PT92478B - Processo de preparacao de receptores para hormona - Google Patents

Processo de preparacao de receptores para hormona Download PDF

Info

Publication number
PT92478B
PT92478B PT92478A PT9247889A PT92478B PT 92478 B PT92478 B PT 92478B PT 92478 A PT92478 A PT 92478A PT 9247889 A PT9247889 A PT 9247889A PT 92478 B PT92478 B PT 92478B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
receptor
hormone
dna
binding
domains
Prior art date
Application number
PT92478A
Other languages
English (en)
Other versions
PT92478A (pt
Inventor
Ronald Mark Evans
Stanley Mark Hollenberg
Original Assignee
Salk Inst For Biological Studi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Salk Inst For Biological Studi filed Critical Salk Inst For Biological Studi
Publication of PT92478A publication Critical patent/PT92478A/pt
Publication of PT92478B publication Critical patent/PT92478B/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C07K2319/715—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16 containing a domain for ligand dependent transcriptional activation, e.g. containing a steroid receptor domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Description

Pedidos de Patente Relacionados
Ê feita referência ã publicação do pedido de patente PCT Ns.
WO 88/03168 e ã publicação do pedido de Patente Europeia Ns.....
325 849. Estes requerimentos publicados referem-se, em vários as pectos, a receptores para hormona e suas composições, e a processos para a sua preparação, e a utilizações, particularmente em novos sis temas de ensaio. As descrições completas destes dois pedidos de patente publicados são, por isso, aqui incorporadas por referência.
Campo da Invenção
O presente invento refere-se, genericamente, ã identificação e caracterização de certas sequências polipeptídicas que funcionam como domínios de trans-activação da transcrição, e ã sua preparação e utilização, particularmente na preparação de novos receptores para hormona, ou semelhante a hormona, intracelulares, por exemplo, polipéptidos receptores de esteróides, polipéptidos de tirõide e po lipéptidos de retinóide, incluindo aqueles da espécie humana, onde são conseguidas vantagens em termos de actividade de iniciação da transcrição por trans-activação, por aumento do efeito dos referidos domínios.
Mais particularmente, o presente invento refere-se ao processo de preparação dos novos polipéptidos receptores referidos, em que os domínios de trans-activação da transcrição foram aumentados em efeito, de modo a produzir novas entidades que exibem uma activida de de iniciação da transcrição aumentada, surpreendentemente superi or ã da molécula de origem.
São incluídos dentro do âmbito deste invento novos aspectos re lacionados com a preparação das referidas moléculas de trans-activa ção da transcrição, incluindo novos isolados de ADN codificando as mesmas e os domínios de trans-activação da transcrição, vectores de expressão compreendendo estas sequências de ADN operativamente ligadas e a hospedeiros transfectados com os referidos vectores.
Mais particularmente, o presente invento refere-se ã utilização dos novos receptores para hormona ou semelhante a hormona, de trans-activação da transcrição, de acordo com o presente invento, em ensaios para avaliação de vários materiais putativos que podem ter
7Q 310 48473
-3afinidade de ligação operativa para estes novos receptores para hor mona ou semelhante a hormona. Numa concretização preferida, este as pecto do invento fornece um ensaio para teste dos referidos materiais putativos, por exemplo, agonistas e antagonistas de esteróide num assim designado sistema de trans-activação melhorado.
Antecedentes do invento
Os pedidos de patente anteriormente citados descrevem, inter alia, a caracterização e preparação de vários receptores para hormona e semelhante a hormona, incluindo receptores de esteróide, ti róide e retinóide tais como aqueles representados pelas classes glu cocorticóide, mineralocorticóide, tirõide, relacionados com estrogé neo e retinóide, e especificamente, os próprios receptores para glu cocorticóide, estrogénio, aldosterona e ácido retinôico. Estes recep tores específicos têm sido objecto de pesquisa considerável e consti tuem as bases particulares para os inventos descritos e reivindicados nestes pedidos de patente. De forma similar, a literatura científica paralela existente tem focado os receptores específicos anteriormente referidosde entre as classes de receptores existentes.
Sabe-se, por exemplo, que o receptor para glucocorticõide pertence a uma grande super-família de factores de transcrição dependentes de ligandos que têm, eles próprios, papéis diversos em homeostasia, no crescimento e no desenvolvimento. A comparação de ADNs complementares codificando estes receptores, assim como aanálise mu tacional das suas sequências de codificação, tem identificado certos domínios funcionais dentro da molécula que se pensa serem responsáveis, respectivamente, pela ligação do ADN, ligação a hormonas e localização nuclear. Ver Evans, e colab., Science 240, 889 (1988) para uma revisão sobre esta matéria. No caso do receptor para gluco corticóide, o assim-denominado domínio de ligação ao ADN abrange cer ca de sessenta e seis aminoácidos e está altamente conservado entre várias espécies, e verificou-se que este domínio é necessário a fim de activar a transcrição. Ver Hollenberg, e colab., Cell 49, 39 (1987), Miesfeld, e colab., Science 236, 423 (1987), Danielsen, e colab., Mol.Endo 1, 816 (1987), Kumar, e colab., Cell 51, 941 (1987),
Gronemeyer, EMBO J. 6, 3985 (1987), e Waterman, e colab., Mol.Endo 2, 14 (1988). Verificou-se que esta região contém nove resíduos de
7,0 310. 48473
-4cisteínas invariantes, e embora a contribuição de cada resíduo de cisteina para a função global seja desconhecida, tal como o é a es trutura precisa formada por este domínio, tem sido proposto que es tes resíduos de cisteina coordenem dois iões de zinco para formar dois assim denominados domínios em dedo de ligação ao ADN, que resultam numa estrutura ternária que se pensa ser responsável pela sua localização e ligação ao sítio de ADN requerido. Ver Klug, e colab.,Tr.Biochem.Sei 12, 464 (1987), Bens, e colab., Cell 52, 1 (1988), e Evans, supra.
Numa localização mais próxima da extremidade do terminal carbo xilo, distai, a partir da região de ligação ao ADN, estã o assim de nominado domínio de ligação ao ligando, o qual tem a capacidade demonstrada de bloquear a actividade do receptor na ausência de bormo na. Assim, a presença da hormona requerida atenua a inibição do receptor para a actividade. Verificou-se que a delecção desta região produz um activador da transcrição independente da hormona. Ver Codowski, e colab., Nature 325 365 (1987), Hollenberg, e colab., supra, Kumar, e colab., supra, Danielsen e colab., supra, e Adler e colab., Cell 52, 685 (1988).
Em contraste com estes dois domínios, as sequências localizadas na direcção da região do terminal amino a partir do domínio de ligação ao ADN são pobremente compreendidas quanto ã estrutura, e particuiarmente, quanto à função. Esta região é extremamente variável, quer em tamanho, quer em composição, entre os vários receptores - ver Evans, supra - e pode contribuir para a heterogeneidade da função do receptor. Ver Kumar e colab., supra, e Tora e colab., 333, 185 (1988).
e colab., Cell £3, 729 (1 985) ,
e colab. , Cell 48, 847 (1 987) ,
e colab., Cell 52, 179 (1 988) ,
Apesar da análise extensa, alguma da qual tendo sido relatada na literatura científica, a(s) região (ões) que determina(m) a trans-activação da iniciação da transcrição permanece(m) pobremerte carac terizada(s). Os domínios de trans-activação podem ser definidos como regiões polipeptídicas que, quando combinadas com o domínio funcional de ligação ao ADN, aumentam a iniciação da transcrição produ tiva pelas ARN-polimerases. Ver Sigler, Nature 333, 210 (1988), Brent ape e colab., Cell 46 885 (1986), Ma a e colab., Cell 51 113 (1987), Lech Hope e colab., Nature 333, 635 (1988)
31 0 48473
-5A pesquisa anterior do receptor para glucocorticóide humano por mutagénese de exploração de ligantes identificou duas regiões exteriores à região de ligação ao ADN com um papel na activação da transcrição. Estas regiões foram definidas como fi e íz. Giguere e colab., Cell 46, 645 (1986). A pesquisa adicional destes laboratórios também resultou na descrição de uma co-localização das funções de activação e ligação ao ADN. Ver Hollenberg e colab., supra, Miesfeld, e colab., supra, Danielsen e colab., supra, e Waterman e colab., supra. Como uma composição, esta pesquisa deu simplesmente origem a uma imagem emergente de uma molécula progressivamente modular com do mínios distintos, cada um deles contribuindo para as propriedades identificadas de ligação ao ligando, ligação ao ADN e trans-activação da transcrição. Contudo, até agora, a(s) região(ões) determinando a actividade de trans-activação não foi(foram), de todo, bem compreendidas . Assim, a imagem baseada na pesquisa existente carece de uma apreciação da natureza dinâmica dos receptores para esterõide e de como os vários domínios determinam uma cadeia de acontecimentos iniciados pela ligação a ligandos e consumados pela trans-activação específica do promotor.
Além disso, embora a pesquisa anterior tenha identificado domínios funcionais, tem havido pouco esforço sistemático para identificar aminoácidos que contribuem para as actividades específicas da própria molécula. Assim, a identificação prévia de regiões de trans-activação do receptor para esterõide resultou apenas de uma perda de actividade demonstrada por meio de mutagénese de delecção ou inserção mas era nenhum caso foram confirmadas as propriedades das próprias regiões em ensaios que refletem um ganho dominante de função .
