KR20200139765A - 헥사하이드로푸로-푸라놀 유도체의 제조 방법, 이의 중간체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제약 합성 분야, 특히 헥사하이드로푸로-푸라놀 유도체의 제조 방법, 이의 중간체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 제조 방법은 할로겐화 반응, 아실화 반응, 효소 환원 반응, 아민 화합물과의 반응, 환원 고리 닫힘 반응 (A1, A2, B, Cp1, CL, Cf)의 단계를 포함한다.
Figure pct00058

상기 R1, R2, R3은 수소 또는 히드록시 보호기이고; R4 및 R5는 동일하거나 상이하며 페닐, 알킬 또는 치환된 페닐이다. 헥사하이드로푸로-푸라놀 유도체의 제조 과정에서 효소법으로 키랄성(분자 비대칭성, chirality)을 구축하며, 이러한 기술적 수단을 채택하여 매우 높은 광학 순도로 생성물을 제조할 수 있다. 제조 방법은 다루나비르의 핵심 중간체인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올을 상업적 생산으로 제조하는 데 사용할 수 있으며, 이는 산업 생산에 적합한 매우 경제적인 경로이다.

Description

헥사하이드로푸로-푸라놀 유도체의 제조 방법, 이의 중간체 및 이의 제조 방법
본 발명은 제약 합성 분야, 특히 헥사하이드로푸로-푸라놀(hexahydrofuro-furanol) 유도체의 제조 방법, 이의 중간체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
이 출원은 2018년 4월 12일 중국 특허청에 출원 번호 201810325842.2와 "헥사하이드로푸로-푸라놀 유도체의 제조 방법, 이의 중간체 및 이의 제조 방법"의 발명 명칭으로 중국 특허 출원의 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
하기의 화학식 Z 구조를 갖는 화합물의 화학명은 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올이다:
Figure pct00001
,
이는 헥사하이드로푸로-푸라놀 유도체 중 하나에 속하며 항 AIDS 약물 다루나비르(Darunavir)의 중간체이다.
다루나비르의 원 제조업체인 Tibotec Pharmaceutical Co., Ltd.의 중국 특허 출원 번호 02817639.1 (출원일: 2002-9-6) 및 200580010400.X는 상기 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 제조 방법을 제공하고, 여기서 원료는 하기 화학식 (3)의 화합물이다.
Figure pct00002
화학식 (3)의 화합물은 출발 물질인 화학식 (1)의 화합물로부터 제조된다.
Figure pct00003
다루나비르의 제네릭 의약품 제조업체인 Sumitomo Chemical Co., Ltd.의 중국 특허 출원 번호 2003080109926.4는 상기 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 제조 방법을 제공하고, 여기서 출발 물질은 하기 화학식 VIII의 화합물이다.
Figure pct00004
일본 Sumitomo Chemical Co., Ltd.는 키랄 구조(chiral conformation)를 생성하기 위해 키랄 리간드 촉매를 사용하는 것을 선택하였다. 이는 실제로 키랄 구조를 구축하는 방법이지만 산업화에는 적합하지 않다.
다루나비르의 제네릭 의약품 제조업체인 스위스의 Lonza Ltd.의 유럽 특허 출원 EP2634180A1 (출원일: 2012-1-3)은 카르보닐 환원 효소 폴리펩티드 또는 카르보닐 환원 효소 폴리펩티드를 포함하는 미생물을 사용하여 카르보닐기를 히드록시기로 환원시켜, 다루나비르 중간체의 키랄성(분자 비대칭성, chirality)을 구축하고, Saccharomyces cerevisiae YNL331C와 같은 시판되는 여러 효소가 명세서에 기재되어 있으며, 하기 화학식 Ia로 표시되는 화합물이 보다 적합한 구성이라고 언급하고 있다.
Figure pct00005
(3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올이 다루나비르 약물의 제조를 위한 핵심 중간체임을 고려할 때, 수율이 높고 DE값이 높은 핵심 중간체를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 비용이 저렴하고 반응 조건이 마일드(mild)하며 산업화에 적합한 핵심 중간체에 대한 더 많은 제조 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명의 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 제조 방법은 출발 물질의 선택과 키랄 구조(configuration)의 구축, 상기 언급된 선행 특허 출원에서 개발된 것과 다른 출발 물질을 가진 다루나비르의 핵심 중간체의 제조 방법으로부터 시작된다. 본 발명의 제조 방법은 키랄성을 구축하기 위해 낮은 비용과 마일드(mild)한 반응 조건을 갖는 효소법을 채택하여, 다루나비르의 핵심 중간체 제조를 위한 산업화에 적합한 대체 경로를 제공한다.
본 발명의 기술적 목표을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 기술적 해결책을 제공한다:
본 발명의 첫 번째 측면은 하기 구조식을 갖는 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올 제조용 중간체 화합물을 제공한다.
Figure pct00006
,
Figure pct00007
상기 R1, R2, R3은 수소 또는 히드록시 보호기이고; R4, R5는 동일하거나 상이하며, 페닐, 알킬 또는 치환된 페닐이다. 히드록시 보호기는 알킬, 실릴, C2-11 아실, C4-9 시클로알케닐, 아릴, 아르알킬(aralkyl), 아로일, 페닐, 치환된 페닐이고; 실릴은 테트라메틸실릴, 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, 트리-n-부틸실릴, tert-부틸디메틸실릴이고; 알킬은 C1-C8 알킬이고; 아릴기는 페닐, 푸라닐(furanyl), 티에닐(thienyl) 또는 인돌일(indolyl)이고; 치환된 페닐은 알킬 치환된 페닐, 알콕시알킬 치환된 페닐, 니트로알킬 치환된 페닐 또는 할로겐 치환된 페닐이고; 알킬 치환된 페닐은 벤질, 벤즈히드릴(benzhydryl), 트리틸(trityl)이고; 알콕시알킬 치환된 페닐은 p-메톡시벤질이고; 니트로알킬 치환된 페닐은 p-니트로벤질이고; 할로겐 치환된 페닐은 p-클로로페닐이다.
본 발명의 두 번째 측면은 화학식 Cp의 화합물과 아민 화합물을 반응시켜 제조된 상기 중간체 화합물의 제조 방법을 제공한다.
Figure pct00008
여기서 R1, R2, R4 및 R5의 정의는 상기와 동일하다.
보다 바람직하게는 화학식 Cp의 화합물을 N-메틸아닐린 화합물과 반응시켜 제조된다.
Figure pct00009
여기서 R1, R2의 정의는 상기와 동일하다.
키랄성을 구축하기 위해 화학식 B의 화합물의 효소 환원 반응에 의해 제조된다.
Figure pct00010
상기 R1의 정의는 상기와 동일하다.
효소는 알도-케토 환원 효소와 같은 생물학적 효소로, 여기서 알도-케토 환원 효소는 사카로마이세스 쿠드리아브제비(Saccharomyces kudriavzevii) 균주에서 유래된다. 아미노산 서열은 서열 번호 1에 표시된 단백질, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가 후 서열 번호 1로부터 수득된 알도-케토 환원 효소 활성을 갖는 단백질, 또는 서열 번호 1에 나타난 아미노산 서열과 80% 상동성을 갖고 알도-케토 환원 효소 활성을 갖는 단백질이고; 이의 뉴클레오티드 서열은 서열 목록에서 서열 번호 2로 표시된다. 알도-케토 환원 효소는 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포, 파쇄된 효소액, 동결 건조된 분말 또는 고정화 효소 또는 고정화 세포로부터 유래될 수 있다.
공급되는 효소의 양은 50-100g/L 범위일 수 있고, 반응 온도는 25-37℃ 범위일 수 있다.
효소 환원 반응에 조효소를 임의적으로 첨가할 수 있으며, 조효소는 NADP+ 또는 NADPH이다.
포도당 탈수소 효소는 효소 환원 반응에 임의적으로 첨가될 수 있다.
효소 환원 반응은 물 또는 완충액 및 유기 용매로 구성된 혼합 용매인 용매의 존재하에 수행된다.
완충액은 인산염 완충액, 탄산염 완충액, Tri-HCl 완충액, 구연산염 완충액 또는 MOPS 완충액 중 하나 이상으로부터 선택된다.
