CN117568357A - 梨转录因子PbrWRKY42与PbrSOT13基因启动子互作在调控果实山梨醇积累中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了梨转录因子PbrWRKY42与PbrSOT13基因启动子互作在调控果实山梨醇积累中的应用。本发明首次揭示了调控梨PbrSOT13基因表达的转录因子PbrWRKY42。本发明阐明了梨PbrWRKY42与PbrSOT13基因启动子中的W‑box元件(转录起始位点ATG上游‑1891到‑1885)互作在调控果实山梨醇积累的分子机制，为实现梨山梨醇代谢精准调控及果实品质的遗传改良提供理论和实践基础。挖掘出参与梨果实山梨醇转运的SOT基因家族成员及其上游调控因子。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种梨转录因子PbrWRKY42通过调控山梨醇代谢关键基因PbrSOT13的表达进而促进果实中山梨醇的积累。
背景技术
梨是蔷薇科梨属植物。果实富含营养物质，深受消费者的青睐。山梨醇是梨果实中重要的可溶性糖，在其风味品质的形成过程中起着重要作用。
梨果实中山梨醇含量与其自身的合成、分解及其区室化分布密切相关。对于梨和苹果等蔷薇科果树来说，山梨醇是主要的光合作用产物。80％以上的山梨醇在叶片中合成后会通过质外体途径运输至果实中。山梨醇转运蛋白(sorbitol transporters，SOT)是参与这一过程的关键蛋白。前人研究发现，苹果MdSOT6介导果实生长发育过程中山梨醇的积累。
转录因子(Transcription factor，TF)可与下游结构基因启动之中的顺势作用元件结合进而调控其的表达量，在植物的生长发育和逆境胁迫中发挥重要作用。常见的转录因子主要包括WRKYs、bZIPs和MYBs等家族基因。PuWRKY31可与PuSWEET15基因启动子中的W-box元件结合，激活PuSWEET15的转录，从而促进‘南果’梨中可溶性糖的积累。转录因子PpybZIP43可与PpySPS3基因启动子中的G-box元件特异性结合来调控其表达，促进‘丰水’梨果实中蔗糖的合成。然而，到目前为止，我们对参与梨山梨醇转运的SOT基因家族成员及其调控机制的了解还很少。
发明内容
本发明的目的在于提供PbrSOT13基因或与PbrSOT13基因相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中山梨醇积累中的应用。
本发明的另一目的在于提供WRKY家族转录因子PbrWRKY42或与转录因子PbrWRKY42相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中山梨醇积累中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种调控蔷薇科果树的果实中山梨醇积累的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供PbrSOT13基因或与PbrSOT13基因相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中山梨醇积累中的应用，所述PbrSOT13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步的，与PbrSOT13基因相关的生物材料为(1)～(8)中的至少一种：
(1)所述PbrSOT13基因编码的蛋白；
(2)含有所述PbrSOT13基因的表达盒；
(3)含有所述PbrSOT13基因的重组载体；
(4)含有(2)所述表达盒的重组载体；
(5)含有所述PbrSOT13基因的重组微生物；
(6)含有(2)所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)所述重组载体的重组微生物；
(8)含有(4)所述重组载体的重组微生物。
更进一步优选的，与PbrSOT13基因相关的生物材料优选为所述PbrSOT13基因编码的蛋白，或包含所述PbrSOT13基因表达盒、重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
更进一步优选的，所述PbrSOT13基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
具体的，上述的应用中，过表达或沉默所述的PbrSOT13基因提高或降低果实中山梨醇的含量。
本发明还提供转录因子PbrWRKY42或与转录因子PbrWRKY42相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中山梨醇积累中的应用，所述转录因子PbrWRKY42的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