Assim, Godowski e colab., Science 241, 812 (1988), relatam resultados que mostram que o receptor para glucocorticóide contém pelo menos um domínio de intensificação outro que não aquele sobrepondo-se à região de ligação ao elemento de resposta de glucocorticóide, e que o segundo domínio ocupa uma região próxima do terminal amino do receptor. De forma similar, Webster e colab., Cell 54, 199 (1988) descrevem uma função de activação da transcrição induzida dos receptores para estrogénio e glucocorticóide, e estes investigadores especulam que as posições relativas das reqiões da hormona (isto é, domínios de ligação ao ADN e ao ligando) não são importantes para a
7.0 310. 48473
-6actividade de indução da transcrição do receptor. Todavia, estes in vestigadores admitem que não têm uma definição da localização e da natureza exactas do que eles chamam domínio de activação induzida pela hormona, para não falar da sua caracterização e papel no potencial de trans-activação.
Como ponto de partida para o presente invento, Giguere e colab., acima, demonstraram perda de actividade no receptor para glucocorticóide com base num ensaio medindo a actividade de transcrição, quan do foi executada mutagénese orientada para um sítio aleatório em di versas localizações da molécula. Como um seguimento, Kollenberg e colab., eliminaram regiões dentro da molécula, demonstrando novamen te perda global da actividade de transcrição induzida pela referida remoção de trechos de aminoácidos.
É um objectivo do presente invento identificar e caracterizar o(s) domínio(s) responsável(veis) pela actividade de transcrição por trans-activação, e a caracterização do(s) referido(s) domínio(s) em relação à sequência e composição de aminoácidos, para explorar a interacção funcional do(s) domínio(s), se alguma, quer com os domí nios de ligação ao ADN quer com os domínios de ligação ao ligando de um dado receptor, e finalmente, para explorar este conhecimento por meio da manipulação do referido domínio de transcricção por trans-activação identificado e caracterizado a fim de aumentar a actividade de transcrição global do referido receptor assim manipu lado.
Deste modo, o presente invento, fornece novos receptores para hormona ou para similares de hormona que foram modificados aprovei tando o conhecimento da identidade e caracterização do(s) domínio(s) de actividade transcrição por trans-activação, por modificações dos mesmos a fim de produzir receptores heterõlogos novos que têm actividade aumentada quando comparada com a da molécula de origem.
É um objectivo do presente invento fornecer novos receptores hete rõlogos, facultativamente híbridos, tendo actividade de transcrição por trans-activação aumentada e, por outro lado, tendo domíni os de ligação ao ADN e de ligação ao ligando que podem ser tomados de empréstimo de vãrios receptores diferentes. É um objectivo adicional do presente invento fornecer novos ensaios por meio dos quais se podem determinar e avaliar agonistas e antagonistas do receptor putativo quanto ao potencial de exploração comercial. Ver
310 48473
-7também Ptashne, Nature 335, 683 (1988).
Sumário do Invento presente invento está baseado na identificação, isolamento e caracterização dos domínios de transcrição por trans-activação de polipéptidos de receptor para hormona ou semelhante a hormona intracelulares, o que permitiu, sucessivamente, a caracterização des criminada do próprio receptor, quer em termos de atributos físicos quer do efeito e função biológica dos seus vários domínios. Esta informação permitiu, por sua vez, a produção de sistemas recombinantes equipados úteis para a preparação destes novos receptores tendo propriedades de activação da transcrição aumentadas.
Foi determinado, baseado na informação aqui fornecida, que os receptores contêm domínios de transcrição por trans-activação que são independentes da posição e autónomos em função. Assim, o presente invento fornece novos receptores para hormona e semelhante a hormona onde os domínios de transcrição por trans-activação estão aumentados na sua capacidade para activar a transcrição. Estes novos receptores de acordo com a invenção contêm domínios de transcrição por trans-activação adicionais em relação â molécula de ori gem, posicionados de forma a fornecer um aumento adicional na acti vidade de transcrição. Estes novos receptores podem ser híbridos onde os domínios de ligação ao ADN e de ligação ao ligando são for necidos a partir de receptores da mesma classe ou de classe e/ou espécie diferentes.
O presente invento é também dirigido ã utilização destes novos receptores para bio-ensaios in vitro para determinação da fun cionalidade de um receptor putativo ou de um material hormonal ou similar putativo. Os bio-ensaios podem tomar a forma, por exemplo, de desafio de um destes novos receptores com um ou mais de uma ba teria de matérias de teste que têm actividade hormonal ou similar, putativa e que podem potencialmente modular a biofunção do referido receptor e acompanhar o efeito do referido material sobre o referido receptor numa montagem in vitro.
O presente invento é adicionalmente dirigido ã preparação des tes novos receptores por meio de tecnologia de ADN recombinante em todos os aspectos relevantes, incluindo uma molécula de ADN que é .70 310 48473
-8uma molécula de ADN recombinante ou uma molécula de ADNc constituída por uma sequência codificando o referido receptor ou um seu domínio de transcrição por trans-activação, e os vectores de expressão requeridos contendo o referido ADN operativamente ligado , compreendendo os elementos de controlo da expressão opera tivos no hospedeiro recombinante seleccionado para a expressão, e as células-hospedeiras recombinantes transfectadas com os referidos vectores de expressão operativos.
O presente invento refere-se ainda a um processo para induzir a expressão do ADN codificando uma molécula relatora ou outro polipéptido heterólogo desejado, compreendendo a indução da trans crição do ADN codificando o referido polipéptido por um complexo formado por um destes novos receptores e por um ligando correspondente capaz de ligação ao referido receptor, numa montagem in vitro em que o referido receptor e o referido ADN codificando o re ferido polipéptido, são produzidos por meio de expressão recombinante num sistema de hospedeiro celular transfectado.
Deste modo, o presente invento compreende um receptor para hormona ou semelhante a hormona tal como um polipéptido com acti vidade de transcrição por trans-activação aumentada, de um promotor com o qual está associado, em virtude da sua capacidade intrínseca de ligação a um elemento de resposta de sequência de ADN do referido promotor ou pela sua capacidade de associação com outro polipéptido(s) que se liga(m) ao referido elemento de respos ta da sequência de ADN, e tendo actividade de transcrição por trans-activação maior do que a do seu receptor de origem correspondente .
O presente invento é dirigido à tecnologia de ADN recombinan te em todos os aspectos relacionados com a utilização da caracterização do domínio de transcrição por trans-activação de um re ceptor para hormona ou semelhante a hormona para produção de isolados de ADN, incluindo isolados de ADN hibridáveis de forma cruzada, vectores de expressão delineados para esse fim, hospedeiros transfectados desse modo e a processos comprendendo um processo de utilização da referida informação para delinear células ou linhas celulares compreendendo informação genética suficiente para que as referidas células ou linhas celulares produzam os referi70 310
48473
-9dos receptores de modo que eles possam ser utilizados como tal ou em sistemas de expressão ou em ensaios para determinação da activi dade dos ligandos putativos correspondentes.
Descrição Detalhada do Invento
1. Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 representa a identidade, e a actividade de transcri ção, de várias entidades de receptores para glucocorticóide humano (hGR) que foram modificados a partir da molécula de origem nos domí nios de transcrição por trans-activação (tauj. Estão representados esquematicamente o tipo selvagem de hGR (ts) e os mutantes de tau .
As regiões funcionais estão tracejadas (tau ), ponteadas (domínio de ligação ao ADN) ou indicadas por DEX (domínio de ligação à hor mona). Os números acima de cada receptor definem as posições dos ami noácidos. As barras verticais grossas identificam as ligações de um fragmento inserido. A actividade relativa da luciferase (molécula re _7 “ latora) foi medida por MTV-LUC utilizando dexametasona 10 M (esteróide correspondente), excepto para os receptores indicados por C após a actividade, os quais são constitutivamente activos.
A figura 2 representa a actividade de luciferase de vários receptores tau2· 0 tipo selvagem de hGR estã representado na parte su perior. A região de tau2 estende-se do aminoácido 526 a 556 e estã representada por um rectângulo a cheio. As substituições da região tau2 estão indicadas por rectângulo a cheio (tau2) ou por rectângulos tracejados para a hélice alfa anfipãtica (aah). As actividades de luciferase relativas foram medidas por MTV-LUC em presença de dexametasona 10 Me sao seguidas por (C) quando sao independentes da hormona. Os asteriscos indicam o sítio da extremidade de aminoácidos da molécula truncada.
A figura 3 ilustra a construção do receptor de esterõide híbrido de receptores para a hormona tiroideia-glucocorticõide, cuja actividade de transcrição por trans-activação estã aumentada pela adição de domínios taui. Inseriu-se um segmento do ADNc do receptor para glucocorticóide humano, codificando os aminoácidos 77 a 262 (codificando o domínio tau ), no ADNc do receptor para hormona tiroideia alfa de ratazana numa posição correspondente ao aminoácido 21, numa cópia ou em cópias múltiplas. O receptor de origem é •70 31Ό 48473
-10rTR alfa com um ligante de BamHI inserido no único sítio BstEII no terminal amino. As construções foram transfectadas para as cé lulas CV-1 com a actividade TRE-CAT e CAT medida na ausência ou na presença de T^.
