
gcctgacgtg ctggtgcccg tgcatcacgt tcggccgcat cgcggagatc gtggaccgcg 360
gcgcgacgtc gtgcggcgtg gcggggacca tctacacgct gctggcctgc ttcacgggct 420
gccactggat ctactcctgc acgtaccgct ccaggatgcg cgcgcagctc ggcctccccg 480
aagcctgctg ctgcgactgc tgcgtccact tctgctgcga gccctgcgcg ctctcccagc 540
agtacaggga gctcaaggcc cgcggattcg accccgacct cggctgggac gtcaacgcgc 600
agaaggccgc cgccgccgcc gccatgtacc cgccgccggc ggaggggatg atgatccgct 660
aagctaagct agctacctcg tcgccgatcc ggcccaacct ccaacgctaa actcagatgc 720
gttgcgtcag tcagatcatc gcgtacgtac gtgttttgta cgtatggtcg tgtatatttg 780
tacgtgatgc gtatatatat aatgttatga ctgaatgtct gagttttaag atttgtacgt 840
ttgaatcctt ttcttaaaaa aaaaaaaaaa aaa                              873
<210>18
<211>175
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>18
Met Tyr Pro Ala Lys Pro Ala Ala Ser Ser Ser Gln Pro Ala Ala Glu
 1               5                  10                  15
Met Ala Gln Pro Val Val Gly Ile Pro Ile Ser Ser Pro Gly Ala Val
            20                  25                  30
Ala Val Gly Pro Val Val Gly Lys Trp Ser Ser Gly Leu Cys Ala Cys
        35                  40                  45
Ser Asp Asp Cys Gly Leu Cys Cys Leu Thr Cys Trp Cys Pro Cys Ile
    50                  55                  60
Thr Phe Gly Arg Ile Ala Glu Ile Val Asp Arg Gly Ala Thr Ser Cys
65                  70                  75                  80
Gly Val Ala Gly Thr Ile Tyr Thr Leu Leu Ala Cys Phe Thr Gly Cys
                85                  90                  95
His Trp Ile Tyr Ser Cys Thr Tyr Arg Ser Arg Met Arg Ala Gln Leu
            100                 105                 110
Gly Leu Pro Glu Ala Cys Cys Cys Asp Cys Cys Val His Phe Cys Cys
        115                 120                 125
Glu Pro Cys Ala Leu Ser Gln Gln Tyr Arg Glu Leu Lys Ala Arg Gly
    130                 135                 140
Phe Asp Pro Asp Leu Gly Trp Asp Val Asn Ala Gln Lys Ala Ala Ala
145                 150                 155                 160
Ala Ala Ala Met Tyr Pro Pro Pro Ala Glu Gly Met Met Ile Arg
                165                 170                 175
<210>19
<211>752
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>19
caaacgcaac cgcagctaca gcacagcaca gcacagcaca acacgtcggc atgtatccgc  60
ccaaggccag cggcgatccg gccgccgggg cggcgccggt gactggcttc cccgtcggcg 120
ggcctgccgc ctcctcccag tggtcctccg gcctgttgga ctgcttcgac gactgcggcc 180
tctgctgcct gacgtgctgg tgcccgtgca tcacgttcgg gcgcgtggcg gagatcgtgg 240
accgcggcgc gacgtcgtgc ggcacggcgg gggcgctgta cgcggtgctg gcctacttca 300
cgggctgcca gtggatctac tcgtgcacgt accgcgccaa gatgcgcgcc cagctcggcc 360
tccccgagac cccctgctgc gactgcctcg tccacttctg ctgcgagccg tgcgcgctct 420
gccagcagta caaggagctc aaggcccgcg gcttcgaccc cgtcctcggc tgggaccgca 480
acgccactat gctgcctccg tccgcacagg ggatgggccg ctgaccgctg accggccagc 540
ctctgcgtaa ataaataatt aatgcttata tatgtactag tatagtgccc gtgcgttgcg 600
acggcacaca aatatagtgt ccgaacttgg caaagacgat gcccatgtcc atgcgtccta 660
ccagatactg gagatattgt gtttcagatt cactgctaga agcaatcaac atatgcaagt 720
cttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa                               752
<210>20
<211>157
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>20