进一步的，与转录因子PbrWRKY42相关的生物材料为以下(1)～(8)中的至少一种：
(1)编码所述转录因子PbrWRKY42的基因；
(2)含有(1)所述基因的表达盒；
(3)含有(1)所述基因的重组载体；
(4)含有(2)所述表达盒的重组载体；
(5)含有(1)所述基因的重组微生物；
(6)含有(2)所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)所述重组载体的重组微生物；
(8)含有(4)所述重组载体的重组微生物。
更进一步优选的，所述与转录因子PbrWRKY42相关的生物材料优选为编码所述转录因子PbrWRKY42的基因，或包含所述转录因子PbrWRKY42的表达盒、重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
更进一步优选的，(1)中编码所述转录因子PbrWRKY42的基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。
具体的，上述的应用中，所述的转录因子PbrWRKY42通过调控上述的PbrSOT13基因的表达量，以调控果实中山梨醇的积累。更具体的，过表达或沉默所述的转录因子PbrWRKY42能够提高或抑制所述PbrSOT13基因的表达量，进一步提高或降低果实中山梨醇的含量。
更具体的，所述的转录因子PbrWRKY42通过与所述PbrSOT13基因启动子进行互作调控上述的PbrSOT13基因的表达量，以调控果实中山梨醇的积累，所述的PbrSOT13基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。研究表明，转录因子PbrWRKY42特异地结合于PbrSOT13基因上游启动子中的W-box元件(转录起始位点ATG上游-1891到-1885)，促进PbrSOT13基因的转录，进而促进梨果实中山梨醇的积累。
本发明还提供一种调控蔷薇科果树的果实中山梨醇积累的方法，过表达转录因子PbrWRKY42的编码基因或/和PbrSOT13基因提高果实中山梨醇的含量；所述转录因子PbrWRKY42的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述的PbrSOT13基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本发明的具体实施方式中，所述的蔷薇科果树为梨。
本发明具体实施方式的研究过程中，以套袋和不套袋‘鸭梨’果实为实验材料，分析生长发育过程中可溶性糖含量。研究发现，所有四种可溶性糖(果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇)随着果实的膨大不断积累。套袋抑制了‘鸭梨’果实中可溶性糖的积累。
基于转录组注释鉴定出所有的PbrSOTs基因，通过分析套袋和不套袋‘鸭梨’果实生长发育过程中PbrSOTs基因表达谱(不套袋的表达量大于套袋的)及其与山梨醇含量的相关性(相关性系数设为>0.6)，筛选出可能调控梨果实山梨醇积累的家族成员PbrSOT13。
构建重组质粒pBI221-PbrSOT13-GFP，转化农杆菌GV3101，和细胞膜marker(pBI221-OsMCA1-mcherry)共同侵染水稻原生质体，利用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光，发现PbrSOT13位于细胞膜上。
构建pCAMBIA1300-过表达载体和pTRV2-PbrSOT13沉默载体，转化农杆菌GV3101，收集阳性菌株，注射至生长在树上的‘鸭梨’果实中。
利用qPT-PCR检测技术发现，瞬时过表达PbrSOT13基因提高了果实中PbrSOT13表达量，而瞬时沉默PbrSOT13基因则抑制了该基因的表达量。
利用超高效液相色谱法(UPLC)检测发现，瞬时过表达PbrSOT13基因提高了果实中山梨醇的含量，而瞬时沉默PbrSOT13基因则抑制了山梨醇的积累。
克隆PbrSOT13基因启动子，提交给PlantCARE数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，预测其中的顺式调控元件。研究发现，PbrSOT13基因启动子有2个W-box元件、3个G-box元件和5个MYB结合位点，说明其可能受到PbrWRKYs、PbrbZIPs和PbrMYBs转录因子的调控。结合相关转录因子在套袋和不套袋‘鸭梨’果实生长发育期间表达量的变化趋势(不套袋的表达量大于套袋的)及其与PbrSOT13基因表达量的相关性(相关性系数设为>0.8)，筛选得到可能调控PbrSOT13基因表达的转录因子PbrWRKY42。