유기 용매는 DMSO, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 이소프로판올, DMF, TBME, 디클로로메탄 및 비닐 아세테이트 중 하나 이상으로부터 선택된다.
본 발명의 효소 환원 반응의 생물학적 전환 과정에서 HPLC-MS 및 HPLC는 기질이 완전히 사용될 때까지 모니터링에 사용된다.
상기 효소 환원 반응 후 보호기를 추가로 도입하여 화학식 Cp의 화합물을 제조할 수 있다.
Figure pct00011
상기 R1의 정의는 상기와 동일하고, R2는 히드록시 보호기이며, 효소는 상기와 동일하다.
상기 화학식 B의 화합물은 아실화에 의해 화학식 A2의 화합물로부터 제조되며, 반응 화학식은 하기와 같다:
Figure pct00012
상기 X는 할로겐이고, R1의 정의는 상기와 동일하다.
상기 화학식 A2의 화합물은 할로겐화 반응에 의해 화학식 A1의 화합물로부터 제조되며, 반응식은 하기와 같다:
Figure pct00013
여기서 X는 할로겐이다.
본 발명은 탈보호(deprotection) 반응에 의해 화학식 C-1의 화합물로부터 제조된 화학식 C-i의 화합물인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 중간체의 제조 방법을 추가적으로 제공한다.
Figure pct00014
여기서 상기 R1, R2의 정의는 상기와 동일하다.
본 발명의 세 번째 측면은 환원 반응에 의해 화학식 CL의 화합물로부터 제조된 화학식 Cf의 화합물인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 중간체의 제조 방법을 제공한다.
Figure pct00015
여기서 R1, R2, R4 및 R5의 정의는 상기와 동일하다.
보다 바람직하게는, 환원 반응에 의해 화학식 C-i의 화합물로부터 제조된다.
Figure pct00016
환원 반응에서 환원제는 붕소 환원제, 알루미늄 환원제 또는 규소-리튬 환원제일 수 있다. 예를 들어 수소화붕소나트륨, 시아노수소화붕소나트륨(sodium cyanoborohydride), 수소화알루미늄리튬(lithium aluminum hydride), Red-Al, 수소화알루미늄리튬, 수소화알루미늄디이소부틸(diisobutyl aluminum hydride), 디이소프로필아미드리튬(lithium diisopropylamide), 헥사메틸디실라자이드리튬(lithium hexamethyldisilazide)이 사용될 수 있다.
상기의 환원 반응 전에 먼저 탈보호 반응을 수행할 수 있으며, 반응식은 하기와 같다:
Figure pct00017
또는 고리화 반응이 먼저 수행될 수 있으며, 반응식은 하기와 같다:
Figure pct00018
제조된 화학식 Cp3의 화합물 및 화학식 Cp4의 화합물은 상기 방법에 따라 카르보닐 환원 반응을 거치며, 환원제는 상기와 동일하다.
즉, 본 발명은 고리 닫힘 반응(ring closure reaction)에 의해 화학식 CL의 화합물로부터 제조된 화학식 Cp의 화합물인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 중간체를 제조하는 대체 방법을 제공한다.
Figure pct00019
여기서 R1, R2, R4, R5의 정의는 상기와 동일하다.
본 발명의 네 번째 측면은 고리 닫힘 반응에 의해 화학식 Cf의 화합물로부터 제조된 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 제조 방법을 제공한다.
Figure pct00020
여기서 R1, R2, R4, R5의 정의는 상기와 동일하다.
보다 바람직하게는, 이는 고리 닫힘 반응에 의해 화학식 Cf-1의 화합물로부터 제조된다.
Figure pct00021
고리 닫힘 반응을 위한 시약은 당해 분야에서 일반적인 산 또는 염기이다.
본 발명의 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 상기 제조 방법은 할로겐화 반응, 아실화 반응, 효소 환원 반응, 아민 화합물과의 반응, 환원 고리 닫힘 반응의 단계를 포함하고, 반응식은 하기와 같다:
Figure pct00022
상기 X는 할로겐이고; R1, R2, R4, R5의 정의는 상기와 동일하다.
보다 바람직하게는 할로겐화 반응, 아실화 반응, 효소 환원 반응, 아민 화합물과의 반응, 탈보호 반응, 환원 고리 닫힘 반응에 의해 제조된다.
Figure pct00023
여기서 환원 반응에 의해 키랄성을 구축하는 방법은 효소법이고, 효소의 정의는 상기와 동일하다.
본 발명에서 제공하는 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 제조 방법은 효소법을 채택하여 키랄성을 구축하며, 높은 수율과 높은 광학 순도로 생성물을 제조할 수 있다. 상기 유럽 출원과 같은 선행 기술은 카르보닐 환원 효소 폴리펩티드 또는 카르보닐 환원 효소 폴리펩티드를 함유하는 미생물에 의해 카르보닐이 히드록시로 환원된다는 것을 개시하였지만, 본 발명에서 사용되는 효소는 수득된 생성물의 더 높은 광학적 순도와 더 적합한 반응 조건이라는 더욱 현저한 이점을 갖는다. 본 발명의 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 제조 방법은 산업 생산에 적합하다.
본 발명을 더욱 이해하기 위하여, 본 발명에서 제공하는 헥사하이드로푸로-푸라놀 유도체의 제조 방법, 이의 중간체 및 이의 제조 방법을 하기 실시예와 결합하여 상세히 설명한다. 이들 실시예의 내용은 본 발명의 범위 또는 본 발명의 청구 범위를 제한하기보다는 본 발명의 특징을 상세하게 설명하기 위한 것으로 이해되어야 할 것이다.
실시예 1:
Figure pct00024
화학식 A1의 화합물과 디클로로메탄을 반응 플라스크에 첨가하고 식힌 후 브롬(bromine)의 무게를 재어 디클로로메탄으로 희석하여, 희석된 브롬을 깔때기에 옮겨 천천히 적하하고(added dropwise) 내부 온도를 조절하였다. 적하 후 온도를 유지한 상태에서 용액을 계속 반응시키고 내부 온도를 조절하였다. 물을 첨가하고 온도를 조절하고 용액을 방치하여 분액을 수행하였다. 하부 유기상을 다른 반응 플라스크에 넣고, 물을 첨가하여 추출하고 분액을 수행하였다. 하부 유기상을 다른 반응 플라스크에 넣고 5% NaHCO3 수용액을 첨가하여 추출하고 분액을 수행하였다. 하부 유기상을 다른 반응 플라스크에 넣고, 상부 수성상을 결합하고 디클로로메탄을 첨가하여 추출하고, 분액을 수행하였다. 수성상을 버리고 유기상을 결합하고 물을 첨가하여 추출하고 분액을 수행하였다. 수성상을 버리고 하부 유기상을 회전 증발기에 넣어 용매가 배출되지 않을 때까지 농축하고 수율은 90-95%이다.
실시예 2:
Figure pct00025
아세톤, 화학식 A2의 화합물 (X는 브롬), 벤조산을 반응 플라스크에 넣고 혼합물을 교반하고 냉각시켰다. 트리에틸아민을 탱크에 첨가하고 천천히 적하하기 시작하고 내부 온도를 조절하였다. 적하 후, 혼합물을 실온까지 온도를 올리고 교반하여 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 흡입 여과를 수행한 후 여과액을 증류 플라스크로 옮겨 감압 증류하고, 증류 플라스크에 페이스트형 고체가 나타날 때까지 온도를 50-60℃로 조절한 다음 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 에틸 아세테이트를 증류 플라스크에 첨가하고 페이스트형 고체가 용해될 때까지 교반하고, 증류 플라스크 내의 액체를 반응 플라스크로 옮겼다. 반응 플라스크에 포화 염수를 첨가하여 세척하고, 용액을 방치하여 분액을 수행하였다. 수층을 혼합하고, 에틸 아세테이트를 첨가하여 추출하고, 용액을 방치하여 층으로 분리되도록 하였다. 수층을 버리고, 유기층을 혼합하고, 유기층에 무수 황산나트륨을 첨가하고 교반 건조시키고, 흡입 여과를 수행하였다. 여과액을 반응 플라스크로 옮기고 감압하에서 증류시키고, 반응액에 페이스트형 고체가 나타날 때까지 온도를 50-60℃로 조절하였다. 에틸 아세테이트의 일부를 첨가하고, 용해될 때까지 교반 및 환류하고, 온도를 50-60℃로 조절하였다. n-헵탄을 탱크에 첨가하고 반응 용기에 완전히 투입될 때까지 반응 용기로 천천히 적하하였다. 천천히 냉각시킨 후, 반응액을 온도를 유지하면서 교반하고, 흡입 여과를 수행하고 목표 고체 조생성물(crude product)을 건조시켰으며, 수율은 70-75%이다.
실시예 3:
알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포 제조