Met Tyr Pro Pro Lys Ala Ser Gly Asp Pro Ala Ala Gly Ala Ala Pro
 1               5                  10                  15
Val Thr Gly Phe Pro Val Gly Gly Pro Ala Ala Ser Ser Gln Trp Ser
            20                  25                  30
Ser Gly Leu Leu Asp Cys Phe Asp Asp Cys Gly Leu Cys Cys Leu Thr
        35                  40                  45
Cys Trp Cys Pro Cys Ile Thr Phe Gly Arg Val Ala Glu Ile Val Asp
    50                  55                  60
Arg Gly Ala Thr Ser Cys Gly Thr Ala Gly Ala Leu Tyr Ala Val Leu
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Phe Thr Gly Cys Gln Trp Ile Tyr Ser Cys Thr Tyr Arg Ala
                85                  90                  95
Lys Met Arg Ala Gln Leu Gly Leu Pro Glu Thr Pro Cys Cys Asp Cys
            100                 105                 110
Leu Val His Phe Cys Cys Glu Pro Cys Ala Leu Cys Gln Gln Tyr Lys
        115                 120                 125
Glu Leu Lys Ala Arg Gly Phe Asp Pro Val Leu Gly Trp Asp Arg Asn
    130                 135                 140
Ala Thr Met Leu Pro Pro Ser Ala Gln Gly Met Gly Arg
145                 150                 155
<210>21
<211>1753
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>21
cttggatcat tgacgctgca ctgctgagcg cgttcaggag taatatatat aggaacgaaa  60
gttaccgaga aactggaaga tcctaaactg ttgccaggac atggacatca tgcatgggga 120
tctcagaagg aatggttcaa accagagcgt gcccagtcgg catggatgga tcgatatgga 180
ggccctctct cctctggcgg atcaatccat gtatccatga gagagagaga gagagaggca 240
taggccaaga ctaggccttt tgttttgaga tgggctgctg ctatctagag cgatactgct 300
atatagtggt accaagagga ccaaaggtcg cgttgcctga aaccaccgag atcatacaga 360
aactaatcgc cgcaacgcat ccaaacccga ccaactgacg gcgcgcgtct gcgtgaacag 420
ctcgcagcat gccgggggag tggtccgtgg ggctctgcga ctgcttcggg gatcttcaca 480
cctgtacgca gtgcaaacaa acctgctagc tatagcaagc tactctcctc tctctctctt 540
cttcttcttc ccgtacgtac tacgatgcat gtttttcagc tctccgtccc ttctctcccg 600
gccgacgatc gaccacgttg caggttgcct gacgctctgg tgcccctgcg tcacgttcgg 660
ccgcaccgcg gagatcgtgg acagaggctc cacgtgtacg cgttccactt cactcccata  720
ctactactgc ccccctcgtc tcgtctccat ctctcctgtt ccttttggct gacgatccgt  780
cccgcattgc atatttgcag cgtgctgcat gagtggcaca ctgtactacc tgctgtcgac  840
gataggctgg cagtggctgt acggctgcgc caagcgctcc tccatgcggt cgcagtacag  900
cctgcgagag tccccctgca tggactgctg cgtccacttc tggtgcggcc cctgcgcgct  960
ctgccaggag tacacggagc tccagaaacg cggcttccac atggccaaag gtatcagctc 1020
ccccccccat cttcccacag tttaactagg cggcctttga tggttccatg atcaccgtgc 1080
ctctacaaaa ccattatatt ccttttattt gcaggatggg aagggagcaa caaggtggtg 1140
gggtgcttcc atgggatgac gacgccacca aggaagcaat ccatgtgctt ttaggatagc 1200
atagctccat cgttctatat aatatgcgct ttattttgaa taaaaatata tgggtctgtc 1260
tattgatgct ttatttagag ctcgttgggt ctcattagtt cctattgctc atagttatgg 1320
tttccattta tttaaatcat cgattgttca ctttatttta cgttgatttt atgattatta 1380
catggcgttt gagcctctgc cggcctctta cgtgagaccc agtaattaat aaagcaatca 1440
aaacaaggat tagatatacc tatagatatg cattaagtgg atcagcttct aaataaacat 1500
aagagcagtt ataatatgtt ttgccataga tttttgccaa gttagaggag aaagagggga 1560
agaaactaac ggaccactaa ttatcagtcg agagattcca aaatagtgct ccatccgtca 1620
