JP6148250B2 - 組換え脱アミド化グリアジン抗原 - Google Patents
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Description
本出願は、2011年12月5日に出願された米国特許仮出願第61/567,060号の優先権の利益を主張するものであり、その全部を参照により本明細書中に援用する。
「配列表」、表、又はASCIIテキストファイルとして提出したコンピュータプログラム一覧表付録の参照
本明細書で用いられる時、用語「接触させる」とは、反応できるように少なくとも2つの異なる種を接触させる過程をいう。結果として生じた反応生成物は、加えた試薬間の反応から直接に又は反応混合物中で生成できる1以上の加えた試薬の中間体から生成されたものである。
本発明はセリアック病を検出するための抗原及び方法を提供する。抗原には固相支持体物質上に固定されたグリアジン融合タンパク質が含まれる。グリアジン融合タンパク質には組換え脱アミド化グリアジン及びタグの両方が含まれる。任意に抗原は組織トランスグルタミナーゼ(tTG)を含むことができる。存在する場合、tTG−グリアジン融合タンパク質複合体を形成するために、固相支持体に固定される前に、例えばアミノ基転移を通してグリアジン融合タンパク質とtTGとを共有結合することができる。固相支持体にtTG−グリアジン融合タンパク質を固定した後に、好適な架橋剤を用いてグリアジン融合タンパク質とtTGとを架橋することができる。
本発明において有用なグリアジン融合タンパク質は、タグ付与タンパク質として発現される組換え脱アミド化グリアジンを含む。多くの組換えグリアジンタンパク質が本発明の調製方法において有用であることが、当業者に認識される。いくつかの実施形態において、組換えグリアジンタンパク質はD2(Aleanzi et al, Clin Chem 2001, 47 (11), 2023)、ペプチド配列:QPEQPQQSFPEQERPF(配列番号1)を含むことができる。組換えグリアジンタンパク質は、以下の式:
X1PX2X3PX4X5SFPX6X7X8RPF(配列番号12)
{式中、各Xはグルタミン(Q)又はグルタミン酸(E)のいずれかであって、少なくとも1つのXはグルタミンであり、少なくとも1つのXはグルタミン酸である}で表されるD2の変異体をも含むことができる。本発明の組換えグリアジンタンパク質は、D2又はその変異体の六量体とすることもできる。いくつかの実施形態において、本発明の組換えグリアジンタンパク質は、GGGGS(配列番号2)等のいずれかの好適なスペーサーで分離されているD2又はその変異体の六量体とすることもできる。本発明において他のスペーサーも有用であることが当業者に理解される。
本発明の使用のための固相支持体物質は、次の性質によって特徴づけられる:(1)スクリーニングに用いられる液層中での不溶性;(2)他の全ての支持体から独立した三次元の移動性;(3)グリアジン融合タンパク質又はtTG−グリアジン融合タンパク質複合体の多数のコピーを含むこと;(4)スクリーニング検定条件への適合;及び(5)検定条件への不活性。好ましい支持体は、これらだけに限定されるものではないが、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、炭酸塩、カルバミン酸塩、イソシアネート、スルホン、スルホン酸塩、スルホンアミド、スルホキシド等の反応性官能基をグリアジン融合タンパク質とtTGの結合のために有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、固体支持体にグリアジン融合タンパク質を接触させることを含む方法によって調製されたセリアック病を検出するための抗原を提供し、ここで前記グリアジン融合タンパク質は、それぞれ配列番号1の配列を有するペプチドの六量体を有する組換え脱アミド化グリアジンを含み、且つ、前記グリアジン融合タンパク質が固相支持体上に固定されるように、前記組換え脱アミド化グリアジンがタグに共有結合により連結される。これにより、セリアック病を検出するための抗原が調製される。
組換え脱アミド化グリアジンポリペプチドを作製するために、本発明は組換え遺伝学の分野におけるルーチン技術を用いることができる。本発明の使用の一般的な方法を開示する基本的な教科書として、Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3版, 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);及びCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994-1999)が挙げられる。