构建重组质粒pSAK277-PbrWRKY42和pGreenII 0800-PbrSOT13pro-LUC，转入农杆菌GV3101，共同侵染烟草叶片，检测到共转烟草叶片的Luc/Ren比值显著高于对照组(pSAK277空载和pGreenII 0800-PbrSOT113pro-LUC共转烟草叶片)。
构建猎物载体PbrWRKY42-AD及诱饵载体(PbrSOT13pro(-1891)-(-1885)-pAbAi或者PbrSOT13pro(-813)-(-807)-pAbAi)，利用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid LibraryScreening System(Weidi,Shanghai,China)检测到PbrWRKY42可以与PbrSOT13基因启动子中的W-box元件结合(W-box(-1891)-(-1885))。
构建重组质粒pBI221-PbrWRKY42-GFP，转化农杆菌GV3101，侵染烟草叶片后采用DAPI染色，利用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光，发现PbrWRKY42位于细胞核中。
构建pCAMBIA1300-PbrWRKY42过表达载体和pTRV2-PbrWRKY42沉默表达载体，转化农杆菌GV3101，收集阳性菌株，注射至生长在树上的梨果实中。
利用qPT-PCR检测技术发现，瞬时过表达PbrWRKY42基因提高了梨果中PbrWRKY42和PbrSOT13基因表达量，而瞬时沉默PbrWRKY42基因则抑制了PbrWRKY42和PbrSOT13基因的表达量。
利用超高效液相色谱法(UPLC)检测发现，瞬时过表达PbrWRKY42基因提高了果实中山梨醇的含量，而瞬时沉默PbrWRKY42基因则抑制了山梨醇的积累。
研究表明，WRKY家族转录因子PbrWRKY42通过与PbrSOT13基因启动子区域中的W-box元件(转录起始位点ATG上游-1891到-1885)结合，调控PbrSOT13基因的转录表达。本发明通过转录组、亚细胞定位、双荧光素酶实验、酵母单杂(Y1H)、在梨果实中瞬时过表达相关基因等技术，阐明梨PbrWRKY42正调控PbrSOT13基因转录进而影响果实山梨醇积累的分子机制，为实现梨山梨醇代谢精准调控及果实品质的遗传改良提供理论和实践基础。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、首次揭示了调控梨PbrSOT13基因表达的转录因子PbrWRKY42。
2、本发明阐明了梨PbrWRKY42与PbrSOT13基因启动子中的W-box元件(转录起始位点ATG上游-1891到-1885)互作在调控果实山梨醇积累的分子机制，为实现梨山梨醇代谢精准调控及果实品质的遗传改良提供理论和实践基础。
3、本发明挖掘出参与梨果实山梨醇转运的SOT基因家族成员及其上游调控因子。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1套袋和不套袋‘鸭梨’生长发育过程中果皮和果肉中可溶性糖(葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨醇和总糖)含量的动态变化。颜色刻度表示归一化处理后的值(Log2(可溶性糖水平+1))，其中红色表示高水平，绿色表示低水平，黑色表示中等水平。
图2套袋和不套袋‘鸭梨’生长发育过程中果皮和果肉中PbrSOTs基因表达量的动态变化。颜色刻度表示归一化处理后的值(Log2(FPKM值+1))，其中红色表示高水平，绿色表示低水平，黑色表示中等水平。
图3PbrSOTs基因表达量与可溶性糖含量之间的相关性。其中负相关用蓝色表示，正相关用红色表示。
图4PbrSOT13定位于水稻原生质体中的细胞膜上。
图5PbrSOT13基因功能验证。(a)瞬时过表达PbrSOT13基因提高果实中PbrSOT13mRNA和山梨醇的含量。(b)瞬时沉默PbrSOT13基因抑制果实中PbrSOT13mRNAs和山梨醇的积累。数据代表三个生物重复的平均值，不同的小写字母表示样本之间的显著性(p<0.05)。
图6PbrSOT13基因启动子分析。
图7转录因子PbrWRKYs、PbrbZIPs和PbrMYBs的编码基因在‘鸭梨’果实生长发育过程中表达量变化及其与PbrSOT13基因表达量的相关性。颜色刻度表示归一化处理后的值(Log2(FPKM值+1))，其中红色表示高水平蓝色表示低水平，白色表示中等水平；此外，PbrSOT13和各转录因子间的皮尔逊相关性被可视化为线条，其中与绿线呈负相关，与红线呈正相关。