재조합 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 구체적인 제조 방법은 사카로마이세스 쿠드리아브제비(Saccharomyces kudriavzevii)에서 유래한 알도-케토 환원 효소의 유전자 서열을 선택하여 인공적으로 설계하고, 전체 유전자에 의해 인공적으로 설계된 서열을 합성하고 (Genscript Biotechnology Co., Ltd.), 발현 벡터 pET28a의 Nde I 및 Xho I 효소 분해 부위에 클로닝하고 숙주 대장균 BL21 (DE3) 수용성 세포(competent cells)로 형질 전환시키고; 양성 형질 전환체(transformants)를 골라 내고 서열 분석 및 식별하여 재조합 발현 벡터를 수득하고; 재조합 발현 벡터를 대장균 BL21 (DE3) 균주로 형질 전환하여 재조합 알도-케토 환원 효소의 발현을 유도할 수 있는 재조합 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아를 수득하는 것이다.
재조합 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아를 카나마이신을 포함하는 LB 배지에 접종하고 37℃에서 밤새 배양하여 종자 배양액을 수득하였다. 종자 배양액을 카나마이신이 포함된 TB 배지에 접종하였고, 접종 부피는 카나마이신을 포함하는 TB 배지 부피의 1%이었다; 그런 다음 37℃에서 2-5시간 동안 배양하였다. 멸균 IPTG를 첨가하여 유도체화(inducing)하고 IPTG의 최종 농도는 0.1mM이고, 접종물은 25℃에서 20시간 동안 계속 배양하였다. 마지막으로 Saccharomyces kudriavzevii에서 유래한 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포를 고속 원심 분리로 수득하였다. 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포를 초음파 방법으로 초음파 파쇄하여 Saccharomyces kudriavzevii에서 유래한 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포의 파쇄 효소액을 수득하였다. 알도-케토 환원 효소는 아미노산 서열이 서열 번호 1로 표시되는 단백질이고, 알도-케토 환원 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열표에서 서열 번호 2로 표시된다.
발현 유도 후, 45kDa에서 명확한 단백질 밴드가 나타났는데, 이는 알도-케토 환원 효소가 재조합 박테리아에서 고도로 발현되었음을 의미한다.
알도-케토 환원 효소의 순수 단백질에 대한 효소 활성을 측정하였으며, 반응계는 부피가 0.25ml이고, Tris-HCl, pH 8.0, 2mmol/L NADPH, 0.1mmol/L 기질
Figure pct00026
및 적절한 양의 효소를 포함한다. 340nm에서 흡광도 감소를 측정하였다. 효소 활성 단위 (U)는 상기 조건하에서 분당 1umol NADPH의 산화를 촉매하는 데 필요한 효소의 양으로 정의되었다.
그 결과, 유전자 조작된 재조합 알도-케토 환원 효소는 유럽 특허 (EP2634180A1)의 서열보다 20% 이상 더 높은 활성을 가지고 있으며, 비-돌연변이(non-mutated) 알도-케토 환원 효소보다 50% 이상 높은 활성을 나타내었다.
본 발명의 실시예에서 사용한 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포는 모두 이 방법으로 제조되었다.
본 발명의 실시예 및 비교예에서 사용된 포도당 탈수소 효소는 모두 sigma-aldrich에서 구입한 시판 효소이다.
거울상 이성질체(enantiomer) 과발현의 ee 값에 대한 알고리즘은 하기와 같다:
ee(syn)=([R,R]-[S,S])/([R,R]+[S,S])
ee(anti)=([R,S]-[S,R])/([R,S]+[S,R])
de={([R,S]+[S,R])-([R,R]+[S,S])}/{([R,S]+[S,R])+([R,R]+[S,S])}.
효소 환원 반응은 하기와 같은 반응식을 갖는다:
Figure pct00027
단계 1: 반응은 1L 진탕 플라스크(shake flask)에서 수행되었고, 반응계는 300mL의 부피로 조절되었다. 진탕 플라스크에서 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아 전체 세포의 파쇄 효소액을 멸균된 인산 칼륨 완충액 260mL에 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 진탕 플라스크에 첨가하고, 세포를 50분 동안 초음파로 파쇄한 다음, 포도당 25g, NADP+ 0.42g을 진탕 플라스크에 첨가하였다. 8g의 반응물의 무게를 재어 40mL의 DMSO에 용해시킨 후 기질이 용해된 DMSO 용액을 진탕 플라스크에 천천히 부었다. 반응 2시간 후 포도당 12g을 추가로 첨가하고, 공급된 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아 전체 세포의 양은 75g/L, 공급된 포도당 탈수소 효소량은 25mg/L이고, 전환 시스템의 온도는 37℃로 조절되었다. 전환 반응은 셰이커에서 수행되었고, 셰이커의 회전 속도는 200r/min으로 제어되었으며, 전환 시간은 12시간이고 전환율 97.8%로 목표 생성물의 전환액을 수득하였다.
단계 2: 단계 1에서 수득한 목표 생성물의 전환액을 정제하고, 동일한 부피의 에틸 아세테이트를 반응계에 첨가하고, 추출을 37℃에서 15분 동안 수행한 후, 3회 반복하여 에틸 아세테이트 층을 원심 분리하여 모으고, 모아진 에틸 아세테이트 층에 5% 무수 황산마그네슘을 첨가하여 15분간 진탕시킨 후 여과하여 황산마그네슘을 제거하였다. 이후, 물을 제거한 후 에틸 아세테이트 층을 승온에서 감압 농축하여 de값이 96.2%이고, ee(anti)값이 99.5%인 목표 생성물 7.41g을 수득하였다.
실시예 4:
Figure pct00028
DCM (80ml) 및 AlCl3 (5.6g)을 250mL의 4구 플라스크에 연속적으로 첨가하고, N-메틸아닐린 (17.1g)을 적하하였고, 적하한 후 화학식 Cp1의 화합물 (80mL의 DCM에 용해된 Cp1 8.0g)의 용액을 적하 하였다. 적하 후 온도를 유지 하였다. 반응액을 묽은 황산 (200mL 물에 용해된 황산 10.1g)에 적하하고, 적하하면서 교반하였다. 적하 후 pH를 측정하였다. 반응 혼합물을 교반하고 층으로 분리한 후 분액을 수행하였다. 산성 수층을 100mL DCM으로 추출하였다. 혼합물을 층으로 분리하고, 유기층을 혼합하고 5% NaHCO3 용액으로 세척하였다. 분액을 수행하고 유기층을 물 100mL로 세척하였다. 분액을 수행하고 유기층을 Na2SO4로 건조시켰다. 유기층을 흡입 여과하고, 여과액을 50℃에서 감압 농축하여 황색 유성 물질을 수득하고, EA 27mL 및 헵탄 27mL를 첨가하고 용해될 때까지 60℃에서 교반하였다. 온도를 천천히 0℃로 낮추어 결정화시켰다. 수득된 결정을 흡입 여과하고 혼합물 20mL (EA:헵탄=1:1)로 헹구고 건조하여 화학식 Cp2의 화합물 (순도>98%)의 백색과 같은 고체 10g을 수득하였다.
실시예 5:
Figure pct00029
반응 플라스크에 화학식 Cp2의 화합물 (3.57g)과 메탄올 (15.00mL)을 연속적으로 첨가하고, 교반하면서 부식성(caustic) 소다액 0.15g을 적하하고, 온도를 -20~30℃으로 유지한 후 5% 황산을 적하하여 pH를 조절하고 중탄산나트륨 0.1g을 첨가하고 혼합물을 30-35℃의 수조(water bath)에서 감압 농축하여 메탄올을 제거하였다. 감압 후 물을 첨가한 다음 DCM을 첨가하여 추출하고 유기상을 결합하고 40℃에서 감압 농축하여 약 99%의 수율로 2.50g의 생성물을 수득하였다.
실시예 6:
Figure pct00030
화학식 Cp3 (2.50g) 및 THF (20.00mL)의 화합물을 연속적으로 반응 플라스크에 첨가하고, 내부 온도를 냉각시키고 LiAlH4 (1.50g)를 배치(batches)로 천천히 첨가하고, 첨가 후 혼합물을 천천히 실온 (20-25℃)으로 가온시키고 온도를 유지하면서 교반한다. 반응 후 내부 온도를 냉각시키고 10% 묽은 염산을 천천히 적하하여 pH를 조절하고, 첨가 후 용액을 천천히 실온 (20-25℃)으로 가온하고 교반하였다. 내부 온도를 냉각시키고 4% NaOH 수용액을 천천히 첨가하여 반응 용액의 pH를 조절하였다. pH를 조절한 후 톨루엔을 첨가하고 교반하고 추출하였다. 톨루엔층을 혼합하고, 수층을 취하고, DCM을 수층에 첨가하여 교반하에 추출하고 DCM 층을 혼합하고, 혼합된 DCM 층을 취하였다. 적절한 양의 무수 황산나트륨을 DCM 층에 첨가하여 건조시켰다. 1.0g의 무색 유상 물질을 40℃에서 감압 농축된 후 80.0%의 수율로 수득하였다.
실시예 7:
Figure pct00031
