CN101870995B - 一种制备胶原三肽的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种制备胶原三肽的工艺，其步骤包括有鱼皮经一次碱液前处理，一次煮沸变性处理，一次枯草杆菌碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶分步复合水解。其中煮沸变性后要用纱布滤去残渣，三酶分步水解得到的水解液通过灭活、过滤、脱苦、脱色、真空浓缩和喷雾干燥即可得到蛋白质含量高、功能活性好的胶原三肽。本发明采用鱼皮为原料，扩展了胶原三肽的原料种类，且制备出的胶原三肽具有多种功效，具有广阔的商业前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备具有多种活性功能的胶原三肽的工艺。
背景技术
胶原肽用作化妆品原料，具有良好的细胞黏结性、吸收性和生物相溶性，在化妆品中作为保湿剂和皮肤保护剂，可促进上皮细胞形成，直接补充人体流失的胶原蛋白，延缓皮肤衰老，可用于祛皱、保湿和修复等。
其中胶原的最小单元是胶原三肽(Collagen tripeptide)简称CTP。其结构可以表示为(Gly-X-Y)，是一种在N端带有甘氨酸的高纯度的胶原三肽。在应用于皮肤表面时，呈现出优异的保湿效果和丝毫不会出现过敏。微量射线自动照相法研究表明，CTP具有约280Da的平均分子量。
长期以来胶原主要是从牛和猪等动物组织中提取的。可近年来疯牛病和口蹄疫的发生使人们开始考虑使用牛、猪胶原的替代品。研究表明，鱼皮胶原具有安全性高、细胞黏结性好、透明、无臭和无刺激作用等特点，可作为化妆品的新原料。但对于鱼皮胶原的提取还需要进一步研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种以鱼皮为原料，生产胶原三肽(分子量280Da)的制备工艺。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种制备胶原三肽的工艺，其包括有以下步骤。对鱼皮原料进行前处理操作，洗净鱼皮、控水，加其质量5～6倍的水，再加入其质量0.5～2.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡1～2天，用自来水充分清洗浸泡后的鱼皮，直至pH值到7.0左右为止，控水备用。对经过前处理的鱼皮原料进行变性操作，其按照上述湿基原料质量的5～6倍加蒸馏水，100℃煮沸变性30～40分钟。将该变性后的水解液降温到50～70℃，滤去鱼鳞残渣和油脂，并加蒸馏水补足变性时蒸发的水分。对过滤后的物质进行蛋白酶水解，酶解过程为3～9小时。将酶解后所得到的水解液在温度95℃以上，灭活10分钟。将灭活后的水解液降温至50～70℃，滤布过滤。对过滤后所得产物进行脱色脱味。将所得滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
进一步的，在不同实施方式中，在蛋白酶水解过程中，其为在恒温50～70℃，首先加入鱼皮原料质量0.5～2.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶酶解1～3小时，再加入鱼皮原料质量0.5～2.0％的中性蛋白酶酶解1～3小时，再加入鱼皮原料质量0.5～2.0％的复合蛋白酶酶解1～3小时，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共酶解3～9小时。
进一步的，在不同实施方式中，在蛋白酶水解过程中，可适时补水，保持料液混合物体积不变。
进一步的，在不同实施方式中，其中所选用的水解液脱色脱味方法为活性碳柱吸附脱色脱味。进一步的，选用的活性碳柱可以是K15活性碳柱。
进一步的，由本发明涉及的制备工艺获得的胶原三肽，其具有多种活性功能，其组分90％左右分子量在1000Da以下。其中胶原三肽(分子量280Da)含量在50％以上。其理化指标如表1所示：
表1胶原三肽理化指标表
为评估本发明涉及的胶原三肽的制备工艺获得的胶原三肽产品的性能，进行了以下实验。
1、抑制酪氨酸酶活性实验
体外抑制酪氨酸酶活性实验证实，胶原三肽在2.0％浓度下酪氨酸酶抑制率可以达到30％左右。
2、体表保湿功能实验
按照1∶4的料液比配制受试物溶液，通过SK-II水分测定仪测定其体表保湿效果，结果证明胶原三肽的体表保湿效果较好。
3、体外保湿功能实验
