CN103710324B - 利用半胱氨酸水解酶家族成员制备(‑)γ内酰胺的方法 - Google Patents
利用半胱氨酸水解酶家族成员制备(‑)γ内酰胺的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一组具有(+)γ内酰胺拆分活性的半胱氨酸水解酶，其来源于13个微生物种属，并且具有三个共同的保守结构域：保守结构域I：*A(V/M/R/G/T)L(V/H/I)L(V/I)L(V/I)V(N/E/D)*(H/I)DM(L/V/I)Q，保守结构域II：*S(G/D/N)*F(W/Y)*，保守结构域III：*I(F/V/M)V(A/C/M/T)G*T(A)N(E/H/D/A)*C(G/A/D/P)，其中，*代表任意氨基酸残基，括号中的氨基酸代表同一氨基酸残基位置上可能存在的氨基酸残基。本发明还提供了上述半胱氨酸水解酶的编码基因，以及上述半胱氨酸水解酶在拆分消旋体γ内酰胺方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及具有(+)γ内酰胺拆分活性的半胱氨酸水解酶家族成员及其编码基因，以及此类酶的应用。
背景技术
目前，资源、能源和环境危机已经威胁到人类的生存与发展。生物转化是以微生物或酶作为催化剂，以可再生资源取代不可再生资源，大规模生产人类所需的化学品、医药、能源、材料等的有效手段。
(-)γ内酰胺是合成抗艾滋病药物阿巴卡韦以及抗甲型流感及禽流感药物帕拉米韦的重要的中间体。目前合成手性(-)γ内酰胺的方法主要分为化学合成法，手性助剂共结晶法和生物酶促转化法。化学法方法成本高、步骤烦琐，而且催化过程中使用的重金属催化剂严重污染环境。以手性助剂为拆分剂的方法收率较低，且终产物中有拆分剂残留。生物酶法在合成手性(-)γ内酰胺中，具有节约能源，效率高，对环境友好的特点。酶法拆分消旋体γ内酰胺的反应如下：
能够水解拆分消旋γ内酰胺的酶被称为γ内酰胺酶。γ内酰胺酶属于酰胺酶的一种，γ内酰胺酶主要应用于(-)γ内酰胺的手性合成中，(-)γ内酰胺是制备阿巴卡韦及帕拉米韦的关键手性中间体。
目前所报道的γ内酰胺酶对消旋γ内酰胺的拆分过程中存在的缺点主要是，γ内酰胺酶对消旋γ内酰胺酶底物的拆分不具有绝对选择性，所以拆分效果依赖于拆分反应的过度反应，即需要超过50％的反应转化率。这种不具绝对选择性的酶很容易造成产物光学活性降低或者目的光学产物的损失。此外，虽然来源于古细菌的γ内酰胺酶具有绝对选择性，但是其最适反应温度过高(80℃)，利用此酶进行生产过程的能耗很大。
本发明人之前曾从Microbacterium hydrocarbonxydans(氧化烃微杆菌)中获得了一个(+)γ内酰胺酶基因，专利号201010210197.3，专利名称：一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用。本发明在此专利的基础上，发现了一类比氧化烃微杆菌(+) γ内酰胺酶活性更高，稳定性更强的酶家族，即半胱氨酸水解酶家族。此家族成员在室温(25℃)相比来源于氧化烃微杆菌的(+)γ-内酰胺酶，具有更高的催化活性。半胱氨酸水解酶家族在拆分消旋体γ-内酰胺的应用方面没有专利报告和文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供十三种具有(+)γ内酰胺拆分活性的半胱氨酸水解酶及其应用。十三种酶分别来源于表1所示的微生物。
表1本发明涉及的微生物及其半胱氨酸水解酶蛋白及编码基因的序列编号
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了十三种半胱氨酸水解酶家族成员，分别来自于表1中的细菌或真菌，其中。所述半胱氨酸水解酶家族成员分别是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中的SEQ ID No：1，SEQ ID No：2，SEQ ID No：3，SEQ ID No：4，SEQ IDNo：5， SEQ ID No：6，SEQ ID No：7，SEQ ID No：8，SEQ ID No：9，SEQ ID No：10，SEQ ID No：11，SEQ ID No：12或SEQ ID No：13的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中的SEQ ID No：1，SEQ ID No：2，SEQ ID No：3，SEQ ID No：4，SEQ IDNo：5，SEQ ID No：6，SEQ ID No：7，SEQ ID No：8，SEQ ID No：9，SEQ ID No：10，SEQ ID No：11，SEQ ID No：12或SEQ ID No：13的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有(+)γ内酰胺拆分活性的衍生的蛋白质。
其中，序列表中的SEQ ID No：1，SEQ ID No：2，SEQ ID No：3，SEQ ID No：4，SEQ IDNo：5，SEQ ID No：6，SEQ ID No：7，SEQ ID No：8，SEQ ID No：9，SEQ ID No：10，SEQ ID No：11，SEQ ID No：12和SEQ ID No：13分另由205，173，231，178，220，197，269，222，186，200，216，206，和207个氨基酸残基组成。
上述半胱氨酸酶的编码基因也属于本发明的保护范围，下述核苷酸序列之一：
(a)序列表中SEQ ID No：14，SEQ ID No：15，SEQ ID No：16，SEQ ID No：17，SEQ IDNo：18，SEQ ID No：19，SEQ ID No：20，SEQ ID No：21，SEQ ID No：22，SEQ ID No：23，SEQ IDNo：24，SEQ ID No：25或SEQ ID No：26所示的核苷酸序列；
(b)编码序列表中SEQ ID No：14，SEQ ID No：15，SEQ ID No：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18，SEQ ID No：19，SEQ ID No：20，SEQ ID No：21，SEQ ID No：22，SEQ ID No：23，SEQ ID No：24，SEQ ID No：25或SEQ ID No：26的蛋白质序列的多核苷酸。
