CN104673813A

CN104673813A - 一种蛇孢假壳素类化合物母核合成基因AuOS及其应用

Info

Publication number: CN104673813A
Application number: CN201510130163.6A
Authority: CN
Inventors: 洪葵; 孟会影; 柴沆镇; 殷如; 邓子新
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2015-03-24
Filing date: 2015-03-24
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2035-03-24
Also published as: CN104673813B; US20180009855A1; WO2016150357A1; US10519203B2

Abstract

本发明公开了一种蛇孢假壳素类化合物母核合成基因AuOS及其应用，属于基因工程领域。该蛇孢假壳素类化合物母核合成基因AuOS来源于焦曲霉094102，其基因序列、cDNA序列和编码的AuOS蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。AuOS蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，该蛋白能以DMAPP、GPP、FPP和GGPP这4种化合物为底物与IPP反应生成蛇孢假壳素类化合物母核。本发明首次发现了焦曲霉094102的AuOS基因，其编码蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，能以DMAPP为底物从头合成蛇孢假壳素类化合物母核，可用于蛇孢假壳素类化合物的制备及其生物合成途径的研究。

Description

一种蛇孢假壳素类化合物母核合成基因AuOS及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种从焦曲霉094102（Aspergillus ustus 094102）中克隆得到的蛇孢假壳素（ophiobolin）类化合物母核合成基因AuOS及其应用。

背景技术

1957年Orsenigo从植物病原真菌Bipolaris oryzae中分离到第一个蛇孢假壳素类化合物，即蛇孢假壳素A（M. ORSENIGO. Estrazione e purificazione della cochliobolina, una tossina prodotta da Helmintosporium oryzae. Phytopath. Z. 1957, 29, 189–196），到目前为止已发现该类化合物30余种，其来源菌株均属于丝状真菌。

蛇孢假壳素（ophiobolin）类化合物属于二倍半萜烯化合物，其结构特征是均具有一个三轮列的C5-C8-C5环母核结构（图1）。到目前为止发表的具有C5-C8-C5环母核结构的蛇孢假壳素类化合物主要有蛇孢假壳素A、C、F、H、M、L（M. ORSENIGO. Estrazione e purificazione della cochliobolina, una tossina prodotta da Helmintosporium oryzae. Phytopath. Z. 1957, 29, 189–196）、蛇孢假壳素O、Q、R、S（CL Tipton，T Tovrea，G Whitehurst.The effect of ophiobolin A on glucose uptake by animal cells.Nutr.Rep.Int.1981,23:723-727）等。该类化合物显示广谱的抗菌活性（如抗真菌、抗细菌）和抗线虫、抗病毒等活性，此外还对多种肿瘤细胞株具有显著细胞毒活性。据报道，该家族的蛇孢假壳素O不仅能抑制乳腺癌细胞株MCF-7的增殖（Tingting Yang, Zhenyu Lu, Li Meng, et al. The novel agent ophiobolin O induces apoptosis and cell cycle arrest of MCF-7 cells through activation of MAPK signaling pathways. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2012, 22, 579–585），还能逆转乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR对阿霉素的耐药性（Wenxia Sun, Cuiting Lv, Tonghan Zhu, et al. Ophiobolin-O reverses adriamycin resistance via cell cycle arrest and apoptosis sensitization in adriamycin-resistant human breast carcinoma (MCF-7/ADR) cells. Marine Drugs. 2013, 11, 4570–4584）。

由于蛇孢假壳素类化合物广泛而重要的生物活性，提高该类化合物的产量以及阐明其合成机制的研究引起了关注。从1992年开始陆续有关于蛇孢假壳素类化合物及其母核化学合成的报道，但该类化合物的复杂结构使其化学合成的研究极具挑战性，到目前仅完成了蛇孢假壳素A的全合成（Kazuhiro Tsuna, Naoyoshi Noguchi, Masahisa Nakada. Enantioselective total synthesis of (+)-ophiobolin A. Chemistry-A European Journal. 2013, 19, 5476–5486; Ke Li, Cheng Wang, Gang Yin, et al. Construction of the basic skeleton of ophiobolin A and variecolin. Organic & Biomolecular Chemistry. 2013, 11, 7550–7558），而且合成步骤繁琐不易操作。

