KR102532093B1 - 헥사하이드로푸로-푸라놀 유도체의 제조 방법, 이의 중간체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

헥사하이드로푸로-푸라놀 유도체의 제조 방법, 이의 중간체 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제약 합성 분야, 특히 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올 유도체 및 이들의 중간체의 제조 방법에 관한 것이다. 제조 방법은 화학식 A1의 화합물로부터 시작하여 수행된다.
Figure 112020107283861-pct00049

(3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올 유도체의 제조에 있어서, 키랄성은 효소법으로 구성하였으며, 광학 순도가 높은 제품을 제조하였다. 제조 방법은 다루나비르의 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 주요 중간체를 상업적으로 생산하는 데 사용될 수 있으며, 이는 산업 생산에 적합한 매우 경제적인 경로이다.

Description

헥사하이드로푸로-푸라놀 유도체의 제조 방법, 이의 중간체 및 이의 제조 방법
본 발명은 제약 산업의 유기 합성 분야, 특히 헥사하이드로푸로-푸라놀 (hexahydrofuro-furanol) 유도체 및 그 중간체의 제조 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2018년 3월 16일 중국 특허청에 출원 번호 201810220506.1로 "헥사하이드로 푸로-푸라놀 유도체의 제조 방법, 이의 중간체 및 이의 제조 방법"으로 제출된 중국 특허 출원의 우선권을 주장한다. 모든 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
하기 Z 구조를 갖는 화합물의 화학명은 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올이다:
Figure 112020107283861-pct00001
이는 헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란의 유도체 중 하나이며, 항 HIV 약물로서 다루나비르(Darunavir)의 중간체이다.
Tibotec Pharmaceuticals Co., Ltd.로부터의 출원 번호 02817639.1 (출원일: 2002-9-6) 및 200580010400.X.인 중국 특허는 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법을 제공하였다. 원료는 하기 화학식 (3)의 화합물이다.
Figure 112020107283861-pct00002
화학식 (3)의 화합물은 화학식 (1)의 출발 물질로부터 제조되었다.
Figure 112020107283861-pct00003
Sumitomo Chemical Co., Ltd.로부터의 출원 번호 200380109926.4인 중국 특허는 상기 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법을 제공하였다. 원료는 하기 화학식 (VIII)의 화합물이다.
Figure 112020107283861-pct00004
Sumitomo Chemical Co., Ltd.는 키랄성(chirality, 분자 비대칭성)을 생성하기 위해 키랄 촉매를 사용하였다. 그러나 이 전략은 상업적 규모의 생산에는 적용되지 않았다.
Lonza Ltd.의 유럽 특허 출원 EP2634180A1 (출원일: 2012-1-3)은 카르보닐 환원 효소에 의해 카르보닐기가 히드록시기로 환원되는 것을 개시하였다. 이 특허에는 사카로마이세스 세레비지애(skaccharomyces cerevisiae)의 YNL331C와 같은 상업적으로 이용 가능한 여러 효소가 나열되어 있다. 그리고 Ia에 표시된 화합물이 적합한 구조(configurations)라고 언급하였다.
Figure 112020107283861-pct00005
(3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올이 다루나비르 제조의 핵심 중간체임을 고려할 때, 이 핵심 중간체의 제조를 위한 보다 유리한 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명의 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법은 출발 물질의 선택 및 키랄 구조(chiral configuration)의 구성으로부터 시작된다. 주요 중간체의 키랄성을 구성하기 위한 출발 물질 및 효소법은 산업화에 적합한 저비용 및 마일드(mild)한 반응 조건으로 이전의 모든 기술과 비교할 때 신규하다.
본 발명의 기술적 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기와 같은 기술 방안을 제공한다:
먼저, 본 발명은 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 중간체 제조 방법을 제공한다. 키랄은 효소 환원 반응에 의해 화학식 (B)의 화합물 또는 화학식 (b-2)의 화합물로부터 구성되었다.
Figure 112020107283861-pct00006
상기 R1은 수소 또는 히드록시(hydroxyl) 기의 보호기이다;
효소는 사카로마이세스 쿠드리아브제비(Saccharomyces kudriavzevii) 균주에서 파생된 알데히드/케톤 환원 효소와 같은 생물학적 효소이다. 이의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 나타난 단백질, 또는 서열 번호 1에 의한 1개 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가 후 알데히드/케톤 환원 효소 활성을 갖는 단백질, 또는 알데하이드/케톤 환원 효소 활성을 갖는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열과 80 % 이상의 상동성을 갖는 단백질이다. 이의 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)은 서열 번호 2와 함께 서열표에 제시되어 있다. 알데히드/케톤 환원 효소는 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포, 효소 파괴 유체, 동결 건조 분말, 또는 고정된 효소 또는 고정된 세포에서 유래할 수 있다.
효소의 공급량은 50-100g/L이고 반응 온도는 25-37℃이다.
NADP+ 또는 NADPH인 조효소는 효소 환원 반응에 임의로 첨가될 수 있다.
포도당 탈수소효소는 효소 환원 반응에 임의로 첨가될 수 있다.
효소 환원 반응은 물 또는 완충액 및 유기 용매로 이루어진 혼합 용매인 용매의 존재하에 일어난다.
완충액은 인산염 완충액, 탄산염 완충액, Tri-HCl 완충액, 구연산염 완충액 또는 MOPS 완충액 중 하나 이상으로부터 선택된다.
유기 용매는 DMSO, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 이소프로판올, DMF, TBME, 디클로로메탄 및 아세트산비닐 중 하나 이상으로부터 선택된다.
Hplc-Ms 및 HPLC는 기질(substrate)이 완전히 이용될 때까지 본 발명의 효소 환원 반응의 생물 전환 과정을 모니터링하는 데 사용된다.
또한, (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올 중간체의 제조 방법은 화학식 B의 화합물의 효소 환원 반응에 의해 구성되며, 또한 히드록시기는 보호기에 의해 보호된다.
Figure 112020107283861-pct00007
여기서 R1은 상기와 같이 정의되고, R2는 히드록시기의 보호기이며, 효소는 상기와 동일하다.
상기 제조 방법에서, R1기는 바람직하게는 C2-11 벤조일기의 직쇄 또는 분지형 아실기 또는 벤젠 고리상의 일 치환 또는 다중 치환 벤조일기이고, 일 치환 또는 다중 치환기는 알킬기, 알콕시기, 니트로기 또는 시아노기이다.
한편, 본 발명은 중간체 화합물 C의 추가 환원 및 고리 닫힘 반응(ring-closing reaction)에 의해 제조되는 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법을 제공한다.