caaaatataa ttctttatcc atttattaac cttaggatat agtttaaagt tggtatgtat 1680
atctatattt attattattt attctaacgt gcatagaaaa agattattag aaagaactat 1740
gttttgggac aga                                                    1753
<210>22
<211>160
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>22
Met Asp Ile Met His Gly Asp Leu Arg Arg Asn Gly Ser Asn Gln Ser
 1               5                  10                  15
Val Pro Ser Arg His Gly Trp Ile Asp Met Glu Ala Leu Ser Pro Leu
            20                  25                  30
Ala Asp Gln Ser Ile Met Pro Gly Glu Trp Ser Val Gly Leu Cys Asp
        35                  40                  45
Cys Phe Gly Asp Leu His Thr Cys Cys Leu Thr Leu Trp Cys Pro Cys
    50                  55                  60
Val Thr Phe Gly Arg Thr Ala Glu Ile Val Asp Arg Gly Ser Thr Ser
65                  70                  75                  80
Cys Cys Met Ser Gly Thr Leu Tyr Tyr Leu Leu Ser Thr Ile Gly Trp
                85                  90                  95
Gln Trp Leu Tyr Gly Cys Ala Lys Arg Ser Ser Met Arg Ser Gln Tyr
            100                 105                 110
Ser Leu Arg Glu Ser Pro Cys Met Asp Cys Cys Val His Phe Trp Cys
        115                 120                 125
Gly Pro Cys Ala Leu Cys Gln Glu Tyr Thr Glu Leu Gln Lys Arg Gly
    130                 135                 140
Phe His Met Ala Lys Gly Ile Ser Ser Pro Pro His Leu Pro Thr Val
145                 150                 155                 160
<210>23
<211>1177
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<220>
<221>不确定的
<222>(452)...(465)
<223>n＝A、C、G或T
<400>23
gcttatcgga gatgtatctg gcagctatgc cctacgaacc gtacggggtg gcggcggcgc   60
cagtcgtgtc cttccccgtt gccggagcgg ccagggcaca ggcagtggtc gtcgggcctc  120
ttcgactgct tggacgagtc ccgcgtctcc tgtaagccta gttagcaccc tcgatgttcg  180
tcagctcgat cttgaacttt tgctaggtcg tatagtaggt agctgagctc accggcaggc  240
acaggctgcc tgacgcactt gtgcccgtgc gtcacgttcg ggcgggatcg cggcgcgacg  300
tcgtgcgcga cgggcggggc gctatacgcg ctcatcgcct gcctctcggc gtcgcggtgc  360
cagtgggtgt attcctgcac gtaccgcgcc gtgatgcgct cgcagttggg cctcccggag  420
gcgccatgcg ccgactgcct cgtccaccta annnnnnnnn nnnnngcgct ctgccagcag  480
tacagggagc tcaaggcttg gggcctcgag ccctcaaccc cgccatcggc cgggacttga  540
acgatgccat gtacccgccg ccggcgcagg ggatgcgacg gcactgatcg gtggatccct  600
ccatgtatcg ggtccatttc gtttgtttgt tgacgacaga tgcagacaca gtacaaggtg  660
tccacctaca ccacacgcca ggctggacca ccctccatat atatagggtg agtaaattgg  720
aagtcatatg ctttcaaata ttatagaaag acctgaccct ttacccccga cctggctgaa  780
acatgcatac gccaggctgt caactgtgtc actgcccgtg caccaggtca accttcccca  840
cgatcatcag gcaaacacct ggtccaaaat caacctcccg catgggacgc aaaccataaa  900
ttgtggttct gtttttacac aaatagagta aaactgtcaa cataaatagt gtaaatagtt  960
cagagagata gcataaaaac cgcgccacat gctcatgcgc aggtgcatgc atgcagattc 1020
tatttttatg atagatccaa taattatgac atggcgtgag aattttaatt atatgtaatc 1080
aaattttaga tgacattttc gtttccattg catgcgcgca aaaaattaca tgacaggaat 1140
gtgcgagatg aaaggaaatt gattgacata tatggaa                          1177
<210>24
<211>148
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<220>
<221>不确定的
<222>(929)...(929)
