CN116064546A - 一种调控丁酸生产的启动子及其应用 - Google Patents

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朱欣娜
樊飞宇
王金盛
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Abstract

本发明公开了一种调控丁酸生产的启动子及其应用。本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种调控丁酸生产的启动子及其应用。本发明提供的启动子是一种DNA分子，可为如下1)或2)或3)：1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。通过上述启动子调控，可以使重组大肠杆菌NZ‑B018在发酵24小时，丁酸产量可达4.08g/L，产率达0.60mol/mol，大大提高大肠杆菌生产丁酸的产量和产率。

Description

一种调控丁酸生产的启动子及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种调控丁酸生产的启动子及其应用。
背景技术
丁酸(C4H8O2)是一种脂肪族短链脂肪酸，广泛应用于农业、工业、医药和食品等行业。如作为抗生素替代品添加于饲料；作为精细化工品原料，生产醋酸丁酸纤维素聚合物；作为医药前体，可以生产神经抑制剂γ-氨基丁酸；作为原料生产香味物丁酸甲酯，用于食品行业。
丁酸梭菌是天然的生产丁酸菌，但其为严格厌氧菌，培养条件苛刻，遗传改造难，改造周期长。相对于丁酸梭菌，大肠杆菌的遗传背景清晰，操作技术成熟，改造大肠杆菌生产丁酸成为研究的热点。
发明内容
本发明所要解决的问题为如何提高微生物产丁酸能力。
为了解决以上问题，本发明提供了一种调控丁酸生产的启动子。具体涉及一种DNA分子，可为如下1)或2)或3)：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
本发明还提供了含有上述DNA分子的生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：
B1)含有所述DNA分子的表达盒；
B2)含有所述DNA分子的重组载体，或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B3)含有所述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，所述重组微生物为所述重组大肠杆菌。
上述生物材料中，所述重组大肠杆菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)NZ-B018，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.25496。
本发明还提供了上述DNA分子作为启动子的应用。
本发明还提供了上述DNA分子作为启动子在构建产丁酸重组大肠杆菌中的应用。
上述应用中，所述重组大肠杆菌不含有乳酸脱氢酶基因、甲基乙二醛合酶基因、丙酸激酶基因、甲酸乙酰转移酶基因、醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因和富马酸还原酶基因；所述重组大肠杆菌含有3-羟基丁酰CoA脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式-2-烯酰CoA还原酶基因、酰基CoA转移酶基因、M1-93启动子和RBSL1启动子。
所述3-羟基丁酰CoA脱氢酶基因来源于丙酮丁酸梭菌和/或，所述巴豆酸酶基因来源于来源于丙酮丁酸梭菌；和/或，所述反式-2-烯酰CoA还原酶来源于齿垢密螺旋体菌；和/或，所述M1-93启动子来源于大肠杆菌。
所述重组大肠杆菌含有启动子P*tesB，P*tesB启动子为下述任一种DNA分子:1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列1的DNA分子；2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
所述重组大肠杆菌含有酰基CoA转移酶AtoB基因表达盒，所述酰基CoA转移酶AtoB基因表达盒含有所述M1-93启动子序列表2和所述M1-93启动子驱动的所述酰基CoA转移酶基因。
所述重组大肠杆菌含有启动子RBSL1，RBSL1启动子为下述任一种DNA分子:1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列3的DNA分子；2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
所述重组大肠杆菌含有反式-2-烯酰CoA还原酶Ter基因表达盒，所述反式-2-烯酰CoA还原酶Ter基因表达盒含有所述RBSL1启动子和所述RBSL1启动子驱动的所述反式-2-烯酰CoA还原酶基因。
所述重组大肠杆菌含有酰基硫脂酶TesB基因表达盒，所述酰基硫脂酶TesB基因表达盒含有所述P*tesB启动子和所述P*tesB启动子驱动的所述酰基硫脂酶基因。
上述重组大肠杆菌中，所述3-羟基丁酰CoA脱氢酶基因编码下述任一种蛋白质：
A1)3-羟基丁酰CoA脱氢酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为CP030018(19日6月2018年)的第437865-438713位的蛋白质3-羟基丁酰CoA脱氢酶，
A2)将A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有3-羟基丁酰CoA脱氢酶活性的蛋白质，
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有3-羟基丁酰CoA脱氢酶活性的融合蛋白质，
所述巴豆酸酶基因编码下述任一种蛋白质：
B1)巴豆酸酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为AE001437(30日1月2014年)的第2835666-2836451位的蛋白质巴豆酸酶，
B2)将B1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有巴豆酸酶活性的蛋白质，
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有巴豆酸酶活性的融合蛋白质，
所述酰基CoA转移酶基因编码下述任一种蛋白质：
C1)酰基CoA转移酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第1569227-1570411位的蛋白质酰基CoA转移酶，
C2)将C1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有酰基CoA转移酶活性的蛋白质，
