JPH09510870A - グルタメート受容体を恒常的に発現する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、グルタメート受容体の恒常的な異所的発現のための真核細胞系を製造する方法に関し、前記細胞系はグルタメート受容体をコード化する核酸を含有する細胞を形質転換することにより製造される。前記方法は、細胞系の樹立中に少なくとも１つの以下の培養条件を満足することを特徴とする：ａ）形質転換した細胞をグルタメート前駆体を含有する培地中で培養する、ｂ）形質転換した細胞をグルタメート受容体アンタゴニストの存在下で培養する、ｃ）第１段階でグルタメート受容体の発現を抑制する条件下でおよび第２段階で抑制を終了する条件下で形質転換した細胞を培養する。本発明は更にこうして得られる細胞系およびその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 グルタメート受容体を恒常的に発現する方法 本発明は、真核細胞内のグルタメート受容体の恒常的な異所的発現、前記特性 を有する適当な組み換え細胞系の製造およびその使用に関する。 グルタメートは中枢神経系における最も重要な興奮性神経伝達物質（Trends i n Pharmacological Sciences 11,1990,126-132,Pharmacological Reviews 40,19 89,143-210,Trends in Pharmacological Sciences 13,1992,291-296）であり、 てんかん、精神分裂病および虚血のような多くの病理生理学的プロセスに含まれ る。 従ってグルタメート受容体はこれらの病気を治療する薬剤による作用を受ける ことを可能にする。 グルタメート受容体はイオノトロピック受容体（ＮＭＤＡ，ＡＭＰＡ，カイネ ート）およびメタボトロピック受容体に区別される。 しかしながら、本発明はイオノトロピックグルタメート受容体の種類のみに関 する。 ＡＭＰＡ、カイネートおよびＮＭＤＡ受容体およびメタボトロピック受容体の サブユニットの一次構造は解明されている（Nature 342,1989,643,Science 249, 1990,556,Neuron 8,1992,169）。 今日、文献には４個のラットＡＭＰＡグルタメート受容体サブユニット、Ｇｌ ｕＲ−Ａ，ＧｌｕＲ−Ｂ、ＧｌｕＲ−ＣおよびＧｌｕＲ−Ｄが記載されており、 これらはそれぞれ２種の接合変形、フリップおよびフロップで生じる（Science 249,1990,1580）。 更に、ＲＮＡ修正がマウスおよびラットＧｌｕＲ−Ｂに関して示され、これは 二次トランスメンブランドメイン内のＱ／Ｒ位置に関する。この２個のＧｌｕＲ −Ｂ変形は電気生理学的特性においてかなり異なる（Cell 67,1991,11-19,Neuro n 8,1992,189-198）。ＧｌｕＲ−ＡフリップおよびＧｌｕＲ−Ａフロップに関す るヒトｃＤＮＡも同様に公開されている（PNAS USA 88,1991,7557-7561,PNAS US A 89,1992,1443-1447）。 ＡＭＰＡ受容体サブユニットはホモメリック（homomeric）およびヘテロメリ ック（heteromeric）チャンネルの両方を形成できる。 ＮＭＤＡ受容体は、１種のＮＲ１サブユニット（Nature 354,3(1991)）および ４個のＮＲ２サブユニット（２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，２Ｄ）（Science 256,1217(199 2),Nature 358,36(1992),Nature 357,70(1992),FEBS Lett.313,34(1992),J.Biol .Chem.268,2836(1993)）の１種からなるヘテロメリック構造を形成することがで きる。 ＮＭＤＡチャンネルはＡＭＰＡチャンネルより遅い 動力学を示すが、高いＣａ²⁺透過性を有し、電圧に依存するＭｇ²⁺ブロックを有 し、コアゴニストとしてグリシンを必要とする。機能性カイネート受容体はサブ ユニットＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７（Neuron 5,583(1990),Nature 35 1,745(1991),EMBO J.11,1651(1992),Neuron 8,257(1992),FEBS Lett.307,139(19 92)）およびＫＡ１およびＫＡ２（Nature 351,742(1991),Neuron 8,267および77 5(1992)）からなる，これらのチャンネルはきわめて速い動力学およびＡＭＰＡ およびカイネートによるきわめて速い減感流の活性化により特徴づけられる。 これに関しては真核細胞内のグルタメート受容体およびサブユニットの遷移す る異所的発現のみが記載されている（Science 246,1990,556-560）。 しかしながら、グルタメート受容体アンタゴニストを同定する試験細胞として のこの遷移発現細胞の適合性は、完全に再現可能に製造できないために低く、従 ってこれにより得られる結果はたとえできるとしても大きな困難を伴ってのみ比 較可能である。 グルタメート受容体の恒常的な異所的発現は今日まで不可能であった。グルタ メートは必須アミノ酸であり、細胞の培地中の栄養素としてのその存在はグルタ メート受容体の恒常的刺激を生じ、これが生じるイオン流入の結果として速い細 胞の死を生じることがある。これは特に高いイオン流を可能にするイオンチャン ネルまたはＣａ²⁺透過性チャンネル（たとえばＮＭＤＡチャンネルまたはＣａ²⁺ 透過性ＡＭＰＡチャンネル）に適用される。 本発明の課題は、グルタメート受容体の恒常的な異所的発現を有する真核細胞 系を製造する方法を提供することであった。 前記課題は、グルタメート受容体をコード化する核酸で細胞を形質転換するこ とにより、グルタメート受容体の恒常的な異所的発現を有する真核細胞系を製造 する方法により解決され、前記方法は細胞系の樹立中に以下の少なくとも１つの 培養条件を維持することを特徴とする： ａ）形質転換した細胞をグルタメート前駆体を含有する培地中で培養する、 ｂ）形質転換した細胞をグルタメート受容体アンタゴニストの存在下で培養する 、 ｃ）第１段階でグルタメート受容体の発現を抑制する条件下でおよび第２段階で 抑制を終了する条件下で形質転換した細胞を培養する。 本発明による方法に適した細胞として真核細胞を使用することが一般的に可能 である。たとえば酵母および菌類のような低い成熟核からの細胞または昆虫細胞 を使用することが可能である。 有利にはほ乳類の細胞、たとえばＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ７を使用する 。 これらの細胞はグルタメート受容体をコード化する１種以上の核酸で形質転換 する。 本発明の方法は単一のグルタメート受容体サブユニットおよび数種のサブユニ ットの組み合わせの両方の恒常的発現に適している。これらは天然に生じるサブ ユニットの組み合わせまたは新しい、従って天然に生じないサブユニットの組み 合わせであってもよい。異なる種類からのサブユニットの組み換えも同様に可能 である。異なるサブクラス（たとえばＡＭＰＡ、カイネートおよびＮＭＤＡ）か らのグルタメート受容体サブユニットを組み合わせることも同様に可能である。 有利にはヒトグルタメート受容体の単一のサブユニットまたは単一のサブユニ ットの組み合わせを使用する。 形質転換に使用される核酸は一般に発現ベクターに結合して使用される。適当 な発現ベクターの選択は、特に形質転換される細胞に依存する。従って発現ベク ターの調節信号を細胞により認識することが保証されるべきである。 真核細胞内の発現のために多数のベクターを使用することができ、ベクターは 特に良好な発現を示すサイトメガロウィルスを有する。 発現構造を種々の方法により、たとえばエレクトロポレーション、燐酸カルシ ウム沈殿またはリポソーム媒介により細胞に導入することができる。 真核発現系は、相当する発現生成物を有効に、一般に天然の形で発現し、翻訳 後調節修正を実施するという利点を有する。本発明の細胞系を樹立するために、 前記ａ）、ｂ）およびｃ）の少なくとも１つの培養条件を満足しなければならな い。 しかしながら、１つ以上のこれらの培養条件を同時にまたは連続して維持する ことも可能である。 ａ）による培養条件下の細胞系の樹立中の細胞培養に使用される培地はグルタ ミン酸またはその塩（グルタメート）を含まない。培地は細胞内でグルタメート に転化する１種以上のグルタメート前駆体を含有する。 適当なグルタメート前駆体は、細胞によりそのまま吸収され、グルタミンが細 胞の内部で遊離し、その後代謝反応によりグルタメートに転化する化合物である 。 前記化合物の例はグルタミン含有オリゴペプチドまたはオリゴペプチド誘導体 、たとえば相当するエステルまたはアミドである。無極性アミノ酸およびグルタ ミンのジペプチドが特に適している。 グルタメート前駆体を含有する培地は、たとえば Gibco BRL社 の Glutamax m edium として市販されており、これはグルタメート前駆体としてジペプチド、Ｌ −アラニル−Ｌ−グルタミンを含有する。 