CN105132394A - 一种脂肪酶lipase6及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂肪酶LIPASE6及其编码基因和应用。本发明从海洋放线菌(Marinactinospora？thermotolerans)中克隆到了一个脂肪酶基因lipase6，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1的第133-894位碱基所示；所编码的脂肪酶LIPASE6，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2的第45-297位氨基酸所示。通过克隆脂肪酶基因lipase6并将其连接表达载体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的脂肪酶LIPASE6。脂肪酶LIPASE6可用于制备手性1-苯乙醇，利用重组表达的脂肪酶LIPASE6作为催化剂，制备得到了光学纯度可达99％的(R)-1-苯乙醇(得率达85％)和光学纯度可达90％的(S)-1-苯乙醇(得率达65％)。脂肪酶LIPASE6在生物化工和生物医药等领域具有非常大的应用价值。

Description

一种脂肪酶LIPASE6及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种脂肪酶LIPASE6及其编码基因和应用。

背景技术

手性化合物虽然原子组成是一样的，但它们的立体结构却互为镜像，在生物学和药学性质上却相差甚远。比如L-薄荷醇具有清凉味，而D-薄荷醇则发霉味；S-天冬酰胺是甜的，R-天冬酰胺是苦的；R型的“反应停”是孕妇用镇痛药和止痛药，而S型的“反应停”对胎儿则有致畸作用，历史上曾出现使用反应停导致大规模新生儿畸形的事件。可见合成手性药物过程中，前体原料的光学纯度是重要环节。

手性化合物的合成主要有：(1)化学法，即利用对映体的物理和化学性质的差异进行分离。通常有盐析法、包结法、以及组合拆分。其缺点是要求对映体之间的性质差异要大，适用的化合物不多。(2)合成法，通过设计反应来进行手性化合物的化学合成。这种方法缺点在于反应过程通常比较剧烈，耗费能量，而且反应中使用大量有毒的有机溶剂。(3)色谱拆分，这种方法是利用填料对手性对映体吸附性质的差异来实现，其缺点是设备昂贵，普及性较差。

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)，又叫作三酰甘油水解酶，是一类能够将三酰甘油水解为甘油和脂肪酸的酶，其来源非常广泛，微生物、植物和动物中都有存在。脂肪酶作为生物催化剂多数可作用非天然底物，而且可拆分的底物多，立体选择性高，不需要辅助因子，是一种重要的手性催化剂。

1-苯乙醇是精细化工利用中重要的骨架和中间体，在化妆品行业的香料，染料和医药行业中都有较大的应用范围。R和S两种对映异构体各有各自的应用，R-1-苯乙醇主要用于化妆品行业中，还可应用于变色染料、眼科防腐剂、胆固醇肠道吸收抑制剂等；S-1-苯乙醇主要是药物合成的前体，如左旋咪唑、(S)-异丙肾上腺素、抗抑郁药物取舍林等。

但是，大多数在工业中应用的脂肪酶都是源于进口，比如NovoNordisk公司的脂肪酶Novozym435(来自Candidaantarctica)，AmanoPharmaceutical公司的LipasePS(来自Burkholderiacepacia)，Fluka公司的LipaseA(来自Candidaantarctica)等等。这些脂肪酶价格昂贵，生产技术受到制约，因此开发具有自主产权的脂肪酶十分必要。

发明内容

本发明的针对现有技术中脂肪酶价格昂贵、生产技术受到制约的不足，提供一种新的脂肪酶LIPASE6及其编码基因和应用。

本发明从一株海洋放线菌(Marinactinosporathermotolerans)中开发了一种新的脂肪酶LIPASE6及其编码基因lipase6，构建了含有lipase6的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得脂肪酶LIPASE6，其可应用于制备手性1-苯乙醇。

本发明的第一个目的是提供一种脂肪酶LIPASE6，其氨基酸序列如SEQIDNO.2的第45-297位氨基酸序列所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的脂肪酶LIPASE6的脂肪酶基因lipase6。

优选，所述的脂肪酶基因lipase6的核苷酸序列如SEQIDNO.1的第133-894位碱基所示。

本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipase6的重组表达载体。所述的表达载体，优选pET28a(+)载体。

本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因lipase6的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第三个目的是提供所述的脂肪酶LIPASE6在制备手性1-苯乙醇中的应用。

