CN106220719A - 一种青蒿bHLH类转录因子编码序列及克隆方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种青蒿AaMYC3基因编码序列的克隆及其应用。具体包括基因AaMYC3的克隆、含有该基因的植物表达载体的构建、该基因对青蒿素生物合成途径特有基因启动子的激活作用。上述青蒿AaMYC3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了AaMYC3基因具有能够激活青蒿素生物合成途径特异的ADS，CYP71AV1，DBR2和ALDH1这4个基因启动子表达的特性。本发明中AaMYC3基因可通过RNAi干扰，antisense抑制等方法应用于青蒿品质改良，可提高青蒿中青蒿素的含量。

Description

一种青蒿bHLH类转录因子编码序列及克隆方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种青蒿bHLH类转录因子编码序列AaMYC3及其应用。
背景技术
植物中新陈代谢分为初生代谢和次生代谢，初生代谢产物(如糖类、脂类和核酸)存在于所有的植物中，是植物维持细胞生命活动所必需的，而植物次生代谢产物是指植物中一大类非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其合成与分布具有种属、组织器官和生产发育特异性。例如，治疗疟疾的特效药物成分青蒿素只在植物青蒿(Artemisiaannua L.)植株表面的分泌型腺毛中合成并储存。近年来，随着对中草药成分研究的逐步深入，发现许多中草药的有效成分均为植物次生代谢产物，例如丹参中的丹参酮，长春花中的长春生物碱等。
大部分植物次生代谢产物其在天然植物中的含量极低，而使用化学合成的方法，工艺流程复杂、成本太高，并且还有许多植物次生代谢产物的生物合成途径不清晰，无法实现化学全合成。因此，研究人员开始探索其他的提高植物次生代谢产物含量的方法。考虑到植物次生代谢产物合成途径复杂，参与反应的基因数量多，且受到发育，环境等多种因素的影响，对途径上单个基因进行修饰有时难以奏效。而转录因子通常可以调控某个植物次生代谢产物生物合成途径上的多个酶基因的表达，从而调控该次生代谢产物的生物合成量。
目前，在青蒿中已有报道发现，转录因子可以有效调控青蒿素合成途径特有基因的表达，从而调控青蒿素的生物合成，例如AaORA1转录因子，bHLH1转录因子，AaMYC2转录因子等等。因此，克隆能调控青蒿素生物合成途径特有基因表达的转录因子，对于改良并提高青蒿中青蒿素的含量具有重要的意义。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了以下技术方案，以提高青蒿中青蒿素的含量：
本发明提供了一种青蒿bHLH类转录因子编码序列，该编码序列记为AaMYC3，AaMYC3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种青蒿bHLH类转录因子编码序列，AaMYC3编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。其构建方法包括以下步骤：
步骤1、根据SEQ ID NO.1序列设计扩增AaMYC3基因开放阅读框序列，扩增引物如下：
正向引物P3：5’-CACCATGGATGATGATTTCCTAATTC-3’
反向引物P4：5’-CTGATTTAATCTAGCTAGAAGATG-3’；
步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接pENTR-TOPO载体；
步骤3、将连接入AaMYC3基因的pENTR-TOPO载体与pEearlygate104植物表达载体通过LR反应的方式构建含有目的基因的pEearlygate104-AaMYC3植物表达载体。
本发明还提供了一种重组表达转化体，该重组表达转化体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，上述重组表达转化体的宿主菌株为农杆菌。
本发明还提供了上述青蒿bHLH类转录因子编码序列AaMYC3在提高青蒿素含量中的应用。
本发明还提供了上述青蒿bHLH类转录因子编码序列AaMYC3的克隆方法，该克隆方法包括以下步骤：
步骤1、总RNA的提取与纯化，采用各种通用的植物总RNA提取试剂盒提取并纯化获得青蒿叶片总RNA；
步骤2、用反转录酶将青蒿叶片总RNA反转成cDNA；
步骤3、以上述cDNA为模板，通过设计基因特异引物，采用PCR的方法扩增，获得PCR产物，基因特异引物为：
正向引物P1：5’-AGGTTTTCTCACTCGTTTATTTC-3’
反向引物P2：5’-TAGAGATAAAGATCGTTGAGATG-3；
步骤4、PCR产物回收纯化测序，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种快速检测AaMYC3编码的氨基酸序列的生物学功能的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1、根据SEQ ID NO.1序列设计扩增AaMYC3基因开放阅读框序列，扩增引物如下：
正向引物P3：5’-CACCATGGATGATGATTTCCTAATTC-3’
反向引物P4：5’-CTGATTTAATCTAGCTAGAAGATG-3’；
步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接pENTR-TOPO载体；