C3)在C1)或C2)的N端和/或C端连接标签得到的具有酰基CoA转移酶活性的融合蛋白质；
所述乳酸脱氢酶基因编码下述任一种蛋白质：
D1)乳酸脱氢酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第2508048-2509037位的蛋白质乳酸脱氢酶，
D2)将D1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有乳酸脱氢酶活性的蛋白质，
D3)在D1)或D2)的N端和/或C端连接标签得到的具有乳酸脱氢酶活性的融合蛋白质；
所述甲基乙二醛合酶基因编码下述任一种蛋白质：
E1)甲基乙二醛合酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第2883345-2883803位的蛋白质甲基乙二醛合酶，
E2)将E1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有甲基乙二醛合酶活性的蛋白质，
E3)在E1)或E2)的N端和/或C端连接标签得到的具有甲基乙二醛合酶活性的融合蛋白质；
所述丙酸激酶基因编码下述任一种蛋白质：
F1)丙酸激酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第626900-628108位的蛋白质丙酸激酶基因，
F2)将F1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有丙酸激酶基因活性的蛋白质，
F3)在F1)或F2)的N端和/或C端连接标签得到的具有丙酸激酶基因活性的融合蛋白质；
所述甲酸乙酰转移酶基因编码下述任一种蛋白质：
G1)甲酸乙酰转移酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第628142-630436位的蛋白质甲酸乙酰转移酶基因，
G2)将G1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与G1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有甲酸乙酰转移酶基因活性的蛋白质，
G3)在G1)或G2)的N端和/或C端连接标签得到的具有甲酸乙酰转移酶基因活性的融合蛋白质；
所述醇脱氢酶基因编码下述任一种蛋白质：
H1)醇脱氢酶基因基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第2627307-2629982位的蛋白质醇脱氢酶基因，
H2)将H1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与H1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有醇脱氢酶基因活性的蛋白质，
H3)在H1)或H2)的N端和/或C端连接标签得到的具有醇脱氢酶基因活性的融合蛋白质；
所述乙酸激酶基因编码下述任一种蛋白质：
I1)乙酸激酶基因基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第1486251-1487453位的蛋白质乙酸激酶基因，
I2)将I1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与I1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有乙酸激酶基因活性的蛋白质，
I3)在I1)或I2)的N端和/或C端连接标签得到的具有乙酸激酶基因活性的融合蛋白质；
所述富马酸还原酶基因编码下述任一种蛋白质：
J1)富马酸还原酶基因基因编码氨基酸序列是Genbank号为NC_010468(27日1月2012年)的第4214758-4218069位的蛋白质富马酸还原酶基因
J2)将J1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与J1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有富马酸还原酶基因活性的蛋白质，
J3)在J1)或J2)的N端和/或C端连接标签得到的具有富马酸还原酶基因活性的融合蛋白质；
所述反式-2-烯酰CoA还原酶基因编码下述任一种蛋白质：
K1)反式-2-烯酰CoA还原酶基因编码氨基酸序列是Genbank号为AE017226(31日1月2014年)的第636109-637302位的蛋白质反式-2-烯酰CoA还原酶，
K2)将K1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有反式-2-烯酰CoA还原酶活性的蛋白质，
K3)在K1)或K2)的N端和/或C端连接标签得到的具有反式-2-烯酰CoA还原酶活性的融合蛋白质；
所述启动子P*tesB为下述任一种DNA分子:
1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列1的DNA分子，
2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
所述M1-93启动子为下述任一种DNA分子:
1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列2的DNA分子，
2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子；
所述RBSL1启动子为下述任一种DNA分子:
1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列3的DNA分子，
2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
上述应用中，上述重组大肠杆菌的构建方法包括敲除受体大肠杆菌中上述乳酸脱氢酶基因、甲基乙二醛合酶基因、丙酸激酶基因、甲酸乙酰转移酶基因、醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因和富马酸还原酶基因，将上述3-羟基丁酰CoA脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式-2-烯酰CoA还原酶基因导入所述受体大肠杆菌，将上述M1-93启动子导入所述受体大肠杆菌，使所述的M1-93启动子驱动所述酰基CoA转移酶基因的转录。
所述方法还包括将所述的P*tesB启动子导入所述受体大肠杆菌使所述的P*tesB启动子驱动所述酰基硫脂酶基因的转录。
所述巴豆酸酶基因在所述受体大肠杆菌的醇脱氢酶基因(adhE)位点引入。
所述巴豆酸酶基因Crt来源于丙酮丁酸梭菌。
所述3-羟基丁酰CoA脱氢酶编码基因hbd在所述受体大肠杆菌的乙酸激酶基因ackA位点引入。
所述3-羟基丁酰CoA脱氢酶编码基因hbd来源于丙酮丁酸梭菌。
所述反式-2-烯酰CoA还原酶基因ter在所述受体大肠杆菌的富马酸还原酶基因frdABCD位点引入。
