CN116693640A - 蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p、其编码基因及应用 - Google Patents

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张琳
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Abstract

本发明公开了蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p，其调控蛹虫草生长发育。本发明还公开了蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p编码基因。本发明还公开了蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p或编码基因在调控蛹虫草菌丝生长中的用途。本发明提供CmLte1p虽不影响子实体的生长形态但提高了子实体的鲜重、数量以及生物学效率和基质利用率，同时蛹虫草的次生代谢产物类胡萝卜素得到了显著提高。因此该基因可参考作为蛹虫草内源基因的筛选标记、并以此菌株作为高产类胡萝卜素的底盘菌株，同时也为相关的基因编辑的提供参考依据。

Description

蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p、其编码基因及应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p、其编码基因及应用。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militaris)是一种珍贵食药用真菌，同时具有多种活性成分，类胡萝卜素、虫草素、虫草酸、虫草多糖等。这些活性成分具有抗肿瘤抗氧化等多重功效。目前我国已经实现蛹虫草的规模化人工栽培，并且由于蛹虫草的营养价值高、具备冬虫夏草(Cordyceps sinensis)类似的功效，逐渐成为其代替品。国内外对于蛹虫草的研究大多集中于在栽培生产的优化或者活性成分的纯化等，对于分子生物学方面研究相对较少，而蛹虫草早在2011年基因组数据已被公布发表，同时基因组里没有含有任何已知对人体有害的真菌毒素基因。因此可以相对安全地通过基因水平上的操作对蛹虫草基因的功能进行分析和基因挖掘，以此对蛹虫草的菌丝生长、子实体的产量、次生代谢产物等活性物质等进行研究。
发明内容
本发明要的目的是提供一种蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p及其编码基因，其核苷酸和氨基酸序列如如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，用于参与蛹虫草菌丝生长发育的调控。
本发明的另一个目的是提供一种CmLte1p的敲除载体，回补载体，其包含上述CmLte1p的CDNA全长核苷酸序列并明确其编码基因的功能，对蛹虫草菌丝的生长，碳源的利用以及细胞壁的完整性和抗逆性。同时，该基因的功能并没有在食用菌中有过报道，明确该激活因子以及编码基因的功能可以为食用菌的基因编辑提供技术手段。
为此，本发明提供的技术方案为：
第一方面，蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p，所述蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p的调控蛹虫草生长发育，所述蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p为如下a)或b)的蛋白质：
a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，
b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且调控蛹虫草生长发育的由a)衍生的蛋白质。
第二方面，蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p编码基因，其编码所述的蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p。
优选的是，所述的蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p编码基因，其碱基序列如SEQ IDNO：1所示。