步骤3、将连接入AaMYC3基因的pENTR-TOPO载体与pEearlygate104植物表达载体通过LR反应的方式构建含有目的基因的pEearlygate104-AaMYC3植物表达载体；
步骤4、将青蒿中青蒿素合成途径特有ADS基因的启动子ProADS连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProADS；
步骤5、将青蒿中青蒿素合成途径特有CYP71AV1基因的启动子ProCYP71AV1连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AV1；
步骤6、将青蒿中青蒿素合成途径特有DBR2基因的启动子ProDBR2连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2；
步骤7、将青蒿中青蒿素合成途径特有ALDH1基因的启动子ProALDH1连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProALDH1；
步骤8、将pEearlygate104-AaMYC3植物表达载体和植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AV1、pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1分别转化入农杆菌中，获得包含目的载体的农杆菌工程菌株；
步骤9、将包含pEearlygate104-AaMYC3植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合后，通过注射侵染的方式注射到生长5周的烟草叶片中；
步骤10、取注射后培养2天的烟草叶片，用液氮速冻后研磨成粉末；
步骤11、采用Promega-Dual-Luciferase检测试剂盒检测荧光强度，确定AaMYC3基因与青蒿素合成途径特有基因启动子的激活作用。
进一步地，上述步骤8中，宿主菌为农杆菌GV3101菌株；上述步骤9中，包含pEearlygate104-AaMYC3植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合比例为按3：1浓度混合。
在本发明中，克隆AaMYC3基因可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在本发明中构建AaMYC3植物表达载体，也可选用本领域已知的各种载体，如市售的pCAMBIA系列载体；在本发明中构建启动子双荧光素报告载体，也可选用本领域已知的各种其他载体，如市售的Promega公司的载体；本发明中所涉及的农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，该菌株可以从市场上公开购买。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1示出了在一个较优实施例中，烟草瞬时转化AaMYC3基因显著抑制ADS,CYP71AV1，DBR2和ALDH1这4个基因启动子的表达活性。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、实施例1青蒿AaMYC3基因的克隆
1、青蒿在人工气候室培养，生长条件为光周期18h/6h(光亮/黑暗)，25℃；
2、青蒿叶片总RNA的提取。取100毫克左右幼嫩的青蒿叶片组织材，置于液氮中充分研磨至粉末状，按照植物总RNA提取试剂盒(天根生化，北京)说明书的方法，提取叶片总RNA。将获得的植物总RNA取3μL进行琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量，然后在NanoDrop(Thermo Fisher，美国)分光光度计上测定总RNA的浓度。
3、基因的克隆。以提取的总RNA为模板(500ng)，按照反转录试剂盒PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大连)说明书的方法，反转录生产第一链cDNA；通过设计的特异引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，特异引物序列如下：
正向引物P1：5’-AGGTTTTCTCACTCGTTTATTTC-3’
反向引物P2：5’-TAGAGATAAAGATCGTTGAGATG-3
PCR反应总体积为50μL，反应体系为：5μL 10×KOD缓冲液,5μL dNTPs,4μL MgSO4，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL cDNA模板，1μL KOD酶，ddH2O补齐至50μL。
PCR扩增条件，预变性95℃3min，35个循环：95℃，30sec；54℃，30sec；68℃，100sec，最后68℃延伸5min。
将PCR产物经回收纯化后，连接平末端载体pLB(天根生化有限公司产品)并测序，获得pLB-AaMYC3质粒载体。
通过上述步骤，获得了青蒿中AaMYC3基因的序列如SEQ ID NO.1所示，并推导出其蛋白编码序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2、包含AaMYC3基因的植物表达载体的构建
1、中间载体pENTR-TOPO-AaMYC3的构建。
根据SEQ ID NO.1序列信息设计扩增AaMYC3基因开放阅读框序列，扩增引物如下：
正向引物P3：5’-CACCATGGATGATGATTTCCTAATTC-3’
反向引物P4：5’-CTGATTTAATCTAGCTAGAAGATG-3’