A figua 4 representa a análise mutacional de ponto do domínio de ligação ao ADN do hGR. Apresenta-se a sequência dos aminoá eidos do domínio de ligação ao ADN do hGR. Cada linha representa informação que se crê ser codificada por parte de um exão separa do. A sequência consensual (con) para a super-família do receptor para a hormona esteroide estã representada sob a sequência do hGR, indicando-se os aminoácidos invariantes (letra carregada), conser vados (tipo padrão) e não-conservados (traços). Os aminoácidos con vertidos em lisina estão encimados por círculos. A actividade de transcrição dos mutantes, analisada com MTV-CAT e comparada com hGR-SV, estã indicada como maior do que 10% (círculos a cheio),
1% a 10% (círculos meio-preenchidos), e menor do que 1% (círculos abertos).
2. Processos Gerais e Definições
A identificação dos aminoácidos utiliza os alfabetos de amino
ácidos de letra única e de três letras, isto é :
Asp D Acido Aspãrtico Ile I Isoleucina
Thr T Treonina Leu L Leucina
Ser S Serina Tyr Y Tirosina
Glu E Acido Glutãmico Phe F Fenilalanina
Pro P Prolina His H Histidina
Gly G Glicina Lys K Lisina
Ala A Alanina Arg R Arginina
Cys C Cisteina Trp W Triptofano
Vai V Valina Gin Q Glutamina
Met M Metionina Asn N Asparagina
Estes receptores para esteroide são preparados 1) tendo metionina como o primeiro aminoácido (presente em virtude da inserção do codão de sinal de partida ATG na frente do gene estrutural), ou 2) onde a metionina é clivada intra-ou extracelularmente, tendo o seu primeiro aminoácido habitual, ou 3) em conjunto quer com o seu polipéptido de sinal quer com uma proteína conjugada, que não o seu
70310 48473
-11polipêptido de sinal convencional, o polipéptido de sinal ou um con jugado sendo especificamente clivável num ambiente intra ou extracelular. Em todos os casos, o receptor assim produzido, nas suas várias formas, é recuperado e purificado até um nível adequado para o uso pretendido. Ver acima.
Os receptores para hormona ou semelhante a hormona de acordo com este invento incluem os receptores especificamente descritos, para todas as espécies onde a hibridação cruzada ocorre, muito notavelmente outros receptores de mamífero, bem como receptores relacionados (por exemplo, família de gene) da mesma espécie ou de espécies hibridáveis de forma cruzada, que são tornadas capazes, em virtude do isolamento do ADN e caracterização e utilização por meio de técnicas de hibridação cruzada a partir dos referidos receptores específicos ou a partir da identificação por imuno-reactividade cru zada para anticorpos produzidos para determinantes da forma habitual conhecida per se. Também inclui equivalentes funcionais de to das as formas anteriores incluindo receptores inter-espécie ou intra-espécies em que os domínios de ligação ao ADN e/ou de ligação ao ligando são permutados um com o outro, ou sob outros aspectos, diferindo em um ou mais aminoácidos originais correspondentes, ou nos padrões de glicosilação e/ou fosforilação, ou na estrutura con formacional ligada.
vector de expressão inclui vectores que são capazes de ex primir as sequências de ADN aí contidas, onde as referidas sequências estão operativamente ligadas a outras sequências capazes de efectuar a sua expressão. Estã implicado , embora nem sempre de uma forma explícita, que estes vectores de expressão podem ser replicã veis nos organismos hospedeiros quer como epissomas, quer como uma parte integral do ADN cromossómico. A expressão Operativo, ou os seus equivalentes gramaticais, significa que as sequências de ADN respectivas são operacionais, isto é, funcionam para os fins pretendidos. Resumindo, aovector de expressão é dada uma definição funcional, e qualquer sequência de ADN que é capaz de efectuar a ex pressão de uma sequência de ADN específica aí localizada é incluída neste termo, tal como se aplicado ã sequência especificada. Em geral, os vectores de expressão com utilidade em técnicas de ADN recombinante estão, muitas vezes, sob a forma deplasmídeos, que se •70 310 48473
-12referem a alças circulares de ADN de cadeia dupla que, na sua forma de vector, não estão ligadas ao cromossoma. Na presente descrição plasmídeo e, vector são utilizados intermutaveImente dado que o plasmídeo é a forma de vector mais vulgarmente utilizada. Contudo, pretende-se que o invento inclua as outras formas de vec tores de expressão referidas,que servem funções equivalentes e as quais se tornarão conhecidas na arte subsequentemente ao presente invento.
Para além da novidade do presente invento envolvendo a manipulação por meios de reposicionamento ou aumento dos domínios de transcrição por trans-activação de um receptor para esteróide ori ginal, deverá entender-se que os novos receptores para esteróide de acordo com o presente invento podem, sob outro aspecto, diferir premissivelmente do receptor para esteróide original em relação a uma diferença num ou mais aminoácidos da entidade de origem, desde que as referidas diferenças não conduzam a uma destruição na es pécie da actividade ou biofuncionalidade do receptor para esterõide básico.
Células hospedeiras recombinantes refere-se a células que foram transfectadas com vectores construídos utilizando técnicas de ADN recombinante.
Meio de suporte extrínseco inclui aqueles meios delineados ou conhecidos que podem suportar as células numa fase de crescimento ou mantê-las num estado viável de modo que elas possam exe cutar a sua função recombinantemente subordinada. Ver, por exemplo, ATCC Media Handbook, Ed. Cote e colab., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1984). Um meio de suporte do crescimento para células de mamífero, por exemplo, contém preferivelmente um suplemento de soro, tal como soro de vitelo fetal ou outro componente de suplementação habitualmente utilizado para facilitar o crescimento e divisão celulares, tal como hidrolisados de leite ou carne animal, extractos de orgãos ou tecidos, coágulos macerados ou seus extractos, e assim por diante. Outros componentes do meio adequados incluem, por exemplo, a transferrina, a insulina e vários metais.
Os vectores e processos que aqui se descrevem são apropriados para utilização em células hospedeiras para uma grande gama
31 0 48473
-1 3de organismos procarióticos e eucarióticos.
Além da discussão acima e das várias referências a ensinamentos da literatura existente, faz-se referência a livros de texto padrão da biologia molecular que contêm definições e métodos, e meios para executar as técnicas básicas abrangidas pelo presente invento. Ver, por exemplo, Maniatis, e colab., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982 e as várias referências nele citadas, e em particular, Colowick e colab., Methods in Enzymology Vol 152,Academic Press, Inc. (1987). Todas as publicações aqui citadas são aqui expressamente incorporadas como referência.
A descrição anterior e os detalhes experimentais seguintes explanam a metodologia inicialmente utilizada pelos presentes investigadores na identificação e caracterização e preparação dos receptores particulares. Os peritos na arte reconhecerão que fornecendo a informação presente, incluindo a localização e composição do domínio de transcrição por trans-activação de um dado receptor e como ele pode ser manipulado para produzir estes novos receptores, não ê necessário, ou talvez nem mesmo cientificamente aconselhável, repetir estes detalhes para que se possa reproduzir este tra balho. Em vez disso, podem-se escolher utilizar processos conheci dos, seguros e alternativos, por exemplo, podem sintetizar-se as sequências de ADN subjacentes codificando um novo receptor particular para distribuição dentro de sistemas de cultura e vectores de expressão, operativos, similares ou outros adequados. Assim, além de fornecer detalhes realmente utilizados, a descrição presen te serve para permitir a reprodução dos receptores específicos des critos e de outros, e dos seus fragmentos, utilizando meios dentro da arte, tendo o benefício da presente descrição. Todos os referidos meios estão incluídos dentro da capacidade e âmbito do presente invento.
3. Descrição Detalhada das Concretizações Particularmente Preferidas
O presente invento foi baseado na utilização do receptor para glucocorticóide como modelo para a preparação de novás entidades modificadas do mesmo, incluindo híbridos do receptor para glucocor70 31 0 48473
-14ticóide com outros receptores, tais como receptor para tirõide, par ticularmente na permuta de domínios de ligação a ADN e de ligação ao ligando para compor os referidos híbridos. Em cada caso, a essên cia deste invento, nomeadamente, o reposicionamento e/ou o aumento do(s) domínio(s) de transcrição por trans-activação a fim de criar novos receptores cuja actividade de transcrição por trans-activação está aumentada em relação à origem, é aqui ilustrada utilizando o receptor para glucocorticóide do original, ou de seus híbridos, em relação aos quais foram feitas comparações para as versões modificadas do novo domínio de transcrição por trans-activação.
Deverá ser entendido que, deste modo, para receptores que são conhecidos na especialidade, quer sejam do tipo selvagem, híbridos, ou equivalentes funcionais tal como aqui se descrevem, são adequados como materiais de partida para os aspectos modificados do(s) domínio(s) de transcrição por trans-activação de acordo com o presente invento.
4. Exemplos
Os exemplos seguintes especificam os materiais e métodos empregues nos processos experimentais que se seguem:
Mutagénese Pontual e Activação da Transcrição
Para definir sistematicamente o papel do domínio de ligação ao ADN na função do receptor, a pesquisa utilizou mutagénese extensiva, orientada para sítios, desta região conservada. Por testar o papel dos aminoácidos individuais, este método tem o potencial para determinar se os mutantes que afectam a trans-activação são independentes daqueles que influenciam a ligação ao ADN.