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>24
Ala Tyr Arg Arg Cys Ile Trp Gln Leu Cys Pro Thr Asn Arg Thr Gly
 1               5                  10                 15
Trp Arg Arg Arg Gln Ser Cys Pro Ser Pro Leu Pro Glu Arg Pro Gly
            20                  25                  30
His Arg Gln Trp Ser Ser Gly Leu Phe Asp Cys Leu Asp Glu Ser Arg
        35                  40                  45
Val Ser Cys Cys Leu Thr His Leu Cys Pro Cys Val Thr Phe Gly Arg
    50                  55                  60
Asp Arg Gly Ala Thr Ser Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Tyr Ala Leu
65                  70                  75                  80
Ile Ala Cys Leu Ser Ala Ser Arg Cys Gln Trp Val Tyr Ser Cys Thr
                85                  90                  95
Tyr Arg Ala Val Met Arg Ser Gln Leu Gly Leu Pro Glu Ala Pro Cys
            100                 105                 110
Ala Asp Cys Leu Val His Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Cys Gln
        115                 120                 125
Gln Tyr Arg Glu Leu Lys Ala Trp Gly Leu Glu Pro Ser Thr Pro Pro
    130                 135                 140
Ser Ala Gly Thr
145
<210>25
<211>813
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>25
gcacaaggca ataaataaaa agcccaacgc tgggctccgc tagctctcgg tctctctgga  60
gtctggactc gcctccacgg ctccaccatg tatcccaagg cggcagacga aggtgcgcag 120
ccgctggcca cgggcatccc cttcagcggc ggcggcggct actaccaggc gggcggcgcg 180
atggcggcgg cgttcgcggt gcaggcgcag gcgcccgtcg ccgcctggtc caccgggctc 240
tgcaactgct tcgacgactg ccacaactgc tgcgtgacgt gcgtgtgccc gtgcatcacg 300
ttcgggcaga ccgcggagat catcgaccgg ggctccacgt cctgcggcac cagcggggcg 360
ctgtacgcgc tcgtcatgct gctcaccggc tgtcagtgcg tctactcctg cttctaccgc 420
gccaagatgc gcgcgcagta cggcctccag gtgagcccct gctccgactg ctgcgtgcac 480
tgctgctgcc agtgctgcgc gctctgccag gagtaccgcg agctcaagaa gcgaggcttc 540
gacatgagca taggatggca tgcgaacatg gagaggcagg ggcgcgccgc cgccgccgtg 600
ccgccgcaca tgcatcctgg gatgacccgc tgacgctctg ccgctcgcct cacttctgct 660
gaggaaatca agtgatttgg tattggtccg ctcccagcag gcagtatcaa ctactgtaac 720
caatccatga tctgtatgcg gtatcgggct gaactgatac tttatggact tgttgcttca 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa                               813
<210>26
<211>546
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>26
atgtatccca aggcggcaga cgaaggtgcg cagccgctgg ccacgggcat ccccttcagc  60
ggcggcggcg gctactacca ggcgggcggc gcgatggcgg cggcgttcgc ggtgcaggcg 120
caggcgcccg tcgccgcctg gtccaccggg ctctgcaact gcttcgacga ctgccacaac 180
tgctgcgtga cgtgcgtgtg cccgtgcatc acgttcgggc agaccgcgga gatcatcgac 240
cggggctcca cgtcctgcgg caccagcggg gcgctgtacg cgctcgtcat gctgctcacc 300
ggctgtcagt gcgtctactc ctgcttctac cgcgccaaga tgcgcgcgca gtacggcctc 360
caggtgagcc cctgctccga ctgctgcgtg cactgctgct gccagtgctg cgcgctctgc 420
caggagtacc gcgagctcaa gaagcgaggc ttcgacatga gcataggatg gcatgcgaac 480
atggagaggc aggggcgcgc cgccgccgcc gtgccgccgc acatgcatcc tgggatgacc 540
cgctga                                                            546
<210>27
<211>181
<212>PRT
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>27
Met Tyr Pro Lys Ala Ala Asp Glu Gly Ala Gln Pro Leu Ala Thr Gly
