CN113430240B - 一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法 - Google Patents

一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113430240B
CN113430240B CN202110728694.0A CN202110728694A CN113430240B CN 113430240 B CN113430240 B CN 113430240B CN 202110728694 A CN202110728694 A CN 202110728694A CN 113430240 B CN113430240 B CN 113430240B
Authority
CN
China
Prior art keywords
butyl
phenylbutyl
carbamate
chloro
tert
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110728694.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113430240A (zh
Inventor
白云鹏
钱源益
张晓彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
East China University of Science and Technology
Original Assignee
East China University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by East China University of Science and Technology filed Critical East China University of Science and Technology
Priority to CN202110728694.0A priority Critical patent/CN113430240B/zh
Publication of CN113430240A publication Critical patent/CN113430240A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113430240B publication Critical patent/CN113430240B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01184—Carbonyl reductase (NADPH) (1.1.1.184)

Abstract

本发明涉及一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法，使用羰基还原酶催化(S)‑叔丁基(4‑氯‑3‑羰基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯不对称还原制备光学活性叔丁基((2S,3R)‑4‑氯‑3‑羟基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯，葡萄糖脱氢酶提供辅酶循环，酶促反应是在连续流微反应器中发生。与现有技术相比，本发明提供了一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法，可在连续流微反应器中立体选择性催化(S)‑叔丁基(4‑氯‑3‑羰基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯的不对称还原，生成相应的光学活性叔丁基((2S,3R)‑4‑氯‑3‑羟基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯，反应条件温和，催化效率高，转化率高，产品光学纯度好，ee值可高于98.3％，具有很好的工业应用前景。

Description

一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法。
背景技术
阿扎那韦是蛋白酶抑制剂(PI)类的抗逆转录病毒药物，像其他抗逆转录病毒一样，它可以用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染。该药物是国际抗病毒协会-美国专家小组推荐的用于治疗成人HIV感染的常用抗HIV药物，它被认为是一种有效的每日服用一次的药物，治疗两种不同类型的患者都有功效。其中阿扎那韦的中间体是叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，这是一个带两个手性中心的化合物，环化后用于生产阿扎那韦。阿扎那韦的化学合成路线如图1所示。
1997年，Chen等人描述了从受保护的氨基酸酯制备α-N-BOC-环氧化物的实用方法。该方法可以容易地大规模进行并且无需使用危险试剂，并且可以制备千克级别的α-N-BOC-环氧化物。该反应步骤中，其中间产物氯醇是通过氨基酸酯的两步化学法合成的，反应条件比较苛刻，在-78℃条件下进行(Tetrahedron Lett,1997,38(18):3175-3178)。2009年，Alanvert等人介绍了一种使用羰基还原酶生物催化还原α-卤代酮为相应的α-卤代醇的方法，并且其立体选择性较高。10g规模制备叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，反应21h，反应的转化率大于98.5％，de(2S,3R)＞98.5％(Tetrahedron-Asymmetry,2009,20(21):2462-2466)。2019年，Wu等人对来自Novosphingobiumaromaticivorans的短链脱氢酶NaSDR进行了研究，其对底物氯酮表现出优异的立体选择性，但活性相对较低。于是对NaSDR活性口袋上的位点进行迭代饱和诱变(ISM)，获得突变体muSDR(G141A/I195L)的催化效率显著提高，其对底物氯酮的kcat增加到4.11s-1，是WT(1.15s-1)的3.57倍。制备实验反应总体积500mL，底物氯酮浓度为150g/L，反应20h后，成功催化还原获得产物氯醇，de(2S,3R)>99％，重结晶后产物的纯度为99.5％，产率为85.3％(获得氯醇64.6g)(Appl Microbiol Biotechnol,2019,103(11):4417-4427)。