按照1∶4的料液比配制受试物溶液，通过干燥器模拟恒温恒湿环境；用3M胶布模拟人体皮肤涂抹受试物溶液；单位时间测量失水量，折算失水率；结果证明胶原三肽的体外失水率较低，具有良好的保湿效果。
4、胶原三肽对小鼠皮肤中胶原含量的影响实验
将77只小白鼠分为对照组、普通胶原组(高、中、低三个剂量)和胶原三肽组(高、中、低三个剂量)，每组11只，对照组蒸馏水灌胃、胶原三肽组和普通胶原组分别用2g/50ml胶原三肽和普通胶原溶液按照人体剂量(即1.2g/60Kg.d)10、20、30倍剂量灌胃，40天后杀死。取背部皮肤8％硫化钠脱毛液脱毛后用氯仿乙醇脱脂液浸泡过夜去脂，取出洗净，真空干燥器烘干，剪碎作为皮肤样品测定羟脯氨酸含量。结果显示胶原三肽10倍组小鼠皮肤中的胶原(以羟脯氨酸折算)含量显著地高于对照组和普通胶原组，20和30倍组含量极显著高于对照组和普通胶原组，而对照组和普通胶原组无显著差异，可见胶原三肽能够有效地增加皮肤胶原含量。
5、胶原三肽对小鼠体重的影响实验
将88只小白鼠分为对照组、模型组、普通胶原组(高、中、低三个剂量)和胶原三肽组(高、中、低三个剂量)，每组11只，对照组喂食普通饲料，其余各组喂食高脂饲料。对照组和模型组蒸馏水灌胃、胶原三肽组和普通胶原组分别用2g/50ml胶原三肽和普通胶原溶液按照人体剂量(即1.2g/60Kg.d)10、20、30倍剂量灌胃，60天后称重进行统计学分析。结果显示模型组与对照组增重有极显著差异，造模成功；而与对照组、普通胶原组、模型组相比胶原三肽组小鼠增重极显著降低，可见胶原三肽具有普通胶原产品不具备的减肥功效。
相对于现有技术，本发明涉及的胶原三肽制备工艺，以鱼皮为原料，扩展了胶原三肽的原料种类。且制备得到的胶原三肽含量较高，除具有一般胶原产品的营养成分外，还拥有保湿、美白、瘦身、润肤等功效，可作为无毒副作用的化妆品或护肤品添加剂，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1是本发明涉及胶原三肽制造工艺的流程框图。
具体实施方式
请参阅图1所示，本发明涉及的胶原三肽制备工艺主要包括有以下步骤：
1、原料前处理
洗净鱼皮，控水(称重)，加其质量5～6倍的水，再加入其质量0.5～2.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡1～2天，用自来水充分清洗浸泡后的鱼皮，直至pH值到7.0左右为止，控水(称重)备用。本发明采用碱溶液处理方法，在去除原料中的非胶原蛋白的同时，还起到了一定的去腥作用。
2、变性
按照上述湿基原料质量的5～6倍加蒸馏水，100℃煮沸变性30～40min。
3、过滤
将上述变性后的水解液降温到50～70℃，用双层纱布滤去鱼鳞残渣和油脂，可视油脂去除情况重复过滤几次。加蒸馏水补足变性时蒸发的水分。
4、蛋白酶水解
恒温在50～70℃，首先加入鱼皮原料质量0.5～2.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶(Alcalase)酶解1～3h，再加入鱼皮原料质量0.5～2.0％的中性蛋白酶(Neutralproteinase)酶解1～3h，再加入鱼皮原料质量0.5～2.0％的复合蛋白酶(Protamex)酶解1～3h，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共酶解3～9h。这期间可适时补水，保持料液混合物体积不变。
5、灭活
将上述水解液95℃以上，灭活10min。
6、过滤
将上述灭活后的水解液降温至50～70℃，滤布过滤。
7、活性碳柱吸附脱色脱味
将上述滤液用K15活性碳柱脱色脱味，注意控制柱内液体动态平衡，以免漏碳。
8、干燥
将上述滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
以下将列举一些具体实施例。通过下述实施实例将有助于理解本发明，但不限制本发明的内容。
实施实例1：
投料50kg碱液(1.0％氢氧化钙)浸泡1天后的洗净沥干的罗非鱼皮，加水250L，煮沸变性30min，纱布过滤收集滤液，降温至50℃左右，加入0.25kg碱性蛋白酶，55℃水解1h，加入0.25kg中性蛋白酶，水解1h，加入0.25kg复合蛋白酶，水解1h，蒸汽灭酶10min；滤布过滤收集滤液约270L，过碳柱，最后浓缩、喷雾干燥制得胶原三肽5.1kg。
所制备的胶原三肽产品指标如下：
| 分子量范围 | 1 | II | III | IV |
| Mp(分子量Dalt) | ＞1000 | 1000～450 | 280 | ＜280 |