반응 플라스크에 화학식 Cp2 (3.57g), THF (25.00mL), 테트라메틸디실록산(tetramethyldisiloxane) (1.34g), 티타늄 테트라이소프로폭사이드(tetraisopropoxide) (2.84g)의 화합물을 연속적으로 첨가하고 20-30℃에서 6-24시간 동안 교반한 다음 EA (50 mL)를 첨가하고 5% 황산을 적하하여 pH를 조절하고 혼합물을 방치하여 층으로 분리하였다. 수층을 EA (20 mL)로 1회 더 추출하고 유기층을 혼합하여 5% 중탄산나트륨을 첨가한 후 30-45℃ 수조에서 감압 농축하여 EA를 제거하였다. 감압 후 EA (5 mL)를 첨가하여 슬러리를 만든 다음 용액을 여과하고 건조하여 화학식 Cp4의 백색 또는 백색과 같은 고체 화합물 2.20g을 약 90%의 수율로 수득하였다.
실시예 8:
Figure pct00032
화학식 B의 고체 화합물 (R1은 벤조일) (20.00g)을 500mL의 건조하고 깨끗한 4구 플라스크에 첨가하고, 톨루엔을 첨가하고 교반하고, 질소 보호하에 진공 교체를 수행하고, 질소 보호하에 혼합물을 냉각시켰다. 질소 보호하에 톨루엔을 정압 깔때기에 첨가하고, 70% Red-Al 용액 (26.50g, 26.00mL)을 질소 보호하에 정압 깔때기에 첨가하였다. 준비가 완료되면 반응액을 -15~-10℃로 냉각한 후 Red-Al을 첨가하고 온도를 조절하고 적하 후 온도를 유지하였다. 순수(pure water)와 에틸 아세테이트를 1000mL의 깨끗한 4구 플라스크에 연속적으로 첨가하고, 황산을 1000mL의 깨끗한 4구 플라스크에 교반하면서 첨가한 다음, 용액을 냉각시키고, 온도를 일정하게 유지한 후 반응액을 황산 용액에 적하하고 반응액의 온도를 조절하고 황산 용액을 0~10℃의 온도로 조절한 후 적하 후 에틸 아세테이트를 첨가하고 교반하였다; 깨끗한 1000mL의 4구 플라스크에 10% 중탄산나트륨 수용액을 첨가하고, 용액을 냉각시키고 교반을 중단하고 반응액을 방치하여 층으로 분리하고, 상부 유기층을 10% 중탄산나트륨 수용액으로 옮기고 교반하였다; 하부 산성 수층을 에틸 아세테이트를 첨가하여 추출한 다음 방치하여 층으로 분리하고, 산성 수층은 버리고, 두 번째 에틸 아세테이트 층은 10% 중탄산나트륨 수용액으로 옮겨 교반하고, 온도는 조절하고 용액을 방치하여 층으로 분리하였다. 에틸 아세테이트를 알칼리 수층에 첨가하여 추출하고 교반하고, 온도를 조절하였다. 순수를 알카리 세척된 유기층에 첨가하여 세척하고 교반하고, 온도를 조절하고, 용액을 층으로 분리하고, 수세된(water-washed) 유기층을 수득하여 추가 사용을 하고 수세된 수층을 에틸 아세테이트로 추가로 추출하고, 방치하여 층으로 분리되도록 하였다. 수층을 버리고 유기층을 혼합하고 황산나트륨으로 건조하고 흡입 여과한 다음 에틸 아세테이트로 헹구었다. 여과액을 40-70℃에서 감압 농축하여 84.33%의 수율로 약 17g의 유성 물질을 수득하였다.
실시예 9:
Figure pct00033
메탄올 (10.00 mL) 및 화학식 C의 화합물 (R1은 벤조일) (1.00 g)을 반응 플라스크에 연속적으로 첨가하고, -15~-5℃로 냉각하고, 수산화나트륨 수용액 (10.00 mL)을 적하하고, 적하 후 원료가 완전히 반응할 때까지 온도를 유지하면서 용액을 교반하였다. 10% 황산 수용액 (4.00g)을 적하하고, 적하 후 온도를 유지하면서 용액을 계속 반응시키고, 온도 변화가 시작된 후 포화 탄산나트륨 수용액을 첨가하여 pH를 조절하였다. 승온에서 감압 증류하여 메탄올을 제거한 후, 메틸 tert-부틸에테르를 첨가하여 추출하고 유기층을 분리하고, 포화될 때까지 수층에 염화나트륨을 첨가하였다. 디클로로메탄을 더 첨가하여 추출하고, 수층을 분리하여 회수하고 유기층을 감압 증류하여 디클로로메탄을 제거하고 0.38g의 생성물을 73.77%의 수율로 수득하였다.
실시예 10:
Figure pct00034
화학식 Cp2 (3.50g) 및 THF (20.00mL)의 화합물을 연속적으로 반응 플라스크에 첨가하고 내부 온도를 냉각시킨다. LiAlH4 (1.50g)를 배치로 천천히 첨가하고 첨가 후 혼합물을 천천히 실온(20-25℃)까지 가온하여 온도를 유지하면서 교반한다. 반응이 완료된 후 내부 온도를 냉각시키고 10% 묽은 염산을 천천히 적하하여 pH를 조절하고, 첨가 후 용액을 천천히 상온(20-25℃)까지 가온하여 교반하였다. 내부 온도를 냉각시키고 4% NaOH 수용액을 천천히 첨가하여 반응액의 pH를 조절하였다. pH를 조절한 후 톨루엔을 첨가하고 교반하여 추출하고, 톨루엔층을 혼합하고, 수층을 취하고, DCM을 교반하에 수층에 첨가하고 추출하여, DCM층을 혼합하고, 결합된 DCM층을 취하고, 적절한 양의 무수 황산나트륨을 DCM층에 첨가하여 건조시켰다. 40℃에서 감압 농축된 후 1.0g의 무색 유상 물질을 80.0%의 수율로 수득하였다.
실시예 11:
Figure pct00035
효소의 제조는 실시예 3과 같다.
단계 1: 반응은 5L 비커에서 수행되었고 반응계는 2L의 부피로 조절되었다. 진탕 플라스크에서 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포를 1.7L의 멸균된 인산칼륨 완충액에서 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 진탕 플라스크에 첨가하고, 세포를 50분 동안 초음파로 파쇄한 다음, 포도당 25g, NADP+ 0.42g을 비커에 첨가하였다. 이어서 기질 80g의 무게를 재어 300mL의 DMSO에 용해시키고 기질이 용해된 DMSO 용액을 진탕 플라스크에 천천히 부었다. 반응 2시간 후 포도당 12g을 더 첨가하고, 공급된 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포의 양은 75g/L, 공급된 포도당 탈수소 효소량은 25mg/L, 전환계의 온도는 37℃로 조절되었다. 전환 반응은 비커에서 수행되었고, 마그네톤(magneton)의 회전 속도는 200r/min으로 조절되었으며, 전환 시간은 12시간이고, 97.8%의 전환율로 목표 생성물의 전환액을 수득하였다.
단계 2: 단계 1에서 수득한 화학식 VIII의 화합물인 다루나비르의 중간체를 포함하는 전환액을 정제하고, 정제 단계는 실시예 3과 같으며 77.10g의 목표 화합물을 수득하였다. 제조된 목표 화합물의 de값은 95.3%이고, ee(anti) 값은 99.6%이다.
실시예 12:
Figure pct00036
단계 1: 반응은 1L 진탕 플라스크에서 수행되었고, 반응계는 300mL의 부피로 조절되었다. 진탕 플라스크에서 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포를 멸균된 탈이온수 250mL에 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 진탕 플라스크에 첨가하고, 10mL의 2.5mol/L 포도당, 0.26g의 NADP+를 첨가하였다. 그 후 기질 10g의 무게를 재어 부틸아세테이트 30mL에 녹인 후, 기질이 용해된 부틸아세테이트 용액을 진탕 플라스크에 천천히 부었다. 반응 1시간 후 2.5mol/L의 포도당 10mL를 더 첨가하고, 공급된 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포의 양은 75g/L이고, 공급된 포도당 탈수소 효소량은 25mg/L이며, 전환계의 온도는 37℃로 조절되었다. 전환 반응은 셰이커에서 수행되었고, 셰이커의 회전 속도는 200r/min으로 제어되었으며, 전환 시간은 12시간이고, 전환율 97.8%로 목표 생성물의 전환액을 수득하였다.
단계 2: 단계 1에서 수득한 목표 화합물의 전환액을 정제하고, 동일한 부피의 에틸 아세테이트를 반응계에 첨가하고, 추출을 37℃에서 15분 동안 수행하고, 3회 반복하여 에틸 아세테이트층을 원심 분리하여 모으고, 모아진 에틸 아세테이트층에 5% 무수 황산마그네슘을 첨가하여 15분간 진탕시킨 후, 여과하여 황산마그네슘을 제거하였다. 그 다음 물을 제거한 후 에틸 아세테이트층을 승온에서 감압 농축하여 목표 화합물 9.55g을 수득하였고, 제조된 목표 화합물은 de값이 99.1%이고, 거울상 이성질체의 ee(anti)값은 99.7%이다. 1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 2.269~2.301 (m, 1H, J=6Hz), 2.367~2.404 (m, 1H), 2.954~2.993 (m, 1H, J=6Hz), 3.438~3.466 (m, 1H), 3.520~3.549 (m, 1H), 4.227~4.269 (m, 1H), 4.298~4.326 (m, 1H), 4.391~4.420 (m, 1H). MS(ESI):m/z 210.03 [M+H]+.