pENTR/D-TOPO载体购置于Invitrogen公司，为该公司Gateway克隆技术的入门载体，按照该产品说明书的要求，在正向引物ATG碱基前添加CACC四个碱基。以pLB-AaMYC3质粒为模板，用平末端高保真酶KOD进行PCR扩增，PCR产物回收纯化后通过Gateway克隆技术的方法连接到pENTR-TOPO载体，具体方法按照Invitrogen公司pENTR/D–TOPO克隆试剂盒说明书进行。
2、包含目的基因的植物表达载体构建。按照Invitrogen公司LR Clonase IIEnzyme试剂盒将将中间载体pENTR-TOPO-AaMYC3与pEearlygate104植物表达载体进行LR反应，反应体系按试剂盒说明书配制，放置于25℃金属浴反应3小时后转化大肠杆菌DH5α感受态，进行阳性克隆PCR验证，最终获得包含有目的基因的pEearlygate104-AaMYC3植物表达载体。
实施例3.青蒿素合成途径特异基因启动子双荧光素报告载体的构建
1、PCR扩增青蒿素合成途径特异基因的启动子。根据NCBI数据库中青蒿ADS基因的启动子(GenBank:DQ448297.1)序列信息，设计ADS基因启动子扩增特异引物，正反特异引物分别含有Kpn I和Pst I酶切位点，引物序列如下：
ProADS F 5’-ggtaccACCGGGGACCTCTAGAGATC-3’,
ProADS R 5’-ctgcagGATTTTACAAACTTTGAA-3’。
同样的，根据NCBI数据库中青蒿CYP71AV1基因的启动子(GenBank:FJ870128.1)序列信息，设计分别含有Kpn I和Pst I酶切位点的CYP71AV1启动子特异引物，引物序列如下：
ProCYP F 5’-ggtaccATGGGTCAATTTCGGGTTG-3’,
ProCYP R 5’-ctgcagTGCTTTTAGTATACTCTTC-3’；
根据NCBI数据库中青蒿DBR2基因的启动子(GenBank:KC118524.1)序列信息，设计分别含有Kpn I和Pst I酶切位点的DBR2启动子特异引物，引物序列如下：
ProDBR2F 5’-ggtaccAAGATGAGATAGGGAACTAAC-3’,
ProDBR2R 5’-ctgcagTATTGAGTTTGATGTTGACC-3’；
根据NCBI数据库中青蒿ALDH1基因的启动子(GenBank:KC118522.1)序列信息，设计分别含有Kpn I和Pst I酶切位点的ALDH1启动子特异引物，引物序列如下：
ProALDH1F 5’-ggtaccATGAACCATTAGAAGGGAAGG-3’,
ProALDH1R 5’-ctgcagCTTTGTTTTTTATGAAA-3’；
以青蒿基因组DNA为模板，PCR扩增上述4个启动子片段，回收纯化。
2.启动子PCR产物连接入双荧光素报告载体。将上述PCR产物用Kpn I和Pst I双酶切，回收酶切片段，将4个酶切回收后的片段连入用Kpn I和Pst I双酶切后回收的pGreenII0800-LUC载体片段，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AV1、pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1。
实施例4.烟草瞬时转化检测基因与启动子激活作用
1、农杆菌工程菌株的获得，将pEearlygate104空载体、pEearlygate104-AaMYC3表达载体和4个启动子双荧光检测报告载体通过冻融法转化入根癌农杆菌GV3101菌株中，获得包含有空载体的农杆菌工程菌株、包含有AaMYC3基因的农杆菌工程菌株和4个包含有启动子的农杆菌工程菌株。
2、农杆菌工程菌株的扩大培养与处理。将上述6个农杆菌工程菌株在包含50mg/L利福平+20mg/L庆大霉素+50mg/L卡那霉素三种抗生素的LB培养液中扩大培养(5mL)，28℃，220转/分钟，培养过夜。第二天测定菌液浓度，当农杆菌菌液浓度达到OD600值在2OD～2.5OD左右后停止培养。离心，收集农杆菌，然后用10mM浓度MgCl2溶液重悬浮菌体，调整重悬浮菌液OD值为0.6。向重悬浮菌液中添加乙酰丁香酮，其浓度为200mM。将上述重悬浮农杆菌菌液静置3小时。
3、注射侵染法瞬时转化烟草。将上述静置处理后的包含有空载体的农杆菌工程菌株与4个包含有启动子的农杆菌工程菌株分别按3:1浓度比例混合，作为对照组；将包含有目的基因AaMYC3表达载体的农杆菌工程菌株与4个包含有启动子的农杆菌工程菌株也分别按3:1浓度比例混合，作为实验组。通过1ml的注射器，将混合后的农杆菌菌夜注射到生长5周左右的烟草叶片中，黑暗培养1天然后转到光下培养。
4、Dual-Luciferase检测。用直径为1.0cm的圆形打孔器，取注射后培养2天的烟草叶片，用液氮速冻后研磨成粉末；采用Promega Dual-Luciferase检测试剂盒检测荧光强度,按Promega公司说明书的方法操作。
本发明中AaMYC3基因能够显著抑制青蒿素生物合成途径中ADS，CYP71AV12，DBR2和ALDH1这4个重要的结构基因启动子的表达，与对照组相比，AaMYC3能显著抑制DBR2启动子表达活性至对照组的13.3％左右，能够显著抑制ALDH1启动子表达活性至对照组的27％左右，同时对ADS和CYP71AV1这2个启动子的表达也有一定的抑制能力。通过本发明为进一步利用该基因在青蒿中RNAi抑制表达进而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的实验证据。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种青蒿bHLH类转录因子编码序列，其特征在于，所述编码序列记为AaMYC3，所述AaMYC3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种青蒿bHLH类转录因子编码序列，其特征在于，所述AaMYC3编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求1或2所述的青蒿bHLH类转录因子编码序列AaMYC3在提高青蒿素含量中的应用。