其中，序列表中的SEQ ID No：14，SEQ ID No：15，SEQ ID No：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18，SEQ ID No：19，SEQ ID No：20，SEQ ID No：21，SEQ ID No：22，SEQ ID No：23，SEQ ID No：24，SEQ ID No：25，SEQ ID No：26分另由615，516，693，534，660，591，807，666，558，600，912，874和877个碱基组成，其编码序列分别为自5’端第1个碱基到最后一位碱基，编码序列表中SEQ ID No：1，SEQ ID No：2，SEQ ID No：3，SEQ ID No：4，SEQ ID No：5，SEQ ID No：6，SEQ ID No：7，SEQ ID No：8，SEQ ID No：9，SEQ ID No：10，SEQ ID No：11，SEQID No：12，或SEQ ID No：13所示的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明的半胱氨酸水解酶家族是通过如下方法分别制备的：
细菌中的半胱氨酸水解酶：
按照微生物菌种保藏管理委员会出版的《菌种目录》的方法培养本专利涉及的细菌获得细胞，提取全基因组DNA。根据基因序列设计PCR引物，以全基因组为模板，利用上述设计的引物进行PCR扩增，获得目的基因。将上述基因构建到重组表达载体上，构建好的蛋白 基因含有羧基端的组氨酸标签蛋白。将构建好的表达载体导入大肠杆菌宿主细胞，表达得到细菌半胱氨酸水解酶。
用于构建含有上述半胱氨酸水解酶编码基因的重组表达载体都可以为基因工程领域中的质粒表达载体、可行的载体包括pET系列载体，pUC系列载体，pGEX系列载体等。宿主细胞选择与上述表达载体相应的宿主。如大肠杆菌E.coil BL21(DE3)等。表达后的蛋白进一步利用公认已知的纯化方法进行纯化。
真菌中的半胱氨酸水解酶：
按照微生物菌种保藏管理委员会出版的《菌种目录》的方法培养本专利涉及的真菌从而获得细胞，提取细胞的总mRNA。根据基因序列设计PCR引物，以全基因组为模板，利用上述设计的引物进行RT-PCR扩增，获得目的基因。将上述基因构建到重组表达载体上，构建好的蛋白基因含有羧基端的组氨酸标签蛋白。将构建好的表达载体导入宿主细胞，表达得到真菌重组半胱氨酸水解酶。
用于构建含有上述半胱氨酸水解酶编码基因的重组表达载体都可以为基因工程领域中的质粒表达载体、可行的载体包括pET系列载体，pUC系列载体，pGEX系列载体等。宿主细胞选择与上述表达载体相应的宿主。如大肠杆菌E.coil BL21(DE3)等。表达后的蛋白进一步利用公认已知的纯化方法进行纯化。
本发明所述的十三种半胱氨酸水解酶都可以用于消旋的γ-内酰胺的拆分，获得99.6％光学纯的(-)γ-内酰胺。这些酶在进行消旋γ内酰胺的拆分前，为了提高反应效率，可以利用Ni-NTA法制备固定化酶。
具体反应为：
将消旋γ-内酰胺底物加入到0.5M，pH6.0～pH8.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在该缓冲液中的浓度为0.06mol/L～0.93mol/L，然后在此缓冲液中加入固定化的酶，该固定化酶与缓冲液的质量体积比为2g～10g：1L，在30℃～60℃转化1～6小时，制得(-)γ-内酰胺。
所述固定化酶是通过下述方法制备获得的：所述半胱氨酸水解酶用Ni-NTA法进行固定，固定化的条件为：将酶溶解在0.23mol/L～0.45mol/L的结合缓冲液中，所述酶在该缓冲液中的浓度为4g/L，然后将含有酶的缓冲液加入到Ni-NTA凝胶中，所述酶溶液与Ni-NTA凝胶的体积比控制在1：1～5，固定化时间2～3小时，固定化温度为室温。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了十三种具有(-)γ-内酰胺拆分活性的半胱氨酸水解酶及其编码基因。这些酶可用于水解外消旋γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺，产率大于40％，光学纯度大于99.0％。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
附图说明
图1十三种半胱氨酸水解酶基因的DNA电泳图
泳道M，DNA分子量标准；泳道1-13分别为SEQ ID No：14，SEQ ID No：15，SEQ IDNo：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18，SEQ ID No：19，SEQ ID No：20，SEQ ID No：21，SEQ IDNo：22，SEQ ID No：23，SEQ ID No：24，SEQ ID No：25和SEQ ID No：26核苷酸序列的PCR电泳图。
图2十三种纯化后的重组半胱氨酸水解酶SDS-PAGE结果图
泳道M，蛋白分子量标准；泳道1-13分别为SEQ ID No：1，SEQ ID No：2，SEQ ID No：3，SEQ ID No：4，SEQ ID No：5，SEQ ID No：6，SEQ ID No：7，SEQ ID No：8，SEQ ID No：9，SEQID No：10，SEQ ID No：11，SEQ ID No：12和SEQ ID No：13所示的重组半胱氨酸水解酶纯化蛋白的SDS-PAGE结果。
图3空白对照组消旋体-γ-内酰胺HPLC图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰。
图4Azorhizobium caulinodans重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的
HPLC图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图5Bacillus pumilus重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的HPLC图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图6Escherichia coli重组半胱氨酸水解酶拆分处消旋γ-内酰胺的HPLC图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图7Lactococcus lactis重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的HPLC图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图8Methylobacterium extorauens重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的
HPLC图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图9Pseudomonas aeruginosa重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的HPLC