综上所述，叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯可以通过生物催化方法获得，非对映选择性优异；但是大多是报导的是利用机械搅拌发生酶促反应，反应效率较低。
发明内容
针对目前存在许多生物法制备光学活性手性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯效率较低的现状，本发明提供一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法。
本发明通过一种来源于酿酒酵母S288C(Saccharomyces cerevisiae S288C)的羰基还原酶作为催化剂催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原，该反应是在微反应器中进行，由两个平流泵同时工作，制备手性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供羰基还原酶OdCR1在催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯还原生成相应的叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯上的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述羰基还原酶OdCR1来源于酿酒酵母S288C(Saccharomyces cerevisiae S288C)。该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.22135，保藏时间为2021年04月06日，保藏地点为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C的催化活性高、立体选择性优异。
在本发明的一个实施方式中，所述羰基还原酶OdCR1是NADPH依赖型的。所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供一种羰基还原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因编码的蛋白质为羰基还原酶OdCR1。
本发明提供一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法，使用羰基还原酶催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯不对称还原制备光学活性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，葡萄糖脱氢酶提供辅酶循环，酶促反应是在连续流微反应器中发生。
在本发明的一个实施方式中，将羰基还原酶溶液和底物(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯溶液按比例持续地通入连续流微反应器中进行反应，通过生物催化反应后经环化及纯化得到叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
在本发明的一个实施方式中，将羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+配制成溶液一，将叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯配制成溶液二，溶液一、溶液二按比例持续地通入连续流微反应器中进行反应，通过生物催化反应后经环化及纯化得到叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
在本发明的一个实施方式中，叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯使用二甲基亚砜(DMSO)溶解。
在本发明的一个实施方式中，使用浓度为100mM，pH为5.0～6.0的磷酸钠盐缓冲溶液配制参与反应的溶液一。
在本发明的一个实施方式中，所述羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的活力比为1:1.5。
在本发明的一个实施方式中，所述葡萄糖与(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的摩尔比为1.5：1。
所述二甲基亚砜与反应液的体积比为1:6，反应液指的是溶液一、溶液二混合后的总溶液。
所述反应液中NADP+的浓度为0.2mmol/L，反应液指的是溶液一、溶液二混合后的总溶液。
在本发明的一个实施方式中，所述连续流微反应器为连续流微通道反应器，所述连续流微通道反应器由1～20片微反应器芯片连接组成，含有两个进料口与一个出料口，两个进料口分别用于注入原料A和原料B，以进行连续的混合反应，一个出料口用于反应后的出料。
在本发明的一个实施方式中，所述连续流微反应器由3片微反应器芯片连接组成，3片微反应器芯片分别设置为3层，第一层微反应器芯片设置两个进料口，第三层微反应器芯片设置一个出料口，第二层微反应器芯片与第一层微反应器芯片和第三层微反应器芯片连接，每个微反应器芯片都有若干个用于液体混合反应的混合反应腔，原料A和原料B从两个进料口分别进入并混合后，依次穿过第一层微反应器芯片的每个混合反应腔、第二层微反应器芯片的每个混合反应腔以及第三层微反应器芯片的每个混合反应腔，再从第三层微反应器芯片的出料口流出，第一层微反应器芯片、第二层微反应器芯片、第三层微反应器芯片上的混合反应腔均作为进行连续的混合反应的场所。
在本发明的一个实施方式中，两个进料口均连接有较长的入口通道，分别为进料流道1与进料流道2，其中，进料流道1一分为二，与进料流道2形成十字交叉的设计，有利于提高两股流体的混合效率。
本发明中，每个微反应器芯片都有若干个用于液体混合反应的混合反应腔，不同的混合反应腔之间通过管道连通，该结构设计有利于在混合反应腔中使局部的流体形成回流，提高不同反应液的返混程度，从而提高反应物和催化剂的混合和传质效率。本发明中，层层级联的混合反应腔进一步提高了反应物的微观混合强度，有助于强化反应过程。
在本发明的一个实施方式中，所述微反应器芯片整体为蛇形排列形式、回字形排列形式或锯齿形排列形式，所述微反应器芯片上的混合反应腔为水滴形结构、灯笼形结构或心形结构，所述微反应器芯片上相连混合反应腔之间采用微管状结构或槽型结构相连。
在本发明的一个实施方式中，所述微反应器芯片的材质是玻璃、陶瓷、耐腐蚀合金或含氟聚合物的其中一种。