실시예 13:
Figure pct00037
단계 1: 반응은 5L 비커에서 수행되었고 반응계는 2L의 부피로 조절되었다. 비커에서 알도-케토 환원효소의 유전자 조작 박테리아의 전체 세포를 1.5L의 멸균된 탈이온수에 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 첨가하고, 2.5mol/L 포도당 100mL, NADP+ 3g을 첨가하였다. 그 다음 기질 100g의 무게를 재어 300ml의 부틸아세테이트에 용해시키고 기질이 용해된 부틸아세테이트 용액을 천천히 비커에 부었다. 반응 1시간 후, 2.5mol/L 포도당 100 mL를 더 첨가하고, 공급된 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포의 양은 100g/L, 공급된 포도당 탈수소 효소의 양은 25mg/L이었다. 전환계의 온도는 28℃로 제어되었다. 전환 반응은 비커에서 수행되었고, 마그네톤의 회전 속도는 200r/min으로 조절되었으며, 전환 시간은 12시간이고, 97.8%의 전환율로 목표 전환액을 수득하였다.
단계 2 : 단계 1에서 수득한 목표 전환액을 정제하고, 정제 단계는 실시예 3과 같으며 목표물 9.42g을 수득하였다. 제조된 목표물의 de값은 96.9%이고, 거울상 이성질체의 ee(anti)값은 99.4%이다.
실시예 14:
Figure pct00038
단계 1: 반응은 1L 진탕 플라스크에서 수행되었고, 반응계는 300mL의 부피로 조절되었다. 진탕 플라스크에서 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포를 멸균된 탈이온수 250mL에 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 첨가하고, 10mL의 2.5mol/L 포도당, 0.26g의 NADP+를 첨가하였다. 이어서 기질 10g의 무게를 재어 부틸아세테이트 30mL에 용해시키고 기질이 용해된 부틸아세테이트 용액을 진탕 플라스크에 천천히 부었다. 1시간 반응 후 2.5mol/L의 포도당 10mL를 더 첨가하고, 공급된 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포의 양은 75g/L, 공급된 포도당 탈수소 효소의 양은 25mg/L, 전환계의 온도는 37℃로 제어되었다. 전환 반응은 셰이커에서 수행되었고, 셰이커의 회전 속도는 200r/min으로 제어되었으며, 전환 시간은 12시간이며, 전환율 97.8%로 목표 전환액을 수득하였다.
단계 2: 단계 1에서 수득한 목표 화합물의 전환액을 정제하고, 정제 단계는 실시예 3과 같으며 9.37g의 목표물을 수득하였다. 제조된 목표 화합물의 de값은 97.1%이고, ee(anti)값은 99.5%이다.
실시예 15:
Figure pct00039
단계 1: 반응은 5L 비커에서 수행되었고 반응계는 2L의 부피로 조절되었다. 비커에서 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포를 1.6L의 멸균된 탈이온수에 현탁시켰다. 포도당 탈수소 효소를 첨가하고, 2.5mol/L 포도당 100mL, NADP+ 2.5g을 첨가하였다. 이어서 기질 100g의 무게를 재어 부틸아세테이트 200mL에 용해시키고 기질이 용해된 부틸아세테이트 용액을 비커에 천천히 부었다. 1시간 반응 후, 100mL의 2.5mol/L 포도당을 추가로 첨가하고, 공급된 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포의 양은 50g/L이고, 공급된 포도당 탈수소 효소의 양은 25mg/L이다. 전환계의 온도는 25℃로 제어되었다. 전환 반응은 비커에서 수행되었고, 마그네톤의 회전 속도는 200r/min으로 조절되었으며, 전환 시간은 12시간이고 전환율 97.8%로 목표 화합물의 전환액을 수득하였다.
단계 2: 단계 1에서 수득한 목표 화합물의 전환액을 정제하고, 정제 단계는 실시예 3과 같으며 목표 화합물 93.1g을 수득하였다. 제조된 목표 화합물의 de값은 95.6%이고, ee(anti)값은 99.6%이다.
실시예 16: 비교예
Figure pct00040
단계 1: 반응은 1L 진탕 플라스크에서 수행되고 반응계는 300mL의 부피로 조절되었다. 진탕 플라스크에서 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포를 멸균된 탈이온수 250mL에 현탁시켰다. 사용된 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포의 알도-케토 환원 효소 유전자의 암호화 서열은 유럽 특허 EP2634180에 공개된 서열 (즉, 특허 EP2634180에 표시된 서열 번호 12)과 같았으며, 서열은 전체 유전자 (Genscript Biotechnology Co., Ltd.에서 합성)로 합성되었고, 제조 방법은 실시예 3과 같다. 포도당 탈수소 효소를 첨가하고 10mL의 2.5mol/L 포도당, 0.26g의 NADP+를 첨가하였다. 그런 다음 기질 10g의 무게를 재어 부틸아세테이트 30mL에 용해시키고 기질이 용해된 부틸아세테이트 용액을 천천히 비커에 부었다. 1시간 반응 후 2.5mol/L의 포도당 10mL를 더 첨가하고, 공급된 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아 전체 세포의 양은 75g/L, 공급된 포도당 탈수소 효소의 양은 25mg/L, 전환계의 온도는 37 ℃로 제어되었다. 전환 반응은 셰이커에서 수행되었으며 셰이커의 회전 속도는 200r/min으로 제어되었고 전환 시간은 12시간이었다.
정제 단계는 실시예 3과 같으며, 8.11g의 목표 화합물을 수득하였다. 제조된 목표 화합물의 de값은 85.1%이고, 거울상 이성질체의 ee(anti)값은 93.3%이다.
실시예 17: 비교예
Figure pct00041
단계 1: 반응은 1L 진탕 플라스크에서 수행되고 반응계는 300 mL의 부피로 조절되었다. 진탕 플라스크에서 사카로마이세스 쿠드리아브제비(Saccharomyces kudriavzevii)의 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포를 250mL의 멸균된 탈이온수에 현탁시켰다. 사용된 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아 전체 세포의 알도-케토 환원 효소 유전자의 암호화 서열은 서열 번호 3에 나타나 있고 (알도-케토 환원 효소 유전자의 암호화 서열은 인위적으로 설계되지 않음), 서열은 전체 유전자 (Genscript Biotechnology Co., Ltd.에서 합성)로 합성하였으며, 제조 방법은 실시예 3과 같다. 포도당 탈수소 효소를 첨가하고 10mL의 2.5mol/L 포도당, 0.26g의 NADP+를 첨가하였다. 그런 다음 기질 10g의 무게를 재어 부틸아세테이트 30mL에 용해시킨 후 기질이 용해된 부틸아세테이트 용액을 천천히 비커에 부었다. 반응 1시간 후 2.5mol/L의 포도당 10mL를 더 첨가하고, 공급된 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아 전체 세포의 양은 75g/L, 공급된 포도당 탈수소 효소의 양은 25mg/L, 전환계의 온도는 37℃로 제어되었다. 전환 반응은 셰이커에서 수행되었으며 셰이커의 회전 속도는 200r/min으로 제어되었으며 전환 시간은 12시간이었다.
정제 단계는 실시예 3과 같으며, 7.73g의 목표 화합물을 수득하였다. 제조된 목표 화합물의 de값은 79.6%이고, 거울상 이성질체의 ee(anti)값은 88.7이다.
서열 번호 1의 서열번호:
Met Ser Asp Leu Phe Lys Pro Ala Pro Glu Pro Pro Thr Glu Leu Gly
Arg Leu Arg Val Leu Ser Lys Thr Ala Gly Ile Arg Val Ser Pro Leu
Ile Leu Gly Gly Ala Ser Ile Gly Asp Ala Trp Ser Gly Phe Met Gly
Ser Met Asn Lys Glu Gln Ala Phe Glu Leu Leu Asp Ala Phe Tyr Glu
Ala Gly Gly Asn Cys Val Asp Thr Ala Asn Ser Tyr Gln Asn Glu Glu
Ser Glu Ile Trp Ile Gly Glu Trp Met Lys Ser Arg Lys Leu Arg Asp
Gln Ile Val Ile Ala Thr Lys Phe Thr Gly Asp Tyr Lys Lys Tyr Glu
Val Gly Gly Gly Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Gly Asn His Lys His Ser