图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图10Ralstonia pickettii重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的HPLC图
谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图11Sinorhizobium fredii重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的HPLC图
谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图12Staphylococcus aureus重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的HPLC
图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图13Vibrio parahaemolyticus重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的
HPLC图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图14Aspergillus fumigates重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的HPLC
图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图15Aspergillus niger重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的HPLC图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图16Talaromyces stipitatus重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋γ-内酰胺的HPLC
图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图17Azorhizobium caulinodans第24位组氨酸取代脯氨酸的重组半胱氨酸水解
酶拆分外消旋γ-内酰胺的HPLC图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图18Astergillus niger第41位插入丙氨酸的重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋
γ-内酰胺的HPLC图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
图19Lactococcus lactis第100位删除苏氨酸的重组半胱氨酸水解酶拆分外消旋
γ-内酰胺的HPLC图谱
图中1-4分别表示乙酸乙酯、乙酰苯丙氨酸、(+)-γ-内酰胺、(-)-γ-内酰胺形成的峰；可以看出，图中第3编号的HPLC出峰较之图3所示空白对照组的第3编号峰高已明显降低，说明经所述重组半胱氨酸水解酶处理后，(+)-γ-内酰胺已经基本反应完全，由此反映出所述重组半胱氨酸水解酶具有良好的拆分外消旋γ-内酰胺的活性。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1本发明涉及的13种微生物来源的半胱氨酸水解酶基因的获得
(1)细菌基因组DNA的获得
在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)购买茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans1.2548)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus1.326)，大肠杆菌(Escherichia coli1.359)，乳酸乳杆菌(Lactococcus lactis1.2030)，扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens4.1476)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa1.228)，皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii1.1759)，费式中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii1.535)，金黄链球菌(Staphylococcus aureus1.363)，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus1.1997)的菌株安培管，将管口打碎后加入1mL培养基，培养基按照微生物菌种保藏管理委员会出版的《菌种目录》的方法分别针对不同的菌株配制。然后将菌株的悬浮液接入100mL同样的培养基培养，摇床条件为220转/分钟，20-40℃，48小时。培养完成后用离心机12000转/分钟离心收集菌体。
纯化提取来自上述微生物的基因组DNA，采用细菌基因组提取试剂盒提取(北京天根生化科技有限公司)，操作方法按照试剂盒提供的说明书进行。
(2)真菌基因组的获得
在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)购买烟曲霉(Aspergillusfumigatus3.1320)，黑曲霉(Aspergillus niger3.111)，梗序篮状菌(Talaromycesstipitatus3.4299)的菌株安培管，将管口打碎后加入1mL培养基，培养基按照微生物菌种保藏管理委员会出版的《菌种目录》的方法分别针对不同的菌株配制。然后将菌株的悬浮液接入100mL同样的培养基培养，摇床条件为220转/分钟，20-40℃，48小时。培养完成后用离心机12000转/分钟离心收集菌体。
纯化提取来自上述微生物的基因组DNA，采用酵母基因组提取试剂盒提取(北京天根生化科技有限公司)，操作方法按照试剂盒提供的说明书进行。
(3)引物设计
根据序列表中的SEQ ID No：14，SEQ ID No：15，SEQ ID No：16，SEQ ID No：17，SEQID No：18，SEQ ID No：19，SEQ ID No：20，SEQ ID No：21，SEQ ID No：22，SEQ ID No：23，SEQID No：24，SEQ ID No：25和SEQ ID No：26的基因序列分别设计引物，引物序列如表2所示，由上海生工合成全部引物。