图8PbrWRKY42可与PbrSOT13基因中的W-box元件(W-box(-1891)-(-1885))结合并激活其表达。(a)双荧光素酶实验；(b)酵母单杂实验。数据代表三个生物重复的平均值，不同的小写字母表示样本之间的显著性(p<0.05)。
图9PbrWRKY42定位于烟草叶片的细胞核中。
图10PbrWRKY42基因功能验证。(a)瞬时过表达PbrWRKY42基因促进果实中PbrSOT13 mRNAs和山梨醇的积累。(b)瞬时沉默PbrWRKY42基因抑制果实中PbrSOT13 mRNAs和山梨醇的积累。数据代表三个生物重复的平均值，不同的小写字母表示样本之间的显著性(p<0.05)。
图11WRKY家族转录因子PbrWRKY42与PbrSOT13基因启动子互作在调控梨果实中山梨醇积累作用机理。
具体实施方式
以下结合具体实施方式详细说明本发明。实施例是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方式中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1挖掘PbrSOT13基因参与调控梨果实生长发育过程中山梨醇的积累：
1.样品采集
以种植于扬州市高邮果园中树龄和树势基本一致的‘鸭梨’为实验材料，于盛花后34天套袋，以处于相同位置不套袋的果实为对照。收集盛花期后15天(S1)、34天(S2)、81天(S3)、110天(S4)、145天(S5)和160天(S6)的套袋和不套袋的‘鸭梨’果实进行测定果皮和果肉中柠檬酸的含量和PbrACOs基因表达量。每个处理3个重复，每个重复200个果实。
2.可溶性糖含量测定
测定采用超高效液相色谱法(UPLC)测定有机酸含量。称取0.5g组织，研磨成粉末，转入10mL玻璃刻度管中，加入5mL超纯水，80℃水浴30min后超声提取20min。将提取液转入2mL离心管中，4℃12000rpm离心20min，收集上清液。吸取1.5mL上清液，采用0.45μm Sep-Pak水系微孔滤膜过滤，获得可溶性糖提取液。
液相色谱仪为Waters1525系统：UPLC ACQUITY BEH Amide色谱柱(1.7μm×100mm×2.1mm，87％(v/v)的乙腈和13％(v/v)的超纯水作为流动相(流速0.2mL/min)，柱温48℃，ELSD检测器，进样量2μL。根据样品峰面积和标准曲线计算蔗糖、山梨醇、果糖和葡萄糖的含量。
3.转录组分析
借助EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(RN3802，艾德莱)提取果皮和果肉组织中的RNA。在采用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，USA)和Agilent2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)鉴定样本RNA纯度、浓度和完整性后，采用VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep试剂盒构建转录组文库。而后，采用DNBSEQ-T7测序平台对构建的文库进行测序。在去除低质量reads后，获得cleanreads用于后续数据分析。使用HISAT2软件与‘砀山酥梨’基因组数据库(http://peargenome.njau.edu.cn/)进行比对，并进行基因表达量(FPKM)计算。转录组测序和分析由百迈客生物科技有限公司(北京，中国)实施。
4.参与山梨醇积累的关键PbrSOT13基因筛选
分析梨不同生长发育时期PbrSOTs基因表达谱及其与山梨醇含量的相关性(相关性系数设为>0.6)，筛选出可能调控果实山梨醇积累的基因家族成员PbrSOT13。
5.qRT-PCR验证PbrACO13基因在果实不同发育时期的相对表达量
采用植物总RNA提取试剂盒(RE-05011，成都福际生物技术有限公司)提取果皮和果肉组织中的总RNA(提取方法参考试剂盒说明书)。而后采用全式金AE301-02EasyScriptcDNA第一链合成试剂盒(AE301-02，北京全式金生物)将总RNA反转成cDNA。最后，采用PrimeScriptTMRT-PCR Kit酶试剂盒(RR014A，宝日医生物技术(北京)有限公司)检测PbrACO13基因在果实不同发育时期的相对表达量。以梨Tublin基因(PbrTub)为看家基因。PbrSOT13和PbrTub基因的引物序列见表1：
表1PbrSOT13和PbrTub基因的引物序列
实验结果：如图1所示，‘鸭梨’生长发育过程中，果皮和果肉中可溶性糖(葡萄糖、蔗糖、果糖和山梨醇)含量呈逐渐上升的趋势；套袋显著抑制了果皮和果肉中可溶性糖的积累。