在本发明的一个实施方式中，所述羰基还原酶来源于酿酒酵母S288C(Saccharomyces cerevisiae S288C)。该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.22135，保藏时间为2021年04月06日，保藏地点为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C的催化活性高、立体选择性优异。
本发明还提供所述羰基还原酶的获得方法：
通过对自然界微生物以及实验室保藏微生物菌株的大规模筛选，发现酿酒酵母S288C可以催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯还原生成相应的叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。通过鸟枪法克隆获得了酿酒酵母S288C中催化相应反应的羰基还原酶，命名为羰基还原酶OdCR1，该酶是NADPH依赖型的。所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
酿酒酵母S288C(Saccharomyces cerevisiae S288C)及羰基还原酶OdCR1可以催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯还原生成相应的叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
本发明还提供所述羰基还原酶OdCR1在不对称还原(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯中的应用。其中所述(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的化学结构如下所示：
Figure BDA0003139431450000051
在本发明的一个实施方式中，所述(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原，可按下述示例性方法进行：在pH 5.5-7.5的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+的存在下，在所述羰基还原酶OdCR1的作用下，催化所述(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原反应。
在本发明的一个实施方式中，所述应用中，底物在反应液中的浓度可以为1～2mmol/L。根据所采用的反应体系，所述羰基还原酶的用量可以为1～500U/L。
酶促(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯不对称还原时，辅酶NADPH氧化生成NADP+，为了进行辅酶NADPH的循环再生，向反应体系中额外添加葡萄糖和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(J Ind Microb Biotechnol,2011,38:633–641)。
反应转化率和产物对映体过量值(ee)可采用液相色谱法进行分析，优选的，使用C18色谱柱(4.6mm×250mm)进行转化率和ee值分析，流动相为乙腈和磷酸溶液(0.1％)，比例7:3。检测器紫外波长为210nm，柱温恒定为40℃。
在本发明的一个实施方式中，酶促反应结束后，反应液冷却至室温，用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚等进行萃取，重复萃取两次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，即可获得相应光学活性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯粗产品。
本发明提供了一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法，相比传统的机械搅拌制备，其催化效率高。所使用的羰基还原酶来源于酿酒酵母S288C(Saccharomycescerevisiae S288C)，其催化活性高、立体选择性优异。本发明还公开了利用平流泵向连续流微反应器中进样，两泵进样不同的物质，使其在连续流微反应器中发生酶促反应。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法，可在连续流微反应器中立体选择性催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原，生成相应的光学活性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，反应条件温和，催化效率高，转化率高，产品光学纯度好，ee值可高于98.3％，具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1为阿扎那韦的化学合成路线。
具体实施方式
本发明提供一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法，使用羰基还原酶催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯不对称还原制备光学活性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，葡萄糖脱氢酶提供辅酶循环，酶促反应是在连续流微反应器中发生。
在本发明的一个实施方式中，将羰基还原酶溶液和底物(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯溶液按比例持续地通入连续流微反应器中进行反应，通过生物催化反应后经环化及纯化得到叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
在本发明的一个实施方式中，将羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+配制成溶液一，将叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯配制成溶液二，溶液一、溶液二按比例持续地通入连续流微反应器中进行反应，通过生物催化反应后经环化及纯化得到叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
在本发明的一个实施方式中，叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯使用二甲基亚砜(DMSO)溶解。
在本发明的一个实施方式中，使用浓度为100mM，pH为5.0～6.0的磷酸钠盐缓冲溶液配制参与反应的溶液一。