表2用于克隆十三种半胱氨酸水解酶基因的引物
其中，上游引物中的下划线表示Nde I酶切位点，下游引物中的下划线表示Xho I酶切位点。
(4)细菌半胱氨酸水解酶PCR扩增及基因克隆
以上述获得的细菌基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：1μL基因组DNA(180μg/mL)，3μL dNTP(10mM，上海生工)，1单位(U)的tag酶(申能博彩)，各1μL的上下游引物(10μM)，用dd H2O补至50μL。PCR条件为：第一步热变性95℃，5分钟，第二步热变性95℃，30秒，第三步退火50℃，30秒，第四步延伸72℃，2分钟，第五步延伸72℃，10分钟，第二步到第四步之间设置30个循环，PCR反应结束后电泳检测，电泳检测结果如说明书附图图1所示。
PCR产物经胶回收试剂盒(上海生工)回收，操作方法按照试剂盒提供的说明书进行，样品回收后分别用Nde I和Xho I酶切，连入相同酶切的pET30质粒。构建好的载体命名为pET**ch(其中**为对应的细菌菌株名缩写，具体见表1)。
(5)真菌半胱氨酸水解酶RT-PCR扩增及基因克隆
以上述获得的真菌基因组DNA作为模板进行两步RT-PCR扩增。
第一步反转录的体系和程序：体系11.5μL RNA(180μg/mL)，1μL dNTP(10mM，上海生工)，1μL(20U)的反转录酶(申能博彩)，1μL的Oligo dT(0.05μg/μL)，RNasin酶抑制剂，buffer5μL，用dd H2O补至20μL。第一步70℃，5分钟，第二步42℃，60分钟，第三步95℃，10分钟。
第二步PCR的反应体系和反应程序为：1μL反转录产物(18μg/ml)，3μL dNTP(10mM，上海生工)，1单位(U)的tag酶(申能博彩)，各1μL的上下游引物(10μM)，用dd H2O补至50μL。PCR条件为：第一步热变性95℃，5分钟，第二步热变性95℃，30秒，第三步退火50℃，30秒，第四步延伸72℃，2分钟，第五步延伸72℃，10分钟，第二步到第四步之间设置30个循环，PCR反应结束后电泳检测，电泳检测结果如说明书附图图1所示。
PCR产物经胶回收试剂盒(上海生工)回收，操作方法按照试剂盒提供的说明书进行，样品回收后分别用Nde I和Xho I酶切，连入相同酶切的pET30质粒。构建好的载体为pET**ch(其中**为对应的真菌菌株名缩写，具体见表1)。
实施例2重组半胱氨酸水解酶蛋白的表达和纯化
将构建好的质粒pET**ch通过电转化法导入大肠杆菌E.coil BL21(DE3)，获得转化子E.coil BL21(pET**ch)。将转化子接种到LB液体培养基(含有卡那霉素)的试管中，37℃过夜培养，按1％的转种量转接到含有400mL的LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃培养，待 OD值为0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导培养3小时，离心收集菌体。将菌体悬浮在结合缓冲液中(50mM TrisHCl，pH8.0，20mM咪唑，50mMNaCl)，进行超声波破碎(300W，超声3秒，间隔1秒，共90个循环)，14000RPM离心，收集上清液，上清液加入1mL的镍亲和柱(Novogen)，结合后用5mL洗涤缓冲液(50mM TrisHCl，pH8.0，100mM咪唑，50mM NaCl)进行洗涤，之后用5mL洗脱缓冲液(50mM TrisHCl，pH8.0，250mM咪唑，50mM NaCl)进行洗脱。洗脱后的蛋白用20mM Tris HCl缓冲液透析，透析后的蛋白冷冻干燥后(Flexdry冷冻干燥仪，美国)收集。SDS-PAGE检测表明蛋白的纯度在95％以上，SDS-PAGE检测结果见说明书附图图2。
十三种半胱氨酸水解酶的单体分子量分别约为22.5，19.6，25.2，19.8，23.9，21.7，28.9，24.3，21.0，22.2，23.8，22.5和22.9kDa，酶的最适反应温度为25-45℃，最适反应pH值为5.5-9.0，催化反应不需要金属离子作为激活剂。
实施例3半胱氨酸水解酶的固定
将纯化后的蛋白用海藻酸钠法进行固定，固定化的方法具体如下，在10mL的水中加入0.3g的海藻酸钠(从百灵威公司购买)，并且加热到121℃彻底溶解，将混合液温度冷却至30℃，加入溶解在pH7.0的磷酸缓冲液中的半胱氨酸水解酶，该半胱氨酸水解酶在该海藻酸钠溶液中的浓度为4g/L，轻微搅拌混合液进行混合，将混合液用注射器小心滴入冰冷的含0.1mol/L的CaCl2的1.5mol/L的硼酸溶液，所述海藻酸钠与CaCl2的摩尔比例控制在23：10，固定化酶在上述硼酸溶液中继续悬浮3小时，保持温度为4℃。固定化结束后，固定化酶过滤收集，用蒸馏水洗涤后保存在4℃冰箱中。
实施例4重组Azorhizobium caulinodans半胱氨酸水解酶在外消旋γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
酶水解外消旋γ内酰胺的活性测定和对映体的分析方法。采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解外消旋γ-内酰胺
将外消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到1L，0.5M，pH7.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为1.5mol/L，然后，加入20g固定化的酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在28℃，通气量1L/min，转化时间为1小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶， 反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为43％、光学纯度为99.6％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图4，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例5重组Bacillus pumilus半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到1L，0.05M，pH8.0的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为0.8mol/L，然后，加入50g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在30℃，通气量1L/min，转化时间为4.