从蛇孢假壳素类化合物的生物合成机制入手，利用其生物合成相关基因的超表达或异源表达来提高该类化合物产量的相关研究显得更有价值。从1967年到1969年，Canonica（L. Canonica, A. Fiecchi, M. G. Kienle, et al. Tetrahedron Letters. 1967, 35, 3371-3376）和Nozoe（S. Nozoe, M. Morisaki, S. Okuda, et al. Tetrahedron Letters. 1968, 19, 2347-2349; S. Nozoe, M. Morisaki. Chemical Communications. 1969, 1319-1320.）等利用同位素标记初步确定蛇孢假壳素类化合物的三环母核来自香叶基法尼基焦磷酸（GFPP）的成环，但未涉及到蛇孢假壳素类化合物合成相关的基因或酶。直到2013年，Ryota等为了挖掘新代谢产物，用Aspergillus oryzae表达系统对来自棒曲霉NRRL 1（Aspergillus clavatus NRRL 1）的ACLA_76850基因进行异源表达，发现主体产物是蛇孢假壳素F（Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3), 594-597），证明了该GGPPS就是AcOS（A. clavatus NRRL 1 ophiobolin F合成酶）。这是蛇孢假壳素类化合物生物合成相关酶的首次报道。AcOS属于嵌合型萜类合成酶，其N端和C端分别包含萜类合成酶结构域和E-IPPS（反式异戊烯基焦磷酸合成酶）结构域。但其酶学方面研究并不深入，例如有关E-IPPS结构域的底物专一性的研究，即该结构域更倾向于识别并结合四种底物即二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）、香叶基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸（FPP）和香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）中的哪一种尚有待明确。

目前已知蛇孢假壳素类化合物的母核均包含三轮列的C5-C8-C5环，但母核包含的烯键数目和位置却不尽相同，如蛇孢假壳素E比蛇孢假壳素F多出C₁₀-C₁₄和C₁₂-C₁₃两个烯键，暗示其成环机制并非完全相同。因此有必要挖掘更多蛇孢假壳素类化合物母核合成相关蛋白，从系统研究角度深入探讨其成环机理。但目前仅有棒曲霉NRRL 1菌株中蛇孢假壳素F合成酶的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛇孢假壳素类化合物母核合成基因，本发明的目的还在于提供该基因的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种蛇孢假壳素类化合物母核合成基因，为焦曲霉094102（保藏编号为CCTCC NO：M 208153）中克隆得到的AuOS基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。所述的AuOS基因含有3个内含子，其cDNA大小为2178bp，序列如SEQ ID NO.2所示。所述的蛇孢假壳素类化合物包括具有一个三轮列的C5-C8-C5环母核结构特征的一系列蛇孢假壳素类化合物，如蛇孢假壳素K、6-表蛇孢假壳素K、蛇孢假壳素G、6-表蛇孢假壳素G、6-表蛇孢假壳素Q、蛇孢假壳素U、6-表蛇孢假壳素V和蛇孢假壳素W等。

所述的AuOS基因编码的蛋白，命名为AuOS蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。AuOS蛋白包含了两个结构域，即N端约324个氨基酸组成的萜类合成酶结构域和C端约401个氨基酸组成的E-IPPS（反式异戊烯基焦磷酸合成酶）结构域。其中，萜类合成酶结构域含有两个用于识别Mg²⁺和底物的特征性保守基序DDEID和NDLFSYEKE，E-IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征性保守基序DDIED和DDYQN。

本发明所述的AuOS蛋白可通过用各种表达系统（如大肠杆菌和链霉菌等所有原核表达系统，以及毕赤酵母、酿酒酵母和米曲霉等所有真核表达系统）对AuOS基因进行异源表达得到，同时AuOS蛋白可通过用各种纯化方法（如镍离子金属螯合亲合层析等）得到。

上述AuOS蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，AuOS蛋白能以DMAPP（二甲基烯丙基焦磷酸）、GPP（香叶基焦磷酸）、FPP（法尼基焦磷酸）和GGPP（香叶基香叶基焦磷酸）这4种化合物为底物，分别添加IPP时直接合成蛇孢假壳素类化合物的母核。

基于上述AuOS蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，AuOS基因不仅可以用于进一步解析蛇孢假壳素类化合物的生物合成途径，而且有助于蛇孢假壳素合成酶酶学领域的深入研究，同时AuOS蛋白可以催化底物制备蛇孢假壳素类化合物的母核，经过氧化还原等修饰手段得到蛇孢假壳素类化合物，在蛇孢假壳素类化合物的产量提高方面也有着重要的意义。

本发明首次发现了焦曲霉094102的AuOS基因，其编码的蛋白可以以DMAPP为底物从头合成蛇孢假壳素类化合物母核，可以以体外酶促反应形式或以基因工程菌形式合成蛇孢假壳素类化合物母核，该母核还可通过化学或生物的方式进行结构修饰而产生系列具有重要药用价值的化合物。

附图说明

图1是蛇孢假壳素（ophiobolin）类化合物母核的结构图。

图2是焦曲霉094102 AuOS基因编码的蛋白AuOS与棒曲霉NRRL 1 AcOS蛋白的氨基酸序列比对结果。

图3是AuOS基因异源表达蛋白的表达结果图，其中，1：pET28a诱导前，2：pET28a诱导后，3：pET28a-AuOS诱导前，4：pET28a-AuOS诱导后，M：Page Ruler Prestained Protein Ladder。