优选，脂肪酶LIPASE6在拆分(±)-1-苯乙醇制备得到(R)-1-苯乙醇中的应用。

进一步优选，其步骤为：取脂肪酶LIPASE6于反应介质中，再加入(±)-1-苯乙醇和酰基供体，进行反应，得到(R)-1-苯乙醇。

所述的反应介质，优选为1,4-二氧六环、四氢呋喃、叔丁醇、异丙醇、二氯甲烷、甲苯、环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷中的一种。

所述的酰基供体，优选为乙酰乙烯酯、乙酸异丙烯酯、丁酸酐、丁酸、戊酸、葵酸和乙酸乙酯中的一种。

优选，脂肪酶LIPASE6在水解乙酸苏合香酯制备得到(S)-1-苯乙醇中的应用。

进一步优选，其步骤为：取脂肪酶LIPASE6于pH为6.0-9.5的缓冲液中，加入乙酸苏合香酯及其助溶剂，进行反应，得到(S)-1-苯乙醇。

所述的助溶剂，优选为1,4-二氧六环、四氢呋喃、叔丁醇、异丙醇、二氯甲烷、甲苯、环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷中的一种。

所述的缓冲液，优选为醋酸-醋酸钠、磷酸缓冲液、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH溶液中的一种。

本发明的脂肪酶基因lipase6来自深海样品中筛选得到的一株海洋放线菌(Marinactinosporathermotolerans)，保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。本发明用生物信息学分析的方法，从基因组测序的放线菌(M.thermotolerans)中得到脂肪酶基因lipase6，全长为894bp(从起始密码子到终止密码子)，编码297个氨基酸，该基因是一个全新的脂肪酶基因，与其它脂肪酶基因序列的最大相似度为57％。经分析序列中包含44个氨基酸残基的信号肽，成熟的脂肪酶LIPASE6由253个氨基酸残基组成。通过克隆编码成熟的脂肪酶LIPASE6的脂肪酶基因lipase6并将其连接表达载体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的脂肪酶LIPASE6。脂肪酶LIPASE6可用于制备手性1-苯乙醇，利用重组表达的脂肪酶LIPASE6作为催化剂，制备得到了光学纯度可达99％的(R)-1-苯乙醇(得率达85％)和光学纯度可达90％的(S)-1-苯乙醇(得率达65％)。脂肪酶LIPASE6在生物化工和生物医药等领域具有非常大的应用价值。

附图说明

图1是不同侧链长度的对硝基苯酚酯对脂肪酶LIPASE6酶活的影响。

图2是脂肪酶LIPASE6的最适pH及pH稳定性。其中，a为最适pH曲线图，b为pH稳定性曲线图。

图3是脂肪酶LIPASE6的最适反应温度和温度稳定性。其中，a为最适反应温度曲线图，b为温度稳定性曲线图。

图4是脂肪酶LIPASE6拆分(±)-1-苯乙醇反应产物GC图。其中，a是标样GC图，按照保留时间依次为：1，内标十二烷；2，(S)-乙酸苏合香酯；3，(R)-乙酸苏合香酯；4，(R)-1-苯乙醇；5，(S)-1-苯乙醇；b是脂肪酶LIPASE6拆分(±)-1-苯乙醇反应36h后的GC图；c是脂肪酶LIPASE6水解消旋乙酸苏合香酯反应24h后的GC图。

图5是脂肪酶LIPASE6的蛋白表达纯化情况。其中，M为蛋白Marker，1为未经IPTG诱导的含有pET-28a(+)-lipase6的大肠杆菌BL21(DE3)，2为经IPTG诱导的含有pET-28a(+)-lipase6的大肠杆菌BL21(DE3)，3为Ni柱纯化后得到的脂肪酶LIPASE6。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

本发明的脂肪酶基因lipase6来自深海样品中筛选得到的一株海洋放线菌(Marinactinosporathermotolerans)，保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。