如图2和3所示，根据转录组注释我们共发掘出23个梨SOT基因家族成员。其中，PbrSOT13基因可能参与调控山梨醇的积累：PbrSOT13表达量和山梨醇含量的变化趋势一致(相关性系数设为>0.6)；同时，套袋抑制了其在果皮和果肉中的表达。
实施例2PbrSOT13基因的功能验证
1.PbrSOT13基因的克隆与序列分析
以‘鸭梨’果实cDNA为模板，根据PbrSOT13基因的编码序列设计扩增引物(上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示)。以‘鸭梨’果实cDNA为模板，利用PCR反应得到扩增产物，导入pBI221-GTP质粒，转化大肠杆菌感受态细胞。测序得到如SEQ ID No.5所示的基因编码序列。PbrSOT13基因编码的蛋白质序列如SEQ ID No.6所示。
2.PbrSOT13亚细胞定位分析
选取30℃培养7-15d后的水稻幼苗茎叶，用水冲洗表面污垢，除去最外层叶鞘，切成碎段(<0.5mm)。取10g碎段，加入10mL酶解液酶解6h。用40μm滤网过滤原生质体，50g离心10min，去上清。用预冷的W5溶液10mL洗涤2次，加入500μL MMG溶液悬浮。
取200μL原生质体悬液加入20μL DNA(10μL pBI221-PbrSOT13-GTP质粒和10μLpBI221-OsMCA1-mcherry质粒)混合；加入等体积的PEG 4000溶液，混合后室温静置30min。加入1mL W5溶液，100g离心5min，除去上清。加入1000μL W5洗2次。最后加入1mLW5溶液，转移至2mL EP管中，28℃暗培养48h，用激光共聚焦显微镜观察荧光信号。
3.PbrSOT13基因的瞬时过表达
以‘鸭梨’果实cDNA为模板，使用高保真KOD-Plus-Ver.2DNA聚合酶(Toyobo，Osaka，Japan)扩增PbrSOT13基因的编码序列(上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示)，插入pCAMBIA1300载体中构建过表达载体，并转化农杆菌GV3101。经PCR鉴定后，培养至OD600为0.6-0.8时收集菌体；用侵染液(10mM MgCl2、10mM MES和200mM乙酰丁香酮)重悬菌体，诱导4h后，调节OD600＝1.0。用注射器将菌液缓慢匀速注入‘鸭梨’果肉中；置于树上5天后，从注射部位收集果肉组织。以pCAMBIA1300空载注射的果实作为对照。
4.PbrSOT13基因的瞬时沉默
以‘鸭梨’果实cDNA为模板，使用高保真KOD-Plus-Ver.2DNA聚合酶(Toyobo，Osaka，Japan)扩增约250bp左右的PbrSOT13基因编码序列(上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示)，插入pTRV2载体中，转化农杆菌GV3101。经PCR鉴定后，培养至OD600为0.6-0.8时收集菌体；用侵染液(10mM MgCl2、10mM MES和200mM乙酰丁香酮)重悬菌体，在小摇床上诱导4h后，调节OD600＝1.0。将分别携带重组pTRV2与pTRV1的菌液按1：1混合后注射到‘鸭梨’果肉中；置于树上5d后，从注射部位收集果肉组织。以pTRV2空载与pTRV1共注射的果实作为对照。
5.瞬时过表达/沉默果实中PbrSOT13基因表达量分析
利用植物总RNA提取试剂盒(RE-05011，成都福际生物技术有限公司)提取组织中的总RNA，并将提取到的总RNA反转录合成cDNA。采用PrimeScriptTM RT-PCR Kit酶试剂盒(RR014A，宝日医生物技术(北京)有限公司)检测PbrSOT13基因的表达量。以梨Tublin基因(PbrTub)为看家基因，引物序列见表1。
6.瞬时过表达/沉默果实中山梨醇含量分析
取0.5g果肉组织，充分研磨成，转入10mL玻璃刻度管中，加入5mL超纯水溶液，80℃水浴30min后超声提取20min。将提取液转入2ml离心管中，4℃12000rpm离心20min，收集上清液。注射器吸取上清液1.5ml，用0.22μm Sep-Pak水系微孔滤膜过滤，，利用液相色谱仪测定山梨醇含量。
实验结果：如图4所示，PbrSOT13定位于细胞膜。如图5所示，瞬时过表达PbrSOT13基因显著促进了果实中山梨醇的积累，而瞬时沉默则表现出相反的效果。
实施例3转录因子PbrWRKY42调控PbrSOT13基因的分子机制
1.PbrSOT13基因启动子的克隆与序列分析