本発明のグリアジン融合タンパク質は、当該技術分野において知られている任意の有用な固定方法で、任意の有用な固相支持材に固定することができる。固相支持体へのグリアジン融合タンパク質の固定は、共有又はイオン結合形成、水素結合、ファンデルワールス力、及び抗体−抗原相互作用を介することができる。本発明において他の固定方法が有用であることが、当業者に理解される。
いくつかの実施形態において、本発明は、セリアック病を患っている対象を診断する方法を提供する。前記方法には、対象からの体液のサンプルを、配列番号3の配列を有する六量体を含む組換え脱アミド化グリアジンを含む本発明の抗原と接触させることを含む。該方法には、抗原に特異的に結合するようになったあらゆる抗体を検出することをも含み、これにより対象におけるセリアック病の存在が示される。
いくつかの実施形態において、本発明は、前記組換え脱アミド化グリアジンが、配列番号3の配列と実質的に同一であるか又は配列番号3の配列を有する六量体を含む、上述された抗原、検出試薬、並びに任意にバッファー、塩、安定剤及び取扱説明書のうちの少なくとも1つを含むキットを提供する。
Hisタグを持つD2六量体は、非変性条件又は変性条件のいずれかを使用して精製できる。この実施例では、D2六量体を、8Mの尿素を用いた変性条件下で精製した。そのタンパク質が配列番号7の配列を有する、Hisタグを持つ「古典的な」D2六量体を作製した。さらに、そのタンパク質が配列番号8の配列を有する、Hisタグを持つ「リジン含有」D2六量体を作製した。
六量体を過剰発現する6リットルのE.コリ培養物からの溶解細胞を、約5ml/gの湿重量にて平衡バッファー(100mMのNaH2PO4、8Mの尿素、500mMのNaCl、10mMのイミダゾール、pH8.0)中に懸濁した。室温にて30分間撹拌した後に、細胞残屑を遠心分離によって取り除いた。約200mlの上清を、平衡バッファーで予洗した25mlのNi−NTA樹脂に加え、室温にて60分間混合した。樹脂に結合した六量体タンパク質を、100mlの洗浄バッファー(100mMのNaH2PO4、8Mの尿素、500mMのNaCl、20mMのイミダゾール、0.5%のTriton X100、pH8.0)で4回洗浄する前に、結合していない溶解物と分離した。洗浄バッファーを樹脂から取り除いた後に、結合した六量体タンパク質を、4倍量の20mlの溶出バッファー(100mMのNaH2PO4、8Mの尿素、200mMのNaCl、250mMのイミダゾール、pH7.5)で溶出した。溶出したタンパク質画分を、貯留し、濃縮し、そして、10mMのMOPS、150mMのNaCl(pH7.4)に対して透析した。得られたすべての沈殿物を、15k×gの遠心分離によって取り除いた。230nmのUVにて観察される、アフィニティー精製したタンパク質は、10mMのMOPS、150mMのNaCl(pH7.4)を用いたサイズ排除カラムでさらに精製できる。最初の主なピークを含む画分を、貯留し、濃縮した。
アフィニティー精製したタンパク質を、SDS−PAGEゲル電気泳動によって分析した(図1)。上述したようにサイズ排除カラムでさらに精製したD2六量体を、SDS−PAGEによって分析した(図1)。意外なことに、両方の六量体(古典的な及びリジン含有)共に、六量体タンパク質の三量体のサイズに相当する45kd近辺に主要なバンドを呈した。六量体のこの凝集は、SDS−PAGEで使用される変性条件の下でも分離されないほど強い。さらに、両方の六量体タンパク質が、サイズ排除クロマトグラムにおいて約45kdの位置に移動した。特定の理論に縛られるものではないが、凝集して六量体の三量体を形成する六量体の驚くべき傾向は、D2六量体の改善された免疫反応性に寄与している可能性がある。
この実施例は、「古典的な」Hisタグ付与した組換え脱アミド化グリアジンタンパク質(配列番号7)の調製に使用したプロトコールを提供する。
10mgのカルボキシル修飾磁性ビーズを、マイクロチューブに入れる。1000μLの70%のエタノール(EtOH)中、50mM 2−(N−モルフィリノ)エタンスルホン酸(MES)pH6.1を、そのチューブに加える。該チューブを、ボルテックスにかけ、そして、ビーズを磁気的に分離する。上清を、ピペットで取り出し、捨てる。この洗浄工程をもう1回繰り返す。