实施例1：脂肪酶基因lipase6引物设计及开放阅读框边界确定

提取海洋放线菌(M.thermotolerans)的基因组DNA，经16SrRNA验证无误后，交至上海美吉生物科技有限公司测序。利用生物信息学手段对基因组进行注释，分析其中的脂肪酶基因，确定了其中脂肪酶基因lipase6的开放阅读框，其碱基序列如SEQIDNO.1所示，共编码297个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，通过信号分析工具http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，分析发现其中含有包含44个氨基酸残基的信号肽(SEQIDNO.2第1-44位所示的氨基酸残基)，成熟的脂肪酶LIPASE6由253个氨基酸残基组成(SEQIDNO.2第45-297位所示的氨基酸残基)，其对应的编码基因区为如SEQIDNO.1第133-894位所示的碱基序列。脂肪酶基因lipase6是一个全新的脂肪酶基因，与其它脂肪酶基因序列的最大相似度为57％。根据分析得到的lipase6基因序列，设计不含信号肽的引物如下：正向引物：5′-CACGGATCCGCCCAGGACGTCGACTACGTCGC-3′，下划线部分为BamHI酶切位点；反向引物：5′-CCGCTCGAGTCACACGGCGGGAACCGCTC-3′，下划线部分为XhoI酶切位点。

实施例2：脂肪酶基因lipase6的克隆及载体构建

2.1PCR扩增

将实施例1设计的引物(正向引物：5′-CACGGATCCGCCCAGGACGTCGACTACGTCGC-3′，反向引物：5′-CCGCTCGAGTCACACGGCGGGAACCGCTC-3′)送至上海生物工程有限公司合成引物，合成的引物使用TE稀释到10μM，提取放线菌(M.thermotolerans)的总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：

表1PCR反应体系

使用以下PCR扩增程序扩增脂肪酶基因lipase6：a.95℃变性5min；b.95℃变性1min，55～65℃退火0.5min，72℃延伸1min20s，进行30个循环；c.72℃延伸10min，冷却到10℃。

将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察。回收760bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20μL无菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。

2.2酶切

将纯化回收的PCR产物使用以下体系进行双酶切，酶切时间1h。酶切体系为：BamHI1μL，XhoI1μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至30μL。酶切后纯化回收得到经过双酶切的PCR产物。

质粒pET-28a(+)的双酶切：挑取含有质粒pET-28a(+)的大肠杆菌DH5α单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用BamHI和XhoI按以下体系双酶切，酶切时间1h。酶切体系为：BamHI1μL，XhoI1μL，质粒DNA<1μg，灭菌的双蒸水加至20μL。酶切后纯化回收得到经过双酶切的pET-28a(+)载体。

上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen，HipureGelPureDNAMicroKit)，质粒提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。

2.3连接

将经过双酶切的PCR产物和pET-28a(+)载体按照3∶1的摩尔比例进行连接。连接使用的T4连接酶购自北京全式金生物技术有限公司，连接使用的酶量为5U/5μL连接体系，连接温度为22℃，连接时间20min。

2.4转化及筛选

取5μL连接产物于50μL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μLLB液体培养基，37℃200rpm培养1h。培养物4000rpm离心1min后，弃上清400μL，吸取余下的100μL涂布于含50μL/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mLLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。

2.5基因核苷酸序列测定

将获得的正确阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与脂肪酶基因lipase6核苷酸序列进行比对，确认是将编码成熟的脂肪酶LIPASE6(氨基酸序列如SEQIDNO.2的第45-297位氨基酸序列所示)的脂肪酶基因lipase6(其核苷酸序列如SEQIDNO.1的第133-894位碱基序列所示)插入到pET-28a(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有编码成熟的脂肪酶LIPASE6的脂肪酶基因lipase6的pET-28a(+)质粒(pET-28a(+)-lipase6)，可用于进行下一步试验。

实施例3：脂肪酶基因lipase6在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达

3.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制备

a、将大肠杆菌BL21(DE3)接入5mLLB液体培养基中，37℃过夜摇培，250rpm；

b、按1％的体积比的接种量将过夜摇培后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种到LB摇瓶中，37℃摇培3h(≥300rpm)，得到原培养物；

c、将摇瓶在冰水中迅速冷却至0℃，将原培养物分装至冰预冷的离心管(50mL)，冰置数分钟；

d、4℃，4000rpm离心10min回收细胞，将残留液空干(迅速)；

e、用冰预冷的10mL0.1M的CaCl₂重悬细胞，4℃，4000rpm离心10min回收细胞；

f、用10mL0.1M的CaCl₂重悬细胞，冰浴1h以上；

g、4℃，4000rpm离心10min回收细胞；

h、每50mL原培养物得到的回收细胞用2mL含15％甘油的CaCl₂来重悬，分装于1.5mL离心管，200μL每管。-80℃保藏。由此得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