所述反式-2-烯酰CoA还原酶基因来源于齿垢密螺旋体菌。
上述应用中，所述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌(Escherichia coli)NZ-B018，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.25496。
在大肠杆菌中创建丁酸合成途径，主要的催化步骤和基因来源如下：葡萄糖经过糖酵解途径产生丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸裂解酶(PflB，来源于大肠杆菌)的作用下生成乙酰CoA；两分子的乙酰CoA在酰基CoA转移酶(AtoB，来源于大肠杆菌)催化下脱去一个辅酶A生成乙酰乙酰CoA；在3-羟基丁酰CoA脱氢酶(Hbd，来源于丙酮丁酸梭菌)的催化下生成3-羟基丁酰CoA；由巴豆酸酶(Crt，来源于丙酮丁酸梭菌)催化生成巴豆酰CoA；经过反式-2-烯酰CoA还原酶(Ter，来源于齿垢密螺旋体菌)催化形成关键前体丁酰CoA；丁酰CoA在酰基硫脂酶(TesB，来源于大肠杆菌)催化下脱去CoA形成丁酸。
保藏说明
菌种名称：大肠埃希氏菌
拉丁名：Escherichia coli
菌株编号：NZ-B018
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年8月5日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25496
附图说明
图1为ldhA敲除验证片段。第一，二泳道分别为菌株ATCC8739，重组大肠杆菌ATCC8739ΔldhA。
图2为tdcDE敲除验证片段。第一，二泳道分别为重组大肠杆菌ATCC 8739ΔldhAΔtdcDE，菌株ATCC8739。
图3为mgsA敲除验证片段。第一，二泳道分别为菌株ATCC8739，重组大肠杆菌ΔldhAΔtdcDEΔmgsA。
图4为Crt,hbd,ter插入验证片段。第一泳道为重组菌NZ-B016D-crt验证片段。第二泳道为重组菌BB-hbd验证片段。第三泳道为重组菌CC-ter验证片段。
图5为代谢驯化得到NZ-B018。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的placZ质粒(仇焕娜等，2018，微生物学通报，45(8)：1693-1704)，公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pACYC184-M质粒(Zhao et al.2013,Metabolic Eng 17:42-50)公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pRedCas9质粒(Zhu et al.2017,Metab.Eng.43,37-45)公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pV4质粒(授权专利：CN114058560A甘氨酸的生产方法。)公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pXZ-CS质粒(Tan et al.2013.Appl.Environ.Microbiol.79,4838-4844)公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的大肠杆菌ATCC 8739，公众可以从美国模式菌种收集中心ATCC(https://www.atcc.org)获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的M1-93(Lu et al.2012,Appl.Microbiol.Biotech.93,2455-2462.5)公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
本发明所用的菌株如表1所示，所用的引物如表2所示，所涉及的质粒如表3所示。
表1本发明所用的菌株
Figure BDA0003952252110000071
表2、本发明中使用的引物
Figure BDA0003952252110000072
Figure BDA0003952252110000081
Figure BDA0003952252110000091
Figure BDA0003952252110000101
Figure BDA0003952252110000111
表3、本发明中所用以及构建的质粒
Figure BDA0003952252110000112
载体的构建：使用了A载体，插入B片段，插入C片段
实施例1、重组大肠杆菌中间菌NZ-B016D的构建
从大肠杆菌ATCC 8739出发，采用CRISPR/Cas9双质粒基因编辑系统连续敲除ldhA(核苷酸序列为Genbank号NC_010468，更新日期27日1月2012年，第2508048-2508037位)，mgsA(核苷酸序列为Genbank号NC_010468，更新日期27日1月2012年，第2883345-2883803位)，tdcDE(tdcD：核苷酸序列为Genbank号NC_010468，更新日期27日1月2012年，第626900-628108位；tdcE：核苷酸序列为Genbank号NC_010468，更新日期27日1月2012年，第628142-630436位)这3个基因，得到中间菌株NZ-B016D。
(1)供体质粒pV4的构建
供体质粒pV4含有lacI-Ptrc-cat-N20-gRNA元件，具有自剪切功能。在pRedCas9的作用下具有自剪切功能。
在供体质粒placZ的基础上添加lacI基因和针对自身质粒cat基因的N20-gRNA序列得到质粒pV4，具体构建过程如下：
第一步，获得骨架DNA片段I。以placZ质粒为模板，使用引物Bone-F和Bone-R(表2)进行PCR扩增，得到6.6kb左右的PCR产物，即为骨架DNA片段I，含有cat、P15A和lacZ基因。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液10μL、dNTP(每种dNTP各2.5mM)1μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μL、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL、蒸馏水33.5μL，总体积为50μL。
扩增条件为：98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸2.5分(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