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为48％、光学纯度为91.6％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图5，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例6重组Escherichia coli半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH9.0的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为0.8mol/L，然后，加入5g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在37℃，通气量1L/min，转化时间为0.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为40％、光学纯度为91.0％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图6，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例7重组Lactococcus lactis半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司ChiralparkAS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH6.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为1.8mol/L，然后，加入5g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在37℃，通气量1L/min，转化时间为0.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为40％、光学纯度为93.0％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图7，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例8重组Methylobacterium extorquens半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH6.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为5.8mol/L，然后，加入55g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在30℃，通气量1L/min，转化时间为0.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为50％、光学纯度为99.0％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图8，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例9重组Pseudomonas aeruginosa半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司ChiralparkAS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH6.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为1.8mol/L，然后，加入5g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在27℃，通气量1L/min，转化时间为5.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为39％、光学纯度为95.0％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图9，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例10重组Ralstonia pickettii半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司ChiralparkAS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH6.5的磷酸缓冲液中，，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为3.8mol/L，然后，加N56g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在27℃，通气量1L/min，转化时间为6.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为49％、光学纯度为93.6％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图10，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例11重组Sinorhizobium fredii半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司ChiralparkAS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm； 产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH6.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为1.8mol/L，然后，加入5g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在25℃，通气量1L/min，转化时间为0.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为40％、光学纯度为93.0％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图11，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例12重组Staphylococcus aureus半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司ChiralparkAS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH6.