第三方面，一种重组载体，其含有所述的蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p编码基因和与所述蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p编码基因可操作地连接的用于表达的调节序列。其敲除载体构建示意如图4所示，其回补载体构建示意图如图6所示。载体利用根癌农杆菌介导的蛹虫草转化后获得的转化子进行表型分析，具体为：菌丝的生长状况、碳源的利用、细胞壁的完整性和抗逆性以及子实体和类胡萝卜素的含量等情况。
第三方面，一种蛹虫草CmLte1p重组载体的构建方法，包括：
以蛹虫草菌株CM基因组为模板，分别以如SEQ ID NO:3和4所示的一组引物对、和以如SEQ ID NO:5和6所示的一组引物对为引物，通过PCR扩增得到CmLte1p基因的上游片段和下游片段，
以蛹虫草菌株CM基因组为模板，以如SEQ ID NO:7和8所示的一组引物对为引物，通过PCR扩增得到BlpR基因片段，
将所述CmLte1p基因的上游片段、下游片段、BlpR基因片段通过同源重组的方式连接到pCAMBIA0390上，得到蛹虫草CmLte1p敲除载体。
第五方面，一种促进蛹虫草生长和子实体发育的方法，包括：
1)将所述的蛹虫草CmLte1p敲除载体转入蛹虫草体内，获得蛹虫草敲除突变体ΔCmLte1p；
2)培养蛹虫草敲除突变体ΔCmLte1p，收获子实体。
优选的是，所述的促进蛹虫草生长和子实体发育的方法中，步骤2)中，培养中采用米饭培养基。
优选的是，所述的促进蛹虫草生长和子实体发育的方法中，步骤2)中，于温度约23℃进行12小时光照、12小时黑暗的光周期培养，培养时间约30d。
优选的是，所述的促进蛹虫草生长和子实体发育的方法，还包括：从所述子实体中提取类胡萝卜素。
第六方面，所述的蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p或所述的蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p编码基因调控蛹虫草菌丝生长中的用途。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明明确了鸟苷酸激活因子CmLte1p及其编码基因在蛹虫草中的功能，结果表明CmLte1p调控菌丝的生长情况，并且低温状态下菌丝的直径受到了抑制，但仍能维持菌落形态；同时在碳源的利用上由于阿拉伯糖和麦芽糖菌落直径受到了抑制。因此可以选择葡萄糖和甘油用于菌株的筛选且降低成本、与此同时，该基因能够维持细胞壁的完整性，CmLte1p的敲除导致了细胞壁的敏感性增加，同时抑制率也比野生型高。同时，该基因的缺失会使蛹虫草菌株类胡萝卜素含量增加，可以降低类胡萝卜素的生产成本。此外，根癌农杆菌介导的蛹虫草遗传转化体系建立也稳定高效，优化后的敲除转化子传代稳定且未出现退化现象。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例中蛹虫草的LTE1P的蛋白结构示意图。
图2为本发明实施例中蛹虫草以及与不同真核生物中CmLTE1P的系统发育树的构建示意图。
图3为本发明实施例中蛹虫草以及与不同真核生物中的CmLTE1P氨基酸序列比对图。
图4为本发明实施例中蛹虫草CmLte1p敲除载体的构建示意图。
图5为本发明实施例中蛹虫草敲除载体以及回补载体片段胶回收的电泳图。
图6为本发明实施例中蛹虫草CmLte1p回补载体的构建示意图。
图7为本发明实施例中蛹虫草敲除载体转化子验证拷贝数的相对基因表达量统计图。
图8为本发明实施例中蛹虫草野生型菌株CM、敲除突变体ΔCmLte1p以及回补突变体ΔCmLte1p-C在PDA不同温度(23℃和13℃)培养基的菌丝形态图及对应的直径数据柱状统计图。
图9为本发明实施例中蛹虫草野生型菌株CM、敲除突变体ΔCmLte1p以及回补突变体ΔCmLte1p-C的孢子产孢量数目柱状统计图和孢子萌发率的数目柱状统计图。
图10为本发明实施例中蛹虫草野生型菌株CM、敲除突变体ΔCmLte1p以及回补突变体ΔCmLte1p-C不同单一碳源的MM培养基的菌丝形态图以及对应的直径数据柱状统计图。
图11为本发明实施例中蛹虫草野生型菌株CM、敲除突变体ΔCmLte1p以及回补突变体ΔCmLte1p-C在含有细胞壁胁迫因子(刚果红和钙荧光白)的MM培养基的菌丝形态图以及对应的直径抑制率柱状统计图。
图12为本发明实施例中蛹虫草野生型菌株CM、敲除突变体ΔCmLte1p以及回补突变体ΔCmLte1p-C在含有高渗透剂(氯化钠和山梨醇)的MM培养基的菌丝形态图以及对应的直径抑制率柱状统计图。
图13为本发明实施例中蛹虫草野生型菌株CM、敲除突变体ΔCmLte1p以及回补突变体ΔCmLte1p-C的子实体生长情况图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；