Leu His Val Ser Val Arg Asp Ser Leu Arg Lys Leu Gln Thr Asp Trp
Ile Asp Ile Leu Tyr Val His Trp Trp Asp Tyr Met Ser Ser Ile Glu
Glu Val Met Asp Ser Leu His Ile Leu Ile Gln Gln Gly Lys Val Leu
Tyr Leu Gly Val Ser Asp Thr Pro Ala Trp Val Val Ser Ala Ala Asn
Asn Tyr Ala Thr Ser His Gly Lys Thr Pro Phe Ser Ile Tyr Gln Gly
Lys Trp Asn Val Leu Asn Arg Asp Phe Glu Arg Asp Ile Ile Pro Met
Ala Arg His Phe Gly Met Ala Leu Ala Pro Trp Asp Val Met Gly Gly
Gly Lys Phe Gln Ser Lys Lys Ala Met Glu Glu Trp Lys Lys Asn Gly
Glu Gly Leu Arg Thr Ala Val Gly Gly Pro Glu Gln Thr Glu Leu Glu
Val Lys Ile Ser Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala Glu Glu His Gly Thr
Glu Ser Val Thr Ala Ile Ala Ile Ala Tyr Val Arg Ser Lys Ala Lys
Asn Val Phe Pro Leu Val Gly Gly Arg Lys Ile Glu His Leu Lys Gln
Asn Ile Glu Ala Leu Ser Ile Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ile Glu Tyr
Leu Glu Ser Ile Val Thr Phe Asp Val Gly Phe Pro Lys Ser Asn Ile
Gly Asp Asp Pro Ala Val Thr Lys Lys Leu Ser Pro Leu Thr Ser Met
Ser Ala Arg Ile Ser Phe Asp Asn
서열 번호 2의 서열 번호:
atgagcgatc tgtttaaacc ggcgccggaa ccgccgaccg aactgggccg cctgcgcgtg 60
ctgagcaaaa ccgcgggcat tcgcgtgagc ccgctgattc tgggcggcgc gagcattggc 120
gatgcgtgga gcggctttat gggcagcatg aacaaagaac aggcgtttga actgctggat 180
gcgttttatg aagcgggcgg caactgcgtg gataccgcga acagctatca gaacgaagaa 240
agcgaaattt ggattggcga atggatgaaa agccgcaaac tgcgcgatca gattgtgatt 300
gcgaccaaat ttaccggcga ttataaaaaa tatgaagtgg gcggcggcaa aagcgcgaac 360
tattgcggca accataaaca tagcctgcat gtgagcgtgc gcgatagcct gcgcaaactg 420
cagaccgatt ggattgatat tctgtatgtg cattggtggg attatatgag cagcattgaa 480
gaagtgatgg atagcctgca tattctgatt cagcagggca aagtgctgta tctgggcgtg 540
agcgataccc cggcgtgggt ggtgagcgcg gcgaacaact atgcgaccag ccatggcaaa 600
accccgttta gcatttatca gggcaaatgg aacgtgctga accgcgattt tgaacgcgat 660
attattccga tggcgcgcca ttttggcatg gcgctggcgc cgtgggatgt gatgggcggc 720
ggcaaatttc agagcaaaaa agcgatggaa gaatggaaaa aaaacggcga aggcctgcgc 780
accgcggtgg gcggcccgga acagaccgaa ctggaagtga aaattagcga agcgctgaac 840
aaaattgcgg aagaacatgg caccgaaagc gtgaccgcga ttgcgattgc gtatgtgcgc 900
agcaaagcga aaaacgtgtt tccgctggtg ggcggccgca aaattgaaca tctgaaacag 960
aacattgaag cgctgagcat taaactgacc ccggaacaga ttgaatatct ggaaagcatt 1020
gtgacctttg atgtgggctt tccgaaaagc aacattggcg atgatccggc ggtgaccaaa 1080
aaactgagcc cgctgaccag catgagcgcg cgcattagct ttgataacta a 1131
서열 번호 3의 서열 번호:
atgtctgatg tatttggacc tgcacctgaa ccacctaccg agttaggacg tctaagagtt 60
ctctctaaaa cagctggtat aagagtctct ccgctaatat tgggaggtat gtcgattggt 120
gacgcctggt caggattcat ggggtcaatg aacaaggagc gggcttttga gctgcttgat 180
gcctttttcg aggcaggtgg aaacttcatt gatactgcaa ataattacca aaatgaacag 240
tcagaggcat ggataggtga atggatggtt tcaagaaaat tgcgtgacca aattgttatt 300
gccaccaaat tcaccacaga ctataagaag tatgaagtgg gcaagggcag aagtgccaac 360
ttctgtggta atcacaagca tagtttacac gtaagtgtga gagattctct tcgcaaattg 420
cagactgatt ggattgacat tctctatgtt cactggtggg attatatgag ttcgatcgag 480
gaagttatgg atagtctgca tattcttgtg cagcagggca aggtcctcta cctgggagta 540
tctgatacac ctgcatgggt cgtgtctgct gcaaattact acgctacctc tcacgggaaa 600
actcccttca gcatctatca aggtaaatgg aatctgttga atagggactt tgagcgtgaa 660
attattccaa tggctaggca ttttggtatg gctctcgctc catgggatgt catgggaggg 720
ggaagatttc agagcaaaaa agctttagaa gaacggaaga agagtggaga gggcctgcgt 780
agctttgttg gtacatctga acagacggat gcagaggtta agatcagcga ggcattgtcg 840
aaggttgctg aggaacatgg cattgagtct gtcacagcta ttgccattgc ctatgtccgc 900
tccaaagcga agcatgtttt cccattggtt ggaggaagga aaattgagca cctcaaacaa 960
aatattgagg cgttgagtat taaattgaca ccaggacaga tagaatatct agaaagcatt 1020
gtcccattcg atgttgggtt ccctagcaat ttcatcggag atgatcctgc agttactaag 1080
aaacttgcat tccttccagc aatgtctgcc aagattgctt ttgacgatta g 1131