在本发明的一个实施方式中，所述羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的活力比为1:1.5。
在本发明的一个实施方式中，所述葡萄糖与(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的摩尔比为1.5：1。
所述二甲基亚砜与反应液的体积比为1:6，反应液指的是溶液一、溶液二混合后的总溶液。
所述反应液中NADP+的浓度为0.2mmol/L，反应液指的是溶液一、溶液二混合后的总溶液。
在本发明的一个实施方式中，所述微反应器装置由3片微反应器芯片连接组成，3片微反应器芯片分别设置为3层，第一层微反应器芯片设置两个进料口，第三层微反应器芯片设置一个出料口，第二层微反应器芯片与第一层微反应器芯片和第三层微反应器芯片连接，每个微反应器芯片都有若干个用于液体混合反应的混合反应腔，原料A和原料B从两个进料口分别进入并混合后，依次穿过第一层微反应器芯片的每个混合反应腔、第二层微反应器芯片的每个混合反应腔以及第三层微反应器芯片的每个混合反应腔，再从第三层微反应器芯片的出料口流出，第一层微反应器芯片、第二层微反应器芯片、第三层微反应器芯片上的混合反应腔均作为进行连续的混合反应的场所。
两个进料口均连接有较长的入口通道，分别为进料流道1与进料流道2，其中，进料流道1一分为二，与进料流道2形成十字交叉的设计，有利于提高两股流体的混合效率。
本发明中，每个微反应器芯片都有若干个用于液体混合反应的混合反应腔，不同的混合反应腔之间通过管道连通，该结构设计有利于在混合反应腔中使局部的流体形成回流，提高不同反应液的返混程度，从而提高反应物和催化剂的混合和传质效率。本发明中，层层级联的混合反应腔进一步提高了反应物的微观混合强度，有助于强化反应过程。
在本发明的一个实施方式中，所述微反应器芯片整体为蛇形排列形式、回字形排列形式或锯齿形排列形式，所述微反应器芯片上的混合反应腔为水滴形结构、灯笼形结构或心形结构，所述微反应器芯片上相连混合反应腔之间采用微管状结构或槽型结构相连。
在本发明的一个实施方式中，所述微反应器芯片的材质是玻璃、陶瓷、耐腐蚀合金或含氟聚合物的其中一种。
在本发明的一个实施方式中，所述羰基还原酶来源于酿酒酵母S288C(Saccharomyces cerevisiae S288C)。该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.22135，保藏时间为2021年04月06日，保藏地点为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C的催化活性高、立体选择性优异。
本发明还提供所述羰基还原酶的获得方法：
通过对自然界微生物以及实验室保藏微生物菌株的大规模筛选，发现酿酒酵母S288C可以催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯还原生成相应的叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。通过鸟枪法克隆获得了酿酒酵母S288C中催化相应反应的羰基还原酶，命名为羰基还原酶OdCR1，该酶是NADPH依赖型的。所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
酿酒酵母S288C(Saccharomyces cerevisiae S288C)及羰基还原酶OdCR1可以催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯还原生成相应的叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
本发明还提供所述羰基还原酶OdCR1在不对称还原(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯中的应用。其中所述(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的化学结构如下所示：
Figure BDA0003139431450000081
在本发明的一个实施方式中，所述(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原，可按下述示例性方法进行：在pH 5.5-7.5的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+的存在下，在所述羰基还原酶OdCR1的作用下，催化所述(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原反应。
在本发明的一个实施方式中，所述应用中，底物在反应液中的浓度可以为1～2mmol/L。根据所采用的反应体系，所述羰基还原酶的用量可以为1～500U/L。
酶促(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯不对称还原时，辅酶NADPH氧化生成NADP+，为了进行辅酶NADPH的循环再生，向反应体系中额外添加葡萄糖和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(J Ind Microb Biotechnol,2011,38:633–641)。
反应转化率和产物对映体过量值(ee)可采用液相色谱法进行分析，优选的，使用C18色谱柱(4.6mm×250mm)进行转化率和ee值分析，流动相为乙腈和磷酸溶液(0.1％)，比例7:3。检测器紫外波长为210nm，柱温恒定为40℃。
在本发明的一个实施方式中，酶促反应结束后，反应液冷却至室温，用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚等进行萃取，重复萃取两次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，即可获得相应光学活性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯粗产品。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，应当理解，所列实施例虽然列举了本发明优选的实施方式，但所列具体实施例仅是为了更好地阐明本发明而给出，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。
下列实施例中的材料来源为：
微反应器。
平流泵购于北京星达科技发展公司。
载体pUC118和限制性内切酶Sau3AI购于宝生物工程(大连)有限公司。
表达质粒pET28a购自Novagen公司。