Figure 112020107283861-pct00008
상기 R1의 정의는 상기와 동일하다.
본 발명은 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법을 제공하며, 이는 또한 중간체 화합물 Cp의 추가 환원 및 고리 닫힘 반응에 의해 제조될 수 있다.
Figure 112020107283861-pct00009
상기 R1 및 R2의 정의는 상기와 동일하다.
본 발명은 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법을 제공하며, 이는 제조된 화학식 C-2 또는 화학식 Cp-2의 화합물을 임의로 분리한 후 고리 닫힘 반응에 의해 제조될 수 있다.
화학식 B의 화합물은 화학식 A2의 화합물의 아실화에 의해 제조되며, 반응은 하기와 같다:
Figure 112020107283861-pct00010
상기 R1은 C2-11의 직쇄 또는 분지형 아실 벤조일기 또는 벤젠 고리상의 일 치환 또는 다중 치환된 벤조일기이고, 일 치환 또는 다중 치환된 기는 알킬기, 알콕시기, 니트로기 또는 시아노기이다.
본 발명의 화합물 A2는 화합물 A1의 할로겐화에 의해 제조되며, 반응은 하기와 같다:
Figure 112020107283861-pct00011
상기 X는 할로겐이다.
본 발명은 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법을 개시하고 있으며, 바람직한 실시예는 할로겐화 반응, 아실화 반응, 효소 환원 반응, 추가 환원 및 고리 닫힘 반응에 의한 제조이다.
Figure 112020107283861-pct00012
상기 X는 할로겐이고, R1과 효소의 정의는 상기와 동일하다.
본 발명은 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법을 개시하고 있으며, 또 다른 바람직한 실시예는 할로겐화 반응, 아실화 반응, 효소 환원 반응, 히드록시기의 보호 반응, 추가 환원 및 고리 닫힘 반응에 의한 제조이다.
Figure 112020107283861-pct00013
상기 X는 할로겐이고, R1의 정의는 청구항 1의 정의와 같고, R2의 정의는 청구항 2의 정의와 같고; 효소의 정의는 상기와 동일하다.
본 발명에서는 효소법으로 구성된 키랄 중심을 갖는 화합물을 보호하고 하기 구조식을 갖는 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 중간체 화합물을 제공한다.
Figure 112020107283861-pct00014
상기 R1 및 R3은 수소 또는 히드록시 보호기이고 R2는 히드록시 보호기이다. 히드록시 보호기는 알킬, 실릴, C2-11의 아실, C4-9의 알케닐 고리, 아릴, 아르알킬(aralkyl), 아로일(aroyl), 페닐 및 치환된 페닐이다. 실릴은 테트라메틸-실릴, 트리메틸-실릴, 트리에틸-실릴, 트리-부틸 실릴 및 tert-부틸 디메틸 실릴이다. 알킬은 C1-C8의 알킬이다. 방향족 기는 페닐, 푸란, 티오페닐(thiophenyl) 또는 인돌기이다. 치환된 페닐기는 알킬 치환된 페닐기, 알콕시 알킬 치환된 페닐기, 니트로 알킬 치환된 페닐기 또는 할로겐 치환된 페닐기이다. 알킬 치환된 페닐은 벤질, 디페닐 메틸 및 트리페닐 메틸기이고; 알콕시 알킬기로 치환된 페닐은 p-메톡시벤질이며; 니트로 알킬기의 치환된 페닐기는 p-니트로 벤질기이고; 할로겐으로 치환된 페닐은 p-클로로페닐기이다.
히드록시 보호기는 바람직하게는 벤조일, 벤젠 고리상의 일 치환 또는 다중 치환된 벤조일, tert-부틸 또는 벤질이다.
환원 반응은 다른 카르보닐기를 헤미케탈 생성물로 환원시키는 방법에 관한 것으로, 반응은 하기와 같다:
Figure 112020107283861-pct00015
상기 두 반응은 하기와 같이 직접 표현할 수 있다:
Figure 112020107283861-pct00016
R3은 R2 또는 수소이다. R1과 R2의 정의는 상기와 동일하다.
헤미케탈 생성물은 분리되거나 분리없이 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 고리 닫힘 반응에 의한 제조와 같은 후속 반응에 추가 적용될 수 있다.
Figure 112020107283861-pct00017
R3는 R2 또는 수소이다. R1과 R2의 정의는 상기와 동일하다.
헤미아세탈에 대한 환원 반응에 사용되는 환원제는 붕소 환원제, 알루미늄 환원제 또는 리튬 실리콘 환원제일 수 있다. 예를 들어, 수소화붕소나트륨, 시아노-수소화붕소 나트륨(sodium cyano-borohydride), 리튬 테트라하이드로알루미늄(lithium tetrahydroaluminum), Red-Al, 수소화알루미늄리튬, 알루미늄 디이소부틸하이드라이드(aluminum diisobutylhydride), 리튬 디이소프로필아미드(lithium diisopropylamide) 및 리튬 헥사메틸디실라지드(lithium hexamethyldisilazide)이다.
고리 닫힘 반응을 위한 시약은 당해 분야에서 일반적인 산 또는 염기이다.
본 발명의 바람직한 실시예는 먼저 키랄 중심을 구성한 다음 히드록시기를 임의로 보호한 다음 이를 헤미케탈 생성물로 환원시키고 고리 닫힘 반응을 수행하여 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올을 제조한다.
Figure 112020107283861-pct00018
R3은 R2 또는 수소이다. R1과 R2의 정의는 상기와 동일하다.
그러나, 본 발명의 실시예는 또한 먼저 헤미케탈 생성물로 환원된 다음, 키랄 중심이 구성될 수 있다. 임의적으로 분리한 후, 고리 닫힘 반응을 수행하여 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올을 제조할 수 있다.
Figure 112020107283861-pct00019
R3은 R2 또는 H이다. R1과 R2의 정의는 상기와 동일하다.
본 발명의 상기 아실화 반응에서,
Figure 112020107283861-pct00020
R1 기는 바람직하게는 C2-11의 직쇄 또는 분지형 아실 벤조일기 또는 벤젠 고리상의 일 치환 또는 다중 치환된 벤조일기이다.
아실화 시약은 치환된 벤조산 화합물 또는 그 염이고, 치환된 벤조산 화합물의 치환기는 알킬기, 알콕시기, 니트로기 또는 시아노기 등일 수 있다. 치환은 단일 치환 또는 다중 치환일 수 있다.
아실화 반응은 트리에틸아민, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 중탄산나트륨 등과 같은 유기 염기 또는 무기 염기일 수 있는 염기의 첨가를 포함할 수 있다.
R1은 tert-부틸기와 같은 또 다른 치환기이다. 이는 화학식 A3 화합물 또는 tert-부틸산과 반응하는 화학식 A2의 화합물에 의해 변형될 수 있으며, 화학식 A3의 화합물은 화학식 A2의 화합물에 의해 제조되었다.
Figure 112020107283861-pct00021
상기 화학식 A2의 화합물은 화합물 A1의 할로겐화에 의해 제조되며, 반응식은 하기와 같다:
Figure 112020107283861-pct00022
여기서 X는 할로겐이다.
본 발명에서 할로겐화 반응에 사용되는 시약은 할로겐화 수소산(hydrogen halide acid) 등이다.
본 발명의 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올 제조 방법은 할로겐화 반응, 효소 환원 반응, 아실화 반응, 환원 후 고리 닫힘 반응에 의해 제조될 수 있다. 반응은 하기와 같이 표시된다
Figure 112020107283861-pct00023
상기 X는 할로겐이고, R1의 정의는 상기와 동일하다.
본 발명에서 제공하는 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법은 효소법을 채택하여 키랄성을 구성하여 높은 수율과 높은 광학 순도로 제품을 생산할 수 있다. 상기 유럽 출원과 같은 선행 방법은 카르보닐 환원 효소 폴리펩티드 또는 카르보닐 환원 효소 폴리펩티드를 포함하는 미생물이 카르보닐기를 히드록시기로 환원시키는 것을 개시하였지만, 본 발명에 사용된 효소는 더 높은 광학 순도와 더 적합한 반응 조건을 갖는 제품의 제조에 반영되는 더 현저한 이점을 갖는다. 본 발명의 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법은 산업적 생산에 적합하다.