 1               5                  10                  15
Ile Pro Phe Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Tyr Gln Ala Gly Gly Ala Met
            20                  25                  30
Ala Ala Ala Phe Ala Val Gln Ala Gln Ala Pro Val Ala Ala Trp Ser
        35                  40                  45
Thr Gly Leu Cys Asn Cys Phe Asp Asp Cys His Asn Cys Cys Val Thr
    50                  55                  60
Cys Val Cys Pro Cys Ile Thr Phe Gly Gln Thr Ala Glu Ile Ile Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gly Ser Thr Ser Cys Gly Thr Ser Gly Ala Leu Tyr Ala Leu Val
                85                  90                  95
Met Leu Leu Thr Gly Cys Gln Cys Val Tyr Ser Cys Phe Tyr Arg Ala
            100                 105                 110
Lys Met Arg Ala Gln Tyr Gly Leu Gln Val Ser Pro Cys Ser Asp Cys
        115                 120                 125
Cys Val His Cys Cys Cys Gln Cys Cys Ala Leu Cys Gln Glu Tyr Arg
    130                 135                 140
Glu Leu Lys Lys Arg Gly Phe Asp Met Ser Ile Gly Trp His Ala Asn
145                 150                 155                 160
Met Glu Arg Gln Gly Arg Ala Ala Ala Ala Val Pro Pro His Met His
                165                 170                 175
Pro Gly Met Thr Arg
            180
<210>28
<211>997
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>28
catctctttt ttgattgtta cattgccaaa agtatatgga gaatcattta ctttgcttta  60
aaaatagaca tgcccattag cattaatcat attatcgggt cttgggaatc taataatgct 120
ctggcataca aaacattatt actgactgga atatccgctt tattttggtc catctggctc 180
tgtcgaaatg aggtggtgtt taatcataaa ccaataccat caattgtgca ggttattttc 240
agggttactc actggttcag attctggaga cttctacaga aggaggaaaa gcaccaacaa 300
attctcgatg cctgtcgagc tttggaggtg gtggcgatgg aagtttttgc aatgcatgga 360
tggcgctcga atgcaagaat tgaagatggc tagtgttttc tatagtcatg gcattttgtt 420
ttctttgagt tagtttaatt attcaagcaa ttgctctatg gtccaataat cgttatgtaa 480
tggctgtacg catttgtatg ctaaagccgg aactcttgtt tccataatca aaaaaaaaat 540
agaaaagaca atacatgctg ctgcgactgt gcatcggaat cgcgggatgt gcaaatatac 600
taatgctctc gtgtttagtg cagtaaccaa acccttcctt gatttgatat taaggaactg 660
catctgcatc ggattcccgt tgaaaagtaa cgcggcatta tttattggta tggtcaccta 720
aaatactatt ttataatata gaccgtatta tttatataat agattttgaa atagataatg 780
gagataatta agctgttgaa gatagccttt aactagttag taccgcagta cgtgagtggt 840
gacttgaggg agacctctcg agtcgagtct tgccgacctg gggcctgctg cgcctggatg 900
aagagctgtg ctgagagaat cattaaagca gcaccgggtc cttgctttgc gcgttgctgt 960
tcgcataaac aagagatcct agttctactc ccaagca                          997
<210>29
<211>997
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>29
tctccgcgtg gagttttata gcgttgttct tttttagcac cgacatgaca tattacatag  60
aatgaaatga aagttaaatg gaatttatgg gaagttttct gtggagattt aattcgcatg 120
aatgacttat taagagttga taaatatgcc aagcagagag tttgatagcc ataaagctca 180
cttcttctct tttctaggat aattgtcacg tacgtcatcc aaaatattta aaactttttg 240
agtacaaata aaactccaac aagatgagat tagtcttatc acacgttcca ctgacacttg 300
gaataatata atgtggatgg acgccttatg tcattagtgg gaagaataga caacaaccga 360
acaacgtgcc attatattgg cgaaagcttg actagcggat tagtttgtat cggtggtcct 420