E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
限制性内切酶EcoR I和Hind III均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。
除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照试剂盒的商品说明书。
本实施例中，微反应器装置由3片微反应器芯片连接组成，3片微反应器芯片分别设置为3层，第一层微反应器芯片设置两个进料口，第三层微反应器芯片设置一个出料口，第二层微反应器芯片与第一层微反应器芯片和第三层微反应器芯片连接，每个微反应器芯片都有若干个用于液体混合反应的混合反应腔，原料A和原料B从两个进料口分别进入并混合后，依次穿过第一层微反应器芯片的每个混合反应腔、第二层微反应器芯片的每个混合反应腔以及第三层微反应器芯片的每个混合反应腔，再从第三层微反应器芯片的出料口流出，第一层微反应器芯片、第二层微反应器芯片、第三层微反应器芯片上的混合反应腔均作为进行连续的混合反应的场所。
两个进料口均连接有较长的入口通道，分别为进料流道1与进料流道2，其中，进料流道1一分为二，与进料流道2形成十字交叉的设计，有利于提高两股流体的混合效率。
磷酸钠缓冲溶液(100mM,pH 6.0)配置的溶液一(羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+)和溶液二((S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯(DMSO助溶))分别通过进料流道1和2进入微反应器混合区中，并瞬间进行均匀混合，并保证在进入微反应器混合区之前两种不同物料不相互接触；酶溶液和底物溶液进入微通道反应器中后，在各个单元反应器中通过温度和浓度的均匀化、微观化控制，可使在微反应器管程内能够高效快速进行催化反应，最后生成产物叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，从出料口排入1mol/L的硫酸溶液中终止反应。
反应结束后用等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，然后用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯溶剂，最后用硅胶层析柱(粒径为200-300目)纯化粗产品，用乙酸乙酯和石油醚(1:20)的流动相洗脱目标产物，得到纯品叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。
实施例1连续流生物催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯合成手性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯
整个酶促实验是在微反应器中进行，需要有两个平流泵往微反应器中通，泵1向微反应器中注入(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯(用DMSO溶)，泵2向微反应器注入羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+，两泵的液体交汇于微反应器中，使得酶催化反应发生。
溶液一中葡萄糖和NADP+的浓度分别为1.5mmol/L和0.2mmol/L；溶液二使用DMSO助溶(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，终浓10mmol/L。在反应温度40℃条件下反应，溶液一和溶液二的流速分别为0.36mL/min和0.06mL/min，反应结束后，使用液相色谱测得底物转化率为>99％，ee值可高于98.3％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 771
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
atgaacacca gcagccgtat cacctacttc atcattggcg gtagccgtgg tatcggcttc 60
aacctggtga agattctgag cgcgagcacc ggtaacaccg ttatcaccag cattcgtggt 120
agcccgagcc tgccgaaaaa caagcaggtg gaagacctgg cgaaaatccg taagaacatt 180
cacatcgtgc agctggatct gaccaaggac gaaagcatcg gtaacatcgc ggatgagatc 240
aaaaagaccc cgtttttcct gggtatcgac attttcatcg cgtgcagcgc ggttagcgac 300
agctattaca aggttctgga gaccccgaaa agcgtttggc tgaaccacta cagcaccaac 360
gcgctgggcc cgattctggc gctgcaaaag gtgtacccgc tgctgctgct gaagaaaacc 420
cgtaagatct ttttcattag cagcgttgcg ggtagcatta acgcgttcgt tccgctgagc 480
gttagcgcgt atggtcagag caaagcggcg ctgaactacg cggttaaaac cctgagcttt 540
gagctgaaac cggagggttt taccgtggtt gcgtttcacc cgggtatggt tagcaccgac 600
atgggtcaat acggtctgga ccacttcaaa gaaaagaaca tcgacattag cggtgttaac 660
atcattaccc cggaagagag cgcgagcgcg ctgatcgacg ttttccgtaa gatcctgccg 720
gaggataacg gcaagttttt caactacgat ggtagcgaag gcgttttcta a 771
<210> 2
<211> 256
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 2
Met Asn Thr Ser Ser Arg Ile Thr Tyr Phe Ile Ile Gly Gly Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Gly Phe Asn Leu Val Lys Ile Leu Ser Ala Ser Thr Gly Asn