第二步，获得lacI基因及Ptrc启动子片段II。以pACYC184-M质粒为模板，使用引物lacI-Ptrc-up和lacI-Ptrc-down(表2)进行PCR扩增，得到1.5kb左右的PCR产物，即为lacI基因及Ptrc启动子片段II，lacI基因及Ptrc启动子片段II的核苷酸序列。扩增体系和扩增条件参考上文中的第一步。
第三步，获得cat-N20-gRNA片段III。以placZ质粒为模板，用引物cat-N20-up和cat-N20-down(表2)进行PCR扩增，得到400bp左右的PCR产物，即为cat-N20-gRNA片段III，cat-N20-gRNA片段III的核苷酸序列。扩增体系和扩增条件参考上文中的第一步。
第四步，将骨架DNA片段I、lacI和Ptrc启动子片段II和cat-N20-gRNA片段III用Golden Gate技术策略进行组装(从上游至下游按照I、II和III的顺序顺次无缝连接)，得到pV4质粒转化化转感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)。得到的克隆用引物V4-lacI-YZ-up和cat-YZ-down(表2)进行PCR验证，条带大小为1.7Kb，阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4质粒，该质粒含有lacI-Ptrc-cat-N20-gRNA元件，具有自剪切功能。
pV4质粒在placZ(仇焕娜等，2018，微生物学通报，45(8)：1693-1704)的lacZ基因后插入lacI-Ptrc-cat-N20-gRNA序列(核苷酸是序列表中序列5所示)，保持placZ的其它核苷酸序列不变得到的重组载体。
(2)用于敲除ldhA的pV4-del-ldhA等质粒的构建
pV4-del-ldhA质粒的构建构建步骤如下：
第一步，获得pV4质粒骨架片段A。以pV4质粒为模板，用引物N20-B-F1和N20-B-R1(表2)反向PCR扩增，得到4.1kb左右的PCR产物，即为pV4质粒骨架片段A。该片段含有cat、P15A和自剪切元件lacI-Ptrc-cat-N20-gRNA。扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。
第二步，获得ldhA-N20-gRNA序列片段B。以pV4质粒为模板，用引物ldhA-N20-B-F2和N20-B-R2(表2)进行PCR扩增，得到400bp左右的PCR产物，即为DNA片段B，扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。
第三步，获得ldhA基因的上游同源臂片段C和下游同源臂片段D。以大肠杆菌ATCC8739的基因组DNA为模板，用引物ldhA-F1和ldhA-R1(表2)进行PCR扩增，获得上游同源臂片段C，约500bp。同理，用引物ldhA-F2和ldhA-R2(表2)进行PCR扩增，获得下游同源臂片段D，约300bp。扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。
第四步，将pV4质粒骨架片段A、ldhA-N20-gRNA序列片段B和ldhA基因的上下游同源臂片段C和片段D用Golden Gate技术策略进行组装(按照A、B、C和D的顺序顺次无缝连接)，转化化转感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)。得到的克隆用引物P15A-UP和ldhA-R2进行PCR验证，条带大小为1Kb左右，阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4-del-ldhA质粒。
(3)pV4-del-mgsA等质粒的构建
pV4-del-mgsA质粒的构建过程具体步骤如下：
第一步，获得pV4质粒骨架片段A。以pV4质粒为模板，用引物N20-B-F1和N20-B-R1(表2)反向PCR扩增，得到4.1kb左右的PCR产物，即为pV4质粒骨架片段A。该片段含有cat、P15A和自剪切元件lacI-Ptrc-cat-N20-gRNA。-扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。
第二步，获得mgsA-N20-gRNA序列片段B。以pV4质粒为模板，用引物mgsA-N20-B-F2和N20-B-R2(表2)进行PCR扩增，得到约400bp左右的PCR产物，即为DNA片段E。扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。
第三步，获得mgsA基因的上下游同源臂片段F和片段G。以大肠杆菌ATCC 8739的基因组DNA为模板，用引物mgsA-F1和mgsA-R1(表2)进行PCR扩增，获得上游同源臂片段F，约400bp。同理，用引物mgsA-F2和mgsA-R2(表2)进行PCR扩增，获得下游同源臂片段G，约400bp。扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。
第四步，将pV4质粒骨架片段A、mgsA-N20-gRNA序列片段E和mgsA基因的上下游同源臂片段F和片段G用Golden Gate技术策略进行组装(按照A、E、F和G的顺序顺次无缝连接)，转化化转感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)。得到的克隆用引物P15A-UP和mgsA-R2进行PCR验证，条带大小为1.2Kb左右，阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4-del-mgsA质粒。
(4)pV4-del-tdcDE等质粒的构建
pV4-del-tdcDE质粒的构建过程具体步骤如下：
第一步，获得pV4质粒骨架片段A。以pV4质粒为模板，用引物N20-B-F1和N20-B-R1(表2)反向PCR扩增，得到4.1kb左右的PCR产物，即为pV4质粒骨架片段A。该片段含有cat、P15A和自剪切元件lacI-Ptrc-cat-N20-gRNA。扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。
第二步，获得tdcDE-N20-gRNA序列片段H。以pV4质粒为模板，用引物tdcDE-N20-B-F2和N20-B-R2(表2)进行PCR扩增，得到约400bp左右的PCR产物，即为DNA片段H。扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。
第三步，获得tdcDE基因的上下游同源臂片段I和片段J。以大肠杆菌ATCC8739的基因组DNA为模板，用引物tdcDE-F1和tdcDE-R1(表2)进行PCR扩增，获得上游同源臂片段I，约400bp。同理，用引物tdcDE-F2和tdcDE-R2(表2)进行PCR扩增，获得下游同源臂片段J，约300bp。扩增体系和扩增条件参考步骤(1)中的第一步。