图4是AuOS基因异源表达蛋白的纯化结果图，M：Page Ruler Prestained Protein Ladder。

图5是以DMAPP、IPP为底物体外反应的色谱图。

图6是以DMAPP、IPP为底物体外反应的质谱图。

图7是以FPP、IPP为底物体外反应的色谱图。

图8是以FPP、IPP为底物体外反应的质谱图。

图9是以GPP、IPP为底物体外反应的色谱图。

图10是以GPP、IPP为底物体外反应的质谱图。

图11是以GGPP、IPP为底物体外反应的色谱图。

图12是以GGPP、IPP为底物体外反应的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，下述实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

本发明所提供的蛇孢假壳素类化合物母核合成基因，是从焦曲霉094102（Aspergillus ustus 094102）中克隆得到，命名为AuOS基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。AuOS基因含有3个内含子，其cDNA大小为2178bp，序列如SEQ ID NO.2所示。AuOS基因编码的蛋白，命名为AuOS蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

从公共数据库上搜索焦曲霉094102 AuOS蛋白的同源序列进行比对，结果显示目标蛋白AuOS与来自棒曲霉NRRL 1（Aspergillus clavatus NRRL 1）的AcOS（A. clavatus NRRL 1 ophiobolin F合成酶）（Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3), 594-597）同源性较高（65%）。AuOS蛋白属于嵌合型萜类合成酶，其N端和C端分别包含约324个氨基酸组成的萜类合成酶结构域和401个氨基酸组成的E-IPPS（反式异戊烯基焦磷酸合成酶）结构域，这两个保守结构域与其蛋白功能密切相关。其中，萜类合成酶结构域含有两个用来识别Mg²⁺和底物的特征性保守基序DDEID和NDLFSYEKE、E-IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征性保守基序DDIED和DDYQN（图2）。

实施例1 AuOS基因克隆

1、焦曲霉094102菌株的RNA提取

以焦曲霉菌株094102的菌丝为材料，用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit（50）试剂盒（货号为74104）提取总RNA，具体操作如下：

（1）估算菌丝样品的用量。每次微量提取一般需要50 mg菌丝。

（2）用液氮将样品研磨成粉末，转移至1.5 mL塑料离心管中。

（3）在离心管中加入450 μL Buffer RLT（Lysis buffer）（Buffer RLT使用前每1 mL加10 μL β-巯基乙醇），在振荡器上振荡1-3 min混匀（振荡器振荡时必须使管底溶液振荡起来）。

（4）4 ℃ 13000×g离心2 min，将上清液转移至另一干净的1.5 mL塑料离心管中（下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取）。

（5）加入0.5倍体积无水乙醇，充分颠倒混匀，制得混合溶液。

（6）将上述混合溶液转移到离心吸附柱中，4 ℃ 8000×g离心15 s，弃穿透液。

（7）将700 μL Buffer RW1（wash buffer）加入到离心吸附柱中，4 ℃ 8000×g离心15 s，弃穿透液。

（8）将离心吸附柱转移到新的收集管（无RNA酶）中，加入500 μL Buffer RPE（wash buffer），4 ℃ 8000×g离心15 s，弃穿透液。

（9）加入500 μL Buffer RPE（wash buffer）（Buffer RPE使用前加4倍体积无水乙醇），4 ℃ 13000×g离心2 min。

（10）将离心吸附柱转移到新的收集管（无RNA酶）中，4 ℃ 13000×g离心1 min。

（11）将离心吸附柱转移到新的1.5 mL塑料离心管（无RNA酶）中，加入30-50 μL RNase-free water，4 ℃ 8000×g离心1 min，离心管中的溶液即为去除DNA污染的RNA样品。

（12）取40 μLRNA样品转移到新的1.5 mL塑料离心管（无RNA酶）中，加DNase I和DNase I buffer各5 μL，37 ℃处理2 h。

（13）加入5 μL 50 mM EDTA，65 ℃处理10 min后-80 ℃保存。

2、反转录

采用美国赛默飞世尔科技公司的Revert Aid First strand cDNA synthesis kit（货号为K1621）进行反转录，操作步骤如下：

（1）取上述制备的RNA样品2 μg，加入 1μL 10μM Oligo(dT)₁₈，RNase-free water补足至12 μL，65 ℃处理5 min后置冰上冷却5 min，4 ℃ 13000×g离心2 min。

（2）加入4 μL 5×Reaction buffer，1 μL Ribo Lock RNase Inhibitor，1 μL RevertAid RT，2 μL 10 mM dNTP Mix，RNase-free water补足至20 μL。42 ℃处理60 min后70 ℃处理5 min。