A sequência da região de ligação ao ADN do hGR é fornecida na figura 4, seguida pela sequência consensual para a super família do receptor para hormona esterõide. Entre os membros da super família, este domínio contém 20 resíduos invariantes e 12 conservados. Todos os aminoácidos invariantes, assim como oito resíduos conservados e oito não-conservados, foram trocados para glicina. Mediu-se a capacidade para estimular a transcrição, a partir do promotor de MTV responsivo ao GR, e para formar complexos especificamen te com um fragmento de ADN do elemento de resposta ao glucocorticóide (GRE), in vitro.
7·0 31 σ 48473
-15Α melhoria da transcrição dependente do esterõide do MTV-CAT para cada mutante ê apresentada na tabela I e está indicada sobre cada aminoãcido alterado na figura 4. Todas as actividades são relativas ao receptor hGR-SB, do tipo selvagem o qual apresenta uma indução média de aproximadamente 1000 vezes. Assim, mesmo 1 % de actividade residual é significativa. Os mutantes de delecção indicados na tabela I, delta 420-451 e delta 450-487, removem a primeira e segunda metades do domínio de ligação de ADN, respectivamente, com o ponto de quebra correspondendo a uma ligação exão-exão dentro dos ADNc do receptor para progesterona de galinha e mineralo corticóide humano. Não têm ambas actividade mensurável, indicando que nenhum dos dedos sozinho é suficiente para a activação.
Dos mutantes pontuais de glicina,todos aqueles que alteram um dos nove resíduos de cisteina invariantes destroem a actividade, o que é consistente com a ideia de que eles são críticos para a função. Uma cisteina não-conservada adicional na posição 431 não é ne cessaria para a função. Surpreendentemente, apenas cinco dos restantes 24 mutantes de glicina são completamente inactivos. Os cinco alelos não funcionais são todos resíduos invariantes, sugerindo que estão envolvidos em aspectos gerais de ligação do ADN, e não na determinação da especificidade da sequência. Contudo, nem todos os resíduos invariantes são críticos para a função. Por exemplo, quando o ácido aspártico 426 é convertido em glicina, não existe quase nenhuma perda de actividade. Sete de oito mutantes com os ami noácidos conservados trocados por glicina são funcionais, com metade deste grupo retendo mais de 40% da actividade. De forma similar, a mutação de aminoácidos não-conservados dentro do domínio de ligação do ADN não produz, em nenhum caso, um receptor com menos de 10% da actividade e provoca, geralrnente, uma pequena redução na função. Assim, apesar de algumas excepções significativas, existe uma boa correlação entre a conservação de um aminoãcido e a extensão da perda funcional quando convertido em glicina com todas as cisteínas invariantes desempenhando um papel crítico para a função.
310 48473
-1 6Tabela 1. Comparação da Actividade Transcricional e da Ligação do ADN para Mutantes de Glicina do hGR
Actividade de CAT Ligação do ADN Relativa
Mutante de hGR Relativa (a) in vitro (b)
hGR-SB 100 100
Δ420-451 <1 1
4450-487 <1 1
G421 <1 <1
G423 <1 <1
G4 24 <1 1
G426 75 75
G431 80 10
G432 10 30
G433 2 1
G437 20 8
G438 4 1 4 1
G441 <1 41
G442 <1 60
G444 <1 1
G445 41 4 1
G4 4 6 40 6
G447 <1 2
G450 60 50
G453 90 60
G455 80 6
G457 41 2
G460 55 90
G462 80 40
G463 <1 1
G465 1 1
G467 40 6
G470 3 4
G471 1 0 6
G473 41 4 1
G474 60 95
G476 41 4 1
G477 <1 1
G479 65 40
G480 90 50
G481 41 3
G486 1 0 1
a. A actividade foi medida com MTV-CAT em células CV-1
b. 0 ensaio de ligação do ADN é descrito noutro lugar
(Hollenberg e colab., 1987). 0 valor dado foi deri-
vado de contagens de imunoprecipitado total mas re-
flete a ligação específica como determinado por elec troforese em gel. -
31 0 48473
-17Ligação do ADN in vitro de Mutantes Pontuais
A actividade CAT medida no ensaio de transcrição é a soma de funções individuais múltiplas incluindo localização nuclear, liga ção do ADN, dimerização e talvez os eventos alostéricos e inter-acções proteína-proteína que, em última análise, resultam na acti vação. Se mais do que uma função essencial é codificada pelo domínio de ligação do ADN, alguns dos mutantes pontuais não-funcionais podem ainda reter a sua capacidade para ligar o ADN mas são incapazes de activar. Para explorar esta possibilidade, cada proteína mutante foi produzida por transfecção do vector de expressão correspondente em células COS-1, e analisada quanto ã sua capacidade, em extractos em bruto, para formar um complexo específico proteína-ADN com ADN radiomarcado. A actividade de cada mutante neste ensaio de imunoprecipitação da ligação ao ADN é indicada na Tabela I; o valor apresentado representa a ligação específica do fragmento GRE. Em geral, existe uma boa correspondência entre a capacidade para activar a transcrição e para ligar o ADN in vitro. Os mutantes para os quais a actividade de ligação ao ADN é significativamente menor do que a actividade de transcrição, tais como G446, G455,
G467 e G486, podem ser instáveis in vitro. A activação da transcri ção medida para estes mutantes é um resultado da interacção especi fica com o ADN, in vivo, dado que a delecção de GREs do promotor de MTV suprime a sua actividade.
Apenas um único mutante, o G442, o qual converte a lisina di rectamente, após o primeiro dedo putativo, em glicina, perdeu a ca pacidade para estimular eficientemente a transcrição embora manten do a afinidade para o ADN in vitro. A especificidade de ligação aos GREs, relativamente ãs sequências não específicas, é apenas minimamente afectada, indicando que a sua perda dramática em actividade não é devida a uma incapacidade para ligar as sequências do promotor in vivo. Este é um mutante intrigante dado que sugere que a li gação ao ADN não é suficiente para a activação. Talvez o G442 evite um evento secundário, tal como uma modificação alostérica, após a interacção ADN-proteína primária. Apesar desta excepção, estes resultados demonstram que a região de 66 aminoácidos rica em cisteína concretiza o domínio de ligação ao ADN. Na realidade, embora a ligação ao ADN seja necessária para a trans-activação, esta fun70 310 48473
-18ção tem de estar localizada noutras regiões do receptor.
A espécie G442 tem significado particular em termos de utilidade, dado que é a única espécie preparada que não consegue produzir actividade, mas que ainda apresenta evidência de ligação substancial ao ADN. É contemplado, por exemplo, que um ensaio pode ser delineado explorando a propriedade de ambas as espécies G442 e 1550*.
A espécie 1550* carece completamente de um domínio de ligação ao li gando, e como tal, não é reponsiva à presença ou ausência de hormona. A hormona para um sítio de ligação ao ligando específico atenua a inibição da molécula para actuar como um factor de transcrição por trans-activação. A falta deste domínio significa que a espe cie 1550* produzirá sempre actividade num ensaio com ou sem a presença de esteróide. Por outro lado, no mesmo ensaio, a espécie G442 será sempre inactiva com ou sem esteróide. Planeando um ensaio apropriado onde ambos os receptores G442 e 1550* estão presentes no sistema, haverá inicialmente 100% de actividade com base na con tribuição da espécie 1550* sozinha. Â medida que o esteróide apropriado é adicionado ao sistema, a actividade observada tenderá, pro gressivamente, para zero com o tempo. A administração do antagonista putativo em conjunto com o esteróide apropriado, se activo como tal, restauraria a actividade dado que o antagonista interferiria com a acção do esteróide reduzindo, desse modo, a actividade global, e observando-se um recuo na actividade.
Quimeras de GAL4/hGP
Se as funções r e de ligação ao ADN são verdadeiramente separáveis, existe a possibilidade de substituir o domínio de ligação ao ADN do hGR por um domínio de ligação ao ADN não-receptor para produzir uma proteína activadora híbrida com uma nova especificidade de promotor. Para testar esta possibilidade, a região rica em cisteina do hGR foi substituída como os primeiros 74 aminoácidos da levedura GAL4. Estes aminoácidos da GAL4 são suficientes para o reconhecimento do ADN específico da sequência, mas não têm capacidade de activação da transcrição. A capacidade de trans-activar resi de fora do domínio de ligação ao ADN e é codificada em duas regiões separadas da proteína. Deste modo, a fim de produzir um factor de transcrição funcional, as fusões entre o domínio de ligação ao ADN
310 48473
-1 9de GAL4 e o hGR devem conter funções de trans-activação devidas ao hGR.
Para analisar a função dos híbridos hGR-GAL4, um promotor res ponsivo ao GAL4, delta MTV-GAL-CAT, foi construído a partir de MTV-CAT. Este gene de fusão foi tornado não-responsivo ao GR e induzível pela GAL4, por substituição de sequências de GRE por um sítio de ligação sintético GAL4. Quando se mede a activação de hGR e GAL4 neste promotor, o hGR não pode produzir estimulação mensurável a partir deste promotor, enquanto que a GAL4 pode aumentar a expressão do CAT cerca de 20 vezes relativamente a um vector de ex pressão de controlo. Isto é consistente com descrições anteriores de que a GAL4 pode funcionar em células eucarióticas superiores. A estimulação pelo GAL4 é claramente medida através do sítio de liga ção sintético ã GAL4; a delecção deste sítio torna o promotor não-responsivo ã GAL4.
As fusões entre o domínio de ligação ao ADN de GAL4 e os domí nios de activação do hGR potenciais foram examinadas quanto ã sua capacidade para estimular o relator responsivo ã GAL4. Para demons trar que o domínio de ligação ao ADN do hGR não é necessário para a actividade deste híbrido, o domínio de ligação ao ADN do hGR foi substituído pelo domínio de ligação ao ADN de GAL4 para produzir o híbrido GgalG. (O hGR, incluindo o terminal amino (G-), o domínio de ligação ao ADN (G), e o terminal carboxilo (G), é designado por G-G-G-, respectivamente. A substituição do domínio de liga ção ao ADN do hGR pelo GAL4, origina o G-gal-G). O híbrido dependente da hormona resultante pode claramente funcionar na ausência do domínio de ligação ao ADN do hGR e actua, realmente, como um factor de transcrição mais potente do que GAL4 neste sistema de en saio, originando um aumento de 500 vezes na actividade do CAT com a adição da hormona. Inesperadamente, o GgalG também pode estimular o delta MTV-CAT sem um sítio de ligação ã GAL4, mas apenas cerca de 5% do medido no delta MTV-GAL-CAT. O plasmídeo delta MTV-AT pode conter um sítio de reconhecimento da GAL4, críptico, que é apenas revelado com o activador GgalG mais forte e não com a GAL4 mais fraca. Na realidade a activação é dependente do domínio de ligação ao ADN de GAL4; o GgalG é funcional sobre o delta MTV-CAT enquanto que o GGG não é.