本发明提供了一种蛹虫草鸟苷酸激活因子子CmLte1p及其编码基因，以蛹虫草菌株CM的基因组DNA为模板，通过在JGI数据库上找到目的基因的同源序列、设计引物、基因扩增、序列测定，获得了CmLte1p基因的全长序列，并确定了该基因的核苷酸和氨基酸序列；在SMART网站上对LTE1P的蛋白结构进行结构分析，同时进行氨基酸序列比对和系统发育树的构建；通过构建基因敲除载体pCAMBIA0390-ΔCmLte1p和回补载体pCAMBIA1300-CmLte1p，并转化至根癌农杆菌AGL1中，采用根癌农杆菌介导蛹虫草的遗传转化获得目的转化子；对获得的敲除突变体和回补突变体与野生型进行表型分析相关实验以此来鉴定该基因的功能。
下面举例对本发明做进一步的说明：
下述实施例中的定量实验，均设置为三次重复实验，结果取平均值
下述实施例中所用菌株及培养如下：
菌株以及培养方式
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株为AGL1，LB培养基，28℃培养以及大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α为LB培养基，37℃培养，蛹虫草CM菌株由本实验室自行分离保存，23℃黑暗培养。载体pCAMBIA0390、pCAMBIA3301和pCAMBIA1300由本实验室保存。
实施例1、蛹虫草CmLte1p生物信息学分析
1、CmLte1p的核苷酸序列和氨基酸序列分析
LTE1P是酿酒酵母中一种参与有丝分裂的低温必需蛋白、它是一个低温(<15℃)基本基因，编码一个具有潜在鸟嘌呤核苷酸交换(GEF)结构域的大蛋白。lte1p是有丝分裂GTPase Tem1p的阳性调控因子，Tem1p过表达抑制了lte1的低温有丝分裂缺陷。通过序列分析，Tem1p与Vps21p(哺乳动物Rab5的酵母同源物)的相似性最高。同时LTE1p并不局限于有丝分裂，而是在整个细胞周期中表达。在蛹虫草中的JGI数据库中blast获得同源蛋白(CCM-08521)(https://mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/home)将其命名为CmLte1p，该基因虽然在多种真菌中高度保守，但在食用菌中未见其功能报道。本发明的CmLte1p基因长度为5760bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。并有一个内含子，大小为165bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1的第720-884位。CmLte1p共编码1864个氨基酸，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2、在SMART网站上对Lte1p的蛋白结构进行结构分析，结果显示：Lte1p蛋白存在一个长度为120aa的RasGEFN结构和一个长度为246aa的RasGEF结构，结构如图1所示。(http://smart.embl.de/smart/job_status.pl？jobid＝124161739189511652504541onX qWwDfQa)。同时以CmLte1p的氨基酸序列为参考序列，在NCBI中搜索不同真核生物中的同源序列并基于该同源序列利用MEGA7.0进行系统发育树的构建(图2)、利用Clustalw软件对该蛋白进行氨基酸序列比对(图3)，发现C端RasGEF结构多个关键氨基酸在不同物种中高度保守。
注：其中图3氨基酸序列比对中的缩写的对象分别为：Bb:Beauveriabassiana,Th:Trichodermaharziamum,Cs:Ophiocordycepssinensis,Fg:Fusariumgraminearum,Cp:Clavicepspurpurea,Po:Pyriculariaoryzae,Nc:Neurosporacrassa,At:Aspergillusterreus,Cm:Cordycepsmilitaris,Sc:SaccharomycesscerevisiaeS288C。
实施例2蛹虫草CmLte1p敲除载体、回补载体的构建以及根癌农杆菌介导的蛹虫草遗传转化
1、蛹虫草CmLte1p敲除载体的构建(图4)：本发明利用同源重组的原理分别从蛹虫草菌株CM基因组中以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为引物克隆CmLte1p的上游片段、以SEQID NO:5和SEQ ID NO:6为引物克隆CmLte1p的下游片段，长度分别为1363bp和1393bp。同时以pCAMBIA3301的质粒为模板以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物扩增克隆BlpR(草铵膦)基因，长度为552bp。利用无缝克隆试剂盒将CmLte1p的上游、BlpR基因(草铵膦)和CmLte1p的下游基因按顺序连接到经ApaI和EcoRI酶切的pCAMBIA0390上，将连接产物转化至大肠感受态DH5α中。经酶切以及菌落PCR验证后送去测序后获得敲除载体。引物序列如下：