SEQUENCE LISTING <110> JIANGSU RUIKE MEDICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY CO.,LTD <120> Method for preparing hexahydrofuro-furanol derivative, Intermediate thereof and preparation method thereof <130> ESP1V201528ZX <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 376 <212> PRT <213> artifical sequence <400> 1 Met Ser Asp Leu Phe Lys Pro Ala Pro Glu Pro Pro Thr Glu Leu Gly 1 5 10 15 Arg Leu Arg Val Leu Ser Lys Thr Ala Gly Ile Arg Val Ser Pro Leu 20 25 30 Ile Leu Gly Gly Ala Ser Ile Gly Asp Ala Trp Ser Gly Phe Met Gly 35 40 45 Ser Met Asn Lys Glu Gln Ala Phe Glu Leu Leu Asp Ala Phe Tyr Glu 50 55 60 Ala Gly Gly Asn Cys Val Asp Thr Ala Asn Ser Tyr Gln Asn Glu Glu 65 70 75 80 Ser Glu Ile Trp Ile Gly Glu Trp Met Lys Ser Arg Lys Leu Arg Asp 85 90 95 Gln Ile Val Ile Ala Thr Lys Phe Thr Gly Asp Tyr Lys Lys Tyr Glu 100 105 110 Val Gly Gly Gly Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Gly Asn His Lys His Ser 115 120 125 Leu His Val Ser Val Arg Asp Ser Leu Arg Lys Leu Gln Thr Asp Trp 130 135 140 Ile Asp Ile Leu Tyr Val His Trp Trp Asp Tyr Met Ser Ser Ile Glu 145 150 155 160 Glu Val Met Asp Ser Leu His Ile Leu Ile Gln Gln Gly Lys Val Leu 165 170 175 Tyr Leu Gly Val Ser Asp Thr Pro Ala Trp Val Val Ser Ala Ala Asn 180 185 190 Asn Tyr Ala Thr Ser His Gly Lys Thr Pro Phe Ser Ile Tyr Gln Gly 195 200 205 Lys Trp Asn Val Leu Asn Arg Asp Phe Glu Arg Asp Ile Ile Pro Met 210 215 220 Ala Arg His Phe Gly Met Ala Leu Ala Pro Trp Asp Val Met Gly Gly 225 230 235 240 Gly Lys Phe Gln Ser Lys Lys Ala Met Glu Glu Trp Lys Lys Asn Gly 245 250 255 Glu Gly Leu Arg Thr Ala Val Gly Gly Pro Glu Gln Thr Glu Leu Glu 260 265 270 Val Lys Ile Ser Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala Glu Glu His Gly Thr 275 280 285 Glu Ser Val Thr Ala Ile Ala Ile Ala Tyr Val Arg Ser Lys Ala Lys 290 295 300 Asn Val Phe Pro Leu Val Gly Gly Arg Lys Ile Glu His Leu Lys Gln 305 310 315 320 Asn Ile Glu Ala Leu Ser Ile Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ile Glu Tyr 325 330 335 Leu Glu Ser Ile Val Thr Phe Asp Val Gly Phe Pro Lys Ser Asn Ile 340 345 350 Gly Asp Asp Pro Ala Val Thr Lys Lys Leu Ser Pro Leu Thr Ser Met 355 360 365 Ser Ala Arg Ile Ser Phe Asp Asn 370 375 <210> 2 <211> 1131 <212> DNA <213> artifical sequence <400> 2 atgagcgatc tgtttaaacc ggcgccggaa ccgccgaccg aactgggccg cctgcgcgtg 60 ctgagcaaaa ccgcgggcat tcgcgtgagc ccgctgattc tgggcggcgc gagcattggc 120 gatgcgtgga gcggctttat gggcagcatg aacaaagaac aggcgtttga actgctggat 180 gcgttttatg aagcgggcgg caactgcgtg gataccgcga acagctatca gaacgaagaa 240 agcgaaattt ggattggcga atggatgaaa agccgcaaac tgcgcgatca gattgtgatt 300 gcgaccaaat ttaccggcga ttataaaaaa tatgaagtgg gcggcggcaa aagcgcgaac 360 tattgcggca accataaaca tagcctgcat gtgagcgtgc gcgatagcct gcgcaaactg 420 cagaccgatt ggattgatat tctgtatgtg cattggtggg attatatgag cagcattgaa 480 gaagtgatgg atagcctgca tattctgatt cagcagggca aagtgctgta tctgggcgtg 540 agcgataccc cggcgtgggt ggtgagcgcg gcgaacaact atgcgaccag ccatggcaaa 600 accccgttta gcatttatca gggcaaatgg aacgtgctga accgcgattt tgaacgcgat 660 attattccga tggcgcgcca ttttggcatg gcgctggcgc cgtgggatgt gatgggcggc 720 ggcaaatttc agagcaaaaa agcgatggaa gaatggaaaa aaaacggcga aggcctgcgc 780 accgcggtgg gcggcccgga acagaccgaa ctggaagtga aaattagcga agcgctgaac 840 aaaattgcgg aagaacatgg caccgaaagc gtgaccgcga ttgcgattgc gtatgtgcgc 900 agcaaagcga aaaacgtgtt tccgctggtg ggcggccgca aaattgaaca tctgaaacag 960 aacattgaag cgctgagcat taaactgacc ccggaacaga ttgaatatct ggaaagcatt 1020 gtgacctttg atgtgggctt tccgaaaagc aacattggcg atgatccggc ggtgaccaaa 1080 aaactgagcc cgctgaccag catgagcgcg cgcattagct ttgataacta a 1131 <210> 3 <211> 1131 <212> DNA <213> artifical sequence <400> 3 atgtctgatg tatttggacc tgcacctgaa ccacctaccg agttaggacg tctaagagtt 60 ctctctaaaa cagctggtat aagagtctct ccgctaatat tgggaggtat gtcgattggt 120 gacgcctggt caggattcat ggggtcaatg aacaaggagc gggcttttga gctgcttgat 180 gcctttttcg aggcaggtgg aaacttcatt gatactgcaa ataattacca aaatgaacag 240 tcagaggcat ggataggtga atggatggtt tcaagaaaat tgcgtgacca aattgttatt 300 gccaccaaat tcaccacaga ctataagaag tatgaagtgg gcaagggcag aagtgccaac 360 ttctgtggta atcacaagca tagtttacac gtaagtgtga gagattctct tcgcaaattg 420 cagactgatt ggattgacat tctctatgtt cactggtggg attatatgag ttcgatcgag 480 gaagttatgg atagtctgca tattcttgtg cagcagggca aggtcctcta cctgggagta 540 tctgatacac ctgcatgggt cgtgtctgct gcaaattact acgctacctc tcacgggaaa 600 actcccttca gcatctatca aggtaaatgg aatctgttga atagggactt tgagcgtgaa 660 attattccaa tggctaggca ttttggtatg gctctcgctc catgggatgt catgggaggg 720 ggaagatttc agagcaaaaa agctttagaa gaacggaaga agagtggaga gggcctgcgt 780 agctttgttg gtacatctga acagacggat gcagaggtta agatcagcga ggcattgtcg 840 aaggttgctg aggaacatgg cattgagtct gtcacagcta ttgccattgc ctatgtccgc 900 tccaaagcga agcatgtttt cccattggtt ggaggaagga aaattgagca cctcaaacaa 960 aatattgagg cgttgagtat taaattgaca ccaggacaga tagaatatct agaaagcatt 1020 gtcccattcg atgttgggtt ccctagcaat ttcatcggag atgatcctgc agttactaag 1080 aaacttgcat tccttccagc aatgtctgcc aagattgctt ttgacgatta g 1131

