CN112391391B

CN112391391B - 抗虫基因及其用途

Info

Publication number: CN112391391B
Application number: CN202011308346.XA
Authority: CN
Inventors: 王正亮; 俞晓平; 付贤树
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2040-11-19
Also published as: JP6936979B1; JP2022081370A; CN112391391A

Abstract

本发明涉及生物防治领域，尤其涉及抗虫基因及其用途，所述抗虫基因为Nlserpin1基因，所述基因能够显著提升金龟子绿僵菌对水稻害虫的毒力，本发明以褐飞虱免疫负调控因子Nlserpin1基因为研究对象,对其进行克隆鉴定和生物学信息分析，为杀虫真菌的遗传改良提供了新基因资源。

Description

抗虫基因及其用途

技术领域

本发明涉及生物防治领域，尤其涉及抗虫基因及其用途。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物之一，在我国农业生产和国计民生中占据举足轻重的位置，其中害虫防治是保障水稻安全生产的关键环节。褐飞虱(Nilaparvata lugens

)是我国最主要的水稻害虫之一，不仅直接吸食水稻汁液，产卵破坏水稻组织，造成枯干倒伏，而且还能传播水稻病毒病，引起水稻产量的重大损失。

目前，开发抗性水稻品种和使用化学杀虫剂是防治褐飞虱的两种重要手段。其中抗性品种的利用往往因为褐飞虱致害性的快速与高度变异而造成使用年限缩短，周期长、成本高；化学杀虫剂的持续大量使用，不仅使褐飞虱抗药性水平不断提高，而且对环境和非靶标生物产生了严重的危害。微生物农药因其有效期长、易降解、对环境友好以及不易使害虫产生抗药性等优点而在害虫的生物防治中广泛应用。其中昆虫病原真菌绿僵菌已被证实在防治褐飞虱中具有应用潜能。但是绿僵菌对褐飞虱的致病能力受诸多因素影响，包括环境因子、寄主昆虫自身的防御机制等，杀虫速度较为缓慢，这样的时滞效应使其在褐飞虱生物防控效果上大打折扣，成为其大规模应用推广的重要限制因素。因此，寻求一条新的防治途径，有效减少化学杀虫剂的使用，延缓抗性水稻品种的使用年限，拓宽微生物农药应用规模是开展褐飞虱防控工作的关键所在。

随着昆虫病原真菌致病机理和分子生物学的深入研究，利用基因工程技术对生防真菌进行遗传改造、提高菌株毒力的工程菌构建方面取得了较大的进展。发掘新的可利用的基因资源，尤其是参与菌虫互作过程中宿主免疫调控相关的基因，将为真菌制剂的改良提供新途径。

发明内容

为了解决上述技术问题，提高昆虫病原真菌毒力，本发明提供一种抗虫基因及其用途。

本发明是以如下技术方案实现的：

一种抗虫基因，所述抗虫基因为Nlserpin1基因，所述抗虫基因能够显著提升金龟子绿僵菌对水稻害虫的毒力。

进一步地，所述Nlserpin1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述Nlserpin1基因核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

为实现上述目的，本发明还提供一种提高杀虫真菌毒力的方法，其特征在于，包括将上述Nlserpin1基因的表达盒导入金龟子绿僵菌基因组中使其有效表达。

进一步地，将Nlserpin1基因片段克隆至真菌表达载体pAN52-1N中，使其位于构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子PgpdA和终止子TtrpC之间，获得pAN52-Nlserpin1质粒；利用XbaI单酶切pET29b-Bar质粒，将切下的草丁膦抗性基因bar表达元件PgpdA-bar-TtrpC导入同样经XbaI单酶切并去磷酸化的pAN52-Nlserpin1中，筛选获得Nlserpin1和bar基因两个表达框方向相同的双元质粒，所述双元质粒经HindIII线性化后通过PEG介导的原生质体转化法导入金龟子绿僵菌野生株中。

进一步地，所述Nlserpin1基因能够显著提升金龟子绿僵菌对褐飞虱的毒力。

本发明的有益效果是：

1)本发明以褐飞虱免疫负调控因子Nlserpin1基因为研究对象,对其进行克隆鉴定和生物学信息分析，利用qRT-PCR分析其时空表达规律以及病原真菌诱导表达模式，构建真菌表达载体，利用PEG介导的原生质体转化法导入金龟子绿僵菌中，从而获得对褐飞虱毒力显著提升的超表达Nlserpin1的遗传重组菌株。