UpF:CTAGGCCACCATGTTgggcccCGGGAAAAGGCAGAAAGTAT(SEQ ID NO:3)
UPR:CTGCCCGTCACCGAGATTTGAACAAGGCAGAGCAAAGGTGG(SEQ ID NO:4)
DOWN F:GGGCGTCGTTCTGGGCTCATTGATACAACAACACACCAGT(SEQ ID NO:5)
DOWN R:GGTGGACTCCTCTTAgaattcAACAAGGCAGAGCAAAGGTGG(SEQ ID NO:6)
BLPR F:CCACCTTTGCTCTGCCTTGTTCAAATCTCGGTGACGGGCAG(SEQ ID NO:7)
BLPR R:ACTGGTGTGTTGTTGTATCAATGAGCCCAGAACGACGCCC(SEQ ID NO:8)
引物序列中，小写字母表示酶切位点
PCR反应条件为：95℃3min，(95℃30s，56℃1min，72℃1min)35个循环，72℃10min。
反应体系如表1所示：
表1片段扩增的PCR体系
2蛹虫草CmLte1p回补载体的构建(图6)：
以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为引物，以蛹虫草菌株CM基因组为模板扩增含有CmLte1p基因全长以及自身的启动子区域和终止子区域(分别在前2000bp左右和后300bp左右)的DNA片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化，然后用限制性内切酶EcoRI和SbfI酶切pCAMBIA1300，利用无缝克隆技术将目的片段插入得到含有hph(潮霉素)的pCAMBIA1300上，将产物转化至将连接产物转化至大肠感受态DH5α中。经酶切以及菌落PCR验证后送去测序后获得回补载体。
引物序列如下：
CmLte1pF:CTATGACCATGATTACgaattcGGACTCTTCGGGAAAAGGCAG(SEQ ID NO:9)
CmLte1pR:TGCCAAGCTTGCATGcctgcaggTTGAGAACCGCAAGGCTGTAGCG A(SEQ ID NO:10)
引物序列中，小写字母表示酶切位点
PCR反应条件以及反应体系参考敲除载体构建方法。
3、根癌农杆菌介导的蛹虫草遗传转化：采用冻融法转化，即将敲除载体以及回补载体分别转入到农杆菌AGL1中。在含有50μg/mL卡那霉素的的LB平板上挑选新鲜培养的农杆菌单菌落，接种于5mLLB中(含卡那霉素)，置于28℃，180rpm过夜培养。次日将200-400μL培养液转移到5mL含200μmol/L AS(乙酰丁香酮)的IM(诱导培养基：Induction Medium)中，OD值约0.15，28℃培养5-6h使OD600达到0.5-0.6。将100μL培养好的农杆菌AGL1菌液和100μL稀释好的孢子悬液(浓度为106个/mL)混合均匀，然后将混合液涂布于AIM(固体IM)平板上，IM平板上铺有硝酸纤维素膜(NC)。23℃共培养72h；将膜切至小片，铺在含有600μg/mL潮霉素、400μg/mL头孢霉素、60μg/mL链霉素的选择性培养基PDA上。23℃培养至转化子出现。将在选择性培养基上长出的转化子挑取后，在含有600μg/mL潮霉素的PDA平板上再次筛选。长出的转化子接于含有10mLPDB培养基的50mL离心管中，28℃200rpm培养48h，所得的菌丝提取基因组DNA作为模板分别以SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16为引物进行PCR验证。
引物序列如下：
4、敲除突变体进一步验证(图7)：将目的转化子用TRIZOL的方法进行RNA的提取并反转录为cDNA(均参考试剂盒说明书方法进行)，cDNA为模板以SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18为内参基因的引物以SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20为BlpR的引物进行qRTPCR验证拷贝数。(0.8-1.2即为单拷贝)
引物序列如下：
程序采用ABI7500仪器两步法如表2所示进行：
表2qRTPCR的程序
实施例3蛹虫草CmLte1p对蛹虫草不同条件下生长特性的影响