본 발명에 사용된 효소는 더 높은 광학 순도와 더 적합한 반응 조건을 갖는 제품의 제조에 반영되는 더 현저한 이점을 갖는다. 본 발명의 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법은 산업적 생산에 적합하다.
본 발명을 더 이해하기 위해, 다음은 본 발명에서 제공하는 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올 유도체의 제조 방법, 중간체 및 제조 방법에 대한 상세한 설명이다. 본 실시예들의 설명은 본 발명의 특징을 추가로 구체화하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위 또는 청구범위를 본 발명으로 제한하지 않음을 이해해야 한다.
실시예 1:
Figure 112020107283861-pct00024
화합물 A1, 디클로로메탄을 반응 용기에 첨가하고 냉각시켰다. 브롬화물의 무게를 재고 디클로로메탄으로 희석하였다. 희석된 브롬화물을 드롭 호퍼(drop hopper)로 옮기고 천천히 첨가하여 내부 온도를 조절하였다. 적하 후 반응 내부 온도를 일정하게 유지한다. 물을 넣고 온도를 조절하고 분리한다. 유기상을 다른 반응 용기에 넣고 물을 넣어 액체를 추출하여 분리한다. 유기상을 다른 반응 용기에 넣고 5 % NaHCO3 수용액을 첨가하여 액체를 추출 및 분리하였다. 유기상을 다른 반응 용기에 넣고 상부 수성상(aqueous phase)을 결합하여 디클로로메탄을 첨가하고 추출 및 분리하였다. 남은(abandoned) 수성상은 유기상과 결합되고, 물이 첨가, 추출, 분리되고, 남은(abandoned) 수성상 및 하부 유기상은 용매가 배출되지 않을 때까지 회전 증발기에서 농축되며 수율은 90-95 %이다.
실시예 2:
Figure 112020107283861-pct00025
아세톤, 화합물 A2 (X는 브롬(bromine)), 벤조산을 반응 용기에 넣고 교반하고 냉각한다. 드롭 탱크(drop tank)에 트리에틸아민을 첨가하고 반응을 느리게 시작하여 내부 온도를 제어한다. 적하 후 실온까지 가열하고 교반하며 반응시킨다. 반응 후 여과를 수행하였다. 여과 후 여과액은 진공 증류용 증류병으로 옮겼다. 증류병에 고체 페이스트(solid paste)가 나타날 때까지 온도를 50-60℃로 조절하였다. 증류 플라스크에 에틸 아세테이트를 채우고 용해될 때까지 교반한다. 증류 플라스크의 액체를 반응 용기로 옮기고, 반응 용기를 포화 염수로 세척한 다음 방치하여 액체를 분리하고 수층과 혼합한다. 에틸 아세테이트 추출물을 첨가하고, 방치하여 층을 이룬 다음 수층을 버리고, 유기층을 혼합하고 무수 황산나트륨을 유기층에 첨가하여 교반 및 건조하고 흡입 여과하였다. 여과액을 진공 증류용 반응 용기로 옮기고, 반응액이 고체 페이스트가 될 때까지 온도를 50-60℃로 조절하였다. 그 다음 에틸 아세테이트의 일부를 첨가하고 환류 교반하여 용해시켰다. 온도는 50-60℃로 조절되었다. 첨가 탱크에 n-헵탄을 추가하였다. 서서히 냉각시킨 후, 계속 교반하고, 여과하고, 목표 고체 조생성물(crude product)을 건조시키며, 수율은 70-75 %이다.
실시예 3:
알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아의 전체 세포 제조
재조합 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아, 제조 방법은 하기와 같다: 사카로마이세스 쿠드리아브제비(Saccharomyces kudriavzevii)의 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 서열이 인공 디자인을 위해 선택되었다. 인공적으로 설계된 서열은 전체 유전자 합성 (GenScript co., LTD.에서 의뢰)에 의해 합성되고, 발현 벡터 pET28a의 Nde I 및 Xho I 절단 부위에 클로닝되어 숙주 박테리아 E. coli BL21 (DE3) 컴피턴트 세포(competent cells)를 형질 전환시켰다. 양성 인버터(inverters)를 선별하고(selected) 시퀀싱으로 확인한 후 재조합 발현을 수득하였다. 재조합 발현 벡터를 E. coli BL21 (DE3)로 옮겨 재조합 알데히드/케톤 환원 효소의 발현을 유도할 수 있는 재조합 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아를 수득하였다.
재조합 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아를 카나마이신이 포함된 LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새 배양하여 종자 배양 배지를 수득하였다. 카나마이신을 포함하는 배지 부피의 1 %를 종자 배지에 접종하였다. 그런 다음 37℃에서 2~5 시간 동안 배양하고 멸균 IPTG로 유도하여 IPTG의 최종 농도가 0.1mM에 도달하도록 하였다. 그 후 25℃에서 20 시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 사카로마이세스 쿠드리아브제비 알데히드/케톤 환원 효소 유전자의 전체 세포를 고속 원심 분리로 수득하였다. 유전적으로 조작된 박테리아의 전체 세포를 초음파 방법으로 파쇄하여, 사카로마이세스 쿠드리아브제비로부터 유전적으로 조작된 박테리아의 전체 세포의 효소 용액을 수득하였다. 알데히드/케톤 환원 효소는 아미노산 서열이 서열 번호 1인 단백질이고, 알도스테론 환원 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)은 서열표의 서열 번호 2에 나타냈다.
유도 후 45kDa에서 뚜렷한 단백질 밴드가 나타났는데, 이는 알데히드/케톤 환원 효소가 재조합 박테리아에서 고도로 발현되었음을 나타낸다. 알데히드/케톤 환원 효소 순수 단백질의 효소 활성은 Tris-hcl, NADPH (pH 8.0, 2mmol/L), 0.1mmol/L 기질
Figure 112020107283861-pct00026
및 적절한 효소를 포함한 0.25ml의 반응계에서 측정되었다. 340nm에서 흡광도 감소가 측정되었다. 효소 활성 단위 (U)는 상기 조건하에서 분당 1umol NADPH의 산화를 촉매하는데 요구되는 효소로 정의된다.
그 결과, 재조합 유전자 조작 알데히드/케톤 환원 효소의 알데히드/케톤 환원 효소 활성은 유럽 특허 (EP2634180A1) 서열에 비해 20 % 이상 증가했으며, 비-돌연변이(unmutated) 알데히드/케톤 환원 효소 서열에 비해 50 % 이상 증가하였다.
본 발명의 실시예에서 사용되는 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아는 이 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 실시예 및 대조군 실험에서 사용된 포도당 탈수소 효소는 시그마-알드리치(sigma-aldrich)에서 구입한 상업적 효소이다.
ee 값의 알고리즘은 하기와 같이 표시된다:
ee(syn)=([R,R]-[S,S])/([R,R]+[S,S])
ee(anti)=([R,S]-[S,R])/([R,S]+[S,R])
de={([R,S]+[S,R])-([R,R]+[S,S])}/{([R,S]+[S,R])+([R,R]+[S,S])}。
효소 환원 반응:
Figure 112020107283861-pct00027
단계 1: 반응은 1L 플라스크에서 수행하고, 반응계는 300mL로 제어하고, 멸균된 인산 칼륨 완충액 260mL를 사용하여 플라스크에 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아 전체 세포 분쇄 효소 용액을 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 넣고 50 분 동안 초음파로 세포를 파쇄하였다. 그런 다음 포도당 25g, NADP+ 0.42g을 넣고 반응물 8g을 달아 DMSO 40mL에 용해시킨다. 기질을 포함하는 DMSO 용액을 진탕병(shaking bottle)에 천천히 붓고 반응 2 시간 후 포도당 12g을 용액에 첨가하였다. 알데히드/케톤 유전자 조작 박테리아의 전체 세포량은 75g/L이었고 포도당 탈수 소효소의 투입량은 25mg/L였다. 온도는 37℃이다. 전환 반응은 회전 속도가 200r/min으로 조절된 셰이커에서 수행되었으며 전환 시간은 12 시간이었다. 목표 생성물의 전환율은 97.8 %였다.