第四步，将pV4质粒骨架片段A、tdcDE-N20-gRNA序列片段H和tdcDE基因的上下游同源臂片段I和片段J用Golden Gate技术策略进行组装(按照A、H、I和J的顺序顺次无缝连接)，转化化转感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)。得到的克隆用引物P15A-UP和tdcDE-R2进行PCR验证，条带大小为1.2Kb左右，阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4-del-tdcDE质粒。
(5)敲除ldhA，tdcDE和mgsA基因
ldhA基因敲除的具体步骤如下：
从大肠杆菌ATCC 8739出发，制备电转化感受态细胞，将质粒pRedCas9和pV4-del-ldhA同时转化到ATCC 8739电转化感受态细胞，涂卡那霉素和氯霉素双抗平板，置于30℃过夜培养。挑取单克隆于2mL LB(含卡那霉素和氯霉素；2.5％ L(+)-阿拉伯糖)，250r/min转速，30℃过夜诱导同源重组和切割未发生重组的DNA。稀释涂LB平板(含卡那霉素和氯霉素，2.5％ L(+)-阿拉伯糖)，30℃过夜培养。挑取单克隆进行菌落PCR验证，引物为ldhA-YZ-up和ldhA-YZ-down，结果如图1所示，阳性克隆菌WJ-001(简称重组大肠杆菌ATCC 8739ΔldhA或菌株8739ΔldhA)扩增得到大小约0.8kb的PCR产物，野生型大小2.2kb。重组大肠杆菌ATCC 8739ΔldhA是将大肠杆菌ATCC 8739的ldhA基因敲除得到重组菌。
tdcDE基因敲除的具体步骤如下：
将正确的克隆通过划线消除pV4-del-ldhA质粒。以阳性克隆菌WJ-001出发，按照步骤五中方法继续按照敲除ldhA基因的方式敲除tdcDE。将质粒pRedCas9和pV4-del-tdcDE同时转化到WJ-001电转化感受态细胞，涂卡那霉素和氯霉素双抗平板，置于30℃过夜培养。挑取单克隆于2mL LB(含卡那霉素和氯霉素；2.5％ L(+)-阿拉伯糖)，250r/min转速，30℃过夜诱导同源重组和切割未发生重组的DNA。稀释涂LB平板(含卡那霉素和氯霉素，2.5％ L(+)-阿拉伯糖)，30℃过夜培养。挑取10个单克隆进行菌落PCR验证，引物为tdcDE-YZ-up和tdcDE-YZ-down，结果如图2所示，阳性克隆菌重组大肠杆菌WJ-002(又称菌株8739ΔldhAΔtdcDE)扩增得到大小约645bp的PCR产物。重组大肠杆菌ATCC 8739ΔldhAΔtdcDE是将大肠杆菌ATCC 8739ΔldhA的tdcDE基因敲除得到重组菌。
mgsA基因敲除的具体步骤如下：
将正确的克隆通过划线消除pV4-del-tdcDE质粒。以阳性克隆菌ATCC 8739ΔldhAΔtdcDE出发，按照步骤五中方法按照敲除ldhA基因的方式继续敲除mgsA。将质粒pRedCas9和pV4-del-mgsA同时转化到ATCC 8739ΔldhAΔtdcDE电转化感受态细胞，涂卡那霉素和氯霉素双抗平板，置于30℃过夜培养。挑取单克隆于2mL LB(含卡那霉素和氯霉素；2.5％ L(+)-阿拉伯糖)，250r/min转速，30℃过夜诱导同源重组和切割未发生重组的DNA。稀释涂LB平板(含卡那霉素和氯霉素，2.5％L(+)-阿拉伯糖)，30℃过夜培养。挑取单克隆进行菌落PCR验证，引物为mgsA-YZ-up和mgsA-YZ-down，结果如图3所示，阳性克隆菌WJ-003(简称重组大肠杆菌ΔldhAΔtdcDEΔmgsA或菌株8739ΔldhAΔtdcDEΔmgsA)扩增得到大小分别约960bp的PCR产物。
最终完成3个基因的敲除，得到中间菌NZ-B016D。
实施例2、重组大肠杆菌中间菌NZ-B016M的构建
(1)整合crt于adhE基因位点
从中间菌NZ-B016D出发，使用两步法同源重组将crt(核苷酸序列是Genbank号为AE001437的第2835666-2836451位(更新日期30日1月2014年))整合到adhE(核苷酸序列是Genbank号为NC_010468的第2627307-2629982位(更新日期27日1月2012年))位点。
以pXZ-CS质粒为模板，使用引物adhE-cat-up/adhE-sacB-down(表2)进行PCR扩增PCR，得到同源重组的cat-sacB片段I，大小约2.8kb。将cat-sacB片段I导入中间菌NZ-B016D中，将，得到将cat-sacB片段I整合到NZ-B016D染色体adhE位点的重组菌NZ-B016D-cat-sacB。
以大肠杆菌ATCC 8739菌株基因组DNA为模板，用引物adhE-del-F1/adhE-m93-del-R1、adhE-del-F2/adhE-del-R2(表2)扩增得到adhE基因上下游同源臂DNA片段1(大小为385bp)和片段2(大小为306bp)；以丙酮丁酸梭菌基因组DNA(Clostridiumacetobutylicum ATCC 824chromosome)为模板，用引物Ca-crt-CPEC-up/Ca-crt-CPEC-down扩增得到crt的基因片段3，大小为827bp；以重组大肠杆菌M1-93的基因组DNA为模板，用引物AP1-UP/M93-R1(表2)得到启动子片段4，大小为88bp。将上述片段1、2、3、4通过融合PCR得到第二次同源重组的片段II，将第二次同源重组的片段II导入重组菌NZ-B016D-cat-sacB，得到将重组菌NZ-B016D-cat-sacB的染色体上cat-sacB的基因盒替换为crt基因的重组菌NZ-B016D-crt。
用引物Ca-crt-yz-down和adhE-del-F1对重组菌NZ-B016D-crt进行基因验证，扩增产物大小为702bp,如图4第一泳道所示。用引物adhE-del-F1/adhE-del-R2(表2)对重组菌NZ-B016D-crt进行PCR验证和测序分析，重组菌NZ-B016D-crt的扩增产物为1545bp的片段(adhE基因上游365bp，crt基因78 9bp，M1-93启动子88bp和adhE基因下游306bp)。重组菌NZ-B016D-crt与中间菌NZ-B016D相比，是将中间菌NZ-B016D中的核苷酸序列是Genbank号为NC_010468更新日期27日1月2012年)的第2627341-2629982位的adhE基因片段替换为核苷酸序列是Genbank号为AE001437(更新日期30日1月2014年)的第2835666-2836451位的crt基因。重组菌NZ-B016D-crt(简称BB)是将crt基因整合入中间菌NZ-B016D的adhE位点得到的重组大肠杆菌。
大肠杆菌AA是将巴豆酸酶编码基因crt基因整合到重组菌NZ-B016D的醇脱氢酶基因adhE位点得到的重组菌。
(2)整合hbd于ackA基因位点
按照实施例2(1)中相同的方法，从大肠杆菌BB出发，使用两步法同源重组，将来源于丙酮丁酸梭菌的hbd(核苷酸序列是Genbank号为CP030018的第2835666-2836451位(更新日期19日6月2018年))整合于ackA(核苷酸序列是Genbank号为NC_010468的第1486251-1487453位(更新日期27日1月2012年))位点。使用的引物序列见表2。