7.0 310 48473
-20A capacidade de trans-activação do GgalG tem de ser determinada pelas regiões do terminal amino ou do terminal carboxilo do hGR, dado que o domínio de ligação ao ADN de GAL4 sozinho é inactivo. Deste modo, testaram-se individualmente cada uma destas regiões do hGR quanto ã sua capacidade para complementar a função de ligação ao ADN de GAL4. Ambos os híbridos são funcionais com o Ggal (delta) exibindo actividade constitutiva, enquanto que o (delta) galG é completamente dependente da hormona. Assim, as funções de trans-activação autónomas estão concretizadas em ambos os segmentos do terminal N e do terminal C do hGR, embora sujeitas a constrangimentos diferentes.
Mutantes do hGR Rearranjados e Parcialmente Duplicados
A fusão com o domínio de ligação ao ADN da GAL4 demonstrou a presença de propriedades de trans-activação distintas nos 300 aminoácidos do terminal carboxilo e nos 420 aminoácidos do terminal amino do hGR. Os mutantes do hGR com duplicações de Tau^ foram analisados no derivado de luciferase de MTV-CAT, MTV-LUC. Os valores de actividade determinados com o gene de fusão de luciferase-MTV e MTV-CAT são equivalentes para os mutantes de delecção anteriormente descritos. A figura 1 representa a série de derivados do mutante lí e a sua actividade de luciferase relativamente ao receptor do tipo selvagem. A ausência de 'Tt reduz a actividade a 5%, enquanto gue o mutante GR11 de duplicação em tandem actua como um receptor super com 310% de actividade. Os mutantes GR12, GR14, GR17 e GR18 revelam que (fí pode funcionar entre as regiões de ligação ao ADN, e à hormona, assim como no lado do terminal amino do domínio de ligação ao ADN, originando, em cada caso, um activador depen dente da hormona (Figura 1). Isto indica uma flexibilidade notável da estrutura do receptor. A capacidade de íi para aumentar a activi dade é independente de ambos os terminais amino e carboxilo, tal como se mostra na Figura 1 por comparação das actividades de GR13 com GR14, e de GR15, com 1515*, com GR16. A região (f/ pode não ser responsável por toda a capacidade de trans-activação no terminal amino tal como é demonstrado pela actividade 4 vezes superior do GR18 relativamente ao GR14. Também como suporte desta proposta, a delecção do 1) e do terminal carboxilo no GR15 deixa uma activida7.0 310 48473
-21de residual de 1%, uma indução de 10 vezes, a qual pode ser abolida por delecção da maior parte do terminal amino (comparar GR15 e GR26, Figura 2) .
Uma segunda região com carácter de trans-activação potencial é a , localizada na própria extremidade do terminal amino do domínio de ligação â hormona (aminoácidos 526-556). Esta região tem cinco resíduos carregados negativamente num trecho de 18 aminoáci dos e está implicada na actividade de receptor pela diferença de du as vezes na activação dos mutantes truncados 1550* e 1515* (Figura 3). Para determinar se Tz, constitui ou não um domínio activador, este foi introduzido adjacente a, ou em vez do Ti . A figura 3 mos tra que esta região actua originando um aumento de 3 vezes na acti vidade quando introduzido no terminal amino independente de (com parar GR20 com ts, GR21 com Δ77-262). Uma segunda cópia origina um aumento adicional de 2-vezes, de modo que um par de regiões T2 origina um aumento global na actividade de seis vezes (GR22). Deste modo, tal como Τι , a posição de Ta no receptor é flexível, a sua actividade é cumulativa e a sua função pode ser constitutiva (por ex., GR25).
Construções semelhantes aos mutantes de T2 , GR21 e GR22, foram construídas utilizando a hélice c< anfipatica sintética, aah, contendo 20%de resíduos ácidos, e que se demonstrou possuir propriedades de trans-activação no contexto da GAL4 de levedura (Giniger e colab., Nature 330, 670(1987)). O tamanho e carga características da sequência aah são semelhantes às da região Ta , o que con duz à exploração da sua actividade potencial no contexto do hGR.
Na realidade,observa-se um aumento semelhante na actividade de mu tantes com cópias únicas ou múltiplas de Ta e aah (Figura 3 ; com parar GR21 com GR23, GR22 com GR24), sugerindo que estas regiões podem desempenhar funções equivalentes. Estes resultados apoiam e alargam a noção da natureza modular dos domínios de trans-activação .
Domínios de Trans-activação (T)
Definiram-se regiões de trans-activação do hGR distintas de acordo com os dois critérios seguintes: a delecção diminui a acti vidade e a duplicação aumenta-a. Por estes padrões, duas regiões
310
48473
-22do receptor, de 200 e de 30 aminoácidos, codificam funções de transactivação. A localização destas duas regiões não exclui um papel de sequências activadoras adicionais dentro do hGR. O exame das sequências primárias de 'íi e ΐχ não revela qualquer homologia óbvia, com a excepção de que ambas as regiões têm carácter ãcido. Esta pro priedade é notável, em virtude dos domínios de activação nos factores de transcrição de levedura GAL4 e GCN4, embora desprovidos de identidade de sequência obvia ,são ricos em resíduos ácidos. Esta se melhança aparente não demonstra que qualquer das regiões activadoras identificadas em qualquer um de GAL4, GCN4, ou no receptor para glucocorticóide, funcionem através dum mecanismo comum, embora isto pareça provável. O potencial para um mecanismo comum é adicionalmente suportado pela observação de que a sequência da hélice anfipãtica (aah) sintética pode substituir funcionalmente o e, até certo ponto, ο 'í, .A falta de sequência óbvia e o relacionamento do tamanho de Y, e Yx e das sequências de activação da levedura, con duz ã conclusão de que as funções de trans-activação podem ser con cretizadas pelo contexto absoluto de resíduos carregados negativamente na superfície da proteína ligada ao ADN.
Natureza Modular do hGR
A natureza modular do hGR surgiu não apenas a partir de compa rações da sequência primária dentro da superfamília do receptor pa ra esterõide, mas também pela capacidade de permutar domínios funcionais para originar novos activadores quiméricos. O domínio de ligação ao ADN do hGR foi substituído pelo do receptor para estrogéneo humano (Green e colab., Nature 325, 75 e Chambon, (1987) e pe lo domínio de ligação ao ADN, não relacionado de GAL4. A sua posição não é crítica dado que pode funcionar no terminal amino. Além disso, o domínio de ligação ao ADN pode ser colocado na direcção do terminal amino ou carboxilo, em relação tanto a Yi como a Yz , sem comprometer a função destes domínios. Coerentemente com as pro priedades modulares, a posição de Yi e Yx não é crítica, e a sua multimerização conduz a uma função do receptor aumentada. Assim, foi possível produzir receptores com actividade de até quatro vezes a do receptor do tipo selvagem ou com especificidade de ligação ao ADN alterada. Os receptores híbridos são ainda induzidos por hor70 310
48473
-23mona, indicando um mecanismo não. específico pelo qual o domínio de ligação à hormona impõe um efeito dependente do ligando no resto da molécula. Segue-se o detalhe experimental e a discussão:
Construção do Plasmídeo e do Mutante Pontual
O plasmídeo hGR-SB foi produzido por recombinação no sítio Ciai entre os mutantes da exploração de ligante 1532 e I403S (Giguere e colab., Cell 46, 645 (1986). O I403S, foi obtido a partir do 1403 por introdução do adaptador SstI, 5'GATCGAGCTCGC 3’, no sí tio BamHI. Este derivado do hGR é origem de todos os mutantes pontuais e é indistinguível do receptor do tipo selvagem na ligação ao ADN e na activação da tradução. Para converter o eodão desejado do hGR-SB num eodão codificando glicina, o fragmento SstI/BamHI, de 400 nucleótidos do plasmídeo hGR-SB foi primeiro introduzido no M13mp18 para originar um molde de cadeia simples. Os oligonucleõtidos sintéticos das bases 13-15 foram então utilizados para trocar, por técnicas padrão, o eodão desejado para GGN, seauindo-se a re-introdução do fragmento SstI/BamHI alterado no hGR-SB. As delecções de Δ 420-451 e A 450-487 foram produzidas com oligonucleótidos mais longos (icosameros); as posições de aminoácidos fornecidas de finem os resíduos não-deleccionados na junção de delecção. As sequências do mutante foram determinadas directamente a partir do ADN do plasmídeo de cadeia dupla utilizando desnaturação alcalina (Hattori e colab., Anal.Biochem 152, 232 (1986)),seguida por terminação de cadeia, de primers de hGR sintéticos.
O plasmídeo relactor MTV-CAT e o seu derivado de delecção ΔMTV-CAT foram produzidos como se segue. O sítio de HindIII de pBLCAT2 (Luckow e colab., Nucl.Acids Res. 15, 5490 (1987)) foi pri meiro destruído para produzir o pTKCAT-H. O promotor de HSV-timidina-quinase do pTKCAT-H foi então excisado por digestão com BamHI/ /BglII, e substituído pelo fragmento BamHI de MTV-LTR de pMTV-TK (Kuhnel e colab.,J.Mol.Biol. 190, 367 (1986)), pLS-190/-181 ou pLS96/-88 (Buetti e colab., J.Mol.Biol. 190, 379 (1986)) para produzir MTV-CAT, -190/-181 MTV-CAT, ou -96/-88 MTV-CAT, respectivamente. Ο ΔMTV-CAT foi construído a partir do MTV-CAT —190/—181— e -90/ /-88 por recombinação entre os sítios do HindIII destes mutantes.
Ο ΔMTV-CAT foi convertido em MTV-GAL-CAT por introdução do sítio de
31 0 48473
-24ligação ã GAL4 sintético 17MX (Webster e colab., Cell 52, 169 (1988)) no sítio HindIII único. O plasmídeo MTV-LUC foi construído por conversão do sítio HindIII de pSVOA/L-A Δ5' (de Wet e colab., Mol. Cell. Biol. Ί_, 7 25 (1987)) em Xhol e introdução das sequências de poliadenilação SV40 e codificação da luciferase deste derivado (produzido por digestão com BamHI, preenchimento das extremidades com polimerase I de Klenow e digestão com Xhol) no MTV-CAT digerido com Xhol/Smal.