단계 2: 단계 1에서 수득한 목표 생성물의 전환액을 정제하였다. 반응계에 일정량의 에틸 아세테이트를 넣고 37℃에서 15분 동안 추출한 후 3회 반복하여 에틸 아세테이트 층을 원심 분리로 모으고, 모아진 에틸 아세테이트 층에 5 % 무수 황산마그네슘을 넣고 15 분간 흔들어 준다. 그런 다음 여과하여 황산 마그네슘을 제거한다. 그 후 탈수된 에틸 아세테이트 층을 고온 및 감압에서 농축하였으며 목표 생성물은 7.41g이고 de 값은 96.2 %, ee(anti) 값은 99.5 %이다.
실시예 4:
Figure 112020107283861-pct00028
고체 형태의 화합물 B (R1은 벤조일) (20.00g)를 500ml 건조되고 청결한 4구 둥근 병(four-neck round bottle)에 첨가한 다음 톨루엔을 첨가하고 교반하여 반응시켰다. 질소 보호하에서 진공 교체 및 질소 보호하에서 냉각한다. 톨루엔은 질소 보호하에 일정한 압력 강하 깔때기에 첨가되었다. 70 % Red-Al 용액 (26.50g, 26.00ml)을 질소 보호하에 일정한 압력 강하 깔때기에 첨가하였다. 반응액이 -15~-10℃로 냉각되면 Red-Al 용액을 적하하여 온도를 조절하고, 적하 후 온도를 유지한다. 1000ml의 4 구 둥근병에 순수(pure water)와 에틸 아세테이트를 차례로 첨가한다. 1000ml 4 구 둥근병에 황산을 넣고 교반한 상태에서 식힌 후 보온한다. 반응액을 황산 용액에 적하한다. 용액을 0~10℃로 조절하고 적하 후 에틸 아세테이트를 넣어 교반한다. 깨끗한 1000ml 4 구 둥근병에 10 % 중탄산 나트륨 용액을 첨가하고, 냉각시키고, 교반을 멈추고, 반응액이 정적으로(statically) 층을 이루고, 상부 유기층을 10 % 중탄산 나트륨 용액으로 옮겨 교반하였다. 하부 수층에 에틸 아세테이트를 첨가하여 추출하고, 층을 이룬 다음 수층을 버렸다. 2 차 에틸 아세테이트 층을 수용액에서 10 % 중탄산 나트륨으로 함께 혼합하였다. 그런 다음 교반하고 온도를 조절하고 층을 이룬다. 알칼리성 수층에 에틸 아세테이트를 첨가하여 추출, 교반 및 온도 조절을 하였다. 부식성(caustic) 세척 유기층을 순수(pure water)로 세척 교반하고, 온도를 조절하고 층을 이룬다. 수층을 에틸 아세테이트로 계속 추출하고, 층을 이루고, 수층을 버리고, 유기상을 결합한다. 황산나트륨을 첨가하여 건조시키고, 흡입 여과하고, 에틸 아세테이트를 증발시켜 17g의 생성물을 수득하고, 수율은 84.33 %이다.
실시예 5:
Figure 112020107283861-pct00029
메탄올 (10.00ml) 및 화합물 C (R1은 벤조일) (1.00g)를 차례로 반응 용기에 첨가하였다. 반응액을 -15~-5℃로 냉각하고 수산화 나트륨 용액 (10.00ml)을 적하하였다. 첨가 후, 혼합물을 일정한 온도로 유지하고 반응이 완료될 때까지 교반하였다. 그 다음 10 % 황산 용액 (4.00g)을 첨가하였다. 적하 후 온도를 유지하면서 반응을 계속한 후 포화 탄산나트륨 용액을 첨가하여 pH를 조절하였다. 반응액을 가열하고 증류하여 감압하여 메탄올을 제거한 후 메틸 tert-부틸 에테르를 가하여 유기층을 추출한 다음 염화나트륨을 첨가하였다. 그런 다음 수층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 회수를 위해 수층을 분리하고, 유기층을 진공 증류하여 환원시켜 디클로로메탄을 제거하였다. 0.38g의 생성물을 수득하였고 수율은 73.77 %이다.
실시예 6:
Figure 112020107283861-pct00030
효소의 제조는 실시예 3과 동일하다.
단계 1: 반응은 5L 플라스크에서 수행하고, 반응계는 2L로 조절하고, 멸균된 인산 칼륨 완충액 1.7L을 사용하여 플라스크에 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아 전체 세포를 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 넣고 50분 동안 초음파로 세포를 파쇄시켰다. 그런 다음 포도당 25g, NADP+ 0.42g을 넣고 반응물 80g을 달아 300mL DMSO에 용해시킨다. 기질을 포함하는 DMSO 용액을 진탕병에 천천히 붓고 반응 2 시간 후 포도당 12g을 용액에 첨가하였다. 알데히드/케톤 유전자 조작 박테리아의 전체 세포량은 75g/L이었고 포도당 탈수소 효소의 투입량은 25mg/L였다. 온도는 37℃이다; 전환 반응은 회전 속도가 200r/min으로 조절된 셰이커에서 수행되었으며 전환 시간은 12 시간이었다. 목표 생성물의 전환율은 97.8 %였다.
단계 2: 화학식 VIII의 중간체 화합물을 포함하는 단계 1로부터의 생성물을 정제하였다. 정제 단계는 실시예 3을 참조한다. 목표 생성물은 77.1g이고, de 값은 95.3 %이고 ee(anti) 값은 99.6 %이다.
실시예 7:
Figure 112020107283861-pct00031
단계 1: 반응은 1L 플라스크에서 수행하고, 반응계는 300mL로 제어하고, 250mL의 탈 이온수를 사용하여 플라스크에 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아 전체 세포를 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 넣고 포도당 (2.5mol/L) 10ml, NADP+ 0.26g을 넣고 반응물 10g을 달아 부틸 아세테이트 30ml에 용해시켰다. 기질을 포함하는 부틸 아세테이트 용액을 진탕병에 천천히 붓고 반응 1 시간 후 포도당 (2.5mol/L) 10mL를 용액에 첨가하였다. 알데히드/케톤 유전자 조작 박테리아의 전체 세포량은 75g/L이었고 포도당 탈수소 효소의 투입량은 25mg/L였다. 온도는 37℃이다; 전환 반응은 회전 속도가 200r/min으로 조절된 셰이커에서 수행되었으며 전환 시간은 12 시간이었다. 목표 생성물의 전환율은 97.8 %였다.
단계 2: 단계 1에서 수득한 목표 생성물의 전환액을 정제하였다. 반응계에 일정 부피의 에틸 아세테이트를 넣고 37℃에서 15분 동안 추출을 3회 반복한 후 에틸 아세테이트 층을 원심 분리로 모으고, 모아진 에틸 아세테이트 층에 5 % 무수 황산마그네슘을 넣고 15분 간 흔들어준다. 그런 다음 여과하여 황산 마그네슘을 제거한다. 이후 탈수된 에틸 아세테이트 층을 고온 및 감압에서 농축하고 목표 생성물은 9.55 g이고, de 값은 99.1 %이며 ee(anti) 값은 99.7 %이다. 1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ2.269~2.301(m, 1 H，J=6 Hz), 2.367~2.404 (m, 1 H)，2.954~2.993 (m, 1 H，J=6 Hz)，3.438~3.466 (m，1 H)，3.520~3.549 (m，1H)，4.227~4.269(m, 1H)，4.298~4.326 (m，1H)，4.391~4.420(m，1H). MS(ESI): m/z 210.03 [M+H]+
실시예 8:
Figure 112020107283861-pct00032
단계 1: 반응은 5L 플라스크에서 수행하고, 반응계는 2L로 제어하고, 1.5L의 탈이온수를 사용하여 플라스크에 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아 전체 세포를 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 넣고 포도당 (2.5mol/L) 10ml, NADP+ 3g을 넣고 반응물 100g을 달아 부틸 아세테이트 300ml에 용해시킨다. 기질을 포함하는 부틸 아세테이트 용액을 진탕병에 천천히 붓고 반응 1 시간 후 포도당 (2.5mol/L) 100mL를 용액에 첨가하였다. 알데히드/케톤 유전자 조작 박테리아의 전체 세포량은 100g/L 이었고 포도당 탈수소 효소의 투입량은 25mg/L였다. 온도는 28℃이다. 전환 반응은 회전 속도가 200r/min으로 조절된 셰이커에서 수행되었으며 전환 시간은 12 시간이었다. 목표 생성물의 전환율은 97.8 %였다.