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为0.8mol/L，然后，加入15g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在37℃，通气量lL/min，转化时间为10.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为49％、光学纯度为97.0％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图12，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例13重组Vibrio parahaemolyticus半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH6.5的磷酸缓冲液 中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为3.8mol/L，然后，加入155g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在30℃，通气量1L/min，转化时间为0.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为30％、光学纯度为93.6％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图13，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例14重组Aspergillus fumigares半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司ChiralparkAS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ，-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH6.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为1.8mol/L，然后，加入5g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在28℃，通气量1L/min，转化时间为0.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为49％、光学纯度为93.0％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图14，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例15重组Aspergillus niger半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司ChiralparkAS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH6.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为1.8mol/L，然后，加入5g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在30℃，通气量1L/min，转化时间为7.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶， 反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为30％、光学纯度为83.0％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图15，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例16重组Talaromyces stipitatus半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司ChiralparkAS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH6.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为1.8mol/L，然后，加入95g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在26℃，通气量1L/min，转化时间为0.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为44％、光学纯度为91.0％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图16，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例17重组Azorhizobium caulinodans氨基酸取代的半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)第24位组氨酸取代脯氨酸的Azorhizobium caulinodans半胱氨酸水解酶的构建
采用PCR的方法，上游引物：CGAATCGGGCACGCCGCCCA下游引物：TGGGCGGCGTGCCCGATTCG。模板为pETAcch，PCR条件为：第一步热变性95℃，5分钟，第二步热变性95℃，50秒，第三步退火50℃，50秒，第四步延伸72℃，8分钟，第五步延伸72℃，10分钟，第二步到第四步之间设置30个循环。PCR终止后用DpnI处理一小时，95℃处理10分钟。之后直接转化Ecoli.DH5α。鉴定阳性克隆正确后的后续处理步骤同原始的半胱氨酸水解酶。