| 百分含量％ | 9.6 | 32.7 | 52.1 | 5.6 |
| 水分％ | 灰分％(干基) | 蛋白质％(干基) | 多肽％(干基) | 得率％ |
| 4.39 | 1.67 | 96.87 | 95.13 | 10.20 |
实施实例2：
投料60kg碱液(1.0％氢氧化钙)浸泡1天后的洗净沥干的罗非鱼皮，加水360L，煮沸变性30min，纱布过滤收集滤液，降温至60℃左右，加入0.60kg碱性蛋白酶，60℃水解1h，加入0.60kg中性蛋白酶，水解1h，加入0.60kg复合蛋白酶，水解1h，蒸汽灭酶10min；滤布过滤收集滤液约400L，过碳柱，最后浓缩、喷雾干燥制得胶原三肽6.3kg。
所制备的胶原三肽产品指标如下：
| 分子量范围 | I | II | III | IV |
| Mp(分子量Dalt) | ＞1000 | 1000～480 | 280 | ＜280 |
| 百分含量％ | 9.5 | 32.7 | 52.4 | 5.4 |
| 水分％ | 灰分％(干基) | 蛋白质％(干基) | 多肽％(干基) | 得率％ |
| 4.25 | 1.74 | 97.03 | 95.50 | 10.50 |
实施实例3：
投料55kg碱液(1.0％氢氧化钙)浸泡1天后的洗净沥干的罗非鱼皮，加水330L，煮沸变性35min，纱布过滤收集滤液，降温至50℃左右，加入0.275kg碱性蛋白酶，50℃水解1h，加入0.275kg中性蛋白酶，水解1h，加入0.275kg复合蛋白酶，水解1h，蒸汽灭酶10min；滤布过滤收集滤液约360L，过碳柱，最后浓缩、喷雾干燥制得胶原三肽5.7kg。
所制备的胶原三肽产品指标如下：
| 分子量范围 | I | II | III | IV |
| Mp(分子量Dalt) | ＞1000 | 1000～500 | 280 | ＜280 |
| 百分含量％ | 9.3 | 33.4 | 52.6 | 4.7 |
| 水分％ | 灰分％(干基) | 蛋白质％(干基) | 多肽％(干基) | 得率％ |
| 4.31 | 1.64 | 97.20 | 95.67 | 10.36 |
Claims (2)
1.一种制备胶原三肽的工艺，其特征在于，其包括有以下步骤：
洗净鱼皮、控水，加其质量 5～6 倍的水，再加入其质量 0.5～2.0%的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡 1～2天，用自来水充分清洗浸泡后的鱼皮，直至 pH值到 7.0 左右为止，控水备用；
对备用鱼皮进行煮沸变性操作，变性操作为按照备用鱼皮的质量加入 5～6倍的蒸馏水，100℃煮沸变性 30～40 分钟；
将变性后的水解液降温到50～70℃，滤去鱼鳞残渣和油脂，并加蒸馏水补足变性时蒸发的水分；
对过滤后的物质在恒温 50～70℃，首先加入鱼皮原料质量 0.5～2.0%的枯草杆菌碱性蛋白酶 Alcalase 酶解 1～3小时，再加入鱼皮原料质量 0.5～2.0%的中性蛋白酶 Neutral proteinase 酶解 1～3 小时，再加入鱼皮原料质量 0.5～2.0%的复合蛋白酶 Protamex 酶解 1～3小时，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共酶解 3～9小时；
将酶解得到的水解液在温度 95℃以上，灭活 10 分钟；
将灭活后的水解液降温至50～70℃，进行过滤操作；
对过滤后所得产物进行脱色脱味操作；
将所得滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
2.根据权利要求 1 所述的一种制备胶原三肽的工艺，其特征在于，其中在蛋白酶水解过程中，可适时补水，保持料液混合物体积不变。
3. 根据权利要求 1 所述的一种制备胶原三肽的工艺，其特征在于，其中所选用的水解液脱色脱味方法为使用活性碳柱进行吸附脱色脱味操作。
4. 根据权利要求 3 所述的一种制备胶原三肽的工艺，其特征在于，其中所选用的活性碳柱为 K15 活性碳柱。
5. 根据权利要求 1 所述的一种制备胶原三肽的工艺，其特征在于，其中获得的胶原三肽，其组分 90％左右分子量在 1000Da 以下。
6. 根据权利要求 5所述的一种制备胶原三肽的工艺，其特征在于，其中分子量为280Da 的胶原三肽含量在 50％以上。
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