단계 2: 화학식 VIII의 중간체 화합물을 포함하는 단계 1의 생성물을 정제하였다. 정제 단계는 실시예 3을 참조한다. 목표 생성물은 9.42g이었고, de 값은 96.9 %이고 ee(anti) 값은 99.4 %였다.
실시예 9:
Figure 112020107283861-pct00033
단계 1: 반응은 1L 플라스크에서 수행하고, 반응계는 300mL로 조절하고, 250mL의 탈 이온수를 사용하여 플라스크에 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아 전체를 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 넣고 포도당 (2.5mol/L) 10ml, NADP + 0.26g을 넣고 반응물 10g을 달아 부틸 아세테이트 30ml에 용해시킨다. 기질을 포함하는 부틸 아세테이트 용액을 진탕병에 천천히 붓고 반응 1 시간 후 포도당 (2.5mol/L) 10mL를 용액에 첨가하였다. 알데히드/케톤 유전자 조작 박테리아의 전체 세포량은 75g/L이었고 포도당 탈수소 효소의 투입량은 25mg/L였다. 온도는 37℃이다. 전환 반응은 회전 속도가 200r/min으로 조절된 셰이커에서 수행되었으며 전환 시간은 12시간 이었다. 목표 생성물의 전환율은 97.8 %였다.
단계 2: 화학식 VIII의 중간체 화합물을 포함하는 단계 1의 생성물을 정제하였다. 정제 단계는 실시예 3을 참조한다. 목표 생성물은 9.37g이고, de 값은 97.1 %이고 ee(anti) 값은 99.5 %였다.
실시예 10:
Figure 112020107283861-pct00034
단계 1: 반응은 5L 플라스크에서 수행하고, 반응계는 2L로 제어하고, 1.6L의 탈 이온수를 사용하여 플라스크에 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아 전체 세포를 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 넣고 포도당 (2.5mol/L) 100ml, NADP+ 0.25g을 넣고 반응물 100g을 달아 부틸 아세테이트 200ml에 용해시켰다. 기질을 포함하는 부틸 아세테이트 용액을 진탕병에 천천히 붓고 반응 1 시간 후 포도당 (2.5mol/L) 100mL를 용액에 첨가하였다. 알데히드/케톤 유전자 조작 박테리아의 전체 세포량은 50g/L이었고 포도당 탈수소 효소의 투입량은 25mg/L였다. 온도는 25℃이다; 전환 반응은 회전 속도가 200r/min으로 조절된 셰이커에서 수행되었으며 전환 시간은 12시간 이었다. 목표 생성물의 전환율은 97.8 %였다.
단계 2: 화학식 VIII의 중간체 화합물을 포함하는 단계 1의 생성물을 정제하였다. 정제 단계는 실시예 3을 참조한다. 목표 생성물은 93.1g이고, de 값은 95.6 %이고 ee(anti) 값은 99.6 %였다.
실시예 11: 대조 실험
Figure 112020107283861-pct00035
단계 1: 반응은 1L 플라스크에서 수행하고, 반응계는 300mL로 제어하고, 250mL의 탈 이온수를 사용하여 플라스크에 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아 전체 세포를 현탁시켰다. 조작된 박테리아의 전체 세포에서 사용되는 알데히드/케톤 환원 효소 유전자의 암호화 서열은 유럽 특허의 EP2634180에 공개된 서열 (특허의 EP2634180의 서열 번호 12)에 나타난 바와 같다. 서열은 전체 유전자 합성 (GenScript Co., Ltd.에 의뢰)으로 합성되었다. 제조 단계는 실시예 3을 참조한다. 포도당 탈수소 효소를 넣고 포도당 (2.5mol/L) 10ml, NADP+ 0.26g을 넣고 반응물 10g을 달아 부틸 아세테이트 30ml에 용해시켰다. 기질을 포함하는 부틸 아세테이트 용액을 진탕병에 천천히 붓고 반응 1시간 후 포도당 (2.5mol/L) 10mL를 용액에 첨가하였다. 알데히드/케톤 유전자 조작 박테리아의 전체 세포량은 75g/L이었고 포도당 탈수소 효소의 투입량은 25mg/L였다. 온도는 37℃이다. 전환 반응은 회전 속도가 200r/min으로 조절된 셰이커에서 수행되었으며 전환 시간은 12시간 이었다.
단계 2: 정제 단계는 실시예 3을 참조한다. 목표 생성물은 8.11g이었고, de 값은 85.1 %이고 ee(anti) 값은 93.3 %였다.
실시예 12: 대조 실험
Figure 112020107283861-pct00036
단계 1: 반응은 1L 플라스크에서 수행하고, 반응계는 300mL로 조절하고, 250mL의 탈 이온수를 사용하여 사카로마이세스 쿠드리아브제비의 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아 전체 세포를 플라스크에 현탁시켰다. 조작된 세균의 전체 세포에서 사용되는 알데히드/케톤 환원 효소 유전자의 암호화 서열은 서열 번호 3에 기재된 서열과 같다. (알데히드/케톤 환원 효소 유전자의 암호화 서열은 인위적으로 설계되지 않음) 서열은 전체 유전자 합성 (GenScript Co., Ltd.에 의뢰)으로 합성되었다. 제조 단계는 실시예 3을 참조한다. 포도당 탈수소 효소를 넣고 포도당 (2.5mol/L) 10ml, NADP+ 0.26g을 넣고 반응물 10g을 달아 부틸 아세테이트 30ml에 용해시켰다. 기질을 포함하는 부틸 아세테이트 용액을 진탕병에 천천히 붓고 반응 1시간 후 포도당 (2.5mol/L) 10mL를 용액에 첨가하였다. 알데히드/케톤 유전자 조작 박테리아의 전체 세포량은 75g/L이었고 포도당 탈수소 효소의 투입량은 25mg/L였다. 온도는 37℃이다; 전환 반응은 회전 속도가 200r/min으로 조절된 셰이커에서 수행되었으며 전환 시간은 12시간 이었다.
단계 2: 정제 단계는 실시예 3을 참조한다. 목표 생성물은 7.73g이었고, de 값은 79.6 %이고 ee(anti) 값은 88.7 %였다.
뉴클레오티드 서열표
서열 번호 1의 서열 번호는 하기와 같다:
Met Ser Asp Leu Phe Lys Pro Ala Pro Glu Pro Pro Thr Glu Leu Gly
Arg Leu Arg Val Leu Ser Lys Thr Ala Gly Ile Arg Val Ser Pro Leu
Ile Leu Gly Gly Ala Ser Ile Gly Asp Ala Trp Ser Gly Phe Met Gly
Ser Met Asn Lys Glu Gln Ala Phe Glu Leu Leu Asp Ala Phe Tyr Glu
Ala Gly Gly Asn Cys Val Asp Thr Ala Asn Ser Tyr Gln Asn Glu Glu
Ser Glu Ile Trp Ile Gly Glu Trp Met Lys Ser Arg Lys Leu Arg Asp
Gln Ile Val Ile Ala Thr Lys Phe Thr Gly Asp Tyr Lys Lys Tyr Glu
Val Gly Gly Gly Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Gly Asn His Lys His Ser
Leu His Val Ser Val Arg Asp Ser Leu Arg Lys Leu Gln Thr Asp Trp
Ile Asp Ile Leu Tyr Val His Trp Trp Asp Tyr Met Ser Ser Ile Glu
Glu Val Met Asp Ser Leu His Ile Leu Ile Gln Gln Gly Lys Val Leu
Tyr Leu Gly Val Ser Asp Thr Pro Ala Trp Val Val Ser Ala Ala Asn
Asn Tyr Ala Thr Ser His Gly Lys Thr Pro Phe Ser Ile Tyr Gln Gly
Lys Trp Asn Val Leu Asn Arg Asp Phe Glu Arg Asp Ile Ile Pro Met
Ala Arg His Phe Gly Met Ala Leu Ala Pro Trp Asp Val Met Gly Gly
Gly Lys Phe Gln Ser Lys Lys Ala Met Glu Glu Trp Lys Lys Asn Gly