Claims (23)

  1. 하기와 같은 구조식을 가지고:
    Figure pct00042
    ,
    Figure pct00043

    상기 R1, R2, R3은 수소 또는 히드록시 보호기이고; R4, R5는 동일하거나 상이하며 페닐, 알킬 또는 치환된 페닐이며, 화학식 C 또는 Cf의 화합물인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올 중간체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 히드록시 보호기는 알킬, 실릴, C2-11 아실, C4-9 시클로알케닐, 아릴, 아르알킬, 아로일, 페닐, 치환된 페닐이고; 상기 실릴은 테트라메틸실릴, 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, 트리-n-부틸실릴, tert-부틸디메틸실릴이며; 상기 알킬은 C1-C8 알킬이고; 상기 아릴기는 페닐, 푸라닐, 티에닐 또는 인돌일이고; 상기 치환된 페닐은 알킬 치환된 페닐, 알콕시알킬 치환된 페닐, 니트로알킬 치환된 페닐 또는 할로겐 치환된 페닐이고; 상기 알킬 치환된 페닐은 벤질, 벤즈히드릴, 트리틸이고; 상기 알콕시알킬 치환된 페닐은 p-메톡시벤질이고; 상기 니트로알킬 치환된 페닐은 p-니트로벤질이며; 상기 할로겐 치환된 페닐은 p-클로로페닐인 화합물.
  3. 화학식 Cp의 화합물을 아민 화합물과 반응시켜 제조되는 중간체로,
    Figure pct00044

    상기 R1, R2, R4, R5의 정의는 제1항과 동일한, 화학식 CL의 화합물인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 중간체의 제조 방법.
  4. 화학식 Cp의 화합물을 N-메틸아닐린과 반응시켜 제조되는 중간체로,
    Figure pct00045

    상기 R1, R2의 정의는 제1항과 동일한, 화학식 C-1의 화합물인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 중간체의 제조 방법.
  5. 키랄성을 구축하기 위해 효소 환원 반응에 의해 제조되는 중간체로,
    Figure pct00046

    상기 R1은 수소 또는 히드록시 보호기이고;
    상기 효소는 서열 번호 1에 나타난 단백질인 아미노산 서열을 갖는 알도-케토 환원 효소이고 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가 후 서열 번호 1로부터 수득한 알도-케토 환원 효소 활성을 갖는 단백질이거나, 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열과 80% 상동성을 가지며 알도-케토 환원 효소 활성을 갖는 단백질인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 중간체의 제조 방법.
  6. 효소 환원 반응에 의해 키랄성을 구축하고, 추가로 보호기를 도입하여 제조되는 중간체로,
    Figure pct00047

    상기 R1의 정의는 제1항과 동일하고, R2는 히드록시 보호기이고, 효소는 제5항과 동일한 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 중간체 화합물의 제조 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 화학식 B의 화합물은 아실화 반응에 의해 화학식 A2의 화합물로부터 제조되고, 반응식이 하기와 같으며:
    Figure pct00048

    상기 X는 할로겐이고, R1의 정의는 제1항과 동일한 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 화학식 A2의 화합물은 할로겐화 반응에 의해 화학식 A1의 화합물로부터 제조되고, 반응식은 하기와 같으며:
    Figure pct00049

    상기 X는 할로겐인 제조 방법.
  9. 탈보호 반응에 의해 화학식 C-1의 화합물로부터 제조되는 중간체로,
    Figure pct00050

    상기 R1, R2의 정의는 제1항과 동일한, 화학식 C-i의 화합물인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 중간체의 제조 방법.
  10. 환원 반응에 의해 화학식 CL의 화합물로부터 제조되는 중간체로,
    Figure pct00051

    상기 R1, R2, R4, R5의 정의는 제1항과 동일한, 화학식 Cf의 화합물인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 중간체의 제조 방법.
  11. 환원 반응에 의해 화학식 C-i의 화합물로부터 제조되는 중간체로, 화학식 Cf-1의 화합물인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 중간체의 제조 방법.
    Figure pct00052
  12. (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올은 고리 닫힘 반응에 의해 화학식 Cf의 화합물로부터 제조되고,
    Figure pct00053

    상기 R1, R2, R4, R5의 정의는 제1항과 동일한, (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 제조 방법.
  13. (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올은 고리 닫힘 반응에 의해 화학식 Cf-1의 화합물로부터 제조되는 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 제조 방법.
    Figure pct00054
  14. (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올이 할로겐화 반응, 아실화 반응, 효소 환원 반응, 아민 화합물과의 반응, 환원 고리 닫힘 반응에 의해 제조되고,
    Figure pct00055

    상기 X는 할로겐이고, R1, R2, R4, R5의 정의는 제1항과 동일한, (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 제조 방법.
  15. (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올이 할로겐화 반응, 아실화 반응, 효소 환원 반응, 아민 화합물과의 반응, 탈보호 반응, 환원 고리 닫힘 반응에 의해 제조되는 것인 (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 제조 방법.
    Figure pct00056
  16. 제5항에 있어서, 상기 알도-케토 환원 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2인 제조 방법.
  17. 제5항에 있어서, 상기 알도-케토 환원 효소는 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포, 파쇄된(broken) 효소액, 동결 건조 분말 또는 고정화 효소 또는 고정화 세포인 제조 방법.
  18. 제5항에 있어서, 반응계에 공급되는 알도-케토 환원 효소의 유전자 조작된 박테리아의 전체 세포의 양은 10-100g/L의 범위이고, 전환 온도는 25-37℃인 제조 방법.
  19. 제5항에 있어서, 상기 반응은 용매의 존재하에 수행되는 것인 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 용매는 물 또는 완충액 및 유기 용매로 구성된 혼합 용매인 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 완충액은 인산염 완충액, 탄산염 완충액, Tri-HCl 완충액, 구연산염 완충액 또는 MOPS 완충액 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 유기 용매는 DMSO, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 이소프로판올, DMF, TBME, 디클로로메탄 및 비닐 아세테이트 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  23. 고리 닫힘 반응에 의해 화학식 CL의 화합물로부터 제조되는 중간체로,
    Figure pct00057

    상기 R1, R2, R4, R5의 정의는 제1항과 동일한, (3R,3aS,6aR)-헥사하이드로푸로[2,3-b]-3-올의 중간체의 제조 방법.
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