以pXZ-CS质粒为模板，使用引物ackA-cat-up/ackA-sacB-down(表2)进行PCR扩增并融合PCR，得到同源重组的cat-sacB片段I，大小为2.5bp，将其整合到中间菌AA染色体ackA位点，得到将cat-sacB片段I整合到大肠杆菌AA染色体adhE位点的重组菌AA-cat-sacB。
大肠杆菌ATCC 8739菌株基因组DNA为模板，用引物ackA-del-F1/ackA-m93-del-R1、ackA-del-F2/ackA-del-R2(表2)扩增得到ackA基因上游同源臂DNA片段1(大小为545bp)和ackA基因下游同源臂DNA片段2(大小为505bp)；以丙酮丁酸梭菌基因组DNA(Clostridium acetobutylicum ATCC 824chromosome)为模板，用引物Ca-hbd-CPEC-up/Ca-hbd-CPEC-down扩增得到hbd的基因片段3(大小为889bp)；以重组大肠杆菌M1-93的基因组DNA为模板，用引物AP1-UP/M93-R1(表2)得到启动子片段4(大小为88bp)。将上述片段1、2、3、4通过融合PCR得到第二次同源重组的片段II，将第二次同源重组的片段II导入重组菌AA-cat-sacB，得到将重组菌AA-cat-sacB的染色体上cat-sacB的基因盒替换为hbd基因的重组菌BB-hbd。
用引物Ca-hbd-CPEC-down和ackA-del-F1对重组菌BB-hbd进行基因验证，扩增产物大小为1482bp,如图4第二泳道所示。用引物ackA-del-F1/ackA-del-R2(表2)对重组菌BB-hbd进行测序分析，重组菌BB-hbd的扩增产物为1967bp的片段(ackA基因上游525bp，hbd基因849bp，M1-93启动子88bp和ackA基因下游505bp)。重组菌BB-hbd与中间菌AA(NZ-B016D-crt)相比，是将中间菌AA(NZ-B016D-crt)中的核苷酸序列是Genbank号为NC_010468(更新日期27日1月2012年)的第1486500-1487627位的ackA基因片段替换为核苷酸序列是Genbank号为CP030018(更新日期19日6月2018年)的第437865-438713位的hbd基因。重组菌BB-hbd(简称BB)是将hbd基因整合入中间菌AA(NZ-B016D-crt)的ackA位点得到的重组大肠杆菌。
大肠杆菌BB是将3-羟基丁酰CoA脱氢酶hbd基因整合到重组菌AA的乙酸激酶基因ackA位点得到的重组菌。
(3)整合ter于frdABCD基因位点
按照实施例2(1)中相同的方法，将来源于齿垢密螺旋体菌的ter(核苷酸序列是Genbank号为AE017226的第636109-637302位(更新日期31日1月2014年))，整合于frdABCD(核苷酸序列是Genbank号为NC_010468的第4214758-4218069位(更新日期27日1月2012年))位点。使用的引物序列见表2。
第一步同源重组的片段准备同实施例2(1)中相同的方法，使用的引物序列见表2。以pXZ-CS质粒为模板，使用引物frd-cat-up/frd-sacB-down(表2)进行PCR扩增并融合PCR，得到同源重组的cat-sacB片段I，大小为2.8kb，将其整合到中间菌BB染色体frd位点，得到将cat-sacB片段I整合到大肠杆菌BB染色体frdABCD位点的重组菌BB-cat-sacB。
第二步同源重组片段的准备：大肠杆菌ATCC 8739菌株基因组DNA为模板，用引物frd-del-F1/frd-m93-del-R1、frd-del-F2/frd-del-R2(表2)扩增得到frd基因上游同源臂DNA片段1(大小为446bp)和frd基因下游同源臂DNA片段2(大小为395bp)；以齿垢密螺旋体菌基因组DNA(Treponema denticola chromosome)为模板，用引物ter-CPEC-up/ter-CPEC-down扩增得到ter的基因片段3(大小为1194bp)；以重组大肠杆菌M1-93的基因组DNA为模板，用引物AP1-UP/frd-RBSL-down(表2)得到启动子片段4(大小为149bp)。将上述片段1、2、3、4通过融合PCR得到第二次同源重组的片段II，将第二次同源重组的片段II导入重组菌BB-cat-sacB，得到将重组菌BB-cat-sacB的染色体上cat-sacB的基因盒替换为ter基因的重组菌CC-ter。
用引物Td-ter-CPEC-down和frd-del-F1对重组菌CC-ter进行基因验证，扩增产物大小为1728bp,如图4中第3泳道所示。用引物frd-del-F1/frd-del-R2(表2)对重组菌CC-ter进行测序分析，重组菌CC-ter的扩增产物为2104bp的片段(frdABCD基因上游426bp，ter基因1194bp，RBSL1启动子89bp(序列表中序列3:TTATCTCTGGCGGTGTTGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCCGTATTGTTAGCATGTACGTTTAAACCAGGAGGGGCACA)和frdABCD基因下游395bp)。重组菌CC-ter与中间菌BB相比，是将中间菌BB中的核苷酸序列是Genbank号为NC_010468(更新日期27日1月2012年)的第4216601-4217660位的frdABCD基因片段替换为核苷酸序列是Genbank号为AE017226(更新日期31日1月2014年)的第636109-637302位的反式-2-烯酰CoA还原酶ter基因。重组菌CC-ter是将ter基因整合入中间菌BB的frdABCD位点得到的重组大肠杆菌。将重组菌CC-ter命名为NZ-B016M。
大肠杆菌NZ-B016M是将反式-2-烯酰CoA还原酶基因ter整合到重组菌BB的富马酸还原酶基因frdABCD位点得到的重组菌。
实施例3、重组大肠杆菌NZ-B016的构建
从重组大肠杆菌中间菌NZ-B016M出发，用两步法同源重组调控atoB(核苷酸序列是Genbank号为NC_010468的第1569227-1570411位(更新日期27日1月2012年))基因。
以pXZ-CS质粒为模板，使用引物atoB-TK-cat-up/atoB-TK-sacB-down(表2)进行PCR扩增，得到约2.8kb的片段atoB-TK-cat-sacB(请指明该片段在同源重组中的作用)。将片段atoB-TK-cat-sacB导入重组大肠杆菌中间菌NZ-B016M，得到将片段atoB-TK-cat-sacB整合到重组大肠杆菌中间菌NZ-B016M的染色体atoB基因的起始密码子ATG前的重组菌NZ-B016M-1。
以重组大肠杆菌M1-93的基因组DNA为模板，用引物atoB-P-up/atoB-RBS-down(表2)得到200bp的片段(含有启动子M1-93)，将该片段导入重组菌重组菌NZ-B016M-1，得到将重组菌NZ-B016M-1的染色体上片段atoB-TK-cat-sacB替换为启动子M1-93的重组菌NZ-B016。