Glu Gly Leu Arg Thr Ala Val Gly Gly Pro Glu Gln Thr Glu Leu Glu
Val Lys Ile Ser Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala Glu Glu His Gly Thr
Glu Ser Val Thr Ala Ile Ala Ile Ala Tyr Val Arg Ser Lys Ala Lys
Asn Val Phe Pro Leu Val Gly Gly Arg Lys Ile Glu His Leu Lys Gln
Asn Ile Glu Ala Leu Ser Ile Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ile Glu Tyr
Leu Glu Ser Ile Val Thr Phe Asp Val Gly Phe Pro Lys Ser Asn Ile
Gly Asp Asp Pro Ala Val Thr Lys Lys Leu Ser Pro Leu Thr Ser Met
Ser Ala Arg Ile Ser Phe Asp Asn
서열 번호 2의 서열 번호는 하기와 같다:
atgagcgatc tgtttaaacc ggcgccggaa ccgccgaccg aactgggccg cctgcgcgtg 60
ctgagcaaaa ccgcgggcat tcgcgtgagc ccgctgattc tgggcggcgc gagcattggc 120
gatgcgtgga gcggctttat gggcagcatg aacaaagaac aggcgtttga actgctggat 180
gcgttttatg aagcgggcgg caactgcgtg gataccgcga acagctatca gaacgaagaa 240
agcgaaattt ggattggcga atggatgaaa agccgcaaac tgcgcgatca gattgtgatt 300
gcgaccaaat ttaccggcga ttataaaaaa tatgaagtgg gcggcggcaa aagcgcgaac 360
tattgcggca accataaaca tagcctgcat gtgagcgtgc gcgatagcct gcgcaaactg 420
cagaccgatt ggattgatat tctgtatgtg cattggtggg attatatgag cagcattgaa 480
gaagtgatgg atagcctgca tattctgatt cagcagggca aagtgctgta tctgggcgtg 540
agcgataccc cggcgtgggt ggtgagcgcg gcgaacaact atgcgaccag ccatggcaaa 600
accccgttta gcatttatca gggcaaatgg aacgtgctga accgcgattt tgaacgcgat 660
attattccga tggcgcgcca ttttggcatg gcgctggcgc cgtgggatgt gatgggcggc 720
ggcaaatttc agagcaaaaa agcgatggaa gaatggaaaa aaaacggcga aggcctgcgc 780
accgcggtgg gcggcccgga acagaccgaa ctggaagtga aaattagcga agcgctgaac 840
aaaattgcgg aagaacatgg caccgaaagc gtgaccgcga ttgcgattgc gtatgtgcgc 900
agcaaagcga aaaacgtgtt tccgctggtg ggcggccgca aaattgaaca tctgaaacag 960
aacattgaag cgctgagcat taaactgacc ccggaacaga ttgaatatct ggaaagcatt 1020
gtgacctttg atgtgggctt tccgaaaagc aacattggcg atgatccggc ggtgaccaaa 1080
aaactgagcc cgctgaccag catgagcgcg cgcattagct ttgataacta a 1131
서열 번호 3의 서열 번호는 하기와 같다:
atgtctgatg tatttggacc tgcacctgaa ccacctaccg agttaggacg tctaagagtt 60
ctctctaaaa cagctggtat aagagtctct ccgctaatat tgggaggtat gtcgattggt 120
gacgcctggt caggattcat ggggtcaatg aacaaggagc gggcttttga gctgcttgat 180
gcctttttcg aggcaggtgg aaacttcatt gatactgcaa ataattacca aaatgaacag 240
tcagaggcat ggataggtga atggatggtt tcaagaaaat tgcgtgacca aattgttatt 300
gccaccaaat tcaccacaga ctataagaag tatgaagtgg gcaagggcag aagtgccaac 360
ttctgtggta atcacaagca tagtttacac gtaagtgtga gagattctct tcgcaaattg 420
cagactgatt ggattgacat tctctatgtt cactggtggg attatatgag ttcgatcgag 480
gaagttatgg atagtctgca tattcttgtg cagcagggca aggtcctcta cctgggagta 540
tctgatacac ctgcatgggt cgtgtctgct gcaaattact acgctacctc tcacgggaaa 600
actcccttca gcatctatca aggtaaatgg aatctgttga atagggactt tgagcgtgaa 660
attattccaa tggctaggca ttttggtatg gctctcgctc catgggatgt catgggaggg 720
ggaagatttc agagcaaaaa agctttagaa gaacggaaga agagtggaga gggcctgcgt 780
agctttgttg gtacatctga acagacggat gcagaggtta agatcagcga ggcattgtcg 840
aaggttgctg aggaacatgg cattgagtct gtcacagcta ttgccattgc ctatgtccgc 900
tccaaagcga agcatgtttt cccattggtt ggaggaagga aaattgagca cctcaaacaa 960
aatattgagg cgttgagtat taaattgaca ccaggacaga tagaatatct agaaagcatt 1020
gtcccattcg atgttgggtt ccctagcaat ttcatcggag atgatcctgc agttactaag 1080
aaacttgcat tccttccagc aatgtctgcc aagattgctt ttgacgatta g 1131
SEQUENCE LISTING <110> JIANGSU RUIKE MEDICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY CO.,LTD <120> Method for preparing hexahydrofuro-furanol derivative, Intermediate thereof and preparation method thereof <130> PI-20K1051CN <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 376 <212> PRT <213> artifical sequence <400> 1 Met Ser Asp Leu Phe Lys Pro Ala Pro Glu Pro Pro Thr Glu Leu Gly 1 5 10 15 Arg Leu Arg Val Leu Ser Lys Thr Ala Gly Ile Arg Val Ser Pro Leu 20 25 30 Ile Leu Gly Gly Ala Ser Ile Gly Asp Ala Trp Ser Gly Phe Met Gly 35 40 45 Ser Met Asn Lys Glu Gln Ala Phe Glu Leu Leu Asp Ala Phe Tyr Glu 50 55 60 Ala Gly Gly Asn Cys Val Asp Thr Ala Asn Ser Tyr Gln Asn Glu Glu 65 70 75 80 Ser Glu Ile Trp Ile Gly Glu Trp Met Lys Ser Arg Lys Leu Arg Asp 85 90 95 Gln Ile Val Ile Ala Thr Lys Phe Thr Gly Asp Tyr Lys Lys Tyr Glu 100 105 110 Val Gly Gly