O GgalG foi obtido a partir do pG525 (Laughon e colab., Mol. Cell.Biol. 4y 260 (1 984)). Foi utilizada a mutagénese dirigida por primer para introduzir os sítios Notl e Xhol nos nucleõtidos da sequência de codificação -10 a -3 e +223 a +228, respectivamente.
domínio de ligação ao ADN de GAL4 foi excisado deste derivado por digestão com Notl e inserido no pRShGR^x (Giquere e colab., Nature 330, 624(1987)) em vez do domínio de ligação ao ADN endógeno. O GgalA e o âgal foram produzidos por digestão do GgalG e âgalG, res pectivamente, com Xhol, seguida por preenchimento das extremidades e ligação. O AgalG foi construído por introdução de um duplex de oligonucleõtido sintético ( 4 AN, 5' GTACCACCATGGGGC 3') contendo um sítio de ligação ao ribossoma consensual (Kozak, Nucl.Acid.Res.
12, 857 (1984)), em lugar do fragmento Asp718/Notl de codificação do terminal amino do GgalG.
A produção dos mutantes A 77-262, 1515* e A 9-385 foi descrita por Hollenberg e colab., Cell 49, 39, (1987). Os mutantes de foram construídos utilizando fragmentos BglII/BamHI de 1262 (Giguere e colab.,Cell 46, 645 (1986)), codificando para os aminoácidos 77-262 do hGR. Este fragmento foi inserido nos sítios BamHI dos mutantes de exploração do ligante do hGR, 1262 e 1515, produzindo-se o GR11 e o GR12, respectivamente. O GR13 foi derivado do pRShGRNX por substituição das sequências de codificação do terminal amino pelo adaptador A AN anteriormente descrito. 0 GR17 foi criado por inserção do fragmento BamHI de codificação do terminal amino, produzido por recombinação entre os mutantes de exploração do ligante 19 e 1384 (Giguere e colab., acima), no sítio BamHI do 1515. O mutante 1550* foi produzido por recombinação entre os sítios BamHI dos mutantes 1550 e 1696, alterando-se deste modo o quadro de leitura após o aminóácido 550. Este mutante incorrecta70 310
48473
-25mente descrito como ά 532-6 97 numa publicação anterior (Hollenberg e colab. acima). Para originar derivados de úi , produziu-se um fra gmento de codificação de excisãvel por conversão dos nucleótidos de hGR 1704-1709 e 1800-1805 (Hollenberg e colab., Nature 318, 635 (1985)) em sítios BamHI e BglII, respectivamente, utilizando mutagénese dirigida ao olegonucleótido. A sequência codificando o íz, foi então introduzida no sítio BamHI do 1262 para produzir o GR20, ou em lugar do fragmento BglII/BamHI do 1262 para produzir o GR21. O GR23 foi originado por substituição do fragmento BglII/ /BamHI do 1262 com um duplex de oligonucleotido sintético (5'GATCT GGAAT TACAA GAGCT GCAGG AACTA CAAGC ATTGT TACAA CAGCA AGAG 3') codificando a sequência de aah (Giniger a Ptashne, 1987). Os mutan tes com cópias em tandém desta sequência e do 'íí (GR24 e GR22) foram produzidos por técnicas padrão (Rosenfeld e Kelly, 1986). Os derivados de mutante duplo das construções anteriormente descritas foram produzidos por recombinação no sítio Ciai: GR14 a partir de GR12 e GR13; GR15 a partir de Δ77-262 e 1515*; GR16 a partir de GR11 e 1515*; GR18 a partir de GR13 e GR17; GR25 a partir de GR22 e 1515*; GR26 a partir de Δ 9-385 e 1515*.
Imunoprecipitação da Ligação ao ADN
A ligação ao ADN foi medida como anteriormente se descreveu (Hollenberg e colab., acima). O receptor mutante, obtido num extracto de células COS-1 em bruto, após transfecção, foi incubado com uma mistura de fragmentos de ADN radiomarcados, um dos quais continha GREs. Os complexos ADN-receptor foram imunoprecipitados com anti-soro específico para o receptor e com Staph A, purificados de proteína, contados de acordo com a técnica Cerenkov, e em seguida, submetidos a electroforese através dum gel de poliacrimida desnaturante para verificar a ligação específica. Compararam -se as contagens de imunoprecipitado total. A presença da proteína do hGR mutante em cada extracto de células COS-1 foi confirmada por anãlise de mancha Western.
Ensaios de Transfecção e de Luciferase
A transfecção das células CV-1 e COS-1 foi efectuada tal como
310
48473
-26anteriormente se descreveu (Giguere e colab., e Hollenberg e colab., acima), utilizando 5 microgramas de cada plasmídeo por placa de cm. Os ensaios de luciferase foram executados tal como se descrevem (de Wet e colab,,acima).
Cultura Celular e Transfecção
As condições de crescimento e transfecção de células CV-1 (rim de macaco verde Africano) foram tal como as anteriormente des critas (Giguere e colab., Cell 46, 645 (1986)), com a excepção de o precipitado de fosfato de cálcio ter sido deixado sobre as célupara las durante 4-8 horas, altura em que o meio foi mudado/DMEM com soro bovino isento de a 5% mais ou menos 10-7 M de (Sigma).
As células foram colhidas 36 horas após a adição de Tp e os ensaios de CAT foram efectuados como se descreveu (Gorman e colab.,
Mol. Cell. Biol. _2 / 1 044 (1 982); Hollenberg e colab. , Cell 4 9 , 39 (1 987)). Tipicamente, foram co-transfectados 5 y*g de relator e 1 />g de vector de expressão, em conjunto com 2,5 /*g de RSV-Çgal como um controlo para a eficiência da transcrição. As formas acetiladas e não-acetiladas de [^4C]cloranfenicol foram separadas por cromatografia de camada fina, excisadas, e quantificadas por contagem de cintilação líquida em Econofluor (DuPont) com DMSO a 5%.
Os ensaios de -galactosidase foram executados como se descreve (Herbomel e colab., Cell 39, 653 (1984)). A actividade de CAT é expressa como a percentagem de conversão dividida pela actividade da Ç -galactosidase.
Construção dos Plasmídeos Relator e de Expressão
Os oligonucleótidos sintéticos correspondentes a -169 até -200 do gene da hormona de crescimento de ratazana ou um TRE palindrõmico (TCAGGTCATGACCTGA) (Glass e colab., Cell 54, 313 (1988)) foram inseridos num mutante de exploração ligante de MTV-CAT que tem um sítio Hind III na posição —190/—181 (Buetti e colab., J.Mol. Biol. 190, 379 (1986)) ou MTV-CAT -190/-88, o qual tem um sítio Hind III substituindo os nucleótidos entre -88 e -190. Os vectores de expressão foram construídos para os receptores para hormona tiroideia por inserção de ADNc a todo o tamanho de pheA12 (Weinberger
31 0 48473
-27e colab., Nature 324, 641 (1986) e rbeA12 (Thompson e colab., Science 237, 1610 (1987)) entre os sítios Kpnl e BamHI do vector pRS (Giguere e colab., Cell 46, 645 (1986) e Nature 330, 124 (1987)).
Construção de Receptores Quiméricos
A construção do hGRNx já foi anteriormente descrita (Giguere, Nature, acima). Para construir o hTR^Nx, o inserto de ADNc de Phe A12 (Weinberger, Nature, acima) foi subclonado entre os sítios Kpnl e BamHI de M13mp19 e sujeito a mutagénese pelo método de Kunkel,
PNAS 82, 488 (1985). O oligonucleótido utilizado para originar o sí tio Notl trocou três aminoácidos: Asp97 para Arg, Lys98 para Pro, Asp99 para Pro. O oligonucleótido utilizado para originar o sítio de Xhol trocou dois aminoácidos: Thr171 para Leu, Asp172 para Gly.
O ADNc do receptor mutante foi então transferido para o vector de expressão pRS (Giguere, Cell, Nature, acima); os híbridos foram cons truídos por permuta dos fragmentos de restrição Kpnl-Notl, Kpnl-Xhol ou NotI-Xhol entre RShGRNX e RShTRylfq^. O RShGRNx tem cerca de 75% da actividade do tipo selvagem, e o RShTR,QNx tem cerca de 60% da actividade do tipo selvaaem. Para a adição de 'íi ao rTRrt, o sítio BstEII único no aminoácido 21 foi permutado por um sítio BamHI por inserção de um adaptador de oligonucleótido que codificou um sítio de BamHI flanqueado por extremidades de BstEII. Isto permitiu a inserção em cadeia de um fragmento BamHI-BglII codificando os aminoácidos 77-262 do hGR, neste sítio. Ο Δ TT e ο ΔGG foram construídos por delecção do fragmento de Asp718-Notl de RShTR$,NX e RShGR^y respectivamente e substituição por um adaptador de oligonucleótido de um sítio de ligação ao ribossoma consensual (Kosak Nucl.Acids Res.
12, 857 (1984)).
Os aminoácidos 77 a 262 do hGR, denominado ‘ίι , foram inseridos na cadeia após o aminoácido 21 do rTRoí-numa cópia ou em cópias múltiplas, e os receptores híbridos resultantes foram analisados quanto à trans-activação. A Tabela 1 mostra que a adição de um domínio 4, aumenta a actividade em, pelo menos, quatro vezes, enquanto que a presença de vários desses domínios aumenta ainda mais a activida de. Isto é consistente com a natureza modular deste domínio, e demonstra que a actividade dos receptores para hormona tiroideia pode ser aumentada pela adição de um domínio de trans-activação a
310
48473
-28partir de um receptor diferente.
Tabela 1 . Actividade de híbridos /receptor para hormona tiroideia.
a
Receptor #de domínio 5) Actividade de CAT Relativa
RShGR 1 0
RSrTRo(-Bm+ 0 100
RSrTR-T1-1 1 1 430
RSrTR-T1_2 2 1 1 40
RSrTR-T o 3 1 960
1-3
RSrTR-T1_4 4 820
a
A actividade de CAT é relativa ã actividade induzida de
RSrTR-Bm+, que é receptor para hormona tiroideia alfa de ratazana com o sítio de BstEII no aminoácido 21 permutado por um sítio BamHI.
Em certas experiências onde se aumenta a quantidade de vector de expressão do receptor de 1 j^g para 5 /t-g, demonstrou-se que a actividade de CAT relativa aumentava diversas vezes.
A descrição anterior pormenoriza processos específicos que po dem ser utilizados na prática do presente invento. Tendo pormenori zado os processos específicos inicialmente utilizados para identificar, isolar, caracterizar, preparar e utilizar estes receptores, e uma descrição adicional quanto ãs entidades específicas e suas sequências, peritos na arte saberão muito bem como planear processos seguros alternativos para alcançar a mesma informação e para alargar esta informação a outros receptores relacionados, interespécie e intraespécie. Assim, por mais pormenorizada que a descrição anterior possa parecer, não deverá ser interpretada como limitativa do seu âmbito global; antes, o âmbito do presente invento deve ser apenas governado pela construção legal das suas reivindicações .