20 25 30
Thr Val Ile Thr Ser Ile Arg Gly Ser Pro Ser Leu Pro Lys Asn Lys
35 40 45
Gln Val Glu Asp Leu Ala Lys Ile Arg Lys Asn Ile His Ile Val Gln
50 55 60
Leu Asp Leu Thr Lys Asp Glu Ser Ile Gly Asn Ile Ala Asp Glu Ile
65 70 75 80
Lys Lys Thr Pro Phe Phe Leu Gly Ile Asp Ile Phe Ile Ala Cys Ser
85 90 95
Ala Val Ser Asp Ser Tyr Tyr Lys Val Leu Glu Thr Pro Lys Ser Val
100 105 110
Trp Leu Asn His Tyr Ser Thr Asn Ala Leu Gly Pro Ile Leu Ala Leu
115 120 125
Gln Lys Val Tyr Pro Leu Leu Leu Leu Lys Lys Thr Arg Lys Ile Phe
130 135 140
Phe Ile Ser Ser Val Ala Gly Ser Ile Asn Ala Phe Val Pro Leu Ser
145 150 155 160
Val Ser Ala Tyr Gly Gln Ser Lys Ala Ala Leu Asn Tyr Ala Val Lys
165 170 175
Thr Leu Ser Phe Glu Leu Lys Pro Glu Gly Phe Thr Val Val Ala Phe
180 185 190
His Pro Gly Met Val Ser Thr Asp Met Gly Gln Tyr Gly Leu Asp His
195 200 205
Phe Lys Glu Lys Asn Ile Asp Ile Ser Gly Val Asn Ile Ile Thr Pro
210 215 220
Glu Glu Ser Ala Ser Ala Leu Ile Asp Val Phe Arg Lys Ile Leu Pro
225 230 235 240
Glu Asp Asn Gly Lys Phe Phe Asn Tyr Asp Gly Ser Glu Gly Val Phe
245 250 255

Claims (1)

1.一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法，其特征在于，使用羰基还原酶OdCR1催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯不对称还原制备光学活性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，葡萄糖脱氢酶提供辅酶循环，酶促反应是在连续流微反应器中发生；
所述羰基还原酶OdCR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
将羰基还原酶OdCR1、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+配制成溶液一，将(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯配制成溶液二，溶液一、溶液二按比例持续地通入连续流微反应器中进行反应，通过生物催化反应后经环化及纯化得到叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯；
所述羰基还原酶OdCR1与葡萄糖脱氢酶的活力比为1:1.5；
所述葡萄糖与(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的摩尔比为1.5：1；
底物(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯在反应液中的浓度为1～2mmol/L；
所述羰基还原酶OdCR1的用量为1～500U/L；
所述连续流微反应器为连续流微通道反应器，由3片微反应器芯片连接组成，3片微反应器芯片分别设置为3层，第一层微反应器芯片设置两个进料口，第三层微反应器芯片设置一个出料口，第二层微反应器芯片与第一层微反应器芯片和第三层微反应器芯片连接，每个微反应器芯片都有若干个用于液体混合反应的混合反应腔，溶液一和溶液二从两个进料口分别进入并混合后，依次穿过第一层微反应器芯片的每个混合反应腔、第二层微反应器芯片的每个混合反应腔以及第三层微反应器芯片的每个混合反应腔，再从第三层微反应器芯片的出料口流出，第一层微反应器芯片、第二层微反应器芯片、第三层微反应器芯片上的混合反应腔均作为进行连续的混合反应的场所。
CN202110728694.0A 2021-06-29 2021-06-29 一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法 Active CN113430240B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110728694.0A CN113430240B (zh) 2021-06-29 2021-06-29 一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110728694.0A CN113430240B (zh) 2021-06-29 2021-06-29 一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113430240A CN113430240A (zh) 2021-09-24
CN113430240B true CN113430240B (zh) 2023-07-04

Family

ID=77757681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110728694.0A Active CN113430240B (zh) 2021-06-29 2021-06-29 一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113430240B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4063512A4 (en) * 2019-11-22 2024-01-03 Api Corp CARBONYL REDUCTASE, NUCLEIC ACID ENCODING SAME, AND METHOD FOR PRODUCING AN OPTICALLY ACTIVE COMPOUND USING SAME