根据梨基因组数据库(http://peargenome.njau.edu.cn/)中PbrSOT13基因的启动子序列设计特异性引物(PbrSOT13基因启动子的上游引物序列如SEQ ID No.11所示，PbrSOT13基因启动子的下游引物序列如SEQ ID No.12所示)。以‘鸭梨’果实DNA为模板，利用PCR反应得到扩增产物，导入pGreenII 0800-LUC质粒，转化大肠杆菌感受态细胞。测序得到如SEQ ID No.13所示的PbrSOT13基因启动子序列。
2.调控PbrSOT13基因表达的上游转录因子PbrWRKY42的筛选
将测序所得到的序列提交至PlantCARE数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，预测PbrSOT13基因启动子中顺式调控元件。从PbrSOT13基因启动子中鉴定到了2个W-box元件、3个G-box元件和5个MYB结合位点(图6)。
利用转录组数据分析‘鸭梨’果实生长发育过程中PbrWRKYs,PbrbZIPs和PbrMYBs基因的表达谱；在此基础上分析其与PbrSOT13基因表达量之间的相关性(相关性系数设为>0.8)，筛选得到可能调控PbrSOT13基因表达的上游转录因子PbrWRKY42。
3.PbrWRKY42基因的克隆与序列分析
以‘鸭梨’果实cDNA为模板，使用高保真KOD-Plus-Ver.2DNA聚合酶(Toyobo，Osaka，Japan)扩增PbrWRKY42基因的编码序列(上游引物序列如SEQ ID No.14所示，下游引物序列如SEQ ID No.15所示)。以‘鸭梨’果实cDNA为模板，利用PCR反应得到扩增产物，导入pSAK277质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，再由测序公司检测序列。
4.双荧光素酶报告实验
以‘鸭梨’果实DNA和cDNA为模板，设计特异性引物克隆PbrSOT13基因启动子和PbrWRKY42基因编码区(CDS)序列。PbrSOT13基因启动子的上游引物序列如SEQ ID No.11所示，PbrSOT13基因启动子的下游引物序列如SEQ ID No.12所示；PbrWRKY42基因编码区的上游引物序列如SEQ ID No.16所示，PbrWRKY42的下游引物序列如SEQ ID No.17所示。将PbrWRKY42基因CDS序列插入pSAK277载体，同时，将PbrSOT13基因启动子序列插入pGreenII0800-LUC质粒中。将pSAK27-WRKY42和pGreenII 0800-PbrSOT13pro-LUC重组质粒分别转化农杆菌GV3101。经PCR鉴定后，扩大培养至OD600为0.6-0.8，收集菌体。用侵染液(10mMMgCl2，10mM MES(pH＝5.7)，200μM乙酰丁香酮)重悬菌液，黑暗条件下诱导3-5h后侵染烟草叶片。侵染72h后，采集叶片，用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒(Promega，美国)和Modulus Luminometer检测仪(Promega，美国)检测萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性(具体步骤参见说明书)。以pSAK277空载与和pGreenII 0800-PbrSOT13pro-LUC重组质粒共侵染的烟草叶片作为对照。
5.酵母单杂(Yeast one-hybrid assay，Y1H)实验
以‘鸭梨’果实DNA为模板，根据PbrSOT13基因启动子中2个W-box元件的位置分别设计引物(PbrSOT13proP1基因启动子上游引物序列如SEQ ID No.18所示，PbrSOT13proP1基因启动子下游引物序列如SEQ ID No.19所示；PbrSOT13proP2基因启动子上游引物序列如SEQ ID No.20所示，PbrSOT13proP2基因启动子下游引物序列如SEQ ID No.21所示)。以‘鸭梨’果实DNA为模板，设计特异性引物克隆PbrWRKY42基因编码区(CDS)序列，PbrWRKY42基因编码区的上游引物序列如SEQ ID No.22所示，PbrWRKY42的下游引物序列如SEQ ID No.23所示。将扩增获得的两个启动子片段插入pAbAi载体中，形成两个诱饵载体，PbrSOT13pro(-1891)-(-1885)-pAbAi和PbrSOT13pro(-813)-(-807)-pAbAi。以‘鸭梨’果实cDNA为模板，将PbrWRKY42基因全长插入pGADT7中，形成猎物载体PbrWRKY42-AD。