2)无污染。现有技术使用的化学防治方法虽然对控制害虫的为害起到了一定作用，但同时也对人、畜和农田生态系统带来了污染、破坏和残留；使用本发明控制害虫的构建体及其方法，可以消除上述不良后果。

3)本发明以褐飞虱免疫负调控因子Nlserpin1基因为研究对象,对其进行克隆鉴定和生物学信息分析，本发明为杀虫真菌的遗传改良提供了新策略和基因资源。

下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1显示金龟子绿僵菌野生株侵染褐飞虱成虫后Nlserpin1的诱导表达模式；

图2显示Nlserpin1超表达菌株筛选鉴定；

图3显示野生株和超表达株MaT6的菌丝生长(A)和产孢量(B)；

图4显示野生株和超表达株MaT6对褐飞虱毒力的时间-死亡率模拟曲线及致死中时LT₅₀。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的抗虫活性特征的部分和/片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有抗虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗褐飞虱的生物活性的蛋白。

本发明中所述的“抗虫”是指对目标昆虫生长发育繁殖具有抑制作用，更具体地，目标昆虫是褐飞虱。

本发明中所述的“超表达株”、“超表达株MaT6”和“MaT6”均指同一真菌菌株。

本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的抗虫活性特征的部分和/或片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有抗虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗褐飞虱的生物活性的蛋白。

本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)具有抗虫活性的蛋白或多肽。

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin)是广泛存在于昆虫体内一类结构保守、功能多样的蛋白酶抑制剂超家族，主要通过抑制丝氨酸蛋白酶级联反应，进而负调控Toll信号通路和酚氧化酶原激活通路来降低宿主应对外来入侵物的防御响应。

实施例1：

供试褐飞虱种群为本实验室保存建立，于人工气候室内(温度24±1℃、光周期16L:8D、相对湿度70％±5％)以TN1水稻苗饲养，维持种群。金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae野生株于PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)斜面上4℃保存，25℃培养传代。

提取褐飞虱RNA并合成cDNA，具体地，取褐飞虱五龄若虫10头置于研钵中用液氮研磨均匀。采用Trizol法提取褐飞虱总RNA，并用微量紫外分光光度计(NanoDrop ND-2000，美国)和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和浓度。以检测合格后的RNA为模板，使用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，日本)试剂盒，参照说明书合成cDNA并于-20℃保存备用。

以家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因的蛋白序列为搜索源，在褐飞虱基因组数据库中通过BlastP进行同源序列搜索，获得一个预测蛋白，命名为Nlserpin1。使用Primer Premier 5设计Nlserpin1扩增引物，

cS1F：5'-ATGATGATACTGTGGATGTGTG-3'

cS1R：5'-TTACTGAGCTTCATTACCGCCT-3'

以实施例1所述褐飞虱cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系如下：cDNA模板1μL,dNTPs(10mmol/L)2μL,正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL,LATaq酶0.25μL,ddH₂O补充至25μL。扩增程序:94℃预变性5min；94℃变性30s,60℃复性30s,72℃延伸1.5min,35个循环；72℃延伸7min。PCR反应完成后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物数量及分子量大小。目标扩增产物经割胶回收后与pMD18-T载体(TaKaRa，日本)连接，并转化入大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞中，阳性转化子送上海桑尼测序有限公司测序。扩增得到的产物经过测序显示褐飞虱Nlserpin1基因cDNA序列全长1269bp(如SEQ ID NO.1所示)，编码422个氨基酸(如SEQ ID NO.2所示)，编码氨基酸分子量大小为47.65kD，等电点6.73。