Gly Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Gly Asn His Lys His Ser 115 120 125 Leu His Val Ser Val Arg Asp Ser Leu Arg Lys Leu Gln Thr Asp Trp 130 135 140 Ile Asp Ile Leu Tyr Val His Trp Trp Asp Tyr Met Ser Ser Ile Glu 145 150 155 160 Glu Val Met Asp Ser Leu His Ile Leu Ile Gln Gln Gly Lys Val Leu 165 170 175 Tyr Leu Gly Val Ser Asp Thr Pro Ala Trp Val Val Ser Ala Ala Asn 180 185 190 Asn Tyr Ala Thr Ser His Gly Lys Thr Pro Phe Ser Ile Tyr Gln Gly 195 200 205 Lys Trp Asn Val Leu Asn Arg Asp Phe Glu Arg Asp Ile Ile Pro Met 210 215 220 Ala Arg His Phe Gly Met Ala Leu Ala Pro Trp Asp Val Met Gly Gly 225 230 235 240 Gly Lys Phe Gln Ser Lys Lys Ala Met Glu Glu Trp Lys Lys Asn Gly 245 250 255 Glu Gly Leu Arg Thr Ala Val Gly Gly Pro Glu Gln Thr Glu Leu Glu 260 265 270 Val Lys Ile Ser Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala Glu Glu His Gly Thr 275 280 285 Glu Ser Val Thr Ala Ile Ala Ile Ala Tyr Val Arg Ser Lys Ala Lys 290 295 300 Asn Val Phe Pro Leu Val Gly Gly Arg Lys Ile Glu His Leu Lys Gln 305 310 315 320 Asn Ile Glu Ala Leu Ser Ile Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ile Glu Tyr 325 330 335 Leu Glu Ser Ile Val Thr Phe Asp Val Gly Phe Pro Lys Ser Asn Ile 340 345 350 Gly Asp Asp Pro Ala Val Thr Lys Lys Leu Ser Pro Leu Thr Ser Met 355 360 365 Ser Ala Arg Ile Ser Phe Asp Asn 370 375 <210> 2 <211> 1131 <212> DNA <213> artifical sequence <400> 2 atgagcgatc tgtttaaacc ggcgccggaa ccgccgaccg aactgggccg cctgcgcgtg 60 ctgagcaaaa ccgcgggcat tcgcgtgagc ccgctgattc tgggcggcgc gagcattggc 120 gatgcgtgga gcggctttat gggcagcatg aacaaagaac aggcgtttga actgctggat 180 gcgttttatg aagcgggcgg caactgcgtg gataccgcga acagctatca gaacgaagaa 240 agcgaaattt ggattggcga atggatgaaa agccgcaaac tgcgcgatca gattgtgatt 300 gcgaccaaat ttaccggcga ttataaaaaa tatgaagtgg gcggcggcaa aagcgcgaac 360 tattgcggca accataaaca tagcctgcat gtgagcgtgc gcgatagcct gcgcaaactg 420 cagaccgatt ggattgatat tctgtatgtg cattggtggg attatatgag cagcattgaa 480 gaagtgatgg atagcctgca tattctgatt cagcagggca aagtgctgta tctgggcgtg 540 agcgataccc cggcgtgggt ggtgagcgcg gcgaacaact atgcgaccag ccatggcaaa 600 accccgttta gcatttatca gggcaaatgg aacgtgctga accgcgattt tgaacgcgat 660 attattccga tggcgcgcca ttttggcatg gcgctggcgc cgtgggatgt gatgggcggc 720 ggcaaatttc agagcaaaaa agcgatggaa gaatggaaaa aaaacggcga aggcctgcgc 780 accgcggtgg gcggcccgga acagaccgaa ctggaagtga aaattagcga agcgctgaac 840 aaaattgcgg aagaacatgg caccgaaagc gtgaccgcga ttgcgattgc gtatgtgcgc 900 agcaaagcga aaaacgtgtt tccgctggtg ggcggccgca aaattgaaca tctgaaacag 960 aacattgaag cgctgagcat taaactgacc ccggaacaga ttgaatatct ggaaagcatt 1020 gtgacctttg atgtgggctt tccgaaaagc aacattggcg atgatccggc ggtgaccaaa 1080 aaactgagcc cgctgaccag catgagcgcg cgcattagct ttgataacta a 1131 <210> 3 <211> 1131 <212> DNA <213> artifical sequence <400> 3 atgtctgatg tatttggacc tgcacctgaa ccacctaccg agttaggacg tctaagagtt 60 ctctctaaaa cagctggtat aagagtctct ccgctaatat tgggaggtat gtcgattggt 120 gacgcctggt caggattcat ggggtcaatg aacaaggagc gggcttttga gctgcttgat 180 gcctttttcg aggcaggtgg aaacttcatt gatactgcaa ataattacca aaatgaacag 240 tcagaggcat ggataggtga atggatggtt tcaagaaaat tgcgtgacca aattgttatt 300 gccaccaaat tcaccacaga ctataagaag tatgaagtgg gcaagggcag aagtgccaac 360 ttctgtggta atcacaagca tagtttacac gtaagtgtga gagattctct tcgcaaattg 420 cagactgatt ggattgacat tctctatgtt cactggtggg attatatgag ttcgatcgag 480 gaagttatgg atagtctgca tattcttgtg cagcagggca aggtcctcta cctgggagta 540 tctgatacac ctgcatgggt cgtgtctgct gcaaattact acgctacctc tcacgggaaa 600 actcccttca gcatctatca aggtaaatgg aatctgttga atagggactt tgagcgtgaa 660 attattccaa tggctaggca ttttggtatg gctctcgctc catgggatgt catgggaggg 720 ggaagatttc agagcaaaaa agctttagaa gaacggaaga agagtggaga gggcctgcgt 780 agctttgttg gtacatctga acagacggat gcagaggtta agatcagcga ggcattgtcg 840 aaggttgctg aggaacatgg cattgagtct gtcacagcta ttgccattgc ctatgtccgc 900 tccaaagcga agcatgtttt cccattggtt ggaggaagga aaattgagca cctcaaacaa 960 aatattgagg cgttgagtat taaattgaca ccaggacaga tagaatatct agaaagcatt 1020 gtcccattcg atgttgggtt ccctagcaat ttcatcggag atgatcctgc agttactaag 1080 aaacttgcat tccttccagc aatgtctgcc aagattgctt ttgacgatta g 1131