gttagtcttt gggcccgcgg gaaagcgagc cgtgccattt ctacgcgcgc actttatttt 480
atttattgtt tacttcggtc gtcgatgttg ggcagggata agtcttgctt ccggtccacg 540
gacgcatgct acgttaccat ctctagctag ctagctaggc ggacacttga cgtcgaaaca 600
agggcagaaa taaaacaacg tgatcattcc atggcagtgc ggcaggccac atacatgcat 660
gaggatgagc atcgcgagtc gcggcgctcc acgtaaccct tgtaccacca tccggtccgg 720
gtgtggccag ccgcgtcgta ctcggcggcc gggagacgac tttgacctgc ttgcacggct 780
ggcccggggc catcgtcagt tcgtcacaac ctgacgtagt gcttgggcac agcgcactga 840
aaaaaaaaac attaccgtcg cgccgagata aatacgcgct gcggccggac aggctagcta 900
gaccggacgc gcacaaggca ataaataaaa agcccaacgc tgggctccgc tagctctcgg 960
tctctctgga gtctggactc gcctccacgg ctccacc                          997
<210>30
<211>1000
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>30
cttcgtctag cgctaggtct tctctttcga ctctgatctt tgccgtcgtc actcggttct   60
ctagctcttg aagcgtgcac ctacaagtcg cccactctcc agctctctcc actcttcggc  120
aagggtgaga ctgaggcggg tcctgtgtcg tgcatgttgt gcggtgcgcc ctgctggcca  180
gcccggctgc ccgacctgag ctagcactac gcagctgctt cactgacttt ggtgcttgca  240
gcttccttgt gccttgtgtg gcccatgacc gtgtgaccat ccttccagcg tagcctaatc  300
aacctcatac attcactgat tgtgagcact acgacactat atgccacaat aagcaacctc  360
aacattcatt catgttgtgc tactccgaac ctattagcct attcatcaca caatacaatt  420
tcattataca aataagtgaa gcggtgaaag cagaggcgcc tggtacagaa acttttttgc  480
ctttttagac cacgcaccgg cgaggaagca atcaattaga aaccccacga gcgaagtttg  540
acataggcaa acaccaaaaa gacatctctg tcactgagaa ctgcaagttc aaagtcatgt  600
aaaaaaccgg tcatacctta aattttactc gtcctccgca actcccaata tattgtacaa  660
cgggtaatta cggaacaata actaccttac aatattaatg attgaaaaaa aagaaagcat  720
aaatgataaa attcgtatgt taagcgtcca ttcattttta ctaacgggtc acactattac  780
tccaatcatc gtacattaat cggcggccgt cacccatata ttcaacattc gtttcgctgt  840
tgtgttgggc cttactacat ttgtagacgg catctagggc ctcttttgac ctttctagat  900
gtcatctata aatacgcata cttggcaagc tgatgcatca actcatcacc cgtagtatca  960
attatcataa cctccgactc cgacgatctg aactgtgaag                       1000
<210>31
<211>442
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>31
gttatatttt gtctaaaatt aatcgtccga attaaaaaac taggtggata tttgtttgag  60
gatgaagtgg tgcatcatga gctcatttct cataaatttg gtgggattct atttatcata 120
ttaatacaaa ctaattatga ggtgttgata aatcatctta ttgtattcca taaatcaaat 180
aaaaagaagt aaggagtgag aagataatag actaggttat ttatcaaacc aaatacttta 240
taactttagt taaaaaagtt aggtcaagta taagcaccaa acaaaagagc cgaggaggat 300
gtttaacttg ggcctgatca gggcccggcg tgcttcatgt aagctccggc ccgatcgatg 360
agaggagtca gacggaggca aggccggggt cggcagcaga ggggagcaga gagatctcat 420
tctccgatcc gcccaggcca cc                                          442
<210>32
<211>815
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>32
tgggaattac ttaggagctg tgggagtagc ttgcattgtt gcaaaaaagg actataatat  60
tgtgtgcgtg tctttggtta tgaataaaac aaaatagata atttgccatg tctcttccta 120
tctcgtttgc attattttgg ggaaaaaaag gaccgtaata atgcgtgtgt ctttggctgt 180
atgcatgaat acaaaataga caaaataatc tctccagagt ggaacgctaa gaaataatgg 240
aagagacagg agggacaact aacgactgtt aggttaggta gtatttgaat ctgaagtata 300
gtgggatgga gcatatctcg gattggatag agtgacttta aaaaggaaaa ttcagttcca 360
atcatccagc tctctaaaat ctctcggatg aaaccgctgg catggagcta cttcatcccg 420