3.2转化

取实施例2中得到的pET-28a(+)-lipase6质粒0.5～1μL与50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μLLB液体培养基，37℃200rpm培养1h。培养物离心后涂布50μL/mL的卡那霉素LB平板，培养20h后挑选单菌。由此得到含有pET-28a(+)-lipase6的大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例4：脂肪酶LIPASE6的表达和纯化

4.1蛋白诱导表达

含有pET-28a(+)-lipase6的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中37℃培养至OD600为0.5左右之间，加IPTG至浓度0.2mM，22℃培养16个小时。300mL菌液4000rpm，4℃离心10min，收集菌体，用30mL(50mM，pH7.2)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声400w，工作4s，暂停6s，破碎10min分钟，在4℃，10000rmp离心10min，收集上清。上清于-80℃冷冻过夜，冷冻干燥制备成粗酶粉。

4.2脂肪酶的纯化

用镍离子亲和层析柱对步骤4.1中收集的上清进行纯化得纯化的脂肪酶LIPASE6(图5)，纯化的蛋白大小约30kD，符合理论预期。具体实施方案如下：使用5mM的咪唑洗脱5个柱体积，20～100mM咪唑洗脱30个柱体积，最后使用100～1000mM咪唑洗脱5个柱体积，收集中间3.5mL。用脱盐柱SephadexG25对上述脂肪酶进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。

4.3脂肪酶酶活测定

脂肪酶活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①配制10mM的对硝基苯酚酯；②在1mL反应体系中加入940μLTris-HClbuffer(50mM，pH8.0)，40μL乙醇，10μL脂肪酶酶液；③于35℃下，3～5min后，410nm测定吸光度。

酶活单位定义：1min内水解对硝基苯酚酯，释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活单位。

实施例5：脂肪酶的酶学性质

5.1水解不同长度的对硝基苯酚酯

按照4.3的测定条件，比较脂肪酶作用不同侧链长度的对硝基苯酚酯，结果如图1，可见脂肪酶LIPASE6不能作用C16，说明对长链对硝基苯酚酯特异性差。而对于中等长度的对硝基苯酚酯的作用效果较好，最佳的底物是C10，即对硝基苯酚葵酸酯。

5.2最适pH和pH稳定性

配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，其浓度均为50mM：

表2不同缓冲体系的pH

将4.3中测定条件所述的缓冲液(Tris-HClbuffer)按照表2中的缓冲溶液分别进行替换，测定重组脂肪酶LIPASE6的酶活力，结果(图2a)说明脂肪酶LIPASE6酶活在中性至弱碱性范围内最高，最适pH为8.0，以Tris-HCl为佳。pH高于8.0，小于7.0都会急剧下降。

重组脂肪酶LIPASE6先置于不同的缓冲液中处理1h，然后，按4.3中测定条件测定脂肪酶酶活，脂肪酶LIPASE6酶活在pH为8.0缓冲液中稳定性最高(图2b)。

5.3最适温度和温度稳定性

使用pH8.0，Tris-HCl作为缓冲溶液，将4.3中的反应混合液置于不同的温度(25～70℃)下处理30min，然后加入脂肪酶LIPASE6，测定酶活，重组脂肪酶LIPASE6最适反应温度在35℃左右，高于45℃酶活将会大大降低，70℃酶活基本仅为35℃的10％(图3a)。

将脂肪酶LIPASE6置于不同温度(25～70℃)预处理1h，于35℃下，pH8.0，Tris-HCl的缓冲溶液中，按4.3测定条件测定脂肪酶LIPASE6的酶活，结果(图3b)说明脂肪酶在25℃的稳定性最好，随着温度升高，稳定性逐渐降低，70℃处理1h后酶活基本为0。

5.4金属离子抑制

将使用50mM，pH7.0的Tris-HCl配制不同金属离子溶液，每种金属离子浓度均为2mM，将脂肪酶LIPASE6酶液在各种金属离子溶液中37℃下处理1h；以不加金属离子的50mM、pH7.0的Tris-HCl溶液为对照(control)。测定酶活，结果见表3，可见仅有Ni²⁺对酶活有促进作用，对Mn²⁺的耐受性也相对较好，其它金属离子对脂肪酶LIPASE6均表现出抑制作用。