Claims (22)

  1. 하기 구조를 갖는 화학식 Cp 또는 화학식 Cp'의 화합물:
    Figure 112023032851301-pct00037

    상기 R1, R3는 수소 또는 히드록시 보호기이고, R2는 히드록시 보호기이며,
    상기 히드록시 보호기는 C2-11의 아실기이다.
  2. 키랄이 효소 환원 반응에 의해 화학식 (B) 화합물 또는 화학식 (B-2) 화합물로부터 구성되고,
    Figure 112023032851301-pct00038

    상기 R1은 수소 또는 히드록시기의 보호기이고, 상기 히드록시기의 보호기는 C2-11의 아실기이며;
    상기 효소는 알데히드/케톤 환원 효소이고, 이의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 제시된 단백질, 또는 서열 번호 1에 의한 1개 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가 후 알데히드/케톤 환원 효소 활성을 갖는 단백질, 또는 알데하이드/케톤 환원 효소 활성을 갖는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열과 80 % 이상의 상동성을 갖는 단백질인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 중간체 화합물의 제조 방법.
  3. 화학식 B 화합물의 효소 환원 반응에 의해 구성되고, 히드록시기는 보호기에 의해 추가로 보호되고,
    Figure 112023032851301-pct00039

    상기 R1은 제2항과 같이 정의되고, R2는 히드록시기의 보호기이며, 상기 히드록시기의 보호기는 C2-11의 아실기이고, 효소는 제2항과 동일한 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올 중간체의 제조 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, R1은 C2-11의 선형 또는 분지형 아실기인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 제2항에서 제조된 중간체 C가 추가 환원 및 고리 닫힘 반응에 의해 제조되는 것을 특징으로 하고,
    Figure 112022082561785-pct00040

    상기 R1의 정의는 제3항과 동일한 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법.
  6. 제2항에서 제조된 중간체 C-2는 고리 닫힘 반응에 의해 제조되는 것을 특징으로 하고,
    Figure 112022082561785-pct00041

    상기 R1의 정의는 제2항과 동일한 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법.
  7. 제3항에서 제조된 중간체 Cp가 추가 환원 및 고리 닫힘 반응에 의해 제조되는 것을 특징으로 하고,
    Figure 112022082561785-pct00050

    상기 R1 및 R2의 정의는 제4항과 동일한 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법.
  8. 제3항에서 제조된 중간체 Cp-2가 고리 닫힘 반응에 의해 제조되는 것을 특징으로 하고,
    Figure 112022082561785-pct00043

    상기 R1 및 R2의 정의는 제3항과 동일한 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법.
  9. 제2항 또는 제3항에서 제조된 중간체 C-2 또는 Cp-2가 추가 고리 닫힘 반응에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법.
  10. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 화학식 B의 화합물은 화학식 A2의 화합물의 아실화 반응에 의해 제조되는 것을 특징으로 하고 반응이 하기에 나타나며:
    Figure 112023032851301-pct00044

    상기 R1은 C2-11의 선형 또는 분지형 아실기인 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 화학식 A2의 화합물은 화학식 A1의 화합물의 할로겐화 반응에 의해 제조되는 것을 특징으로 하고 반응이 하기에 나타나며:
    Figure 112022082561785-pct00045

    상기 X는 할로겐인 제조 방법.
  12. 할로겐화 반응, 아실화 반응, 효소 환원 반응, 추가 환원 및 고리 닫힘 반응에 의한 제조를 특징으로 하고,
    Figure 112022082561785-pct00046

    상기 X는 할로겐이고, R1의 정의는 제2항과 동일하며, 효소는 제2항에서 정의된 바와 같은 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법.
  13. 할로겐화 반응, 아실화 반응, 효소 환원 반응, 보호 반응, 추가 환원 및 고리 닫힘 반응에 의한 제조를 특징으로 하고,
    Figure 112022082561785-pct00051

    상기 X는 할로겐이고, R1의 정의는 제2항과 같고, R2의 정의는 제3항과 같으며, 효소는 제2항에서 정의된 바와 같은 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법.
  14. 할로겐화 반응, 효소 환원 반응, 아실화 반응, 환원 및 고리 닫힘 반응에 의한 제조를 특징으로 하고,
    Figure 112022082561785-pct00052

    상기 X는 할로겐이고, R1의 정의는 제2항과 동일한 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]푸란-3-올의 제조 방법.
  15. 제2항에 있어서, 상기 알데히드/케톤 환원 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 2인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  16. 제2항에 있어서, 상기 알데히드/케톤 환원 효소는 유전자 조작 박테리아의 총 세포, 파쇄 효소액, 동결 건조 분말 또는 고정 효소 또는 고정 세포인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  17. 제2항에 있어서, 반응계에서 알데히드/케톤 환원 효소 유전자 조작 박테리아의 총 세포 투입량은 10-100g/L이고, 전환 온도는 25-37℃인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  18. 제2항에 있어서,
    상기 반응은 용매 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 용매는 물 또는 완충액 및 유기 용매로 이루어진 혼합 용매인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 완충액은 인산염 완충액, 탄산염 완충액, Tri-HCl 완충액, 구연산염 완충액 또는 MOPS 완충액 중 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 유기 용매가 DMSO, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 이소프로판올, DMF, TBME, 디클로로메탄 및 비닐 아세테이트 중 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  22. 삭제
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