atcaccaaac cctacgttac tcaagtgaca agtggtggga ggccaaacgc tagctgggcc 480
ccaccctagt gcatccgcca agagcacatg catgcccgtg ccgtgcgcgg tgagccccgc 540
cgccgagttg gctgcagagc tgcggagtct tggcgaagac cccgcgctgg gcgtcgccgc 600
tgctgagtcg gtcaacgagg cgtaaccagc gagccagcga cgcgcctttg ggttgggatt 660
ggacccggtc gtcccatccc agccccgcct atgtaaagag cacccgccgc tgcccagctc 720
tctcattcct gtcggcaagg tgaacgcgag agccgaccgt ctcagtgtgc gcgcgaagaa 780
gagaaggagg aggaggagga ggaagaagaa gaaga                            815
<210>33
<211>630
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>33
gggtgtgtgt tttggtaaaa tatgaacgaa atgaacctcg ctcaagtctc gaacgttggg  60
ccctagcccc aacctgtttc cgactgctgt tttaactact gcagttataa ttcctgttcc 120
gactgctgtt ttaactatta cagttataat ttatagagac aaaaataaaa atactatcag 180
tccgaagctg atacatatta aagtcaagtc ctagctcttg ggtgcgtgtg tgctgctcaa 240
caccccaacg cgtggaacgg gaaagccgga aaggcccccg cccgcacacg ccgccgccgc 300
tgccaattcg gtcaacgtac gataccagcc gcgggccggc gagtccaggc ggtcgcagtc 360
gcacgtcgcg acgcgcctta gcattggacc gagccgcggc cacttgcttt gcaattgcat 420
ttgccgggat ccatgccagc agctccgtcc tatatgtgaa gcacccggcc gcaaggctct 480
ctcgctcatt cacggcaaat taagcgagcg ccggccgagg cagacacaac ccgcagcaac 540
aacttgcatc ggcacggacg accgattgag agcctcggcg ttcgtacgcc acgccaccaa 600
gagactctgt gcaacaagtg aagggacgaa                                  630
<210>34
<211>100
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>34
cttggatcat tgacgctgca ctgctgagcg cgttcaggag taatatatat aggaacgaaa  60
gttaccgaga aactggaaga tcctaaactg ttgccaggac                       100
<210>35
<211>89
<212>DNA
<213>玉蜀黍(Zea mays)
<400>35
gcttatcgga gatgtatctg gcagctatgc cctacgaacc gtacggggtg gcggcggcgc  60
cagtcgtgtc cttccccgtt gccggagcg                                    89
<210>36
<211>17
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>36
gatcggctgg gaggcta                                                 17
<210>37
<211>17
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>37
gatctgtatg cggtatc                                                 17
<210>38
<211>17
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>38
gatccagacg gtacata                                                 17
<210>39
<211>17
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>39
gatctttaac tgatatg                             17
<210>40
<211>17
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>40
gatctttcaa caacaaa                             17
<210>41
<211>17
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>41
gatcatcgcg tacgtac                             17
<210>42
<211>17
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>42
gatctggtcg aggacga                             17
<210>43
<211>17
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>43
gatctactcg tgcacgt                             17
<210>44
<211>126
<212>PRT
<213>番茄属(Lycopersicon)
<220>
<221>不确定的
<222>(305)...(305)
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>44
Ser Cys His Phe Ile Met Ser Met His Asp Ser Ile Pro Gly Cys Leu
 1               5                  10              15
Thr Cys Trp Cys Pro Cys Ile Thr Phe Gly Arg Val Pro Glu Ile Val