1、不同温度(23℃和13℃)培养基对生长发育的影响
分别将蛹虫草的野生型菌株CM、敲除突变体ΔCmLte1p以及回补突变体ΔCmLte1p-C在PDA培养基上23℃黑暗培养一周后再用直径5mm的打孔器打取菌落最边缘的菌丝并接种至新的PDA培养基上，23℃和13℃黑暗培养25d后测量其菌落直径并观察菌丝的生长情况，由图8可以看出无论是23℃还是13℃该基因CmLte1p缺失后菌落直径小于野生型和回补菌株，之后对平板用蒸馏水进行分生孢子的清洗并用血球计数板统计孢子数，同时将孢子悬浮液统一稀释到106，滴加40μL于灭菌后的盖玻片，23℃保湿黑暗培养，于12h、14h、16h、18h、20h、22h统计孢子的萌发率。由图9可以看出CmLte1p的缺失并没有影响菌株的产孢量以及孢子萌发率。
2、不同单一碳源(葡萄糖、木聚糖、甘油、阿拉伯糖、麦芽糖)对各个菌株生长的影响
参考上述的方法分别将野生型、敲除突变体以及回补突变体接种至不同碳源(葡萄糖、木聚糖、甘油、阿拉伯糖、麦芽糖)的MM培养基上，23℃黑暗培养25d后测量其菌落直径并观察菌丝的生长情况。结果如图10所示，CmLte1p基因缺失后，与在PDA上情况基本一致，该基因Cmlte1p缺失后，对碳源的利用率明显降低，尤其是在阿拉伯糖上效果显著。由于阿拉伯糖代谢途径相对比较单一，所以有可能Cmlte1p缺失后导致在以阿拉伯糖为碳源的MM培养基比野生菌株生长缓慢更为明显。综上结果表明，该基因Cmlte1p的缺失使蛹虫草的菌丝生长受到了抑制同时降低了各个碳源的利用率，但对于温度的因素控制还不明显。
3、细胞壁的完整性分析
同样将培养好的野生型、敲除突变体以及回补突变体(即参考上述分别将蛹虫草的野生型菌株CM、敲除突变体ΔCmLte1p以及回补突变体ΔCmLte1p-C在PDA培养基上23℃黑暗培养一周后再用直径5mm的打孔器打取菌落最边缘的菌丝)接种于含有200μg/mL的荧光增白剂(Calcofluor white)和200μg/mL刚果红(Congo red)的MM平板上，于23℃黑暗培养25d后测量其菌落直径并观察菌丝的生长情况。结果图11显示，ΔCmLte1p菌株的气生菌丝的量显著减少，且菌落边缘参差不齐(野生型比较)，菌落的直径下降、生长速度受到了抑制。其中刚果红的平板条件最为明显，ΔCmlte1p与WT以及回补突变体ΔCmlte1p-C相比，对细胞壁的敏感性明显增加并且抑制率显著上升。其中刚果红的平板条件最为明显。
4、抗逆性分析
将培养好的菌丝分别接种于含有0.7M的氯化钠和1.0M的山梨醇的MM培养基上，于23℃黑暗培养25d后测量其菌落直径并观察菌丝的生长情况以此来探究该基因对抗逆性的胁迫影响。结果如图12显示，CmLte1p基因的敲除对蛹虫草的抗逆性有轻微的影响，敲除突变体在山梨醇的MM培养基的条件时，抗逆性下降比氯化钠平板相对明显。在山梨醇的MM培养基下ΔCmLte1p菌株的菌丝相比于野生型和回补菌株稀疏。并且在这两种条件下ΔCmLte1p菌株的菌落直径均比野生型小。
5、子实体的生长情况和类胡萝卜素的含量
将WT、ΔCmLte1p和ΔCmLte1p-C在PDA培养基上23℃避光培养一周后，用直径1cm的打孔器打孔后，每瓶PDB培养基中接入4块菌块，23℃避光180rpm培养成菌丝球后取5mL菌丝悬浮液接种至米饭培养基上至菌丝完全覆盖米饭培养基后转移至生态培养箱中，23℃光周期12:12(光：暗)培养1月。观察子实体生长情况并记录。米饭培养基配方如下：30g大米，45mL蒸馏水(含0.3％ KH2PO4，0.15％ MgSO4，2％葡萄糖)121℃，1h高温灭菌。子实体的生长情况如图13显示，说明该基因的敲除对蛹虫草的子实体的生长形态并无影响。而子实体相关性状如下表3所示，该基因敲除后子实体鲜重、子实体的数目以及基质利用率都明显增加。
生物学效率＝子实体鲜质量/初始基质风干质量×100％
基质利用率＝(初始基质风干质量-剩余基质风干质量)/初始基质风干质量×100％
表3子实体相关性状表格
注：采用显著性差异字母标记法(abcd)，其中凡有一个相同标记字母的即为差异不显著,凡具不同标记字母的即为差异显著。
分别取23℃180rpm避光培养5d(PDA)的和23℃180rpm避光培养5d后光照12h的(PDA)以及子实体(23℃避光培养至菌丝完全覆盖麦粒培养基后大约5-7d转移至23℃，光周期12:12光：暗，培养35d)。提取类胡萝卜素的方法：丙酮：石油醚＝4:1，提取溶剂15mL将液氮研磨后的样品加入提取溶剂中，100-120rpm 25℃黑暗1h，后5000rpm离心10min。取上清于450nm测量od值。公式为：carotenoidcontent(μg/g)＝A×V×D/0.16×W其中A为稀释后的萃取物的吸光度值(λmax)，V为提取试剂体积，D为稀释比，0.16为类胡萝卜素消光系数，W(g)为蛹虫草重量。结果如下表4所示，CmLte1p基因的敲除后类胡萝卜素的含量提高，说明该基因的敲除负调控影响蛹虫草的类胡萝卜素的生物合成。说明该基因敲除提高了蛹虫草次生代谢产物类胡萝卜素的含量。