用引物atoB-YZ-up600/atoB-cx-down/(表2)对重组菌NZ-B016进行PCR验证和测序分析，重组菌NZ-B016的扩增产物约为880bp的片段(atoB基因上游517bp，M1-93启动子88bp和atoB基因下游275bp)。
重组菌NZ-B016与中间菌重组菌NZ-B016M-1相比，是将重组菌NZ-B016M-1中atoB基因的起始密码子ATG前的核苷酸序列是Genbank号为NC_010468(更新日期27日1月2012年)的第1570412-1570441位的片段替换为人工启动子M1-93。
重组菌NZ-B016是将启动子M1-93整合入重组菌NZ-B016M的atoB基因的起始密码子ATG前得到的重组大肠杆菌。
实施例4、重组大肠杆菌NZ-B016的发酵
种子培养基为LB培养基:10g/L胰蛋白胨；5g/L酵母膏；10g/L NaCl,其余为水。
发酵培养基：葡萄糖20g/L、酵母粉1g/L、KH2PO4 3.5g/L、K2HPO4 6.55g/L、(NH4)2HPO4 3.5g/L、MgSO4·7H2O 0.12g/L和甜菜碱-KCl 0.15g/L、FeCl3·6H2O1.5g/L、CoCl2·6H2O 0.1g/L、CuCl2·2H2O 0.1g/L、ZnCl2 0.1g/L、Na2MoO4·2H2O0.1g/L、MnCl2·4H2O0.2g/L、H3BO3 0.05g/L，其余为水。
种子培养：将NZ-B016单克隆接种于100mL培养基(250mL三角瓶)在37℃和100rpm的条件下培养12小时，得到种子液，用于发酵培养基接种。
发酵培养：500mL厌氧罐中发酵培养基体积为250mL，将种子液按照终浓度OD550＝0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150rpm，发酵1天，得到发酵液。中和剂为1.2M KOH。发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程中没有通任何气体。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对24小时发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX–87H有机酸分析柱。
NZ-B016发酵24小时后，菌株OD550nm＝0.838；丁酸产量达0.49g/L，糖酸转化率达0.15mol/mol。对照菌株大肠杆菌ATCC8739的OD550nm＝6.2；丁酸产量为0，糖酸转化率为0。
实施例5、重组大肠杆菌NZ-B018的构建
从NZ-B016出发，通过进化代谢同步提高细胞生长和丁酸生产能力。
进化代谢所使用的发酵培养基与实施案例4相同。
发酵培养：500mL厌氧罐中发酵培养基体积为250mL，将种子液按照终浓度OD550＝0.1的接种量接种于发酵培养基。每隔24小时，将发酵液转接到新的发酵罐中，使初始OD550达0.1，测定24小时培养基丁酸产量，如图5所示。
经过79代进化，获得菌株NZ-B018，发酵24小时，菌株OD550nm＝2.1；丁酸产量达4.08g/L，产率达0.60mol/mol。
实施例6、突变启动子P*tesB的获得
对重组大肠杆菌NZ-B018和NZ-B016进行重测序和转录组分析，由诺禾致源生物科技有限公司完成。每个样品产生1Gb清单数据(clean data)。序列分析的参考序列为ATCC8739基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010468.1)。重测序结果显示，相对于NZ-B016，重组大肠杆菌NZ-B018的tesB基因的启动子序列发生改变(序列信息)，改变后的启动子序列命名为P*tesB；同时，tesB基因的表达量是NZ-B016的37倍。
启动子P*tesB的核苷酸序列为如下序列(序列表中序列1所示)：
Figure BDA0003952252110000201
重组大肠杆菌NZ-B018含有启动子P*tesB。重组大肠杆菌NZ-B018已于2022年8月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.25496。大肠杆菌(Escherichia coli NZ-B018)简称大肠杆菌NZ-B018。
实施例7、重组大肠杆菌NZ-B025的构建
从重组大肠杆菌NZ-B018出发，利用两步法同源重组，将野生型PtesB启动子(核苷酸是序列表中序列4所示)替换NZ-B018的突变启动子P*tesB序列(核苷酸是序列表中序列1所示)，获得重组大肠杆菌NZ-B025。具体步骤如下：
以pXZ-CS质粒为模板，使用引物tesB-TK-cat-up/tesB-TK-sacB-down(表2)进行PCR扩增，得到同源重组的cat-sacB片段，转化NZ-B018电转化感受态细胞，得到将cat-sacB片段整合到NZ-B018的突变启动子P*tesB位点的重组菌NZ-B018C。
以NZ-B016菌株基因组DNA为模板，用引物tesB-cx-up/tesB-cx-down(表2)扩增得到部分tesB基因和其上游DNA片段(大小为807bp)，将此片段转化到NZ-B018C电转化感受态细胞。
用引物tesB-cx-up/tesB-cx-down(表2)得到的克隆重组菌命名为NZ-B025，将NZ-B025进行PCR验证和测序分析，重组菌NZ-B025的扩增产物为807bp的片段。重组菌NZ-B025与中间菌NZ-B018相比，是将核苷酸序列Genbank号为NC_010468(更新日期27日1月2012年)的第3466291-3466398位的野生型启动子PtesB替换出突变P*tesB启动子，P*tesB启动子的核苷酸序列是序列表中序列1。野生启动子PtesB调控丁酰CoA在酰基硫脂酶tesB的表达。重组菌NZ-B025是将野生型PtesB启动子替换出中间菌NZ-B018的突变启动子P*tesB位点得到的重组大肠杆菌。
实施例6、重组大肠杆菌NZ-B026的构建
从重组大肠杆菌NZ-B016出发，利用两步法同源重组，将野生型启动子PtesB序列Genbank号为NC_010468(更新日期27日1月2012年)的第3466291-3466398位的tesB基因上游PtesB启动子片段替换突变P*tesB启动子序列(核苷酸是序列表中序列1所示)，获得重组大肠杆菌NZ-B026。具体步骤如下：
以pXZ-CS质粒为模板，使用引物tesB-TK-cat-up/tesB-TK-sacB-down(表2)进行PCR扩增，得到同源重组的cat-sacB片段，转化NZ-B016电转化感受态细胞，得到菌株将cat-sacB片段整合到NZ-B016的启动子PtesB位点的重组菌NZ-B016C。
以NZ-B018菌株基因组DNA为模板，用引物tesB-cx-up/tesB-cx-down(表2)扩增得到部分tesB基因和其上游DNA片段(大小为932bp)，将此片段转化至NZ-B016C电转化感受态细胞。