Claims (16)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1 - Processo de ensaio para análise e identificação de materiais tendo um potencial putativo de ligação a um receptor de hormona ou semelhante a hormona, caracterizado por compreender os passos de:
    (a) controlo do efeito de um material de teste no referido receptor de hormona ou semelhante a hormona, quando as referidas espécies de receptor de hormona ou semelhante a hormona, numa forma tendo actividade de trans-activação de transcrição melhorada, é desafiada com um ou mais, de uma bateria,de materiais de teste, sendo o referido controlo efectuado por medição da quantidade de transcrição induzida pela espécie de receptor na presença do material de teste, e (b) selecção, como candidatos, de entre a bateria de materiais de teste, dos materiais de teste que exercem um efeito sobre a referida actividade de trans-activação da transcrição da referida espécie de receptor.
  2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender ainda, a seguir ao passo (b), o passo adicional de:
    (c) utilização do referido candidato na preparação de uma composição contendo o referido candidato, como um componente essencial, sendo a referida composição útil para conferir as suas propriedades biofuncionais a um receptor correspondente quando é colocada em contacto, in vivo, com o referido receptor.
  3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, como espécie de um receptor, se utilizar o receptor glucocorticéide G442 humano.
  4. 4 - Processo de preparação de um receptor de hormona ou semelhante a hormona, tendo actividade de trans-activação da transcrição melhorada, relativamente ao receptor de origem, de um promotor, com o qual estã associado, caracterizado por compreender a in70 310
    48 ·473
    - 3 0 trodução de, pelo menos, um domínio de trans-activação de transcrição ou um seu fragmento funcional, num receptor de origem numa localização exterior aos domínios de ligação do ligando e de ligação ao ADN, de modo que o receptor resultante contenha uma pluralidade . „ de transcrição de domínios de trans-activaçao/, ou de seus fiagmentos funcionais, localizados no referido receptor, numa localização exterior aos seus domínios de ligação ao ADN e de ligação ao ligando.
  5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido receptor de origem ser baseado no receptor glucocorticõide humano.
  6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o domínio de trans-activação de transcrição introduzido no receptor de origem ser o domínio Τ'
  7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o receptor resultante conter dois dos referidos domínios
  8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por o segundo dos referidos domínios estar localizado adjacente ao primeiro.
  9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por o segundo dos referidos domínios J 1 estar localizado numa localização distai em relação ao terminal C, a partir da primeira sequência de J/.
  10. 10 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado por o dito receptor estar desprovido de um domínio de ligação ao ligando.
  11. 11 - Processo de preparação de receptor de hormona ou semelhante a hormona tendo domínios de trans-activação de transcrição adicionais aos do receptor de origem, autónomos com ambos os domínios
    70 310
    48 '473 7Ύ
    - 31 de ligação ao ADN e de ligação ao ligando do receptor de origem, estando os referidos domínios de trans-activação de transcrição adicionais localizados numa posição exterior a cada um dos referidos domínios de ligação ao ADN e de ligação ao ligando, se presentes, e tendo uma biofuncionalidade de ligação ao ADN, caracterizado por compreender a expressão do ADN codificando para o referido receptor, numa célula-hospedeira recombinante transfectada com o referido ADN.
  12. 12 - Processo de produção de um vector de expressão alojando operacionalmente ADN codificando um receptor possuindo actividade de trans-activação de transcrição melhorada, em relação ao receptor de origem, de um promotor ao qual está associado, caracterizado por compreender incorporar, num vector de expressão, uma molécula de ADN codificando um receptor de hormona ou semelhante a hormona possuindo domínios de trans-activação de transcrição adicionais aos do receptor de origem, autónomos relativamente aos domínios de ligação ao ligando e de ligação ao ADN do receptor de origem,estando os referidos domínios de trans-activação de transcrição adicionais localizados numa posição exterior a cada um dos referidos domínios de ligação ao ligando e de ligação ao ADN, se presentes, e possuindo uma biofuncionalidade de ligação a ADN.
  13. 13 - Processo de produção de célula-hospedeira recombinante, caracterizado por a célula ser transfectada com um vector de expressão de acordo com a reivindicação 12.
  14. 14 - Processo de obtenção de uma cultura de células, caracterizado por compreender associar células de acordo com a reivin dicação 13 com um meio de suporte extrínseco, o qual assegura a viabilidade das referidas células.
  15. 15 - Processo caracterizado por compreender a recuperação e purificação de um receptor de hormona ou semelhante a hormona tendo domínios de trans-activação de transcrição adicionais aos do receptor de origem, autónomos com ambos os domínios de ligação
    70 310
    48 ·473
    - 32 ao ADN e de ligação ao ligando do receptor de origem, estando os referidos domínios de trans-activação de transcrição adicionais localizados numa posição exterior a cada um dos referidos domínios de ligação ao ADN e de ligação ao ligando, se presentes,e tendo uma biofuncionalidade de ligação ao ADN, numa forma com qualidade e quantidade suficientes para permitir o seu uso em ensaios que possibilitem a medição da biofuncionalidade induzida extrinsecamente do referido receptor.
  16. 16 - Processo de bio-ensaio para determinação da funcionalidade de um receptor de hormona ou semelhante a hormona, compreendendo o referido bio-ensaio:
    a) a transfecção, em células negativas para o receptor, de um ou mais vectores de expressão alojando um elemento promotor/ melhorador responsivo â hormona, operativo funcionalmente, ligado a um relator operativo ou outro ADN desejado e uma sequência de ADN operativa codificando o referido receptor;
    b) a cultura das referidas células transfectadas do passo (a) em presença ou na ausência de material extrínseco tendo a capacidade putativa para activar o referido elemento promotor/meIhorador responsivo à hormona;
    c) o controlo, nas referidas células, da indução do produto do referido relator ou sequência de ADN desejada, e
    d) a medição, nas referidas células, da expressão do relator ou outro ADN desejado, caracterizado por o referido receptor de hormona ou semelhante a hormona ser um que tenha actividade de trans-activação da transcrição melhorada comparada com o receptor de origem, sendo a referida actividade adicional ã do receptor de origem devida a domínios, ou aos seus fragmentos funcionais localizados dentro da molécula numa posição exterior a cada um dos domínios de ligação ao ADN e de ligação ao ligando do referido receptor.
PT92478A 1988-11-30 1989-11-30 Processo de preparacao de receptores para hormona PT92478B (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/278,614 US5217867A (en) 1988-11-30 1988-11-30 Receptors: their identification, characterization, preparation and use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT92478A PT92478A (pt) 1990-05-31
PT92478B true PT92478B (pt) 1995-07-18