表4蛹虫草不同生长阶段WT、ΔCmLte1p和ΔCmLte1p-C的类胡萝卜素含量
注：采用显著性差异字母标记法(abcd)，其中凡有一个相同标记字母的即为差异不显著,凡具不同标记字母的即为差异显著。
本发明公开了一种蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p及其编码基因，所述的转录因子氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示并且公开了该编码基因在调控蛹虫草生长发育中的用途。本发明公开了CmLte1p蛋白及其编码基因调控蛹虫草菌丝生长以及抗逆性和细胞壁等应用。本发明通过对蛹虫草中的CmLte1p的敲除和回补试验发现，它影响蛹虫草菌丝在平板和不同碳源下的生长，并且具有维持细胞壁的能力和具有一定的抗逆性。此外，CmLte1p虽不影响子实体的生长形态但提高了子实体的鲜重、数量以及生物学效率和基质利用率，同时蛹虫草的次生代谢产物类胡萝卜素得到了显著提高。因此该基因可参考作为蛹虫草内源基因的筛选标记、并以此菌株作为高产类胡萝卜素的底盘菌株，同时也为相关的基因编辑的提供参考依据。

Claims (10)

1.蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p，其特征在于，所述蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p调控蛹虫草生长发育，所述蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p为如下a)或b)的蛋白质：
a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，
b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且调控蛹虫草生长发育的由a)衍生的蛋白质。
2.蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p编码基因，其特征在于，其编码如权利要求1所述的蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p。
3.如权利要求2所述的蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
4.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p编码基因和与所述蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p编码基因可操作地连接的用于表达的调节序列。
5.一种蛹虫草CmLte1p重组载体的构建方法，其特征在于，包括：
以蛹虫草菌株CM基因组为模板，分别以如SEQ ID NO:3和4所示的一组引物对、和以如SEQ ID NO:5和6所示的一组引物对为引物，通过PCR扩增得到CmLte1p基因的上游片段和下游片段，
以蛹虫草菌株CM基因组为模板，以如SEQ ID NO:7和8所示的一组引物对为引物，通过PCR扩增得到BlpR基因片段，
将所述CmLte1p基因的上游片段、下游片段、BlpR基因片段通过同源重组的方式连接到pCAMBIA0390上，得到蛹虫草CmLte1p敲除载体。
6.一种促进蛹虫草生长和子实体发育的方法，其特征在于，包括：
1)将如权利要求5所述的蛹虫草CmLte1p敲除载体转入蛹虫草体内，获得蛹虫草敲除突变体ΔCmLte1p；
2)培养蛹虫草敲除突变体ΔCmLte1p，收获子实体。
7.如权利要求6所述的促进蛹虫草生长和子实体发育的方法，其特征在于，步骤2)中，培养中采用米饭培养基。
8.如权利要求6所述的促进蛹虫草生长和子实体发育的方法，其特征在于，步骤2)中，于温度约23℃进行12小时光照、12小时黑暗的光周期培养，培养时间约30d。
9.如权利要求6所述的促进蛹虫草生长和子实体发育的方法，其特征在于，还包括：从所述子实体中提取类胡萝卜素。
10.如权利要求1所述的蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p或如权利要求2所述的蛹虫草鸟苷酸激活因子CmLte1p编码基因在调控蛹虫草菌丝生长中的用途。
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