CN114507172B (zh) * 2022-02-28 2024-03-01 四川依维欣医药科技有限公司 一种（r）-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的合成方法
CN117025694B (zh) * 2023-08-21 2024-03-15 南京先进生物材料与过程装备研究院有限公司 一种基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111635893A (zh) * 2020-07-07 2020-09-08 南京朗恩生物科技有限公司 一种酮还原酶及其在达芦那韦中间体生产中的应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG177331A1 (en) * 2009-06-22 2012-02-28 Codexis Inc Ketoreductase-mediated stereoselective route to alpha chloroalcohols
CN103386338A (zh) * 2013-08-07 2013-11-13 苏州扬清芯片科技有限公司 一种微流控组合化学反应芯片
CN103468757A (zh) * 2013-09-18 2013-12-25 苏州汉酶生物技术有限公司 一种阿扎那韦中间体的生物制备方法
CN107266311B (zh) * 2017-03-24 2020-07-28 南京工业大学 一种利用微流体芯片反应器连续制备α-酮酸酯的方法
CN110372641B (zh) * 2018-04-12 2022-10-14 江苏瑞科医药科技有限公司 六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法
CN110079564A (zh) * 2019-04-29 2019-08-02 上海健康医学院 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法及其应用
CN111378703B (zh) * 2020-03-27 2021-05-18 长兴制药股份有限公司 一种(2s,3s)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法
CN111235123B (zh) * 2020-03-27 2020-10-27 长兴制药股份有限公司 一种醇溶液高浓度耐受的羰基还原酶及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111635893A (zh) * 2020-07-07 2020-09-08 南京朗恩生物科技有限公司 一种酮还原酶及其在达芦那韦中间体生产中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
倪国伟等.羰基还原酶在动态动力学拆分中的应用进展.第39卷第339-349页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113430240A (zh) 2021-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113430240B (zh) 一种连续流生物催化合成阿扎那韦中间体氯醇的方法
CN110643587B (zh) 一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法
CN106755209A (zh) 一种酶法制备β‑烟酰胺单核苷酸的方法
CN100379859C (zh) 固定化核苷磷酸化酶微生物及其在合成嘌呤核苷中的应用
CN111718915A (zh) 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体、包含该突变体的重组表达载体和重组菌及应用
CN109750011A (zh) 一种甘露糖6-磷酸磷酸酶及甘露糖生物制备方法
CN112410276A (zh) 一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用
CN104560905B (zh) 一种源自假单胞菌的硫醚单加氧酶及其合成应用
CN113373186A (zh) 一种采用连续流微反应器合成手性(R)-γ-癸内酯的方法
CN104673813A (zh) 一种蛇孢假壳素类化合物母核合成基因AuOS及其应用
CN116479068A (zh) 一种利用生物酶制备n1-甲基-假尿苷单磷酸的方法
CN106520856A (zh) (s)‑n‑叔丁氧羰基‑3‑羟基哌啶的酶催化制备方法
CN112646851B (zh) 一种酶法快速制备β-烟酰胺单核苷酸的方法
CN114934082B (zh) 一种连续流生物催化合成(s)-5-甲基-2-吡咯烷酮的方法
CN105132394B (zh) 一种脂肪酶lipase6及其编码基因和应用
CN114686465A (zh) 一种水解酶和一种(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的合成方法
CN110791483B (zh) 一种短链还原酶及其制备方法和应用
CN101503432B (zh) 5&#39;-脱氧核苷单磷酸的制备方法
CN210481367U (zh) 一种可拼拆的多通道定向突变克隆制备芯片
CN110283799B (zh) 醛酮还原酶BsAKR(YvgN)及其突变体和应用
CN106906192B (zh) 一种葡萄糖基转移酶及在合成藏红花酸葡萄糖酯中的应用
CN112760303A (zh) 一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶及其制备方法与应用
CN107903227B (zh) 琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法
CN112029743A (zh) 一种6-溴茚酮的生物酶催化合成方法
CN109762801A (zh) 卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性药物中间体中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant