JPH04501955A - 新規レセプター：それらの同定、特微付け、製造および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １６．請求項１５の細胞および該細胞の生存を確保する外来性維持培地を含有す る細胞培養物。

１７、請求項１２のヒトレセプターを調製するプロセスであって、該レセプター をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた組換え宿主細胞中での発現を包含 するプロセス。

１８、請求項１２のレセプターを、アッセイに使いうるに十分な質および量を有 する形態になるように回収および精製することを包含するプロセスであって、該 アッセイは、該レセプターの外因誘導された生物学的機能性の測定を可能にする 、プロセス。

１９、ホルそンまたはホルモン様のレセプターの機能性を測定する生物学的アッ セイにおいて、 （ａ）レセプターを有しない細胞のなかに、作動可能なりポーターあるいは他の 所望のＤＮＡと機能的に結合した作動可能なホルモン応答プロモーター／エンハ ンサ−エレメントと前記レセプターをコードする作動可能なりＮＡ配列とを有す る１種あるいは２種以上の発現ベクターをトランスフェクトする工程、 （ｂ）工程（ａ）で得られた該トランスフェクト細胞を、該ホルモン応答プロモ ーター／エンハンサ−エレメントを活性化する推定上の能力を持つ外来性物質の 存在下あるいは非存在下で培養する工程、 （Ｃ）該リポータ−あるいは所望のＤＮＡ配列の生成物の誘導を該細胞において モニターする工程、および（ｄ）リポータ−あるいは他の所望ＤＮＡの発現を該 細胞で測定する工程、 を包含し、該ホルモンまたはホルモン様のレセプターが、もとのレセプターと比 べてそのトランス作用転写活性が高められており、もとのレセプターに付加的な 該活性が、該レセプターの分子内のＤＮＡ結合ドメインおよびリガンドＭ合ドメ インとは別の場所に位置するドメインあるいはその機能的断片部分によるという 、改良法を含む生物学的アッセイ。

明細書 レセプター：　それらの口　１．　・け、毀鳳遺」５１服 閲１は１月 関連出願としては、ＰＣＴによる国際特許出願公開第Ｗ０８８１０３１６８号お よび欧州特許出願公開第０３２５８４９号がある。これらの公開された出願は、 ホルモンレセプターおよびそれらの組成物、およびそれらの製造方法、および特 に新規なアッセイシステムにおける使用を様々な面から言及している。これら両 方の公開された出願の全説明は、本明細書に参考として援用されている。

（以下余白） 穴ｊ！ソ五肚 本発明は、一般には、トランス作用転写活性化ドメイン（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｏｎ　ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｔｏｎ　ｄｏｍａｉｎ）として機能する特 定のポリペプチド配列の同定および特徴付けに関する。本発明はまた、これらの ポリペプチドの調製および使用に関し、特に新規な細胞内のホルモンまたはホル モン様のレセプター、例えば、人間のそれを含むステロイドレセプターポリペプ チド、テロイドポリペプチド、およびレチノイドポリペプチドに関する。本発明 では、前記のドメインの効果を増加させることによって、転写開始活性をトラン スに活性化する利点が提供される。

とりわけ、本発明は、このような新規なレセプターポリペプチドに向けられ、ト ランス作用転写活性化ドメインの効果が増強されて、もとの分子より非常に優れ た転写開始活性の増大を示す新規なレセプターが製造される。

このようなトランス作用転写活性化分子の調製に関する新規な点が本発明の範囲 に含まれるが、この調製には、以下が包含される：　トランス作用転写活性化ド メインをコードする新規なりＮＡ単離物；　これらのＤＮＡ配列を機能的にもつ 発現ベクター；　および該ベクターで形質導入された宿主。

とりわけ、本発明は、本発明の新規なトランス作用転写活性化ホルモンまたはホ ルモン様のレセプターを、これらの新規なホルモンまたはホルモン様のレセプタ ーに対し、有効な結合親和性を有しうる様々な推定物質のスクリーニングアッに 用いることに関する。好ましい実施態様において、本発明はこの点で、このよう な推定物質、例えば、ステロイドホルモンアゴニストおよびアンタゴニスト、の 効率のよい、いわゆるトランス作用転写活性化システムにおけるスクリーニング アッセイを提供する。

１豆Δ五五 前に別層された特許出願は、特に、様々なホルモンおよびホルモン様レセプター の特徴付け、および調製を開示する。

このレセプターには、例えば、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、チ ロイド、エストロゲン関連物質、およびレチノイドクラスに代表されるようなス テロイドホルモン、甲状腺ホルモン、およびレチノイドホルモンレセプター、特 にグルココルチコイド、エストロゲン、アルドステロン、およびレチノイし酸レ セプター自身が含まれる。これらの特定のレセプターは、重要な研究の主題であ り、これらの特許出願に開示され、請求されている発明に対し、重要な基礎を形 成する。同様に、現存する類似の科学文献は、存在するレセプターのクラスのう ち、上記の特定のレセプターに重点を置いてきた。

例えば、グルココルチコイドレセプターは、それ自身がホメオスタシス、成長、 および発育に様々な役割を果たすリガンド依存性転写因子の、大きいスーパーフ ァミリーに属することが知られている。これらのレセプターをコードする相補鎖 ＤＮＡの比較、およびコードするＤＮＡ配列の突然変異導入分析により、その分 子内でそれぞれＤＮＡ結合、ホルモン結合、および核局在性の役割があると考え られる特定の機能ドメインが同定された。　この主題の総説に関しては、Ｅｖａ ｎｓら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０ｓ　８８９　（１９８８）　を参照のこと。

グルココルチコイドレセプターの場合、いわゆるＤＮＡ結合ドメインは、約６６ 個のアミノ酸にわたり、様々な生物種間で高度に保存されている。このドメイン はまた、転写を活性化するのに必要であることが見いだされた。Ｈ。

１１ｅｎｂｅｒｇらの、ｃｅｔｔ　土９　３９　（１９８７）、Ｍｉｅｓｆｅｌ ｄらの、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６．４２３（１９８７）、Ｄａｎｉｅｌｓｅｎら の、Ｍｏｌ　Ｅｎｄ。

上、８１６　（１９８７）、Ｋｕｍａｒらの、ｃｅｔ上　ｉ上、９４１　（１９ ８７）、Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒの、ＥＭＢＯＪ、６．３９８５　（１９８７）、 およびＷａｔｅｒｍａｎらの、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏ　２．１４　（１９８８）を 参照のこと。この領域は、９個の不変のシスティン残基を含むことが見いだされ た。全体の機能に対する各々のシスティン残基の寄与、およびこのドメインが形 成する実際の構造は知られていない。しかし、これらのシスティン残基が、２個 の亜鉛イオンを配位して、いわゆるフィンガードメインと呼ばれる２個のＤＮＡ 結合を形成し、その結果、必要なりＮＡ部位に位置し結合するためと思われる三 次構造をとるのではないかといわれている。ＫｌｕｇらのＴｒ、ＢＩｏｃｈの、 Ｃｅ１ｌ　５２．１　（１９８８）、およびＥｖａｎＳの前出文献を参照のこと 。

ＤＮＡ結合領域よりＣ末端側に近い場所に、いわゆるリガンド結合ドメインがあ る。このドメインは、ホルモン不在の状態でレセプターの活性を妨げるという能 力が示されている。

すなわち、必要なホルモンの存在は、レセプターの阻害を排除し、活性化する。

本領域が欠損すると、ホルモン非依存性の転写活性因子が生成されることが知ら れている。Ｇｏｄ。

ｗ　ｓ　ｋ　ｉらの、Ｎａｔｕｒｅ　３２５．３６５　（１９８７）、Ｈｏｌ　 ｌ　ｅｎｂｅｒｇらの前出文献、Ｋｕｍａ　ｒらの前出文献、Ｄａｎ　ｉ　ｅ　 ｌ　ｓ　ｅｎらの前出文献、およびＡｄｌｅｒらの、Ｃｅ１ｌ　５２．６８５　 （１９８８）を参照のこと。

これら２つのドメインとは対象的に、ＤＮＡ結合ドメインよりＮ末端側に位置す る配列は、構造および特に機能の両方ともにほとんど知られていない。この領域 は、様々なレセプター間で、大きさおよび組成の両方が非常に異なり（Ｅｖａｎ ｓの前出の文献参照のこと）そしてレセプター機能の多様性に寄与しているらし い。Ｋｕｍａｒらの前出文献、およびＴｏｒａらの、３３３．１８５　（１９８ ８）を参照のこと。

さらに分析がなされ、そのいくつかが科学文献にも報告されたにもかかわらず、 転写開始のトランス活性化を決定する領域は、その特性がほとんど判っていない 。トランス活性化ドメインは、以下のようなポリペプチド領域として定義されう る。すなわち、ＤＮＡ結合機能ドメインと組み合わされたとき、ＲＮＡポリメラ ーゼによる生産的な転写開始を増加するポリペプチドであるｏ　５１ｇ１ｅｒの 、Ｎａｔｕｒｅ　３止１．２１０　（１９８８）、　Ｂｒｅｎｔらの、Ｃｅ１ｌ 土主、７２９　（１９８５）、Ｈｏｐｅらの、Ｃｅ１１４６．８８５　（１９８ ６）、Ｍａらの、Ｃｅ１ｌ　４８．８４７　（１９８７）、Ｍａらの、（ｅｌｆ 　Ｓ上、１１３　（１９８７）、Ｌｅｃｈらの、Ｃｅ１ｌ　５２、　１７９　（ １９８８）、およびＨｏｐｅらの、Ｎａｔｕｒｅ３３３、　６３５　（１９８８ ）を参照のこと。

リンカースキャンニング変異導入によるヒトグルココルチコイドレセプターに関 する以前の研究で、ＤＮＡ結合領域以外の、転写活性の役割を有する２つの領域 が同定された。これらの領域は、τ１およびτ２と定義された。ａｔｇｕｅｒｅ ら、Ｃｅ１ｌ　４６、　６４５　（１９８６）。さらに、これらの研究室での更 なる研究の結果、トランス活性化、およびＤＮＡ結合機能が同じ場所に配置され ていることが報告された。Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇらの前出文献、Ｍｌｅｓｆｅｌ ｄらの前出出文献、ＤａｎｉｅｌＳｅｎらの前出文献、Ｗａｔｅｒｍａｎらの前 出文献参照のこと。まとめると、この研究は、別々のドメインの複数モジュール で構成される１つの分子の像を次第に浮かびあがらせたにすぎない。それぞれの ドメインは、リガンド結合、ＤＮＡ結合、および転写のトランス作用活性化とい う、同定された性質に寄与している。しかしながら現在まで、トランス活性化の 活性を決定する領域領域は、全く、よく知られていなかった。したがって、現在 までの研究を基にして作られた知見は、ステロイドホルモンレセプターの動的な 性質、および多様なドメインが、どのように、リガンド結合に始まりプロモータ ー特異的なトランス活性化に終わる一連の出来事を、決定しているのかについて の認識が欠けている。

さらに、以前の研究では、機能的ドメインが同定されたが、この分子自身の特定 の活性に寄与するアミノ酸を同定する系統的な研究はなされていない。つまり、 前述のステロイドホルモンレセプターのトランス活性化領域の同定は、欠失、あ るいは挿入の突然変異によって示された失活からなされた。

領域自身の性質が、優占的機能を反映するアッセイによって確認された例はない 。

Ｇｏｄｏｗｓｋｉらは、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１．８１２（１９８８）で、グ ルココルチコイドレセプターは、グルココルチコイド応答エレメント結合領域と 重なるドメイン以外に少なくとも１つの「促進ドメイン」を有すること、および その第２ドメインは、レセプターのＮ末端近くの領域を占めることを示す結果を 報告する。同様に、Ｗｅｂｓｔｅｒらは、Ｃｅ１ｌ　５土、１９９　（１９８８ ）で、エストロゲンおよびグルココルチコイドレセプターの誘導可能な転写活性 化機能を報告している。彼らはホルモン領域（すなわち、リガンドおよびＤＮＡ の結合ドメイン）の相対位置が、レセプターの転写誘導活性に重要ではないと推 察している。しかし彼らはまた、彼らの言うホルモン誘導性活性化ドメインの、 そのトランス活性化能力における特性および役割については言うまでもなく、正 確な位置および性質は、明らかにされてないと認めている。

本発明の出発点として、Ｇｉｇｕｅｒｅら（前出）は、転写活性化測定のアッセ イに基づいて、グルココルチコイドレセプターが、分子の数カ所の位置にランダ ムに部位特異的突然変異導入された時、失活したことを示した。これをうけて、 Ｈｏｔ　ｌ　ｅｎｂｅｒｇらは、分子内の領域を欠失させることにより、転写活 性の全体的な失活が、アミノ酸鎖のそのような除去によって引き起こされること を再び示した。

本発明の目的は、以下に示すとおりであるニドランス作用転写活性の役割を果た すドメインの同定および特性付け、並びに該ドメインのアミノ酸組成および配列 の点からの特性付けを行うこと；　与えられたレセプター中に、もしあれば、該 ドメインの、ＤＮＡ結合およびリガンド結合ドメインの両者との機能的相互作用 を探究すること；　そして最後に、同定され、特性付けられたトランス作用転写 活性ドメインを操作された所与のレセプターの全体的な転写活性が高まるように 操作することにより、その知識を利用すること。

本発明は、このように新規なホルモンまたはホルモン様のレセプターを提供する 。該レセプターは、トランス作用転写活性化ドメインの同定および特性付けの知 識を利用して、改された。この改変により、もとの分子よりも高い活性を持つ、 新規なヘテロレセプターがつくられる。新規な、ヘテロの、随意にハイブリッド されたレセプターを提供することは、本発明の目的である。このハイブリッドレ セプターは、高いトランス作用転写活性化活性を有し、他の点では、様々な異な るレセプターから借りうる、ＤＮＡ結合およびリガンド結合ドメインを有する。

新規なアッセイを提供することは、本発明の更なる目的である。このアッセイで は、推定のレセプターアゴニストおよびアンタボニスをスクリーニングすること が可能で、商業上の利用の可能性が評価されうる。Ｐｔａｓｈｎｅの、Ｎａｔｕ ｒｅ　３３５．６８３　（１９８８）　も参照のこと。

１児旦！且 本発明は、細胞内のホルモンまたはホルモン様のレセプターポリペプチドのトラ ンス作用転写活性化ドメインの同定、分離、および特性付けに基づき、次に、物 理的特徴と生物学的な機能の両面に関するレセプター自身の特徴付け、およびそ の様々なドメインの効果を明らかにすることが可能となる。

この情報は、次に、ここで言う、増加した転写活性化活性を有する新規なレセプ ターの調製に有用な、動力化した組換えシステムの生産を可能にする。

ここで提供された情報に基づき、レセプターは、トランス作用転写活性化ドメイ ンを含有し、該ドメインは、位置に非依存的であり、自律的に機能することが確 かめられた。すなわち本発明は、新規なホルモンまたはホルモン様のレセプター を提供するが、該レセプターは、トランス作用転写活性化ドメインが、転写活性 能力において高められている。本発明のこのような新規なレセプターは、もとの 分子に加えて、転写活性をより高めるよう配置したトランス作用転写活性化ドメ インを含有する。これらの新規なレセプターは、ハイブリッドで有り得る。　こ のときＤＮＡ結合およびリガンド結合ドメインは、同じ、あるいは異なるクラス および／または種のレセプターから提供される。

本発明はまた、このような新規なレセプターのｉｎ　ｖｉｔｒｏでの生物学的ア ッセイへの利用に向けられる。このアッセイは、推定のレセプター、あるいは推 定のホルモンまたはホルモン様の物質の機能性を測定する。生物学的アッセイは 、たとえば、ここで言う新規なレセプターに、１つあるいはそれ以上の一連の試 験物質を与え、ｉｎ　ｖＩｔｒｏにおいて、該レセプターに対する該物質の効果 を検出するという形式で行われうる。この試験物質は推定のホルモンあるいはホ ルモン様活性を有し、該レセプターの生物学的機能を調節する可能性がある。

本発明は更に、本願の新規なレセプターの調製に向けられるが、それは関連した 全ての面で、組換えＤＮＡ技術を用い、組換えＤＮＡ分子であるＤＮＡ分子、あ るいは前記レセプターあるいはここで言うトランス作用転写活性ドメインをコー ドするｃＤＮＡ分子を包含する。本発明はさらに、発現のために選択された組換 えの宿主内で機能する発現調節エレメントを有するＤＮＡを機能的に担っている 必須の発現ベクターにむけられる。本発明はさらに、このような機能的な発現ベ クター、でトランスフェクトされた宿主細胞にも向けられる。

本発明はさらにリポータ−分子あるいはその他の所望のへテロポリペプチドをコ ードするＤＮＡの発現の誘導方法に向けられる。この方法は、本願の新規なレセ プターと該レセプターに結合可能な対応するリガンドとの複合体によって、前記 ポリペプチドをコードするＤＮＡの、転写開始を誘導する工程を包含する。上記 のことは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてなされるが、前記レセプターおよび前記ポ リペプチドをコードする前Ｗｅ　Ｄ　Ｎ　Ａは、トランスフェクトされた細胞宿 主システム中の組換え発現によってつくられる。

本発明は、従って、ホルモンまたはホルモン様のレセプターを、プロモーターへ のトランス作用転写活性が高められたポリペプチド、およびそれぞれと対応する もとのレセプターのトランス作用転写活性より優れた活性を持つポリペプチドと して包含する。プロモーターとそのポリペプチドとは、前記プロモーターのＤＮ Ａ配列応答エレメントに結び付く本質的な能力、あるいは該ＤＮＡ配列応答エレ メントと結合している他のポリペプチドと結び付（能力によって結び付いている 。

する全ての局面において、ＤＮＡ組換え技術が関与するものである。この特性は 、クロスハイブリダイズ可能なりＮＡ単離物を含むＤＮＡ単離物の製造、そのた めの発現ベクターの考案、それを用いてトランスフェクトした宿主の製造、およ びこのような情報を利用した使用方法を包含する方法に用いられる。この使用方 法は、前記レセプターを生産するのに充分な遺伝情報を担う細胞あるいは細胞系 を考案するものであり、前記細胞あるいは細胞系によって生産されたレセプター は、レセプターとして、あるいは発現系において、あるいは対応する推定リガン ドの活性を測定するためのアッセイに用いられ得る。

ｌ豆恋１皿星五皿 １、　ＩＩＥＬ皿立１星呈笠ユ 第１図は、もとの分子のトランス作用転写活性化ドメイン（τ、）を改変した、 様々なヒトグルココルチコイドレセプタ−（ｈＧＲ）の構成、および転写開始活 性を示している。野、生型ｈＧＲ（ｗｔ）およびτｌの変異体が、図式的に表さ れている。機能的な領域は、斜線（τ１）、点画（ＤＮＡ結合ドメイン）、ある いは“ＤＥＸ”　（ホルモン結合ドメイン）で示されている。各々のレセプター 上の番号は、アミノ酸の位置を示している。太い縦線は、挿入フラグメントの境 界を明らかにしている。ルシフェラーゼ（リポータ−分子）の相対活性は、活性 の後に「Ｃ」と表した構成的に活性のあるレセプターを除き、１０−７Ｍのデキ サメタシン（対応するステロイド）をもちいて、ＭＴＶ−ＬＵＣで測定した。

第２図は、ここでの様々なτ２レセプターのルシフェラーゼ活性を示している。

野生型ｈＧＲは１番上に示す。τ２領域は、アミノ酸の５２６位から５５６位に わたっており、黒の長方形で示しである。τ１領域の入れ換えは、黒長方形（τ ２）あるいは両性αヘワックス（「ａａｈＪ）の斜線長方形で示されている。ル シフェラーゼの相対活性は、１０−７Ｍのデキサメタシン存在下のＭＴＶ−ＬＵ Ｃで測定され、ホルモン非依存性の場合は、後ろに「Ｃ」を記しである。星印は 、切断された分子のアミノ酸末端の位置を示す。

第３図は、グルココルチコイド−甲状腺ホルモンレセプターのハイブリッドステ ロイドホルモンレセプターの構築を示している。該レセプターのトランス作用転 写活性化活性は、τ１ドメインの付加によって高められている。７７位から２６ ２位のアミノ酸配列をコードする、ヒトグルココルチコイドレセプターのｃＤＮ Ａ断片（τ１ドメインをコードする）を、ラットα甲状腺ホルモンレセプターの ｃＤＮＡの２１位のアミノ酸に対応する部位に、１あるいは複数コピー挿入した 。

もとのレセプターは、Ｎ末側の唯一のＢｓｔＥＩＩ部位にＢａｍＨＩリンカ−を 挿入したｒＴＲαである。構築した物をＴＨＥ−ＣＡＴとともにＣＶ−１細胞に トランスフェクトし、Ｔ３の非存在下あるいは存在下で、ＣＡＴ活性を測定した 。

第４図は、ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインの点変異導入分析を示している。ｈＧＲ のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列が示されている。各行は、分かれているエ クソン部分にコードされていると思われる情報を表す。ステロイドホルモンレセ プターのスーパーファミリーのコンセンサス配列（ＣＯｎ）をｈＧＲ配列の下に 表し、不変のアミノ酸（太字）、保存されているアミノ酸（標準の字）、保存さ れていないアミノ酸（ダッシュ）をそれぞれ示す。リジンで置き換えたアミノ酸 の上には丸印をつけである。変異体の転写活性は、ＭＴＶ−ＣＡＴで測定し、ｈ ＧＲ−３Ｖと比較して次の様に示しである。すなわち、１０％より大きい（黒丸 ）、１％から１０％（半分の黒丸）、１％より少ない（白丸）。

２、−５　・な　および アミノ酸を１文字あるいは３文字のアミノ酸のアルファベットで表す。すなわち ： Ａｓｐ　Ｄ　アスパラギン酸ｒｔｅ　■　イソロイシンＴｈｒ　Ｔ　スレオニン 　Ｌｅｕ　Ｌ　ロイシンＳｅｒ　Ｓ　セリン　Ｔｙｒ　Ｙ　チロシンＧｌｕ　Ｅ 　クルタミン酸　ＰｈｅＦ　フェニルアラニンＰｒｏ　Ｐ　プロリン　Ｈｉｓ　 Ｈヒスチジンｃｔｙ　Ｇ　グリシン　Ｌｙｓ　Ｋ　リシンＡｌａ　Ａ　アラニン 　Ａｒｇ　ＲアルギニンＣｙｓ　Ｃシスティン　ＴｒｐＷ）リブトラ１ンＶａｔ 　Ｖ　バリン　Ｇｉｎ　Ｑ　グルタミンＭｅｔ　Ｍ　メチオニン　Ａｓｎ　Ｎ　 アスパアラギンここでのステロイドホルモンは、以下のように調製する。

■）最初のアミノ酸としてメチオニンを宵する（構造遺伝子の前にＡＴＧ開始コ ドンを挿入することによって現れる）あるいは、２）メチオニンが細胞内あるい は細胞外で切断されたところに、通常の最初のアミノ酸を有する、あるいは３ン シグナルボリペプチドあるいは通常のシグナルポリペプチド以外の複合蛋白質の いずれかとともに存在し、該シグナルポリペプチドあるいは複合体は、細胞内あ るいは細胞外で、特異的に切断される。いずれにしてもこのように産生されたレ セプターは、その様々な形態において、意図される用途に適するレベルまで回収 され精製される。前出文献参照のこと。

本発明の「ホルモンまたはホルモン様のレセプター」は、全ての種についてクロ スハイブリダイゼーシ盲ンが存在する特に開示されたレセプター、最も注目され る他の哺乳類のレセプター、および同種のあるいはクロスハイブリダイズ可能な 種の関連した（例えば、遺伝子ファミリー）レセプターを包含する。クロスハイ ブリダイズ可能な種は、前記の特異的なレセプターからクロスハイブリダイゼー ション技術によるＤＮＡの分離および特徴付けおよび使用により、あるいは既知 の常法で決定基に対して生じた抗体への免疫交叉反応性による確認から得られる 。同一種内あるいは異極レセプターを含む上記の全てのものと機能的に等価なも のも含まれる。ここで、ＤＮＡ結合および／あるいはリガンド結合ドメインは互 いに交換されているか、あるいはさもなければ対応するもとのレセプターと１つ あるいはそれ以上のアミノ酸が異なっているか、あるいはグリコジル化および／ あるいはリン酸化のパターンが異なっているか、あるいは結合した状態の立体構 造が異なっている。

「発現ベクター」は、そこに含まれるＤＮＡ配列を発現できるベクターを包含す る。そのベクターにおいては、このＤＮＡ配列は、その他の、発現に影響しつる 配列と、機能的につながれている。常にはっきりと言えるわけではないが、これ らの発現ベクターが、宿主生物の中で、エピゾームあるいは染色体ＤＮＡの組み 込まれた部分として、複製しうることを包含する。「機能的な」、あるいは文法 上これと同意義をもつ言葉は、それぞれのＤＮＡ配列が、作動可能な、すなわち 意図する目的の為に使えることを意味する。まとめると、「発現ベクター」には 、機能上の定義が与えられ、この用語が特定の配列に対して用いられるときは、 ベクターの中に配置された特定のＤＮＡ配列を発現させるのに影響しうるような 任意のＤＮＡを包含する。一般に、組換えＤＮＡ技術で利用する発現ベクターは 、「プラスミド」の形である。プラスミドは、環状の２本鎖ＤＮＡループで、ベ クターの形態で、染色体とは結合していない。プラスミドは、ベクターとして最 もよく用いられているので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」 は、互換性がある。しかしながら本発明は、同等の機能をするような、および続 いて当業者に公知となるような他の発現ベクターをも包含する。

本発明には、もとのステロイドレセプターのトランス作用転写活性化ドメインの 入れ換え、あるいは増強による操作が含まれ、新規性がある。それとは別に本発 明の新規なステロイドレセプターは、もとのステロイドレセプターと１つあるい はそれより多くのアミノ酸が異なるという点で、違うものでありうる。ただし、 その違いは、基本的なステロイドレセプターの活性、あるいは生物学的機能性を 破壊しない。

「組換え宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターでトラ ンスフェクトされた細胞のことをいう。

「外来性維持培地」とは、公知の、あるいは考案した培地のことで、成長期にお ける細胞を維持できる、あるいはその細胞が組換えを動力化する機能を発揮でき るような能力のある状態を、保持できる培地である。Ｃｏｔｅら、ＡＴＣＣＭｅ ｄｉａ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ％　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＳ　ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＳ　ＭＤ　（１９８４）を参照の こと。例えば、哺乳類の成長維持培地とは、好ましくは、ウシ胎児血清のような 血清添加物、あるいは、細胞の成長と分裂を促進する添加成分を含有する。この 添加成分は、例えば、動物の肉あるいはミルクの加水分解物、組繊あるいは器官 の抽出物、浸軟させたクロットあるいはその抽出物、およびその他である。

他の適当な培地成分は、例えばトランスフェリン、インシュリンおよび様々な鉱 物を包含する。

ここで開示するベクターおよび方法は、原核および真核細胞の広い範囲にわたる 宿主細胞の中で用いるのに適している。

これまでの考察および現存の文献についての様々な参考に加え、本発明に包含さ れる定義および方法および基本的な技術を実行するための手段を含む、分子生物 学の規範となるテキストが参考にされる。例えば、Ｍａｎｉａｔｌｓら、ＬＩｅ ｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｊｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒ　Ｍａｎｕａｌ、　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｌｎｇ　Ｈａｒｂ。

ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８２）およびそこに引用さ れている様々な参考文献、とくにＣｏｌｏｗｆｃｋらの、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚ　ｍｏｌ。

ＪＬＬ　Ｖｏｌ　１５２　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１ｎｃ、１９８７ ）を参照のこと。ここに引用される全ての出版物は、本発明に参考として援用さ れている。

前述の説明およびこれから取り上げる実験の詳細は、はじめに本研究者らによっ てなされた方法を示す。当業者は、本情報を与えることにより、これらの方法を 繰り返すことが、この仕事を再現する上で、必ずしもではないが、あるいは科学 的に望ましいことを認識する。本情報には、与えられたレセプターのトランス作 用転写活性化ドメインの位置および構造ならびに本願の新規なレセプターをつく るための操作法が包含される。代わりに、彼らは、代替の信頼できる公知の方法 を選びうる。例えば、本願の特定の新規なレセプターをコードする基礎のＤＮＡ 配列を合成し、同様のまたは他の、適当な機能的発現ベクターおよび培養システ ムに配備しろる。

このように、実際に行ったことの詳細を与えることに加え、本願の説明は、開示 されているおよび他の、特異的なレセプターおよびそれらの断片の、再・現を可 能にするためになされ、本発明に有利な当該技術の手段が用いられる。このよう な手段の全ては本発明の可能性および範囲に包含される。

３０、に　ましい　”−熊　の行細な１Ｂ本発明は、ここでの新規な改変された レセプターの調製にモデルとしてグルココルチコイドレセプターを使用すること を前提とする。グルココルチコイドレセプターと、例えば甲状腺ホルモンレセプ ターのような他のレセプターとのハイブリッド、特にＤＮＡ結合およびリガンド 結合ドメインを交換してつくったハイブリッドも包含される。いずれにしても、 本発明の核心は、グルココルチコイドレセプターを、もとの形あるいはそのハイ ブリッドとして用い、それを新規なトランス作用転写活性化ドメインの改変形と 比較することによって、ここに説明されている。本発明の核心とは、すなわち、 トランス作用転写活性化活性がもとのレセプターより高い、新規なレセプターを 創るために、トランス作用転写活性化ドメインの置き換えおよび／または増強を 行うことである。

従ってそれが野生型であろうが、ハイブリッドであろうが、あるいはここに述べ ているものと機能的に同等な物であろうが、当業者に公知のレセプターは、本発 明のトランス作用転写活性化ドメインの改変の出発材料として適当である。

４、大玉１吋 次に挙げる実施例は、以下の実験手順に用いられた材料および方法を説明する： 点・・１　人および転　の゛ レセプターの機能において、ＤＮＡ結合ドメインの役割を系統的に明らかするた め、この保存された領域に、広く部位特異的突然変異導入を行った。この方法で 個々のアミノ酸の役割をテストすることにより、トランス活性化に影響する変異 体がＤＮＡ結合に影響するものと独立であるかどうかを調べることができる。

第４図にｈＧＲのＤＮＡ結合領域の配列、およびその下に、ステロイドポルモン レセブターのスーパーファミリーのコンセンサス配列を示す。このスーパーファ ミリーのメンバーの間では、このドメインは、２０個の不変的な残基およびＲ２ 個の保存された残基を含む。全ての不変的なアミノ酸および８個の保存されてい るアミノ酸および８個の保存されていないアミノ酸をすべてグリシンに変えた。

ｉｎ　ｖｌｔｒｏにおいて、ＧＲ応答性ＭＴＶプロモーターからの転写を刺激す る能力およびグルココルチコイドの応答エレメント（Ｇ　ＲＥ）ＤＮＡ断片に結 合する能力を測定した。

それぞれの変異体について、ＭＴＶ−ＣＡＴからの転写のステロイド依存性の促 進を表１に示した。第４図には変えられたアミノ酸の上に活性の程度を示しであ る。全ての活性は、平均しておよそ１０００倍の誘導を起こす野生型レセプター ｈＧＲ−３Ｂと比較している。従って、たとえ１％の活性でも意義がある。表１ に挙げたデルタ４２０−４５１およびデルタ４５０−４８７の欠損変異体は、そ れぞれＤＮＡ結合ドメインの前半および後半の半分ずつを取り除く。その分割の 点は、ヒトミネラルコルチコイドおよびニワトリプロゲステロンレセプターのｃ ＤＮＡのエクソン−エクソン境界と一致する。どちらにもモニター可能な活性は なく、「フィンガー」のどちらもそれ１つでは充分でないことを示す。

グリシン点変異体では、９個の不変的なシスティン残基のどれか１つを変えた変 異体のすべてが失活し、これらの残基が機能上重要であるという考えと一致する 。更に、４３１位の保存されていないシスティンは、機能に必須ではない。驚く べきことに、残りの２４個のグリシン変異体のうちわずかに５変異体のみが完全 に失活した。この５つの機能的でない変異体の変異は、すべて不変的な残基であ り、このことは、それらがＤＮＡ結合の一般的な面に関わっており、配列の特異 性あ決定には関わっていないことを示す。しかしながら、全ての不変的な残基が 機能上重要なわけではない。例えば、４２６位のアスパラギン酸をグリシンに変 えても殆ど失活はない。保存されたアミノ酸をグリシンに変えた８変異体中７つ ′が機能し、この内の半分は、４０％より多い活性を残している。同様に、Ｄ’ Ｎ　Ａ結合ドメインの、保存されていないアミノ酸を変異させた変異体は、１０ ％より少ない活性を示すレセプターとなる例はなく、一般的に機能の減少をわず かにき起こす。すなわち、いくらかの例外は存在するが、アミノ酸の保存とグリ シンに変えられたときの機能的損失の程度とには、高い相関関係があり、全ての 不変的なシスティンは機能上重要な役割を果たしている。

（以下余白） 表１．ｈＧＲグリシン変具体の転写活性およびＤＮＡＮＡ結合活性はＣＶ−１細 胞中でＭＴＶ−ＣＡＴを用いて測定した。

ｂ）ＤＮＡ結合測定法は別に記されている（　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら１９８） ）。示された数値は、全免疫沈降カウントから出したが、ゲル電気泳動から測定 された特異的結合を反映する。

、６　・　のｉｎ　ｖｌｔｒｏにおけるＤＮＡ転写アッセイで測定したＣＡＴ活 性は、核局在性、ＤＮＡ結合、二量体化、並びに活性化を結果的に生じさせるお そらくアロステリックな事象および蛋白質−蛋白質の相互作用、を含む複数の別 々の機能の総和である。もし２つ以上の必須の機能がＤＮＡ結合ドメインにコー ドされているなら、機能的でない黒変異体のうちいくつかは、活性化することは できなくても、ＤＮＡに結合する能力は残留しうる。この可能性を探究する為、 対応する発現ベクターをＣ０８−１細胞にトランスフェクトさせることによって 、それぞれの変異蛋白質をつくり、アッセイした。アッセイは、粗抽出物が、放 射能ラベルしたＤＮＡと特異的なりＮＡ−蛋白質複合体を形成する能力について 行った。この免疫沈降のＤＮＡ結合アッセイにおけるそれぞれの変異体の活性を 表１に示す；表した値は、ＧＲＥ断片の特異的結合を示す。一般に、転写活性化 の能力とｉｎ　ｖｉｔｒｏでＤＮＡと結合する能力との間には、高い相関関係が ある。Ｇ４４６．Ｇ４５５．Ｇ４６７およびＧ４８６のようにＤＮＡ結合活性が 転写活性より有意に低い変異体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて不安定で有りうる 。これらの変異体で測定した転写の活性化は、ｉｎ　ｖｌｖｏでのＤＮＡとの特 異的な相互作用の結果である。ＭＥＶプロモーターからＧＲＥｓを欠失させると これらの活性はなくなるからである。

第１の推定のフィンガーのすぐ後のりシンをグリシンに変えている、１つのＧ４ ４２変異体のみが、転写を刺激する能力は効率よく失いながらも、ｉｎ　ｖｌｔ ｒｏにおけるＤＮＡとの親和性は保持していた。非特異的な配列に比べ、ＧＲＥ ｓに対する結合の特異性は、最小限影響を受けたのみであり、このことは、活性 の顕著な喪失が、ｉｎ　ｖｆｖｏにおけるプロモーター配列への結合能の欠如に はよらないことを示す。これは興味深い変異体である。なぜならば、ＤＮＡ結合 は活性化の十分条件ではないことを示唆するからである。

おそら＜Ｇ４４２は、例えばアロステリックな変化、それに続く初期の蛋白質− ＤＮＡ相互作用のような２次的な事象を阻害する。しかしこの例外はさておき、 これらの結果は、システィンに富んだ６６個のアミノ酸領域が、ＤＮＡ結合ドメ インであることを示唆する。トランス活性化には、ＤＮＡ結合が、必要であるけ れども、この機能は、レセプターの他の領域に位置している。

Ｇ４４２Ｆｍは、有用性という点では、特に意義がある。なぜならば、この種は 、調製した中で、活性は示さないが十分なりＮＡ結合の痕跡を見た唯一の種だか らである。Ｇ４４２および１５５０１４１の両者にある１つの性質を活用してア ッセイを考案しうると予想する。このｌ５５０＊種は、リガンド結合ドメインを 完全に欠いており、従ってホルモンの存在あるいは非存在に反応しない。特異的 なリガンド結合部位に付いたホルモンは、分子の阻害を解除して、トランス作用 転写活性化因子として働（ようにさせる。このドメインが欠如していることは、 ｔｓｓｏｓ種が、ステロイドの存在下あるいは非存在下でのアッセイで、常に活 性を示すことを意味する。

一方、Ｇ４４２種は、同じアッセイにおいて、ステロイドの存在下あるいは非存 在下で常に活性がない。システム中にＧ４４２およびｌ５５０＊の両方のレセプ ターが存在する適当なアッセイが考案されると、はじめに１５５０＊橿のみの寄 与に基づいて１００％の活性を有する。そのシステムに適当なステロイドを加え ると、観察される活性は、時間と共に０に向かってざん減する。適当なステロイ ド（前記のように作用する）とともに推定のアンタゴニストを投与すると、アン タゴニストは、全体の活性を減少させるステロイドの作用を阻害するので、活性 は回復し、活性の立ち直りがみられうる。

ＧＡＬ４　ｈＧＲキメラ もしＤＮＡ結合と１機能が本当に別々ならば、ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインを非 レセプターのＤＮＡ結合ドメインに置き換えて、新しいプロモーター特異性のあ るハイブリッドの活性化蛋白質をつ（らせる可能性が存在する。この可能性を調 べるために、ｈＧＲのシスティンリッチ領域を、酵母ＧＡＬ４のはじめの７４個 のアミノ酸に置き換えた。これらのＧＡＬ４のアミノ酸は、配列特異的なりＮＡ 認識は十分にあるが、転写活性化の能力は有さない。トランス活性化能力は、Ｄ ＮＡ結合ドメインの外側にあり、蛋白質の２つの別々の領域にコードされている 。従って、機能的な転写因子をつくるために、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと ｈＧＲとの融合は、ｈＧＲにより寄与されるトランス活性を含むはずである。

ｈＧＲ−ＧＡＬ４ハイブリッドの機能をアッセイする為に、ＧＡＬ４応答プロモ ーターである、デルタＭＴＶ−ＧＡＬ−ＣＡＴをＭＴＶ−ＣＡＴから構築した。

この融合遺伝子は、ＧＲＥ配列を合成のＧＡＬ４結合部位に置き換えることによ って、ＧＲ非反応性およびＧＡＬ４誘導性ｌこっくられた。このプロモーターで ｈＧＲおよびＧ　Ａ、　Ｌ　４による活性化を測定すると、ｈＧＲは、モニター 可能なほどの刺激はこのプロモーターから、つくりえないが、ＧＡＬ４の方は、 コントロールの発現ベクターに比べてＣＡＴ発現を約２０倍に増加しうる。この ことは、ＧＡＬ４が真核細胞の中でよりよく機能するというこれまでの報告と一 致する。ＧＡＬ４による刺激は、明かにＧＡＬ４合成結合部位によって媒介され る。すなわち、この部位を欠損させるとこのプロモーターは、ＧＡＬ４に反応性 がなくなる。

ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、作用可能なｈＧＲの活性化ドメインとの融合 がＧＡＬ４反応性リポータ−を刺激する能力について調べた。ｈＧＲのＤＮＡ結 合ドメインがこのハイブリッドの活性に必要でないことを示すために、ｈＧＲＤ ＮＡ結合ドメインをＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに置き換えてＧｇａ　ＩＧハ イブリッドをつくった。（ｈＧＲはアミ７基末端（Ｇ−）、ＤＮＡ結合ドメイン （Ｇ）、およびカルボキシル基末端（Ｇ）を含み、それぞれ、Ｇ−Ｇ−Ｇと表さ れる。ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインをＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインで置き換え るとＧ−ｇａｆ−Ｇができる。）結果として生じたホルモン依存性ハイブリッド は、明かにｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインの非存在下で機能しうる。実際、このア ッセインステムにおいては、ＧＡＬ４より強い転写因子として作用し、ホルモン 存在の添加により、ＣＡＴ活性が５００倍増加した。予期しなかったが、Ｇｚａ ｌＧはまた、ＧＡＬ４結合ドメインのないデルタＭＴＶ−ＣＡＴを刺激しつるが 、それはデルタＭＴＶ−ＧＡＬ−ＣＡＴの測定値のわずか５％である。プラスミ ドデルタＭＴＶ−ＡＴは、強いＧｇａ　ｌ　Ｇアクチベーターのみに現れ、弱い ＧＡＬ４には現れない、なぞめいたＧＡＬ４認識部位を含有しうる。全く、活性 化は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに依存性である。すなわち、Ｇｇａ　ｌ　 ＧはデルタＭＴＶ−ＣＡＴに機能し、ＧＧＧの方は、機能しない。

ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインのみでは活性がないことから、ＧｇａｌＧのトラ ンス活性化能力は、ｈＧＲのアミノ基およびカルボキシル基末端領域によって決 定されるにちがいない。したがって、ｈＧＲのそれぞれの領域がＧＡＬ４のＤＮ Ａ結合機能を補う能力を調べた。Ｇｇａｌ（デルタ）は本質的な活性を示し、（ デルタ）ｇａｌＧの方は全くのホルモン依存性であり、両方のハイブリッドとも 機能する。したがって、それぞれ異なる制約を与えはするが、ｈＧＲのＮ−末端 およびＣ−末端セグメント両方において、自律的なトランス活性化機能が包含さ れている。

および一部重　したｈＧＲ・・ ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとの融合によって、ｈＧＲのアミ７基末端側の４ ２０個のアミノ酸およびカルボキシル基側の３００個のアミノ酸に別々のトラン ス活性化の性質が存在することが示された。ｈＧＲのτ１重複変異体をＭＴＶ− ＣＡＴのルシフェラーゼ誘導体であるＭＴＶ−ＬＵＣにてアッセイした。ＭＴＶ −ルシフェラーゼフニージョン遺伝子およびＭＴＶ−ＣＡＴで決定した活性の値 は、前述した欠損等価である。第１図にτ１変異誘導体およびそのルシフェラー ゼ活性の野生型との比較を示す。τ１が存在しないと、活性は５％にまで減少し 、一方τ１の２つつながった重複変異体ＧＲ１１は、３１０％の活性を持つ「ス ーパー」受容体の作用をする。変異体ＧＲ１２、ＧＲＩ４、ＧＲＩ　７およびＧ ＲＩ８は、τ１が、ＤＮＡおよびホルモン結合領域の間、およびＤＮＡ結合ドメ インよりアミノ基側で機能しうることを明らかにする。

いずれの場合でもホルモン依存性アクチベーターとなる（第１図）。このことは 、受容体の構造に、著しい柔軟性があることを示す。ＧＲＩ３およびＧＲＩ４の 活性、および１５１５＊とともにあるＧＲＩ５およびＧＲＩ６を比較して第１図 に示す通り、活性を高めるというτ１の能力は、アミノ基およびカルボキシル基 末端で独立している。ＧＲＩ８がＧＲＩ４に比べて、４倍高い活性を示している ことから判るように、τ１領域は、アミン基末端のトランス活性能方今てには関 係し得ない。この主張を支持する意味でまた、τ１およびカルボキシル基末端を 欠損させたＧＲＩ５では、１％の活性が残る。

アミノ基末端の大部分を欠損させると、この活性はなくなるが、ＧＲＩ５の場合 、それより１０倍の誘導を行うわけである（ＧＲＩ５と第２図のＧＲ２６を比べ よ）。

トランス活性化の性質を有する可能性のある、第２の領域は、τ２で、ホルモン 結合ドメインのアミノ基末端側のすぐ横にある（アミノ酸５２６−５５６位）。

この領域は、アミノ酸１８個の並びの中で、５個のマイナスの電荷を持っ残基を 存し、切断変異体ｌ５５０＊およびｌ５１５＊の活性化に２倍の違いがみられる ことから、レセプターの活性に対して関係がある（第３図）。τ２が、アクチベ ータードメインを構成しているか調べるために、τ２をτ１の横あるいはτ１の 場所に導入した。第３図をみると、この領域がτ１とは関係ないアミノ基末端に 導入されたとき、３倍増の活性を示すことが判る（ＧＲ２０を野生型と、またＧ Ｒ２１をΔ７７−２６２と比べよ）。第２のコピーにより更に２倍増となる結果 から、２つのτ２領域で全体として活性が６倍増加した（ＧＲ２２）。

従って、τ１のように、τ２のレセプターにおける位置には柔軟性があり、その 活性は累積し、およびその機能は、構造的でありうる（例えばＧＲ２５）。

２０％の酸性残基を含有し、酵母ＧＡＬ４　（Ｇ　ｉ　ｎ　ｉ　ｇｅｒら、Ｎａ ｔｕｒｅ　３３０　６７０　（１９８７））のなかで、トランス活性化の性質を 持つ合成の両親媒性のαヘリックス、ｒａａｈＪを用いて、τ２変異体ＧＲ２１ とＧＲ２２との構造が構築された。ａａｈ配列のサイズおよび電荷の特性は、Ｉ ２領域と類似している。それ故に我々は、ｈＧＲのっ九がりの中で、この領域の 可能な活性を調べることにした。全く、Ｉ２およびａａｈの１つあるいは複数の コピーを有する嘘異体では、同様な活性の増加がみられ（第３図；ＧＲ２１とＧ Ｒ２３、ＧＲ２２とＧＲ２４を比べよ）、これらの領域が、同等の機能を果たし うろことが示される。

トランス°　τ　ドメイン 我々は、別々のｈＧＲ）ランス活性化領域を、次の２つの基準にしたがって定義 した：欠損が活性を減少させ、および重複がそれを増加させる。この基準によれ ば、アミノ酸２００個および３０個の、レセプターの２つの領域が、トランス活 性化機能をコードしている。これら２つの領域の配置は、ｈＧＲの中のさらなる アクチベーター配列の役割を除外しない。Ｉ１およびＩ２の一次配列を調べたと ころ、明かなホモロジーは何処にも見られず、両方の領域共、酸性の性質を持っ ているというだけであった。この性質は注目に値する。なぜなら、酵母の転写因 子であるＧＡＬ４およびＧＧＮ４の活性化ドメインは、明かな配列の一致はない が、酸性の残基に富んでいるからである。この明かな類似性は、そのように見え るにも関わらず、ＧＡＬ４、ＧＧＮ４、あるいはグルココルチコイドレセプター の中の同定された活性化の領域がすべて共通の機構を通じて機能しているという ことを示すわけではない。共通の機構についての可能性は更に、合成の両親媒性 αヘリックス（ｒａａｈＪＪ）配列が機能的にＩ２の代わりを、ｔ　およびある 程度τ１の代わりをしうることの観察によって、支持される。Ｉ１とＩ２と酵母 活性化配列との間で、明確な配列矢　およびサイズの関連性が欠如していること から、トランス活性化機能がＤＮＡに結合した蛋白質の表面のマイナスの電荷を 持っ残基の実効電荷によって現れてきうるという見解が導びかれる。

ｈＧＲモジニール ｈＧＲのモジュラ−な性質は、ステロイドのレセプタースーパーファミリー間の 一次配列の比較からだけではなく、機能的なドメインの交換によって、新規なキ メラアクチベーターをつくる能力からも明らかになってきた。ｈＧＲのＤＮＡ結 合ドメインを、ヒトエストロゲンレセプターのＤＮＡ結合ドメイン（Ｇｒｅｅｎ ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２５．７５およびＣｈａｍｂｏｎ、（１９８７）および関 連のないＧＡＬ４からのＤＮＡ結合ドメインに置き換えた。それがアミノ基末端 でも機能し得たことから、その位置は重要でない。更に、そのＤＮＡ結合ドメイ ンは、Ｉ１およびＩ２両方のアミノ基末端あるいはカルボキシル末端側に、これ らのドメインの機能を削ることなく、配置しうる。モジュラ−な性質に一致して 、Ｉ１およびＩ２の位置は重要ではなく、それらの多量体化によって、レセプタ ーの機能が増加する。したがって、我々は、野生型のレセプターの４倍までの活 性を持つレセプター、あルイはＤＮＡ結合特異性を変えたレセプターをつくりう る。

ハイブリッドレセプターは、まだホルモン誘導性であり、非特異的機構であるこ と、それによってホルモン結合ドメインは、分子の他の部分にリガンド依存性の 影響を与えることが判る。実験の詳細および考察は、次の通りであるニブラスミ ド　び占・・　の プラスミドｈＧＲ−３Ｂは、リンカースキャンニングｆＸ体ｌ５３２および１４ ０３ＳのＣｌａｌ部位の組換えによって作成された（Ｇｉｇｕｅｒｅら、Ｃｅｌ 　１，４６，６４５（１９８６））。Ｉ４０３Ｓは、Ｉ４０３のＢａｍＨＩの部 位に５ｓｔｌアダプター、５’　ＧＡＴＣＧＡＧＣＴＣＧＣ３°を導入した誘導 体である。このｈＧＲ誘導体は、全ての黒変異体のもとであり、ＤＮＡ結合およ び転写の活性において野生型と区別可能である。ｈＧＲ−３Ｂの所望のコドンを １つのコードするグリシンにかえる為に、まず、プラスミドｈＧＲ−３Ｂの５ｓ ｔｌ／ＢａｍＨＩの４００ヌクレオチド断片をＭ１３ｍｐ１８に導入し、１本鎖 の鋳型を得た。次に常法により、ｌ　３−１５塩基の合成オリゴヌクレオチドを 用い、その後、所望のコドンをＧＧＮに変えて、変更した５ｓｔＩ／　Ｂ　ａ　 ｍ　ＨＩ断片をｈＧＲ−３Ｈに再導入して、。Δ４２〇−４５１およびΔ４５０ −４８７欠損は、より長いオリゴヌクレオチド（２０マー）を用いて作成した。

；ここに述べたアミノ酸の番号は、欠損させたところとの繋目で、それ自体は欠 損してないところを指している。変異体の配列は、２本鎖プラスミドＤＮＡをア ルカリ変性処理（Ｈａｔｔｏｒｉら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　１５２、２３ ２　（１９８６））し、その後合成ｈＧＲプライマーのチェーンターミネーシｌ ン法により、直接決定した。

リポータ−プラスミドＭＴＶ−ＣＡＴおよびその欠損誘導体ΔＭＴＶ−ＣＡＴは 、次のように作成した。ｐＢＬ、ｃＡＴ２のＨｉｎｃｌｌ１１部位（Ｌ　ｕ　ｃ 　ｋ　ｏｗら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５．５４９０　（１９８７ ））をまずつぶして、ｐＴＫＣＡＴ−Ｈを作成した。ｐＴＫＣＡＴ−Ｉ（のＨ３ Ｖ−チミジンキナーゼプロモーターをＢａｍＨＩ／ＢｇＩＩＩ消化して削り、Ｂ ａｍＨＩで、ｐＭＴＶ−ＴＫのＭＴＶ−ＬＴＲ断片（Ｋｕｈｎｅｌら、Ｊ　ＭＯ Ｉ　Ｂｉｏｌ工１９０．３６７　（１９８６））、ｐＬｓ−１９０／−１８１、 あるいはｐＬｓ−９６７−８８（Ｂｕｅ　ｔ　ｔ　ｉら、Ｊ、Ｍ。

１．８ｉｏ１．　１９０．３７９　（１９８６））におきかえ、それぞれ、ＭＴ Ｖ−ＣＡＴ、−１９０７−１８１ＭＴＶ−ＣＡＴ、あるいは−９６７８８ＭＴＶ −ＣＡＴを作成した。ΔＭＴＶ−ＣＡＴは一１９０／−１８１−および−９０／ −８８ＭＴＶ−ＣＡＴのそれぞれの変異体をＨｉｎｄＩ１１部位で再びつなげ、 構築した。ΔＭＴＶ−ＣＡＴの唯一のＨｆｎｄＩ１１部位に合成ＧＡＬ４結合部 位ｒ　１７ＭＸ　Ｊ　（Ｗｅ　ｂｓｔｅｒら、Ｃｅ１ｌ　５２．１６９　（１９ ８８））を導入して、ΔＭＴＶ−ＣＡＴをＭＴＶ−ＧＡＬ−ＣＡＴにかえた。

プラスミ　）’ＭＴＶ−ＬＵＣは、ｐｓＶＯＡ／Ｌ−ＡΔ５’　（ｄｅＷｅｔら 、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｊｏｌ、　７　７２５　（１９８７））のＨｌｎｄ ｌ　Ｉ　１部位をＸｈｏＩに変え、この誘導体から得たルシフェラーゼコードお よびＳＶ４０ボリアデニレーシゴン配列（ＢａｍＨＩ消化、クレノウボリメラー ゼＩ末端修復、およびＸｈｏｌ消化で得た）をＸｈｏ／Ｓｍ、ａｌ消化したＭＴ Ｖ−ＣＡＴに導入して作成した。

ＧｇａｌＧは、　ｐＧ５２５　（Ｌａｕｇｈｏｎら、　Ｍｏ　Ｉ。

Ｃｅ１１．Ｂｆｏｌ、　土、２６０　（１９８４）から誘導した。プライマー特 異的突然変異導入法を用いて、コーディング配列のヌクレオチド−１０から一３ 位および＋２２３から＋２２８位に、それぞれＮｏｔｌおよびＸｈｏ１部位を導 入した。ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをこの誘導体からＮ。

ｔｌ消化により、取り出し、ｐＲ３ｈＧＲＮｘ（Ｇｉｇｕｅｒｅら、Ｎａｔｕｒ ｅ　３３０．６２４　（１９８７））のもとのＤＮＡ結合ドメインの代わりに挿 入した。ＧｇａｌΔおよびΔｇａｌΔは、それぞれＧｇａ　Ｉ　ＧおよびΔｇａ ｌＧをＸｈｏｌで消化した後、末端修復し、およびライゲーションして作成した 。ΔｇａｌＧは、コンセンサスのりボゾーム結合部位（Ｋｏｚａｋの、Ｎｕｃｌ 、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、　１主、８５７　（１９８４））を含む合成オリゴヌクレ オチド二本鎖（ΔＡＮ、５’　ＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣ３’　）　を、 Ｇｇａ　Ｉ　ＧのＡｓｐ７１８／ＮｏｔＩ断片のアミノ基末端コーディングの代 わりに導入して構築した。

変異体Δ７７−２６２．１５１５＊およびΔ９−３８５の作成は、Ｈｏｌｌｅｎ ｂｅｒｇら、Ｃｅ１１　４９　３９、（１９８７）に記載されている。τ１変異 体は、ｈＧＲの７７＝２６２位のアミノ酸をコードする１２６２　（Ｇｉｇｕｅ ｒｅら、　Ｃｅ１ｌ　４６、６４５　（１９８６）　のＢｇｌ　Ｉ　Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ断片を用いて構築した。この断片をｈＧＲのリンカースキャンニング変異体 である、Ｉ２６２およびｌ５１５のＢａｍＨｒ部位に挿入して、それぞれＧＲＩ ｌおよびＧＲＩ２を作成した。ＧＲＩ３は、Ｎ末端コード配列を、上記ΔＡＮア ダプターの代わりにいれ、ｐＲＳｈＧＲＮｘから誘導した。ＧＲＩ７は、リンカ ースキャンニング変異体Ｉ９および１３８４　（Ｇｌｇｕｅｒｅら、前出）を１ ５１５の９μｍＨ１部位に組換えて作成したＮ末端コードＢａｍＨＩ断片を挿入 して作成した。変異体ｒｓｓｏ＊は、ｌ５５０とｌ６９６変異体のＢａｍＨＩ部 位での組換えによって作成し、従って、アミノ酸５５０位の後のリーディングフ レームがずれている。

この変異体は、δ５３２−６９７として以前の報告（Ｈｏｌｌ　ｅｎｂｅｒｇら 、前出）の中に不正確に述べられている。

Ｉ２誘導体をつ（るために、オリゴヌクレオチド特異的突然変異導入法を用い、 ｈＧＲのヌクレオチド１７０４−１７０９位および１８００−１８０５位（Ｈｏ ｌ　ｌｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３１ｇ、６３５（１９８５））をそれぞ れＢａｍＨＩおよびＢｇｌ　Ｉ　Ｉ部位に変え、取り出し可能なＩ２コーディン グフレームを作成した。Ｉ２をコードする配列を次に、Ｉ２６２のＢａｍ１（１ 部位に導入し、ＧＲ２０を作成するか、あるいはＩ２６２のＢｇｌｌｌ／Ｂａｍ ＨＩ断片と置き換えて導入しＧＲ２１を作成した。ＧＲ２３は、Ｉ２６２のＢｇ １１１／ＢａｍＨｒ断片の代わりに、ｌ’−ａａｈＪ配列をコードする（Ｇｉｎ ｉｇｅｒおよびＰｔａｓｈｎｅ、１９８７）合成オリゴヌクレオチド二本鎖（５ ’　ＧＡＴＣＴ　ＧＧＡＡＴ　ＴＡＣＡＡ　ＧＡＧＣＴ　ＧＣＡＧＧ　ＡＡＣＴ Ａ　ＣＡＡＧＣＡＴＴＧＴ　ＴＡＣＡＡ　ＣＡＧＣＡ　ＡＧＡＧ３′）と置き換 えて作成した。この配列およびＩ２が２コピ一つながった変異体（ＧＲ２４およ びＧＲ２２）は、常法により、作成した（ＲｏｓｅｎｆｅｌｄおよびＫｅｌｌｙ 、１９８６）。上記に述べた構築物のダブル変異誘導体を、次のようにＣｌａＴ 部位での組換えによって得た：ＧＲ１２とＧＲ１３由来のＧＲＩ４；Δ７７−２ ６２と１５１５＊由来のＧＲＩ５；ＧＲＩＩとｌ５１５＊由来のＧＲＩ　ａ；　 ＧＲＩ　３とＧＲ１７由来のＧＲＩ　ｓ；　ＧＲ２２と１５１５＊由来のＧＲ２ ５；Δ９−３８５と１５１５＊由来のＱＲ２６゜ｆ−ＤＮＡ　Ａ ＤＮＡ結合は、以前の文献に述べられている方法で測定した（Ｈｏ　ｌ　ｌ　ｅ ｎｂｅｒｇら、前出）。トランスフェクションの後、ＣＯ３−１細胞の粗抽出物 から得た変異体レセプターを、放射能ラベルしたＤＮＡ断片の混合物と共にイン キュベージフンした。ＤＮＡ断片のうちの工つはＧＲＥｓを自存した。レセプタ ー−ＤＮＡ複合体をレセプター特異的抗血清およびスタフＡ（Ｓｔａｐｈ　Ａ） で免疫沈降させ、タンパク質を取り除き、チェレンコフを計数し、次に変性ポリ アクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、特異的結合を確かめた。

全免疫沈降カウントを比較した。ｈＧＲ変異体のタンパク質が、それぞれのＣＯ ５−１細胞抽出物に存在するかどうかは、ウェスタンプロット分析で確かめた。

トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイＣＶ−１およびＣＯ３−１ のトランスフェクションは、以前の文献に述べられている方法（Ｇｉｇｕｅｒｅ ら、およびＨｏｔ　Ｉ　ｅｎｂｅｒｇら、前出）で行い、１０ｃｍディシュにつ きそれぞれのプラスミドを５マイクログラムずつ用いた。

ルシフェラーゼアッセイは、記載の方法により行った（ｄｅＷｅｔら、前出）。

立　およびトランスフェクション ＣＶ−１（アフリカングリーンモンキー腎臓）細胞の増殖およびトランスフェク ションの条件は、以前に記載されているとおりであるが（Ｇｉｇｕｅｒｅら、（ ｅｌｌ　４立、６４５　（１９８６））、違う点は、リン酸カルシウム沈澱を４ −８時間、細胞上に残留させ、その時間に培地を、１０−７ＭのＩ３　（Ｓ　ｉ 　ｇｍａ）を添加しないまたは添加した５％Ｔ３牛血清を含むＤＭＥＭに変えた ことである。細胞をＴ３添加の３６時間後に回収し、ＣＡＴアッセイを、（Ｇｏ ｒｍａｎら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　２　１０４４　（１９ｇ２）；Ｈ ｏｌ　１　ｅｎｂｅｒｇら、　Ｃｅ１ｌ　１主、　３９（１９８７））に述べら れているように行った。代表的には、５μｇのリポータ−および１μｇの発現ベ クターを同時にトランスフェクシツンし、２．５μｇのＲＳＶ−βｇａｌをコン トロールとしてトランスフェクシ１ンの効率をだした。アセチル化した、および アセチル化していない形の［１４ｃ］クロラムフエニコールを薄層クロマトグラ フィーで分離し、取り出し、５％ＤＭＳＯいりのＥｃｏｎｏｆ　ｌ　ｕｏｒ　（ ＤｕＰｏｎｔ）中で、液体シンチレーションカウンターにて定量した。β−ガラ クトシダーゼ７　ッセイは、　（Ｈｅｒｂｏｍｅｌら、ＣｅＬ上　３９，６５３ 　（１９８４））に述べられているように行った。ＣＡＴ活性は、β−ガラクト シダーゼ活性で割った百分率換算で表す。

Ｉポー　−および　プラスミドの ラットの成長ホルモン遺伝子の−１６９から一２００位に相当する合成オリゴヌ クレオチド、あるいはパリンドロームのＴＨＥ　（ＴＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣ ＴＧＡ）（Ｇｌ　ａｓＳら、　Ｃｅ１１５４、３１３（１９８８））　を−１９ ０／−１８１位１：Ｈｉｎｄｌ１１部位をもっＭＴＶ−ＣＡＴリンカースキャン ニング変異体（Ｂｕｅｔｔｉら、Ｊ、Ｍｏ１Ｂｉｏｔ、　１９０，３７９　（１ ９８６））あるいは−８８から一１９０位の開のヌクレオチドをＨｉｎｄ■１１ 部位に置き換えた一１９０／−８８位ＭＴＶ−ＣＡＴの中に挿入した。

チロイドホルモンレセプターの発現ベクターは、ｐｈｅＡ１２　（Ｗｅｉｎｂｅ ｒｇｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　３２４、６４１（１９８６））の全長のｃＤＮＡ およびｒｂｅＡ１２　（Ｔｈｏｍｐ　ｓ　ｏｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３７、 １６１０（１９８７））をｐＲｓベクター（Ｇｉｇｕｅｒｅら、Ｃｅ１ｌａｓ、 ｓ４５　（１９８６）およびＮａｔｕｒｅ　３３０％　１２４　（１９８７）　 ）のＫｐｎ　ＩとＢａｍＨ１部位の間に挿入して構築した。

キメラレセプターの　１ ｈ　Ｇ　ＲＮＸの構築は、既に述べられているとおりである（Ｇｉｇｕｅｒｅ、 Ｎａｔｕｒｅ前出）。ｈＴＲβＮ×を構築するためにｐｈｅＡ１２　（Ｗｅ１ｎ ｂｅｒｇｅｒＳＮａｔｕｒｅ前出）のｃＤＮＡ挿入部をＭｌ　３ｍｐ１９のＫｐ ｎＩとＢａｍＨＩ部位の間にサブクローンし、クンケル法、ＰＮＡＳ８２　４８ ８　（１９８５）で変異させた。Ｎｏｔ１部位をつくるために用いたオリゴヌク レオチドによって、３つのアミノ酸が変わった：Ａｓｐ９７がＡｒｇへ、Ｌｙｓ ９８がＰｒｏへ、Ａｓｐ９９がＰｒｏへ。ＸｈｏＩＲ位をつくるために用いたオ リゴヌクレオチドによって、２つのアミノ酸が変わった：Ｔｈｒ１７１がＬｅｕ へ、Ａｓｐ１７２がＧｌｙへ。

次に変異レセプターｃＤＮＡを、発現ベクターｐＲＳ（Ｇｉｇｕｅｒｅ、Ｃｅ１ ｌ　Ｎａｔｕｒｅ　前出）に移した。Ｒ３ｈＧＲｍｘとＲ３ｈＴＲβＮ×の間で 、Ｋｐｎｌ−ＮｏｔＩ。

Ｋｐｎ　Ｉ−Ｘｈｏ　ＩまたはＮｏ　ｔ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ制限酵素断片を交換し 、ハイブリッドを構築した。ＲＳｈＧＲＮｘは、野生型の約７５％の活性を有し 、Ｒ３ｈＴＲＮｘは、野生型の約６０％の活性を有する。ｒＴＲαへτ１を付加 するために、ＢｓｔＥＩ　Ｉ末端を付けたＢａｍＨ１部位をコードするオリゴヌ クレオチドアダプターを挿入し、アミノ酸２１位にある唯一のＢｓｔＥＩＩ部位 がＢａｍＨ１部位に変えられた。これによって、この部位へｈＧＲのアミノ酸７ ７−２６２位をコードするＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ断片を、フレームを合わ せて挿入することが可能になった。ΔＴＴおよびΔＧＧは、それぞれ、Ｒ３ｈＴ ＲｓｘおよびＲＳｈＧＲＮｘのＡｓｐ７１８−ＮｏｔＩ断片を欠損させ、コンセ ンサスリボゾーム結合部位のオリゴヌクレオチドアダプター（Ｋｏｚａｋ、Ｎｕ ｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２．８５７（１９８４））に置き換えて構築し た。ｈＧＲのアミノ酸７７−２６２位は、τ１とよばれるが、これをｒＴＲαの ２１位のアミノ酸の後に、１つあるいは複数コピー挿入し、得られたハイブリ・ ノドレセプターのトランス活性化をアッセイした。表１に示すように、τ１ドメ インを１つ加えると、少なくとも活性は４倍増加し、そのようなドメインが複数 存在すると、更に活性が増加した。

これは、このドメインのモジュラ−な性質と一致し、また、チロイドホルモンレ セプターの活性は、他のレセプター由来のトランス活性化ドメインの付加により 、増強しうろことを示す。　（以下余白） 表１．チロイドホルモンレセプター／τ１ハイブリッドの活性レセプター　τ１ ドメインの数　ＣＡＴ活性比較ａＲ５ｈにＲＩ　Ｏ ＬｉｒＴＲａ−Ｂｍ＋　Ｏユロ０ １；ｔｓｒＴＲ−丁１°１　１　１４コＯ・ＣＡＴ活性は、ＲＳｒＴＲ−Ｂｍ” の誘導活性と比較しテ０る。ＲＳｒＴＲ−Ｂｍ”は、ラットのアルファチロイド ホルモンレセプターで、アミノ酸２１位のＢｓｔＥＩＩ部位が、ＢａｍＨ１部位 に変えられている。

レセプター発現ベクターの量を１μｇから５μｇに増やしたいくつかの実験では 、相対的ＣＡＴ活性に数倍の増加がみられた。

（以下余白） 前述した説明は、本発明を実施するにあたり、用いうる特定の方法を、詳細に説 明している。レセプターの同定、分離、特徴付け、調製、および使用に最初に用 いられた特定の方法並びに特定のレセプターに関する更なる明細、並びにその配 列について詳細に説明されたので、当業者は、同じ情報を得るために、およびこ の情報を、他の同一種内および異種間の関連するレセプターに拡大するために、 どの様に他の信頼しつる方法を工夫すればよいかを十分に知る。従って、前述の 詳細な説明がテキストに詳しく見られるかも知れないが、本願での全体の範囲を 制限すると解釈されてはならない。むしろ、本発明の範囲は、付記した請求項の 範囲の法律上の解釈によってのみ決定される。

１　７７　２６６　４２ｔ４Ｅ１６　７７７ＦＩＧ、　３ Ｃｏｎ　Ｃ−土Ｃ−０−△５Ｇ−ＨＹＧ−−−ＣＣ２−ＣＫ−ＦＦＫＲ−−−Ｖ ＳＴ　ＥＲ 国際調査報告

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．ホルモンまたはホルモン様のレセプターに結合する推定上の能力を持つ物質 のスクリーニングおよび同定のためのアッセイであって、次のことを含む工程を 包含するアッセイ：（ａ）改善されたトランス作用転写活性を持つ形のホルモン またはホルモン様のレセプターの種を提供する工程、（ｂ）該形のレセプター種 に、ホルモンまたはホルモン様のレセプターに結合する推定上の能力を有する１ あるいは２以上の一連の試験物質を試す工程、 （ｃ）該試験物質の影響を、該レセプター種によって誘導された転写の量を測定 することによって検出する工程、および（ｄ）該レセプター種の該トランス作用 転写活性に影響を与えうる候補を一連の試験物質から選択する工程。
2. ２．請求項１のアッセイであって、さらに工程（ｄ）に続いて、次のことを含む 追加の工程を包含する、アッセイ：（ｅ）前記候補を必須の成分として含有する 組成物の調製に前記候補を用いる工程、ここで該組成物は、ｉｎ　ｖｉｖｏにお いて対応するレセプターと接したとき、その生物学的機能の性質を該レセプター に伝えるのに有用である。
3. ３．請求項２のアッセイであって、更に工程（ｅ）に続いて、次のことを含む追 加の工程を包含する、アッセイ：（ｆ）前記組成物をヒト被験体に接触させる工 程。
4. ４．プロモーターへのトランス作用転写活性が高められたポリペプチドとしての ホルモンまたはホルモン様のレセプターであって、該ポリペプチドは、該プロモ ーターのＤＮＡ配列応答エレメントに結合する本来の能力により、あるいは該Ｄ ＮＡ配列応答エレメントに結合する他のポリペプチドに結び付く能力により、該 プロモーターと結び付くものであり、分子内のＤＮＡ結合ドメインおよびリガン ド結合ドメインとは別の場所に位置する、複数個のトランス作用転写活性化ドメ インあるいはその機能的断片部分を有するレセプター。
5. ５．前記レセプターが、ヒトグルココルチコイドに基づいている請求項４のレセ プター。
6. ６．前記トランス作用転写活性化ドメインがτ１ドメインである請求項４のレセ プター。
7. ７．前記レセプターが２つのτ１ドメインを含有する請求項６のレセプター。
8. ８．２番目の前記τ１ドメインが、１番目のドメインに並んで位置している請求 項７のレセプター。
9. ９．２番目の前記τ１ドメインが１番目のτ１配列よりＣ末端側に離れて位置す る請求項７のレセプター。
10. １０．リガンド結合ドメインが欠如している先行の請求項のいずれかのレセプタ ー。
11. １１．ヒトＧ４４２グルココルチコイドレセプターである請求項１の種としての レセプター。
12. １２．もとのレセプターのトランス作用転写活性化ドメインに加えて、もとのレ セプターのＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインから独立したトラン ス作用転写活性化ドメインを有するホルモンまたはホルモン様のレセプターであ って、該付加的なトランス作用転写活性化ドメインが、存在する場合には、該Ｄ ＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインとは別の場所に位置し、そしてＤ ＮＡ結合に関する生物学的機能性を有する、レセプター。
13. １３．請求項１２のレセプターをコードする組換えＤＮＡ分子あるいはｃＤＮＡ 分子であるＤＮＡ分子。
14. １４．請求項１３のレセプターをコードするＤＮＡを作動可能に有する発現ベク ター。
15. １５．請求項１４の発現ベクターでトランスフェクトされた組換え宿主細胞。
16. １６．請求項１５の細胞および該細胞の生存を確保する外来性維持培地を含有す る細胞培養物。
17. １７．請求項１２のヒトレセプターを調製するプロセスであって、該レセプター をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた組換え宿主細胞中での発現を包含 するプロセス。
18. １８．請求項１２のレセプターを、アッセイに使いうるに十分な質および量を有 する形態になるように回収および精製することを包含するプロセスであって、該 アッセイは、該レセプターの外因誘導された生物学的機能性の測定を可能にする 、プロセス。
19. １９．ホルモンまたはホルモン様のレセプターの機能性を測定する生物学的アッ セイにおいて、 （ａ）レセプターを有しない細胞のなかに、作動可能なリポーターあるいは他の 所望のＤＮＡと機能的に結合した作動可能なホルモン応答プロモーター／エンハ ンサーエレメントと前記レセプターをコードする作動可能なＤＮＡ配列とを有す る１種あるいは２種以上の発現ベクターをトランスフェクトする工程、 （ｂ）工程（３）で得られた該トランスフェクト細胞を、該ホルモン応答プロモ ーター／エンハンサーエレメントを活性化する推定上の能力を持つ外来性物質の 存在下あるいは非存在下で培養する工程、 （ｃ）該リポーターあるいは所望のＤＮＡ配列の生成物の誘導を該細胞において モニターする工程、および（ｄ）リポーターあるいは他の所望ＤＮＡの発現を該 細胞で測定する工程、 を包含し、該ホルモンまたはホルモン様のレセプターが、もとのレセプターと比 べてそのトランス作用転写活性が高められており、もとのレセプターに付加的な 該活性が、該レセプターの分子内のＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメ インとは別の場所に位置するドメインあるいはその機能的断片部分によるという 、改良法を含む生物学的アッセイ。