实施例2：

用金龟子绿僵菌野生株(下称野生株)分生孢子悬液喷雾法接种褐飞虱成虫，检测诱导不同时间后褐飞虱Nlserpin1的表达量。具体地，将野生株分生孢子以0.02％Tween-80水溶液制成5×10⁷个/mL浓度的悬液，用喷雾法接种褐飞虱成虫，接种体积为1mL，接种3批次，每批次100头。以接种相同体积的0.02％Tween-80水溶液为对照。分别于0h(未接种),接种后6,12,24和48h后收集虫体，用75％的酒精表面消毒虫体3次，每次3min，再用无菌蒸馏水清洗5遍，晾干虫体备用。根据Nlserpin1基因cDNA序列，设计一对定量PCR引物，

qS1F：5'-ACCATGATGAGACAGAAGGGAA-3'

qS1R：5'-AGGGTCAACCGCTTTAGGAT-3'

样品RNA提取和cDNA合成步骤同实施例1。qRT-PCR分析采用

Premix ExTaqTM II试剂盒，反应体系如下：

Premix Ex TaqTM II 10μL,上下游引物(10μmol/L)各1μL,适量稀释的cDNA 2μL和ddH₂O 6μL，反应体系20μL。扩增程序：95℃预变性30s,进入40个扩增循环(95℃变性5s,60℃退火34s)；融解曲线为：95℃ 15s,60℃ 1min,95℃ 15s。以褐飞虱β-Actin基因作为内参，扩增引物如下，

ActinF：TGCGTGACATCAAGGAGAAGC；

ActinR：CCATACCCAAGAAGGAAGGCT，反应体系和程序同上。每个实验设置3次生物学重复和3次技术重复。Nlserpin1基因在病原真菌接种不同时间诱导后的相对表达量用2^-ΔΔCt计算，以0.02％Tween-80接种组的表达量为基数，其值设为1。与对照组(未接种)相比，野生株诱导48h内Nlserpin1表达量均呈显著下调趋势(P<0.05)。在野生株刺激6h后，Nlserpin1表达量最低，仅为对照的41.7％。诱导24h和48h后其表达量为对照的63.8％和76.4％，与对照组差异均达到显著水平(P<0.05)，结果如图1所示。

实施例3：

将经NcoI/BamHI消化的Nlserpin1基因片段克隆至真菌表达载体pAN52-1N中，使其位于构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子PgpdA和终止子TtrpC之间，形成pAN52-Nlserpin1。利用XbaI单酶切pET29b-Bar质粒，将切下的草丁膦(PPT)抗性基因bar表达元件PgpdA-bar-TtrpC导入同样经XbaI单酶切并去磷酸化的pAN52-Nlserpin1中，筛选获得Nlserpin1和bar基因两个表达框方向相同的克隆，即成功构建出含目的基因和抗性标记基因的双元质粒pAN52-Nlserpin1-Bar。此质粒经HindIII线性化后通过PEG介导的原生质体转化法导入金龟子绿僵菌野生株中。

在选择性平板上随机挑取8个长势良好的转化子进行培养并抽提菌丝DNA，经两轮PCR分别鉴定Nlserpin1和bar基因的存在。具体地，随机挑取8个生长和产孢良好的转化子，将其分生孢子均匀涂布于铺有玻璃纸的SDAY平板上，在25℃下培养3天后，CATB法提取菌丝体基因组DNA进行PCR鉴定。以各转化子的基因组DNA为模板，首先用bar基因的引物，Bar-F：5'-AGAACGACGCCCGGCCGACAT-3；Bar-R：5'-CTGCCAGAAACCCACGTCATGC-3'进行PCR反应，以鉴定bar是否存在于基因组中，再以bar基因阳性的转化子基因组为模板，以Nlserpin1基因鉴定引物，iS1F：5'-TCTTCTTCTCGCCTCACAGC-3'；iS1R：5'-CGAACTTGGGAATGGACACC-3'进行PCR扩增反应，以进一步鉴定基因组中Nlserpin1基因的存在。

上述bar基因和Nlserpin1基因PCR扩增体系:cDNA模板1μL,dNTPs(10mmol/L)2μL,正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL,LaTaq酶0.25μL,ddH₂O补充至25μL；扩增反应程序为：94℃预变性5min后进入35个扩增循环，每循环依次94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，循环结束后再在72℃延伸7min。

对所获6个阳性转化子的总RNA进行反转录。具体地，用qRT-PCR法测定Nlserpin1基因的相对转录表达水平，采用TRIzol法提取上述PCR鉴定为双阳性转化子的RNA，通过