用引物tesB-cx-up/tesB-cx-down(表2)得到的克隆重组菌命名为NZ-B026，将NZ-B026进行PCR验证和测序分析，重组菌NZ-B026的扩增产物为932bp的片段。重组菌NZ-B026与中间菌NZ-B016相比，是将中间菌NZ-B016中的核苷酸序列是Genbank号为NC_010468(更新日期27日1月2012年)的第3466291-3466398位的tesB基因上游PtesB启动子片段替换为核苷酸序列是序列表中序列1所示的突变启动子P*tesB。突变启动子P*tesB调控丁酰CoA在酰基硫脂酶tesB的表达。重组菌NZ-B026是将突变启动子P*tesB整合入重组菌NZ-B016的野生型PtesB启动子位点得到的重组大肠杆菌。
测定大肠杆菌ATCC 8739、重组大肠杆菌NZ-B016、重组大肠杆菌NZ-B018、重组大肠杆菌NZ-B025和NZ-B026中如下基因的表达量，具体步骤如下：按实施例4发酵并进行发酵样品分别取样，液氮处理，RNA提取和转录组测序由诺和致源生物科技有限公司完成。每个样品产生1Gb清单数据(clean data)。序列分析的参考序列为ATCC8739的基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010468.1)。
检测结果如表4所示。丁酸合成途径关键基因tesB的表达水平显著提高，驯化菌株NZ-B018是出发菌株NZ-B016表达水平的37倍；整合的外源基因hbd，crt和ter，他们的表达水平相对较高，FPKM范围从12609到34773。
表4大肠杆菌的hbd、crt、tesB和ter表达水平
Figure BDA0003952252110000211
实施例8、重组大肠杆菌NZ-B025和NZ-B026的发酵
将大肠杆菌ATCC 8739、重组大肠杆菌NZ-B016、重组大肠杆菌NZ-B018、重组大肠杆菌NZ-B025和NZ-B026分别按照实施例4的方法制备种子液。500mL厌氧罐中装有250mL实施例4的发酵培养基，将种子液按照终浓度OD550nm＝0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150rpm，发酵24小时，得到发酵液。中和剂为1.2M KOH。发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程中没有通任何气体。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行HPLC分析测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的AminexHPX–87H有机酸分析柱。其中，以丁酸为标准品根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析丁酸，以葡萄糖为标准品根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析葡萄糖。糖酸转化率＝丁酸产量*180/葡萄糖消耗量*88。HPLC分析中，柱温35℃，自动进样器进样，进样量20μL,流动相为由5mM浓硫酸，流速为0.5mL/min，利用UV检测器在波长205-215nm处检测并自动形成分离图谱。
表5、突变P*tesB启动子对丁酸产量的影响
菌株 OD 丁酸产量(g/L) 糖酸转化率
ATCC 8739 6.2 0 0
NZ-B016 0.84 0.49±0.027 0.48±0.000
NZ-B018 2.10 4.08±0.007 0.89±0.028
NZ-B025 0.92 0.38±0.001 0.52±0.021
NZ-B026 2.18 3.54±0.085 0.91±0.000
发酵结果见表5。NZ-B025的产量相比于NZ-B018，显著降低，24h丁酸产量降低到0.38g/L，说明当突变P*tesB启动子改变为野生型PtesB后，丁酸的产量降低；NZ-B026的产量相比于NZ-B016，产量显著提升，24h丁酸产量达到3.54g/L，糖酸转化率达0.91mol/mol，说明当野生型PtesB改变为突变P*tesB启动子后，丁酸产量提高。说明突变P*tesB启动子对丁酸产量的有正相关性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (8)

1.一种DNA分子，为如下1)或2)或3)：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
2.含有权利要求1所述的DNA分子的生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：
B1)含有权利要求1中所述DNA分子的表达盒；
B2)含有权利要求1中所述DNA分子的重组载体，或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B3)含有权利要求1中所述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：所述重组微生物为重组大肠杆菌。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于：所述重组大肠杆菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)NZ-B018，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.25496。
5.权利要求1所述DNA分子作为启动子的应用。
6.权利要求1所述DNA分子作为启动子在构建产丁酸重组大肠杆菌中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述重组大肠杆菌不含有乳酸脱氢酶基因、甲基乙二醛合酶基因、丙酸激酶基因、甲酸乙酰转移酶基因、醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因和富马酸还原酶基因；所述重组大肠杆菌含有3-羟基丁酰CoA脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式-2-烯酰CoA还原酶基因、酰基CoA转移酶基因和M1-93启动子；所述重组大肠杆菌含有启动子P*tesB，P*tesB启动子为权利要求1中所述的DNA分子。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述重组大肠杆菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)NZ-B018，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.25496。
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