将诱饵载体和猎物载体共转入酵母菌株中，利用Matchmaker Gold酵母单杂交文库筛选系统试剂盒(630491，Clontech)开展Y1H实验(具体步骤参见说明书)。以pGADT7与pAbAi共转化的酵母菌株作为阳性对照，以pGADT7-AD和PbrSOT13pro(-1891)-(-1885)-pAbAi(或者PbrSOT13pro(-813)-(-807)-pAbAi)共转化的酵母菌株作为阴性对照。在缺素培养基(SD/-Ura)中加入不同浓度的AbA，开展PbrSOT13pro(-1891)-(-1885)-pAbAi和PbrSOT13pro(-813)-(-807)-pAbAi的自激活检测，筛选合适的AbA浓度。
实验结果：如图6～8所示，借助于PlantCARE数据，PbrSOT13基因启动子中共鉴定到了2个W-box元件、3个G-box元件和5个MYB结合位点(图6)。利用转录组数据分析‘鸭梨’果实生长发育过程中PbrWRKYs,PbrbZIPs和PbrMYBs基因的表达谱；在此基础上分析其与PbrSOT13基因表达量之间的相关性(相关性系数设为>0.8)，筛选得到可能调控PbrSOT13基因表达的上游转录因子PbrWRKY42：PbrWRKY42和PbrSOT13基因表达量高度一致(相关性系数设为>0.8)；同时，套袋抑制了PbrWRKY42基因在果皮和果肉中的表达。
通过Y1H和双荧光素酶报告实验发现，转录因子PbrWRKY42特异地结合于PbrSOT13基因上游启动子中的W-box元件(转录起始位点ATG上游-1891到-1885)，促进PbrSOT13基因的转录。
实施例4PbrWRKY42基因的功能验证
1.PbrWRKY42编码蛋白的亚细胞定位检测
以‘鸭梨’果实cDNA为模板，扩增PbrMYB65基因的编码序列(上游引物序列如SEQID No.14所示，下游引物序列如SEQ ID No.15所示)，插入pBI221-GTP载体，转化农杆菌GV3101。经PCR鉴定后，培养至OD600为0.6-0.8时收集菌体；用侵染液(10mM MgCl2，10mM MES(pH＝5.7)，200μM乙酰丁香酮)重悬菌液，黑暗条件下诱导3-5h后侵染烟草叶片。侵染72h后，DAPI染色。用激光共聚焦显微镜观察荧光信号。以pBI221-GTP空载侵染的烟草作为对照。
2.PbrWRKY42基因的瞬时过表达
以‘鸭梨’果实cDNA为模板，使用高保真KOD-Plus-Ver.2DNA聚合酶(Toyobo，Osaka，Japan)扩增PbrWRKY42基因的编码序列(上游引物序列如SEQ ID No.24所示，下游引物序列如SEQ ID No.25所示)，插入pCAMBIA1300载体中构建过表达载体，并转化农杆菌GV3101。经PCR鉴定后，培养至OD600为0.6-0.8时收集菌体；用侵染液(10mM MgCl2、10mM MES和200mM乙酰丁香酮)重悬菌体，诱导4h后，调节OD600＝1.0。用注射器将菌液缓慢匀速注入‘鸭梨’果肉中；置于树上5天后，从注射部位收集果肉组织。以pCAMBIA1300空载注射的果实作为对照。
3.PbrWRKY42基因的瞬时沉默
以‘鸭梨’果实cDNA为模板，使用高保真KOD-Plus-Ver.2DNA聚合酶(Toyobo，Osaka，Japan)扩增约250bp左右的PbrWRKY42基因编码序列(上游引物序列如SEQ ID No.26所示，下游引物序列如SEQ ID No.27所示)，插入pTRV2载体中，转化农杆菌GV3101。经PCR鉴定后，培养至OD600为0.6-0.8时收集菌体；用侵染液(10mM MgCl2、10mM MES和200mM乙酰丁香酮)重悬菌体，在小摇床上诱导4h后，调节OD600＝1.0。将分别携带重组pTRV2与pTRV1的菌液按1：1混合后注射到‘鸭梨’果肉中；置于树上5天后，从注射部位收集果肉组织。以pTRV2空载与pTRV1共注射的果实作为对照。
4.瞬时过表达/沉默果实中PbrWRKY42和PbrSOT13基因表达量分析
利用植物总RNA提取试剂盒(RE-05011，成都福际生物技术有限公司)提取组织中的总RNA，并将提取到的总RNA反转录合成cDNA。采用PrimeScriptTM RT-PCR Kit酶试剂盒(RR014A，宝日医生物技术(北京)有限公司)检测PbrWRKY42和PbrSOT13基因的表达量。以梨Tublin基因(PbrTub)为看家基因，PbrWRKY42的上游引物序列如SEQ ID No.28所示，下游引物序列如SEQ ID No.29所示。
5.瞬时过表达/沉默果实中山梨醇含量分析
取0.5g果肉组织，充分研磨成，转入10mL玻璃刻度管中，加入5mL超纯水溶液，80℃水浴30min后超声提取20min。将提取液转入2ml离心管中，4℃12000rpm离心20min，收集上清液。注射器吸取上清液1.5mL，用0.22μm Sep-Pak水系微孔滤膜过滤，利用液相色谱仪测定山梨醇含量。
实验结果：如图9-11所示，PbrWRKY42定位于细胞膜。瞬时过表达PbrWRKY42基因显著促进了果实中山梨醇的积累，而瞬时沉默则表现出相反的效果。