RT reagent Kit试剂盒，将其反转录为cDNA。反转录体系为：

缓冲液、1μL 50μM Oligo dT Primer、1μL 100μM Random 6mersPrimer、1μL

RT Enzyme Mix I反转录酶和2μL的总RNA，双蒸水补足至20μL。逆转录反应的程序为先37℃下反应15min，再85℃下5s失活反转录酶。qRT-PCR分析采用

Premix Ex TaqTM II试剂盒，反应在实时定量PCR仪

eprealplex(Eppendorf,Hamburg,Germany)上操作完成。RT-PCR体系为：

PremixEx TaqTM II 10μL、10μM上下游检测引物各1μL(同1.4节qS1/qS1R)、和2μl适量稀释的cDNA，并用双蒸水补足至20μL。扩增程序为：95℃预变性30s后，进入40个扩增循环(95℃变性5s，60℃退火34s)；融解曲线为：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。并以18S rRNA作为内参，其扩增引物如下：18SF：TGGTTTCTAGGACCGCCGTAA；18SR：CCTTGGCAAATGCTTTCGC。反应体系和程序同上。2^-ΔΔCt法计算不同转化子中Nlserpin1基因的相对表达量，选Nlserpin1基因转录表达水平最高的阳性转化子进一步实验。

结果显示，基因bar和Nlserpin1能在6个转化子中检测同时出，在6个阳性转化子在SDAY平板上培养4天，其菌丝中均有Nlserpin1表达，如图2所示，图2(A)显示超表达转化子T1-T8中Nlserpin1和bar基因的PCR鉴定，其中，M：100bp分子量Marker；(B)显示超表达阳性转化子中Nlserpin1基因转录表达水平；柱状图上不同小写字母表示其所示数值间差异显著(P<0.05)。其中T6转化子中Nlserpin1的转录表达量最高，将该菌株命名为MaT6，为超表达株。

实施例4：

超表达株MaT6的表型分析及毒力测定：

1.菌落生长速率测定：将野生株和超表达株的分生孢子用0.02％吐温80分别调成10⁷个/mL的孢子悬液，取200μL分别涂到PDA平板上，25℃培养3天，而后用打孔器切下直径为5mm的菌落块，将其分别接种于PDA培养基平板上，25℃下连续培养8天，每天十字交叉法测定菌落直径并拍照，菌丝生长数据如图3(A)所示，结果表明，在PDA平板上生长时，MaT6与野生株的菌落直径大小无显著差异。

2.产孢潜能测定：将野生株和超表达株的分生孢子用0.02％吐温80分别调成10⁷个/mL的孢子悬液，取200μL分别涂到PDA平板上，25℃培养7天，用打孔器取0.6mm直径的菌丝圆片，放入1mL 0.02％吐温80中，涡旋振荡混匀后，在显微镜下计数孢子浓度。产孢量数据如图3(B)所示，结果表明，在PDA平板上培养8天后，MaT6的产孢量为3.22×10⁸个/cm²，与野生株的产孢量(3.07×10⁸个/cm²)相比无显著变化。

野生株和超表达株MaT6的菌丝生长和产孢量比较分析结果如图3所示，由图3可知，Nlserpin1基因超表达不影响超表达菌株的菌丝生长和产孢进程。

3.毒力测定

将野生株和超表达株分生孢子悬液(1×10⁷个/mL)分别涂布于PDA平板上连续培养7天后，刮取分生孢子粉移入盛有20mL 0.02％吐温80溶液的三角瓶中，充分震荡使分生孢子均匀分别在溶液中。在显微镜下用血球计数板检查计算出孢子数和浓度，用0.02％吐温80溶液将其分别配置成浓度为1×10⁶、1×10⁷和1×10⁸个/mL的孢子悬液。

取事先准备好的稻苗，每杯稻苗接褐飞虱成虫40头，吸取1mL各浓度孢子液，用喷雾法处理成虫，喷雾后在杯口覆盖事先已经刺孔的塑料盖以防止试虫逃跑。每个浓度重复3次，以1mL 0.02％吐温80溶液作为对照。在25℃和14L:10D条件下饲养，逐日定时观察记录死亡率，连续观察10天，并及时将虫尸移出，置于25℃下保湿培养，根据虫尸表面长出的菌落特征确定真菌致死的显症率。实际接种剂量用平放于稻苗旁的盖玻片(20×20mm)收集孢子，棉兰染色后在显微镜下镜检孢子数，从而将沉降到褐飞虱及水稻叶片上的孢子附着量标准化为孢子数。