グルタメート前駆体を有する予備混合した市販の培 地を使用しない場合は、グルタメート前駆体を一般にμＭ範囲、有利には１〜１ ００μＭの最終濃度で培地に添加する。 本発明の方法に関するほかの可能な培養条件は、グルタメート受容体アンタゴ ニストの存在下で形質転換した細胞をｂ）に記載された条件で培養することであ る。 これらの化合物は恒常的に発現したグルタメート受容体の連続的刺激を防ぐ。 これはそうでなければ連続的刺激中に生じる細胞の死を防ぐことを可能にする。 適当なグルタメート受容体アンタゴニストの例は、ＮＢＱＸまたはＣＮＱＸであ る。培地内のこれらの化合物の最終濃度は一般にμＭの範囲内である。 ほかの可能な培養条件はグルタメート受容体発現のｃ）に記載された一時的抑 制である。これは培養条件に依存して開始または中断する誘導発現系を使用する ことにより実施する。細胞系の樹立および培養の第１段階で選択される培養条件 はグルタメート受容体発現が抑制される条件である。その後第２段階で抑制を終 了し、受容体発現を生じる。 有利な誘導発現系はテトラサイクリンオペロンにより制御される系である。 本発明は更にグルタメート受容体の恒常的な異所的発現を有し、前記方法によ り製造できる細胞系に関する。 この種の細胞系は特にグルタメート受容体の機能性リガンドを同定するために 適している。 受容体発現細胞系は特定の受容体リガンドをスクリーニングする際の重要な手 段である。この目的のために、たとえば受容体結合測定に細胞系の膜を使用する ことが可能である。 受容体リガンドの作用の形式（アゴニズム／アンタゴニズム）に関する情報は 本発明の細胞系にリポーター系を導入することにより得られる。適当なリポータ ー系は信号形質導入経路（二次メッセンジャー）の化合物により制御されるプロ モーターがルシフェラーゼのような容易に検出できる生成物の遺伝子に機能的に 接続されている系である。この種のリポーター系は、たとえばScience 252,1424 (1991),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,5061(1991)またはJ.Rec.Res.13,79(1993)に 記載されている。たとえば細胞内Ｃａ²⁺濃度により制御される適当なプロモータ ーはフォス遺伝子のプロモーターである。特にＺｎ²⁺により刺激されるメタロチ オネインプロモーターが同様に適している。 受容体にリガンドを結合することにより引き起こされる細胞内イオン濃度の変 化は発光染料（たとえばＦＵＲＡ ２ＡＭ，ナトリウムグリーン、カルシウムグ リーン、エコーリン（aequorin）（Analyt.Biochem.209,343(1993)））によりま たは化学的検出反応（たとえばイオンの沈殿（Neuron 7,509(1991)））により測 定 することができる。 リガンド結合の関数として細胞膜を通過する電流流量を測定することが同様に 可能である。 適当な精製後、発現した受容体プロテインを、診断目的にまたは合理的薬剤目 的の補助物質として使用される多クローン性または単クローン性抗体を生じる抗 原として使用することができる。晶出およびＸ線構造分析またはほかの物理的方 法、たとえばＮＭＲまたは走査式トンネル顕微鏡の後に受容体およびリガンド結 合位置の空間構造を解明するために、純粋のポリペプチドを使用することもでき る。本発明の細胞系は、信号形質導入に影響を及ぼすためにまたはリガンド濃度 を分析するために、形質転換した動物または宿主生物のような受容性の系に挿入 することができる。 本発明を以下の実施例により詳細に説明する。 例１ ＨＥＫ２９３細胞中のグルタメート受容体サブユニット（ＡＴＣＣ）の安定な 発現 アデノウィルスタイプ５で形質転換したヒト胎児腎臓細胞をＣＯ₂５％下で、 透析したＦＣＳ１０％（Gibco BRL）を有するＲＰＭＩ１６４０glutamax medium Ｉ（Gibco BRL）中で培養した。 適当なグルタメート受容体ｃＤＮＡ分子（WO93/23536;Science 249,556-560,1 990;J.Biol.Chem.268,3728-3733,1993;WO91/06648）を異所的発現ベクターｐｃ ＤＮＡ３（Invitrogen）にクローン化した。この発現構造をＨＥＫ２９３細胞に 、単独でまたは以下の条件によるエレクトロポレーションと組み合わせて導入し た。エレクトロポレーションのために、エレクトロポレーター（ＢＴＸ,electro cell manipulator 600,3mF,130V,72ohm）を使用してＰＢＳ０.８ｍｌ中の１０⁷ セルを発現構造２０μｇでトランスフェクションした。 