1000μLのブロッキングバッファー(界面活性剤、塩化カルシウム、保存料及びブロッカーを含んで成る緩衝食塩水)をチューブに加えた。そのチューブを、混合しながら2〜8℃にてインキュベートする。インキュベーション終了時点で、ビーズを磁気的に分離し、そして、上清をピペットで取り出し、捨てた。
この実施例は、抗原としてHisタグ付与した古典的な組換え脱アミド化グリアジンタンパク質(配列番号7)を使用したセリアック病の検出のために使用した方法を提供する。
機器(Bio-Rad Laboratoriesが製造した)BioPlex2200は、サンプルチューブから5μLのサンプルを吸引し、45μLの洗浄バッファー(界面活性剤と保存料を含んで成るリン酸緩衝生理食塩水)によって追い出される該サンプルを反応器(RV)に分注する。
表1は、異なった濃度のDGP六量体における正常サンプルとセリアック病陽性サンプルについて検出されたシグナルの量(相対蛍光強度、RFI)を示す。
以下の一致試験は62個のセリアック病サンプルから成る。表2はDGP六量体と述語メソッド(predicate method)との比較の結果を示す。
この実施例では、「リジン含有」D2六量体タンパク質(N末端領域付近の14位にてグルタミン酸残基と置換したリジンを有する、Hisタグ付与した組換え脱アミド化グリアジンペプチド)(配列番号8)を、セリアック病に対する感度について試験した。
表4は、異なった濃度のDGP六量体における正常サンプルとセリアック病陽性サンプルについてのRFIを示す。
表5は、DGP六量体によって計測される正常サンプルとセリアック病患者サンプルに関する相対蛍光強度(RFI)を示す。患者の免疫反応性を、陽性の反応性が>1.0である抗体指数(AI)によって評価した。
62個のセリアック病サンプルから成る以下の一致試験は、DGP六量体対以前に記載したグリアジン抗原であるD2三量体組換え融合タンパク質(参照により本明細書中に援用されるUS2009/0311727ですでに記載した)の予測値を比較した。DGP六量体は、DGP三量体に対して改善された陽性の一致及び合計の一致を示した(表6)。これらの結果は、DGP三量体と比較して、DGP六量体の改善された感度を実証する。
以下の表7は、407個の正常サンプルのスクリーニングからのデータを示す。DGP三量体は25%の偽陽性を生じたが、それに対して、DGP六量体は0.5%の偽陽性しか生じなかった。偽陽性検出の特異性は≦1%である。
Claims (25)
- ペプチドの六量体を含んで成る組換え脱アミド化グリアジンを含んで成るセリアック病を検出するための抗原であって、各ペプチドが配列番号1の配列を有し、前記組換え脱アミド化グリアジンがタグに共有結合により連結されて、グリアジン融合タンパク質を形成し、前記グリアジン融合タンパク質が固相支持体上に固定され、且つ、前記組換え脱アミド化グリアジンが抗脱アミド化グリアジン抗体に結合できる、前記抗原。
- 前記六量体が各ペプチドを分離するスペーサーを含んで成る、請求項1に記載の抗原。
- 前記スペーサーが配列番号2の配列を有する、請求項2に記載の抗原。
- 前記六量体が配列番号3の配列を有する、請求項1に記載の抗原。
- 前記タグがグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)及びHisタグから成る群から選択される、請求項1に記載の抗原。
- 前記Hisタグが、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6から成る群から選択される配列を有する、請求項5に記載の抗原。
- 前記組換え脱アミド化グリアジンが、配列番号7及び配列番号8から成る群から選択される配列を有する、請求項6に記載の抗原。
- 前記タグがGSTである、請求項5に記載の抗原。
- 前記抗原が更に組織トランスグルタミナーゼ(tTG)を含んでなり、tTG−グリアジン融合タンパク質複合体を形成する、請求項5に記載の抗原。
- 架橋剤によって、前記tTGと前記グリアジン融合タンパク質が共有結合により連結されている、請求項9に記載の抗原。
- 前記架橋剤がヘテロ二官能性架橋剤及びホモ二官能性架橋剤から成る群から選択されるメンバーである、請求項10に記載の抗原。
- 前記架橋剤がホモ二官能性架橋剤である、請求項11に記載の抗原。