通过超表达菌株MaT6与野生株对褐飞虱的平行生物测定的结果表明，MaT6对褐飞虱成虫的毒力显著高于野生株。褐飞虱成虫接种MaT3和野生株分生孢子(1×10⁸个孢子/mL)后的死亡率及接种后时间呈正相关，累积死亡率随喷菌后时间的增加而递增。接种MaT6第7天引发的累积死亡率分别为74.7％，而对照菌株约为59.2％。虫尸经保湿培养后均出现典型的真菌感染致死症状。MaT6和野生株对褐飞虱成虫毒力测定数据的机率分析，拟合出可接受的的时间-死亡率模型，结果如图4所示，图4中CK为空白对照组(0.02％Tween80处理)。图4(A)为野生株(Ma456)和超表达株(MaT6)对褐飞虱毒力的时间-死亡率模拟曲线，由(A)可见MaT6对褐飞虱成虫的毒力显著上调；图4还显示了超表达株(MaT6)半致死时间LT₅₀为3.6天，较对野生株(Ma456)提前1.5天。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 抗虫基因及用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1269

<212> DNA/RNA

<213> Nilaparvata lugens

<400> 2

atgatgatac tgtggatgtg tgtagttgcg gttactctac cagttttcac caaccaacaa 60

tgtctcacca aagatgactc gaagccttca accgacccgc aagcaaggct ggctctgttc 120

agaggccaac aggagttcag cctggcaatg ctgcagacgg tgaaccacat gtacccgaac 180

cagaacatct tcttctcgcc tcacagcatc taccaggcaa tgttgttgtc ctactttgtc 240

gccgccaatc acaccgaagc ctccattaag aaggccatct tcctgcccaa gcaacaggat 300

aagttgagta ctatgcaggc ttacaggttg gagaaattct tccaaagcat gcgattggtc 360

aacggatctg acagctatga actgcgcagt gctaaccgac tatttgtctc acaacagcag 420

aaggtgaagg agtgcatgct ggagctgttc aaggacgagg tgcagcaggt ggatttcgcc 480

aagtcagcag aatcggcgcg agtgatcaac cagtgggtgg ccaaccagac caggaacaac 540

attaaggagt tgatacctga aggcagtatt agcgagacaa cacaactcat actgacaaat 600

gcggcctact tcaagggact atggaagtca aagttcttga aatccaactc ccgaaaggag 660

atcttctaca ttaacagttc taaaaacgcg tttgttacca tgatgagaca gaagggaaca 720

ttcaatcatg ccgtatcaga acaactagga gcccacatcc tggagctgcc ttacaaaggt 780

gatgacgtca gcatgtttgt cctacttcct ccctttgcca gtccgtcagg tatcaccaac 840

atcctaaagc ggttgaccct gaagactctg cacgagatca tagacgaaga cagcatgatt 900

ccgcgtgccg tcgaggtgtc cattcccaag ttcgaggttg aaaagtctat cgagttggtc 960

cagatcctga cctcgttcgg catcgacatg ttcgaagaca ctgccgacct gtcgtcgctg 1020

accgatgcga ccggcccgcg tgtgcgattc accgacgccg tgcacaaggc gcgactccag 1080

gtggacgagg acggcacaac cgccgcagct gcgactgccg ttctgtcgtt caggtcgtca 1140

cgaccgctcg atccggcaca gttcatttgc aaccatccgt ttgtctacat catctacgac 1200

aaggtcgcac aggttgtgct gttcaccggg gtgtatagca cgcctgaagg cggtaatgaa 1260

gctcagtaa 1269

<210> 2

<211> 422

<212> PRT

<213> Nilaparvata lugens

<400> 2

Met Met Ile Leu Trp Met Cys Val Val Ala Val Thr Leu Pro Val Phe

1 5 10 15

Thr Asn Gln Gln Cys Leu Thr Lys Asp Asp Ser Lys Pro Ser Thr Asp

20 25 30

Pro Gln Ala Arg Leu Ala Leu Phe Arg Gly Gln Gln Glu Phe Ser Leu

35 40 45

Ala Met Leu Gln Thr Val Asn His Met Tyr Pro Asn Gln Asn Ile Phe