細胞を培地中で２４〜３６時間インキュベーションし、引き続き選択培地（６ ００〜８００μｇ／ｍｌＧ４１８スルフェート、ゲネチシン（geneticin）また は５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを有する培地）に転移した。１０〜１２日後 に単一の細胞沈殿により安定のゲネチシンまたはハイグロマイシン耐性細胞クロ ーンを単離し、拡大し、膜結合測定により分析した。 例２ グルタメート受容体を安定に発現する細胞系の膜での受容体結合測定 組み換え細胞系を例１に記載のように培養した。 膜の製造：５ｍＭトリス２〜３ｍｌ,ｐＨ７.４／１０ｃｍ皿中でセルをかき出 し。回転させた（１２００ｒｐｍ，４℃）。ペレットを氷冷したトリス１ｍｌ（ ５ｍＭ,ｐＨ７.４）中で再懸濁し、氷上で１５分インキュベートし、引き続き４ ℃で１１５００ｒｐｍで回転させた。ペレットを結合緩衝液１.５ｍｌ／１０ｃ ｍ皿（トリス３０ｍＭ,ｐＨ７.２,１０℃,ＣａＣｌ₂２.５ｍＭ,ＫＳＣＮ１００ ｍＭ）中で再懸濁し、均質化し、遠心分離した（１１５００ｒｐｍ，３０分，４ ℃）。上澄みを再び均質化し、遠心分離した。膜ペレットを結合緩衝液１５０μ ｌ／１０ｃｍ皿中で再懸濁し、結合測定に使用した。 結合混合物：結合緩衝液中の膜５０μｌを結合緩衝液１４９μｌおよび³Ｈ− ＡＭＰＡ（６００ｍＭ）１μｌとともに氷上で１時間インキュベートし、ＧＦＣ フィルタで濾過し、結合緩衝液で洗浄し、算定した。置換反応のために、結合緩 衝液中の膜５０μｌを結合緩衝液１４７μｌ、グルタメート２μｌ（１００ｍＭ ）および³Ｈ−ＡＭＰＡ（６００ｍＭ）１μｌとともにインキュベートし、結合 剤混合物として処理した。 例３ 信号形質導入経路（二次メッセンジャー）でのリガンドの結合作用を検出する ために使用することができるリポーター系 細胞を培養し、例１に記載されるようにトランスフェクションした。 トランスフェクション後、細胞クローンを誘導発現に関して検定した。この目 的のために、細胞を９６個のウェルプレート（不透明なマイクロタイトル（micr otitre）プレート）中で培養した。細胞を刺激して２〜４８時間後に細胞の溶解 により測定を中断した。溶 解、細胞抽出物の製造およびルシフェラーゼ活性の決定をその指令によりルシフ ェラーゼ測定（Promega,No.E1500）を使用して行った。ルシフェラーゼ活性を一 般のルミノメータで測定した。 例４ グルタメート受容体のための機能性リガンドの同定、測定、発光染料の使用、 細胞内イオン濃度の変化をリガンドの結合により行った。 組み換え細胞系を例１に記載されるように培養した。 ＦＵＲＡ２、細胞の標識：細胞をトリプシンまたはＥＤＴＡで分離し、標識緩 衝液（ＮａＣｌ１２０ｍＭ,ＫＣｌ５ｍＭ,ＭｇＣｌ₂１.５ｍＭ、ＣａＣｌ₂１ｍ Ｍ,ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ,グルコース１０ｍＭ）で洗浄した。標識緩衝液中の細胞 （２×１０⁶／ｍｌ）を３７℃で１５分２μＭＦＵＲＡ−２−ペンタアセトキシ メチルエステルで標識し、引き続き標識緩衝液で洗浄した。標識サンプルを氷に 保存し、３時間以内で測定手段として使用した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 トーマス ヘーガー ドイツ連邦共和国 Ｄ−68535 エーディ ンゲン−ネッカーハウゼン ラーテナウシ ュトラーセ 12 (72)発明者 ハンス−ゲオルク レマイレ ドイツ連邦共和国 Ｄ−67117 リムブル ガーホーフ マインシュトラーセ ８ (72)発明者 アルフレート バッハ ドイツ連邦共和国 Ｄ−69123 ハイデル ベルク ネッカーハム 28

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．グルタメート受容体をコード化する核酸で細胞を形質転換することにより、 グルタメート受容体の恒常的な異所的発現を有する真核細胞系を製造する方法に おいて、細胞系の樹立中に少なくとも１つの以下の培養条件を維持することを特 徴とする、グルタメート受容体の恒常的な異所的発現を有する真核細胞系を製造 する方法： ａ）形質転換した細胞をグルタメート前駆体を含有する培地中で培養する、 ｂ）第１段階でグルタメート受容体の発現を抑制する条件下でおよび第２段階 で抑制を終了する条件下で形質転換した細胞を培養する。 ２．グルタメート前駆体としてグルタメート含有ジペプチドを使用する請求の範 囲１記載の方法。 ３．請求の範囲１または２記載の方法により得られるグルタメート受容体の恒常 的な異所的発現を有する細胞系。 ４．グルタメート受容体の機能性リガンドを同定するための請求の範囲３記載の 細胞系の使用。