综上所述，本发明基于一种WRKY家族转录因子PbrWRKY42，其可与PbrSOT13基因上游启动子中的W-box元件(转录起始位点ATG上游-1891到-1885)，调控其表达，促进梨果实中山梨醇的积累，为实现梨果实山梨醇代谢精准调控及果实品质的遗传改良提供理论和实践基础。
以上所述对本发明具体的实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。应当指出的是在不脱离本发明技术原理的前提下，任何本领域技术人员做出的改进、等同替换等，均应包含在本发明的权利要求保护范围内。
Claims (12)
1.PbrSOT13基因或与PbrSOT13基因相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中山梨醇积累中的应用，所述PbrSOT13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，与PbrSOT13基因相关的生物材料为(1)～(8)中的至少一种：
(1)所述PbrSOT13基因编码的蛋白；
(2)含有所述PbrSOT13基因的表达盒；
(3)含有所述PbrSOT13基因的重组载体；
(4)含有(2)所述表达盒的重组载体；
(5)含有所述PbrSOT13基因的重组微生物；
(6)含有(2)所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)所述重组载体的重组微生物；
(8)含有(4)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PbrSOT13基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1～3中任一所述的应用，其特征在于，过表达或沉默所述的PbrSOT13基因提高或降低果实中山梨醇的含量。
5.转录因子PbrWRKY42或与转录因子PbrWRKY42相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中山梨醇积累中的应用，所述转录因子PbrWRKY42的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，与转录因子PbrWRKY42相关的生物材料为以下(1)～(8)中的至少一种：
(1)编码所述转录因子PbrWRKY42的基因；
(2)含有(1)所述基因的表达盒；
(3)含有(1)所述基因的重组载体；
(4)含有(2)所述表达盒的重组载体；
(5)含有(1)所述基因的重组微生物；
(6)含有(2)所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)所述重组载体的重组微生物；
(8)含有(4)所述重组载体的重组微生物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，(1)中编码所述转录因子PbrWRKY42的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
8.根据权利要求5～6中任一所述的应用，其特征在于，所述的转录因子PbrWRKY42通过调控权利要求1中所述的PbrSOT13基因的表达量，以调控果实中山梨醇的积累。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的转录因子PbrWRKY42通过与所述PbrSOT13基因启动子进行互作调控权利要求1中所述的PbrSOT13基因的表达量，以调控果实中山梨醇的积累，所述的PbrSOT13基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，过表达或沉默所述的转录因子PbrWRKY42能够提高或抑制所述PbrSOT13基因的表达量，进一步提高或降低果实中山梨醇的含量。
11.一种调控蔷薇科果树的果实中山梨醇积累的方法，其特征在于，过表达转录因子PbrWRKY42的编码基因或/和PbrSOT13基因提高果实中山梨醇的含量；所述转录因子PbrWRKY42的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述的PbrSOT13基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
12.权利要求1～10中任一中所述的应用，权利要求11中所述的方法，其特征在于，所述的蔷薇科果树为梨。
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