50 55 60

Phe Ser Pro His Ser Ile Tyr Gln Ala Met Leu Leu Ser Tyr Phe Val

65 70 75 80

Ala Ala Asn His Thr Glu Ala Ser Ile Lys Lys Ala Ile Phe Leu Pro

85 90 95

Lys Gln Gln Asp Lys Leu Ser Thr Met Gln Ala Tyr Arg Leu Glu Lys

100 105 110

Phe Phe Gln Ser Met Arg Leu Val Asn Gly Ser Asp Ser Tyr Glu Leu

115 120 125

Arg Ser Ala Asn Arg Leu Phe Val Ser Gln Gln Gln Lys Val Lys Glu

130 135 140

Cys Met Leu Glu Leu Phe Lys Asp Glu Val Gln Gln Val Asp Phe Ala

145 150 155 160

Lys Ser Ala Glu Ser Ala Arg Val Ile Asn Gln Trp Val Ala Asn Gln

165 170 175

Thr Arg Asn Asn Ile Lys Glu Leu Ile Pro Glu Gly Ser Ile Ser Glu

180 185 190

Thr Thr Gln Leu Ile Leu Thr Asn Ala Ala Tyr Phe Lys Gly Leu Trp

195 200 205

Lys Ser Lys Phe Leu Lys Ser Asn Ser Arg Lys Glu Ile Phe Tyr Ile

210 215 220

Asn Ser Ser Lys Asn Ala Phe Val Thr Met Met Arg Gln Lys Gly Thr

225 230 235 240

Phe Asn His Ala Val Ser Glu Gln Leu Gly Ala His Ile Leu Glu Leu

245 250 255

Pro Tyr Lys Gly Asp Asp Val Ser Met Phe Val Leu Leu Pro Pro Phe

260 265 270

Ala Ser Pro Ser Gly Ile Thr Asn Ile Leu Lys Arg Leu Thr Leu Lys

275 280 285

Thr Leu His Glu Ile Ile Asp Glu Asp Ser Met Ile Pro Arg Ala Val

290 295 300

Glu Val Ser Ile Pro Lys Phe Glu Val Glu Lys Ser Ile Glu Leu Val

305 310 315 320

Gln Ile Leu Thr Ser Phe Gly Ile Asp Met Phe Glu Asp Thr Ala Asp

325 330 335

Leu Ser Ser Leu Thr Asp Ala Thr Gly Pro Arg Val Arg Phe Thr Asp

340 345 350

Ala Val His Lys Ala Arg Leu Gln Val Asp Glu Asp Gly Thr Thr Ala

355 360 365

Ala Ala Ala Thr Ala Val Leu Ser Phe Arg Ser Ser Arg Pro Leu Asp

370 375 380

Pro Ala Gln Phe Ile Cys Asn His Pro Phe Val Tyr Ile Ile Tyr Asp

385 390 395 400

Lys Val Ala Gln Val Val Leu Phe Thr Gly Val Tyr Ser Thr Pro Glu

405 410 415

Gly Gly Asn Glu Ala Gln

420

Claims

1.一种抗虫基因，其特征在于，所述抗虫基因为Nlserpin1基因，所述抗虫基因能够显著提升金龟子绿僵菌对褐飞虱的毒力，所述Nlserpin1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Nlserpin1基因核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种提高杀虫真菌毒力的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述Nlserpin1基因的表达盒导入金龟子绿僵菌基因组中使其有效表达。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，将Nlserpin1基因片段克隆至真菌表达载体pAN52-1N中，使其位于构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子PgpdA和终止子TtrpC之间，获得pAN52-Nlserpin1质粒；利用XbaI单酶切pET29b-Bar质粒，将切下的草丁膦抗性基因bar表达元件PgpdA-bar-TtrpC导入同样经XbaI单酶切并去磷酸化的pAN52-Nlserpin1中，筛选获得Nlserpin1和bar基因两个表达框方向相同的双元质粒，所述双元质粒经HindIII线性化后通过PEG介导的原生质体转化法导入金龟子绿僵菌野生株中。