(2)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(3)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将外消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到1L，0.5M，pH7.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为1.5mol/L，然后，加入20g固定化的酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在28℃，通气量1L/min，转化时间为1小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为47％、光学纯度为99.1％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图17，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例18重组Aspergillus niger氨基酸插入的半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)第41位插入丙氨酸Aspergillus niger半胱氨酸水解酶的构建
采用PCR的方法，上游引物：CTAACGGCTCTATGCTCAATTTTGGCAA下游引物：TTGCCAAAATTGAGCATAGAGCCGTTAG。模板为pETAnch，PCR条件为：第一步热变性95℃，5分钟，第二步热变性95℃，50秒，第三步退火50℃，50秒，第四步延伸72℃，8分钟，第五步延伸72℃，10分钟，第二步到第四步之间设置30个循环。PCR终止后用DpnI处理一小时，95℃处理10分钟。之后直接转化Ecoli.DH5α。鉴定阳性克隆正确后的后续处理步骤同原始的半胱氨酸水解酶。
(2)反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司ChiralparkAS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(3)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将外消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到lL，0.5M，pH7.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为1.5mol/L，然后，加入20g固定化的酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在28℃，通气量1L/min，转化时间为1小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为41％、光学纯度为89.1％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图18，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
实施例19重组第100位删除苏氨酸Lactococcus lactis半胱氨酸水解酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用
(1)第100位删除苏氨酸Lactococcus lactis半胱氨酸水解酶的构建
采用PCR的方法，上游引物：ATTTTTGAAAAAACTTTTGGTT下游引物：AACCAAAAGTTTTTTCAAAAAT。模板为pETLlch，PCR条件为：第一步热变性95℃，5分钟，第二步热变性95℃，50秒，第三步退火50℃，50秒，第四步延伸72℃，8分钟，第五步延伸72℃，10分钟，第二步到第四步之间设置30个循环。PCR终止后用DpnI处理一小时，95℃处理10分钟。之后直接转化Ecoli.DH5α。鉴定阳性克隆正确后的后续处理步骤同原始的半胱氨酸水解酶。
反应转化率测定和对映体手性分析方法
半胱氨酸水解酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司ChiralparkAS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。
(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺
将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到0.5L，0.15M，pH6.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为1.8mol/L，然后，加入5g固定化酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在37℃，通气量1L/min，转化时间为0.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化酶，反应液用二氯甲烷萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为40％、光学纯度为93.0％的(2R,3S)-γ-内酰胺，手性HPLC检测结果见说明书附图图19，其中空白对照组的HPLC结果如附图图3所示。
需要说明的是，本发明的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来讲，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.如序列表中SEQ ID No：3所示的半胱氨酸水解酶在水解消旋的δ内酰胺、制备(-)γ内酰胺中的应用。
2.如序列表中SEQ ID No：16所示的半胱氨酸水解酶基因在水解消旋的γ内酰胺、制备(-)γ内酰胺中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用为：将消旋的γ内酰胺底物加入到0.5M，pH6.0～pH8.5的磷酸缓冲液中，所述消旋的δ内酰胺在所述磷酸缓冲液中的浓度为0.06mol/L～0.93mol/L，然后在所述磷酸缓冲液中加入固定化的半胱氨酸水解酶，所述固定化的半胱氨酸水解酶与所述磷酸缓冲液的质量体积比为2g～10g∶1L，在30℃～60℃转化1～6小时，制得(-)γ内酰胺。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述固定化的半胱氨酸水解酶是通过下述方法制备获得的：将所述半胱氨酸水解酶用Ni-NTA法进行固定，固定化的条件为：将所述半胱氨酸水解酶与30℃的0.23mol/L～0.45mol/L的海藻酸钠溶液混合，所述半胱氨酸水解酶在所述海藻酸钠溶液中的浓度为4g/L，然后将含有半胱氨酸水解酶的海藻酸钠溶液滴入到4℃的含有浓度为0.1mol/L～0.5mol/L CaCl2的1.5mol/L～5mol/L的硼酸溶液中，使得海藻酸钠与CaCl2的摩尔比例控制在23∶10～50，固定化时间3～8小时，固定化温度为4℃。
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