表3金属离子对LIPASE6酶活力的影响

5.5有机溶剂和变性对脂肪酶活性的影响

将纯化后得到脂肪酶LIPASE6加入到表4中的有机溶剂和变性剂溶液中处理12h(对照为蒸馏水)，然后按照4.3的测定方法测定剩余酶活。结果说明脂肪酶LIPASE6对醇有较好的耐受性，10％(V/V)的丁醇(butanol)能提高酶活至173.43±9.11％，10％(V/V)戊醇(1-pentanol)能提高酶活至115.81±6.75％，而对抑制剂尿素(Urea)和盐酸胍(guanidinehydrochloride)耐受性不高。

表4有机溶剂、变性剂和抑制剂对脂肪酶LIPASE6活性的影响

实施例6：手性1-苯乙醇的制备

本法采用两种路径获得手性1-苯乙醇，一种通过在有机相中的转酯反应，另一种在水相中的水解乙酸苏合香酯。

途径1)：苯乙醇是一种重要的医药中间体和药物合成骨架，酶法拆分(±)-1-苯乙醇受到反应有机溶剂种类、反应温度、转速、酰基供体和底物比例等等诸多条件的影响。本发明优化了上述参数，实现了(±)-1-苯乙醇的手性拆分。在优化的条件下，即在3mL正庚烷介质中，加入50mg脂肪酶LIPASE6粗酶粉，100mM的乙酸异丙烯酯和30mmol的(±)-1-苯乙醇，于37℃，200rpm条件下进行反应拆分，在36h后可得到99％光学纯度的(R)-1-苯乙醇，得率可达85％(图4b)。

途径2)：酶法拆分水解乙酸苏合香酯获得光学纯的1-苯乙醇受到助溶剂种类和比例、反应温度、转速等等诸多条件的影响。本发明优化了上述参数，在优化的条件下，即在500μL50mM，pH7.0，Tris-HCl溶液中，加入10％(V/V)的二氯甲烷作为助溶剂，25mg脂肪酶LIPASE6粗酶粉和20mmol的乙酸苏合香酯，于37℃，200rpm条件下，在24h后可得到90％光学纯度的(S)-1-苯乙醇，得率可达65％(图4c)。

具体分析条件为：采用福立气相色谱仪，配有手性柱(30m×0.25mmCyclosilBchirlcolumn)和氢离子火焰检测器。仪器分析条件设置为：注射器温度220℃，检测器温度250℃，载气为N₂，流速1.2mL/min，采用梯度升温进行分析：100℃保持3min,15℃/min到220℃，保持1min。

Claims (10)

1.一种脂肪酶LIPASE6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2的第45-297位氨基酸所示。

2.一种编码权利要求1所述的脂肪酶LIPASE6的脂肪酶基因lipase6。

3.根据权利要求2所述的脂肪酶基因lipase6，其特征在于，所述的脂肪酶基因lipase6的核苷酸序列如SEQIDNO.1的第133-894位碱基所示。

4.权利要求1所述的脂肪酶LIPASE6在制备手性1-苯乙醇中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，脂肪酶LIPASE6在拆分(±)-1-苯乙醇制备得到(R)-1-苯乙醇中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用为：取脂肪酶LIPASE6于反应介质中，再加入(±)-1-苯乙醇和酰基供体，进行反应，得到(R)-1-苯乙醇。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的反应介质为1,4-二氧六环、四氢呋喃、叔丁醇、异丙醇、二氯甲烷、甲苯、环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷中的一种；所述的酰基供体为乙酰乙烯酯、乙酸异丙烯酯、丁酸酐、丁酸、戊酸、葵酸和乙酸乙酯中的一种。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，脂肪酶LIPASE6在水解乙酸苏合香酯制备得到(S)-1-苯乙醇中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用为：取脂肪酶LIPASE6于pH为6.0-9.5的缓冲液中，加入乙酸苏合香酯及其助溶剂，进行反应，得到(S)-1-苯乙醇。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的助溶剂为1,4-二氧六环、四氢呋喃、叔丁醇、异丙醇、二氯甲烷、甲苯、环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷中的一种；所述的缓冲液为醋酸-醋酸钠、磷酸缓冲液、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH溶液中的一种。