- 前記架橋剤が、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)、エチレングリコールビス[スクシンイミジルスクシネート](EGS)、エチレングリコールビス[スルホスクシンイミジルスクシネート](スルホ−EGS)、ビス[2−(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、ジチオビス(スクシンイミジル)プロピオネート(DSP)、3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP)、ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、ジスクシンイミジルグルタレート(DSG)、メチルN−スクシンイミジルアジペート(MSA)、ジスクシンイミジルタータレート(DST)、1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン(DFDNB)、1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリド(EDC又はEDAC)、スルホスクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(スルホ−SMCC)、N−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)、ヒドロキシルアミン及びスルホ−LC−SPDP(N−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオネート)、並びにスルホスクシンイミジル6−(3’−[2−ピリジルジチオ]−プロピオアミド)ヘキサノエート(スルホ−LC−SPDP)から成る群から選択されるメンバーである、請求項12に記載の抗原。
- 前記架橋剤がビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)である、請求項13に記載の抗原。
- セリアック病を検出するための抗原であって、
(a)固体支持体をグリアジン融合タンパク質と接触させるステップ
を含む調製方法によって調製され、
前記グリアジン融合タンパク質は、それぞれ配列番号1の配列を有するペプチドの六量体を含んで成る組換え脱アミド化グリアジンを含んで成り、且つ、前記グリアジン融合タンパク質が固相支持体上に固定されるように、前記組換え脱アミド化グリアジンはタグに共有結合により連結され、これにより、セリアック病を検出するための前記抗原が調製される、前記抗原。 - 前記組換え脱アミド化グリアジンが配列番号3の配列を有する六量体を含んで成る、請求項15に記載の抗原。
- 前記組換え脱アミド化グリアジンが、配列番号7及び配列番号8から成る群から選択される配列を有する、請求項15に記載の抗原。
- 前記グリアジン融合タンパク質がタグを介して固相支持体上に固定される、請求項15に記載の抗原。
- 前記調製方法が、接触ステップ(a)の前に、前記グリアジン融合タンパク質を組織トランスグルタミナーゼ(tTG)と接触させて、前記グリアジン融合タンパク質とtTGの間に少なくとも1つの共有結合を形成させることを更に含む、請求項15に記載の抗原。
- 前記調製方法が、
(b)前記抗原を架橋剤と接触させて、前記グリアジン融合タンパク質を前記tTGと架橋させること
を更に含む、請求項19に記載の抗原。 - 対象のセリアック病の検査方法であって:
(a)前記対象からの体液のサンプルを、配列番号3の配列を有する六量体を含んで成る組換え脱アミド化グリアジンを含んで成る請求項1に記載の抗原と接触させ、そして
(b)前記抗原に特異的に結合するようになった任意の抗体を検出し、これにより、前記対象におけるセリアック病の存在を示すこと
を含む、前記方法。 - 前記サンプルが血液サンプルである、請求項21に記載の方法。
- 前記検出ステップが、ELISA、RIA、及び免疫蛍光アッセイから成る群から選択されるアッセイを使用しておこなわれる、請求項21に記載の方法。
- 前記抗原に特異的な抗体がIgG及びIgAから成る群から選択される、請求項21に記載の方法。
- 配列番号3の配列を有する六量体を含んで成る組換え脱アミド化グリアジンを含んで成る請求項1に記載の抗原;
検出試薬;並びに
任意に、バッファー、塩、安定剤及び取扱説明書から成る群から選択される少なくとも1つのメンバー、
を含んで成るキット。
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