7.根据权利要求1所述的青蒿bHLH类转录因子编码序列AaMYC3的克隆方法，其特征在于，所述克隆方法包括以下步骤：
步骤1、总RNA的提取与纯化，采用各种通用的植物总RNA提取试剂盒提取并纯化获得青蒿叶片总RNA；
步骤2、用反转录酶将所述青蒿叶片总RNA反转成cDNA；
步骤3、以所述cDNA为模板，通过设计基因特异引物，采用PCR的方法扩增，获得PCR产物，所述基因特异引物为：
正向引物P1：5’-AGGTTTTCTCACTCGTTTATTTC-3’
反向引物P2：5’-TAGAGATAAAGATCGTTGAGATG-3；
步骤4、PCR产物回收纯化测序，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求4所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
步骤1、根据SEQ ID NO.1序列设计扩增AaMYC3基因开放阅读框序列，扩增引物如下：
正向引物P3：5’-CACCATGGATGATGATTTCCTAATTC-3’
反向引物P4：5’-CTGATTTAATCTAGCTAGAAGATG-3’；
步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接pENTR-TOPO载体；
步骤3、将连接入AaMYC3基因的pENTR-TOPO载体与pEearlygate104植物表达载体通过LR反应的方式构建含有目的基因的pEearlygate104-AaMYC3植物表达载体。
9.一种快速检测根据权利要求2所述的AaMYC3编码的氨基酸序列的生物学功能的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、根据SEQ ID NO.1序列设计扩增AaMYC3基因开放阅读框序列，扩增引物如下：
正向引物P3：5’-CACCATGGATGATGATTTCCTAATTC-3’
反向引物P4：5’-CTGATTTAATCTAGCTAGAAGATG-3’；
步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接pENTR-TOPO载体；
步骤3、将连接入AaMYC3基因的pENTR-TOPO载体与pEearlygate104植物表达载体通过LR反应的方式构建含有目的基因的pEearlygate104-AaMYC3植物表达载体；
步骤4、将青蒿中青蒿素合成途径特有ADS基因的启动子ProADS连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProADS；
步骤5、将青蒿中青蒿素合成途径特有CYP71AV1基因的启动子ProCYP71AV1连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AV1；
步骤6、将青蒿中青蒿素合成途径特有DBR2基因的启动子ProDBR2连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2；
步骤7、将青蒿中青蒿素合成途径特有ALDH1基因的启动子ProALDH1连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProALDH1；
步骤8、将所述pEearlygate104-AaMYC3植物表达载体和所述植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AV1、pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1分别转化入农杆菌中，获得包含目的载体的农杆菌工程菌株；
步骤9、将包含所述pEearlygate104-AaMYC3植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含所述植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合后，通过注射侵染的方式注射到生长5周的烟草叶片中；
步骤10、取注射后培养2天的所述烟草叶片，用液氮速冻后研磨成粉末；
步骤11、采用Promega-Dual-Luciferase检测试剂盒检测荧光强度，确定AaMYC3基因与青蒿素合成途径特有基因启动子的激活作用。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤8中，宿主菌为农杆菌GV3101菌株；所述步骤9中，包含所述pEearlygate104-AaMYC3植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含所述植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合比例为按3：1浓度混合。
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