            20                  25                  30
Asp Xaa Gly Ala Thr Ser Cys Gly Thr Ala Gly Ala Leu Tyr Pro Val
        35                  40                  45
Leu Ala Tyr Phe Pro Gly Cys Gln Trp Ile Tyr Ser Cys Thr Tyr Arg
    50                  55                  60
Ala Lys Met Arg Ala Gln Leu Gly Leu Pro Glu Thr Pro Cys Cys Asp
65                  70                  75                  80
Cys Leu Val His Phe Cys Cys Glu Pro Cys Ala Leu Cys Gln Gln Tyr
                85                  90                  95
Lys Glu Leu Lys Ala Arg Gly Phe Asp Pro Val Leu Gly Trp Asp Arg
            100                 105                 110
Asn Ala Thr Met Leu Pro Pro Ser Ala Gln Gly Met Gly Arg
        115                 120                 125
<210>45
<211>163
<212>PRT
<213>番茄属(Lycopersicon)
<400>45
Met Tyr Gln Thr Val Gly Tyr Asn Pro Gly Pro Met Lys Gln Pro Tyr
 1               5                  10                  15
Val Pro Pro His Tyr Val Ser Ala Pro Gly Thr Thr Thr Ala Arg Trp
            20                  25                  30
Ser Thr Gly Leu Cys His Cys Phe Asp Asp Pro Ala Asn Cys Leu Val
        35                  40                  45
Thr Ser Val Cys Pro Cys Ile Thr Phe Gly Gln Ile Ser Glu Ile Leu
    50                  55                  60
Asn Lys Gly Thr Thr Ser Cys Gly Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Cys Leu
65                  70                  75                  80
Leu Gly Leu Thr Gly Leu Pro Ser Leu Tyr Ser Cys Phe Tyr Arg Ser
                85                  90                  95
Lys Met Arg Gly Gln Tyr Asp Leu Glu Glu Ala Pro Cys Val Asp Cys
            100                 105                 110
Leu Val His Val Phe Cys Glu Pro Cys Ala Leu Cys Gln Glu Tyr Arg
        115                 120                 125
Glu Leu Lys Asn Arg Gly Phe Asp Met Gly Ile Gly Trp Gln Ala Asn
    130                 135                 140
Met Asp Arg Gln Ser Arg Gly Val Thr Met Pro Pro Tyr His Ala Gly
145                 150                 155                 160
Met Thr Arg

Claims (11)

1.一种分离的多核苷酸，其选自：
a.编码SEQ ID NO：4的多肽的多核苷酸；
b.SEQ ID NO：3的多核苷酸；和
c.和(a)或(b)的多核苷酸互补的多核苷酸。
2.一种重组表达盒，其包含权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸以有义或反义方向可操作地连接至启动子。
3.包含权利要求2的表达盒的宿主细胞。
4.调节植物中细胞数目的方法，其包括：
a.将包含可操作地连接至启动子的权利要求1的多核苷酸的重组表达盒导入植物细胞；和
b.在植物细胞生长条件下培养该植物；其中调节所述植物中的细胞数目。
5.权利要求4的方法，其中所述植物细胞来自选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸芥子、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生和可可的植物。
6.调节植物中细胞数目的方法，其包括：
a.将包含可操作地连接至启动子的权利要求1的多核苷酸的重组表达盒导入植物细胞；
b.在植物细胞生长条件下培养该植物细胞；和
c.从所述植物细胞再生植物；其中调节所述植物中的细胞数目。
7.权利要求6的方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、高粱、低芥酸芥子、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生和可可。
8.在植物细胞中减少细胞数目调节性多肽的活性的方法，其包括：
a.提供包含SEQ ID NO：3的互补物的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；
b.提供包含具有SEQ ID NO：3中所示的序列的mRNA的植物细胞；和
c.将步骤(a)的核苷酸序列导入植物细胞，其中该核苷酸序列抑制mRNA在该植物细胞中的表达。
9.权利要求8的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
10.权利要求9的方法，其中所述单子叶植物是玉米、小麦、水稻、大麦、高粱或黑麦。
11.权利要求8的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
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