Family

ID=23065666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT92478A PT92478B (pt) 1988-11-30 1989-11-30 Processo de preparacao de receptores para hormona

Country Status (13)

Country Link
US (2) US5217867A (pt)
EP (2) EP0716145A1 (pt)
JP (1) JPH04501955A (pt)
CN (1) CN1043741A (pt)
AT (1) ATE140964T1 (pt)
AU (1) AU635726B2 (pt)
CA (1) CA2004339A1 (pt)
DE (1) DE68926905T2 (pt)
DK (1) DK102191D0 (pt)
ES (1) ES2090041T3 (pt)
GR (1) GR3020702T3 (pt)
PT (1) PT92478B (pt)
WO (1) WO1990006318A1 (pt)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6150328A (en) * 1986-07-01 2000-11-21 Genetics Institute, Inc. BMP products
AU625534B2 (en) * 1987-11-25 1992-07-16 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
AU665039B2 (en) * 1987-12-02 1995-12-14 Salk Institute For Biological Studies, The Chimeric receptors and methods for identification
US5217867A (en) * 1988-11-30 1993-06-08 The Salk Institute For Biological Studies Receptors: their identification, characterization, preparation and use
AU633045B2 (en) * 1988-12-23 1993-01-21 Salk Institute For Biological Studies, The Receptor transcription-repression activity compositions and methods
CA2075974C (en) * 1990-02-15 2001-02-06 Dana M. Fowlkes Totally synthetic affinity reagents
US5498538A (en) * 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
US5747334A (en) * 1990-02-15 1998-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Random peptide library
US5641652A (en) * 1990-03-22 1997-06-24 The Salk Institute For Biological Studies Insect retinoid-like receptor compositions and methods
ES2157197T3 (es) 1990-09-13 2001-08-16 Univ Duke Expresion de receptores acoplados a una proteina g en levadura.
JPH06505152A (ja) * 1990-12-21 1994-06-16 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ 肝集積性転写因子
US20080070842A1 (en) * 1991-11-04 2008-03-20 David Israel Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
ATE238417T1 (de) * 1991-11-04 2003-05-15 Inst Genetics Llc Rekombinante knochenmorphogenetische protein heterodimere, zusammensetzungen und verfahren zur verwendung
US5756448A (en) * 1992-02-26 1998-05-26 The General Hospital Corporation Constitute activator of retinoid (CAR) receptor polypeptides
US6989242B1 (en) 1992-02-26 2006-01-24 The General Hospital Coporation Car receptors and related molecules and methods
ATE365209T1 (de) * 1992-05-14 2007-07-15 Baylor College Medicine Mutierte steroidhormonrezeptoren, methoden für ihre benutzung und molekularer schalter für gentherapie
US6416998B1 (en) 1992-09-02 2002-07-09 Baylor College Of Medicine Plasmid encoding a modified steroid hormone
US5707798A (en) * 1993-07-13 1998-01-13 Novo Nordisk A/S Identification of ligands by selective amplification of cells transfected with receptors
US6291206B1 (en) 1993-09-17 2001-09-18 Genetics Institute, Inc. BMP receptor proteins
AU689184B2 (en) * 1993-12-07 1998-03-26 Genetics Institute, Llc BMP-12, BMP-13 and tendon-inducing compositions thereof
US6518397B1 (en) 1997-07-24 2003-02-11 Shoukat Dedhar Pharmaceuticals for modulating hormone responsiveness
US5854202A (en) * 1995-01-24 1998-12-29 Dedhar; Shoukat Peptide fragments of calreticulin, peptide mimetics thereof, and pharmaceutical compostions comprising same
US7429646B1 (en) 1995-06-05 2008-09-30 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor-like 2
US7427492B1 (en) * 1995-06-05 2008-09-23 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding human tumor necrosis factor receptor-like2
AU6601096A (en) 1995-07-28 1997-02-26 Edward R.B. Mccabe Dax-1 protein, methods for production and use thereof
US5952345A (en) * 1995-09-01 1999-09-14 Allergan Sales, Inc. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US6008204A (en) 1995-09-01 1999-12-28 Allergan Sales, Inc. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US6218128B1 (en) 1997-09-12 2001-04-17 Allergan Sales, Inc. Methods of identifying compounds having nuclear receptor negative hormone and/or antagonist activities
US6942980B1 (en) 1995-09-01 2005-09-13 Allergan, Inc. Methods of identifying compounds having nuclear receptor negative hormone and/or antagonist activities
US5776699A (en) * 1995-09-01 1998-07-07 Allergan, Inc. Method of identifying negative hormone and/or antagonist activities
US5958954A (en) * 1995-09-01 1999-09-28 Allergan Sales, Inc. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
ATE183516T1 (de) * 1995-09-08 1999-09-15 Karobio Ab Waisen-rezeptor
US20030219832A1 (en) * 1996-03-11 2003-11-27 Klein Elliott S. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
CA2200423C (en) 1996-03-26 2006-12-19 Sietse Mosselman Novel estrogen receptor
AU6908998A (en) * 1996-10-29 1998-05-22 Baylor College Of Medicine Modified glucocorticoid receptors, glucocorticoid receptors/progesterone receptors hybrids
WO1998027986A1 (en) * 1996-12-24 1998-07-02 Zymogenetics, Inc. Treatment agents and methods for treating type ii diabetes and symptoms of type ii diabetes
US6037488A (en) 1997-04-19 2000-03-14 Allergan Sales, Inc. Trisubstituted phenyl derivatives having retinoid agonist, antagonist or inverse agonist type biological activity
AU7383298A (en) * 1997-05-13 1998-12-08 Regents Of The University Of California, The Novel antiangiogenic peptide agents and their therapeutic and diagnostic use
WO1998054201A1 (en) * 1997-05-29 1998-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like protein 8
US6222015B1 (en) 1997-09-08 2001-04-24 Merck & Co., Inc. Estrogen receptor
DE19750702A1 (de) * 1997-11-15 1999-05-27 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Antisense Oligonucleotide gegen Tenascin zur Behandlung von Vitiligo
US6504082B1 (en) * 1998-09-10 2003-01-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ecdysone receptors and methods for their use
US6727224B1 (en) * 1999-02-01 2004-04-27 Genetics Institute, Llc. Methods and compositions for healing and repair of articular cartilage
US6586189B2 (en) 1999-06-18 2003-07-01 City Of Hope Screening method for PPAR-γ ligands
US6548739B2 (en) * 1999-06-18 2003-04-15 City Of Hope Method for activating peroxisome proliferator activated receptor-γ
US20050148018A1 (en) 1999-10-07 2005-07-07 David Weiner Methods of identifying inverse agonists of the serotonin 2A receptor
AU774427B2 (en) 1999-10-15 2004-06-24 Fidia Advanced Biopolymers S.R.L. Formulations of hyaluronic acid for delivery of osteogenic proteins
US7329728B1 (en) * 1999-10-25 2008-02-12 The Scripps Research Institute Ligand activated transcriptional regulator proteins
WO2001072837A2 (en) * 2000-03-24 2001-10-04 City Of Hope Methods of modulating drug clearance mechanisms by altering sxr activity
US20030082233A1 (en) * 2000-12-01 2003-05-01 Lyons Karen M. Method and composition for modulating bone growth
ATE393573T1 (de) * 2001-06-01 2008-05-15 Wyeth Corp Zusammensetzungen für die systemische verabreichung von sequenzen, die für knochenmorphogenese-proteinen kodieren
TWI267378B (en) * 2001-06-08 2006-12-01 Wyeth Corp Calcium phosphate delivery vehicles for osteoinductive proteins
EP1318400A1 (fr) * 2001-12-06 2003-06-11 Unisensor S.A. Procédé pour effectuer un diagnostic in vitro au moyen de mécanismes de régulation génétique et trousse de diagnostic correspondante
TW200638946A (en) * 2002-05-17 2006-11-16 Wyeth Corp Injectable solid hyaluronic acid carriers for delivery of osteogenic proteins
US20050026949A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using amounts of retinoids without regard to body weight
US20050026950A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using retinoids to achieve consistent bioavailability
EP1653942A1 (en) * 2003-07-30 2006-05-10 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using amounts of retinoid components
RU2363478C2 (ru) * 2003-09-12 2009-08-10 Вайет Инъецируемые стержни из фосфата кальция для доставки остеогенных белков
EP1637885A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-22 Vivalis Method of screening by using conformation sensitive peptides
AU2006230434A1 (en) * 2005-03-30 2006-10-05 Wyeth Methods for stimulating hair growth by administering BMPs

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4870009A (en) * 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4738922A (en) * 1984-05-25 1988-04-19 Dana Farber Cancer Institute Trans-acting transcriptional factors
US4761371A (en) * 1985-02-12 1988-08-02 Genentech, Inc. Insulin receptor
US4859609A (en) * 1986-04-30 1989-08-22 Genentech, Inc. Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists
US5071773A (en) * 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US5171671A (en) * 1987-12-02 1992-12-15 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor composition
US4981784A (en) 1987-12-02 1991-01-01 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor method
US5217867A (en) * 1988-11-30 1993-06-08 The Salk Institute For Biological Studies Receptors: their identification, characterization, preparation and use

Also Published As

Publication number Publication date
CA2004339A1 (en) 1990-05-31
AU4751290A (en) 1990-06-26
DK102191A (da) 1991-05-29
PT92478A (pt) 1990-05-31
EP0371820A3 (en) 1991-08-21
JPH04501955A (ja) 1992-04-09
EP0371820B1 (en) 1996-07-31
ES2090041T3 (es) 1996-10-16
DK102191D0 (da) 1991-05-29
DE68926905D1 (de) 1996-09-05
EP0716145A1 (en) 1996-06-12
GR3020702T3 (en) 1996-11-30
AU635726B2 (en) 1993-04-01
DE68926905T2 (de) 1997-01-02
CN1043741A (zh) 1990-07-11
US5217867A (en) 1993-06-08
EP0371820A2 (en) 1990-06-06
US5310662A (en) 1994-05-10
ATE140964T1 (de) 1996-08-15
WO1990006318A1 (en) 1990-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT92478B (pt) Processo de preparacao de receptores para hormona
US5262300A (en) Receptors: their identification, characterization, preparation and use
McInerney et al. Analysis of estrogen receptor transcriptional enhancement by a nuclear hormone receptor coactivator.
Tzukerman et al. Human estrogen receptor transactivational capacity is determined by both cellular and promoter context and mediated by two functionally distinct intramolecular regions.
Tagami et al. Nuclear receptor corepressors activate rather than suppress basal transcription of genes that are negatively regulated by thyroid hormone
Goldberg et al. Activation of protein kinase C or cAMP‐dependent protein kinase increases phosphorylation of the c‐erbA‐encoded thyroid hormone receptor and of the v‐erbA‐encoded protein.
Guido et al. Determinants of promoter-specific activity by glucocorticoid receptor.
JPH09275988A (ja) Ｇａｌ４受容体構築体の使用
King et al. DEF-1, a novel Src SH3 binding protein that promotes adipogenesis in fibroblastic cell lines
CA2034220A1 (en) Expression vectors that produce steroid receptors, steroid receptor chimera, screening assays for steroid receptors and clinical assays using synthesized receptors and receptor vector
JPH08512197A (ja) 受容体アゴニストのスクリーニング方法
JPH04506073A (ja) ステロイド／サイロイドスーパーファミリーのレセプターの優性の負のメンバー
CA2653929C (en) Screening method for prokinetic agent
US20080014585A1 (en) Synergistic activation of regulatory elements by rel proteins and a steroid receptor
US6852538B1 (en) Nur-RE a response element which binds nur nuclear receptors and method of use therefor
JP3862703B2 (ja) 物質のホルモン作用を判定する方法
CA2443676A1 (en) A novel modulator of non-genomic activity of nuclear receptors (mnar) and uses thereof
St-Arnaud Transcriptional regulation during mesenchymal cell differentiation: the role of coactivators
WO2007092185A2 (en) Assays and enhancers of the human delta enac sodium channel
McInerney Detailed analysis of transcriptional regulation by activation functions-1 and-2 of the human estrogen receptor
Zhuang Mechanistic analysis of estrogen receptor action using dominant negative mutants
Ince Dominant negative mutants of the human estrogen receptor
Lanigan Control of calcitonin/CGRP gene transcription and thyroid C cell differentiation
Chan Molecular and biological analysis of mutant thyroid hormone receptors associated with human hepatocellular carcinoma
Ciampa Investigating the function of KCNE4 in cardiac physiology

Legal Events

Date Code Title Description
MM3A Annulment or lapse

Free format text: LAPSE DUE TO NON-PAYMENT OF FEES

Effective date: 19970930