3、AuOS基因的扩增

根据焦曲霉094102菌株的基因组测序结果，设计扩增AuOS基因的引物：

正向引物AuOS-F：5’-CATATGATGGAGTATAAGTACTCGACC-3’（为了便于其表达载体的构建，引入酶切位点NdeⅠ）；

反向引物AuOS-R：5’-AAGCTT TCAAACCTTCAGCAGCTCCA-3’（为了便于其表达载体的构建，引入酶切位点HindⅢ）。

反应体系为：1 μL美国New England Biolabs公司的Pfu高保真DNA聚合酶，21 μL灭菌去离子水，1 μL Pfu高保真DNA聚合酶自带的5×NF buffer，正向、反向引物各2.5 μL（10 μM），cDNA模板2 μL。

PCR扩增条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s；53 ℃退火20 s，72 ℃延伸70 s，35个循环；72 ℃充分延伸10 min。

4、目的DNA回收

PCR产物电泳后，按照德国OMEGA公司的Gel Extraction Kit （100）（货号： D2500-01）的说明书，从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段。具体操作步骤如下：

（1）使用三羟甲基氨基甲烷-乙酸（简称为TAE）缓冲液制作1.0%的琼脂糖凝胶，对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

（2）在紫外灯下切下含有目的DNA片段的凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体（此时应尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率）。

（3）切碎胶块（胶块切碎后可以加快胶块融化时间，提高DNA回收率）。

（4）称量胶块重量，计算胶块体积。按每100 mg琼脂糖凝胶400 μL的比例加入Binding buffer，50-60 ℃处理约10 min（每隔2 min混匀一次，直至胶块完全融化）。

（5）将融化的胶溶液转移到收集管的吸附柱内，室温10000×g离心1 min，弃滤液。

（6）加入500 μL XP2（Binding buffer）至吸附柱中，室温10000×g离心1 min，倒掉收集管中的滤液，将吸附柱放回到收集管中。

（7）加入700 μL SPW（Wash buffer）至吸附柱中，室温10000×g离1 min，倒掉收集管中的滤液，将吸附柱放回到收集管中。

（8）加入300 μL SPW（Wash buffer）至吸附柱中，室温10000×g离心1 min，倒掉收集管中的滤液，将吸附柱放回到收集管中。

（9）室温10000×g开盖离心2 min。

（10）将吸附柱放入另一干净的1.5 mL塑料离心管中，在吸附柱模的中央处加入30-50 μL Elution buffer或无菌水，室温放置2-5 min后室温10000×g离心1 min。

（11）回收产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检验。

5、目的DNA的克隆

回收的目的DNA于16 ℃与pEASY-Blunt载体连接2-4 h，连接产物转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，过夜培养后采用快速检验的方法初步筛选阳性克隆子，方法如下：

（1）用无菌牙签在转化平板上挑取约20个单克隆子，在含有氨苄抗性（100 μg/mL）的LA平板上划线，于37 ℃培养8 h。

（2）在1.5 mL塑料离心管中加入30 μL STE溶液（20 mM Tris-HCl，25 mM EDTA，75 mM NaCl），用牙签将扩大培养后的单克隆子分别挑取到上述塑料离心管中涡旋处理约2min，使其充分混匀。

（3）加入等体积氯仿:酚:异戊醇（v:v:v = 24:25:1），轻摇混匀后，室温10000×g离心5min。

（4）上清液用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，初步确定克隆子含有的质粒是否插入外源片段。

用武汉麦克莱博生物科技有限公司的质粒小量提取试剂盒对含有外源片段的克隆子进行质粒抽提，具体操作如下：

（1）将单克隆子接入含氨苄抗性（100 μg/mL）的5 mL LB培养基中，于37 ℃条件下，220 r/min过夜培养后转移2 mL菌液至2 mL塑料离心管中，于室温12000×g离心1 min，弃上清。

（2）加入250 μL Buffer 1，于漩涡振荡器上剧烈震荡，使菌体充分重悬。

（3）加入250 μL Buffer 2，温和颠倒离心管5-6次，直到体系变清亮为止。

（4）加入350 μL Buffer 3，温和颠倒离心管3-5次以充分混匀。

（5）室温12000×g离心10 min，将上清液小心转入收集管的吸附柱中，室温12000×g离心1 min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管。

（6）加入500 μL Buffer D，室温12000×g离心1 min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管。

（7）加入600 μL Buffer W，室温12000×g离心1 min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管。

（8）再次加入300 μL Buffer W，室温12000×g离心1 min。

（9）将吸附柱转移到另一干净1.5 mL塑料离心管中，在吸附膜的中央处悬空加入50-100 μL Buffer E后室温静置1 min，室温12000×g离心1 min洗脱克隆子的质粒。

将获得的质粒用美国New England Biolabs公司的高保真限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ双酶切（2 μL Cutsmart buffer，0. 5 μL NdeⅠ，0.5 μL HindⅢ，1 μL质粒DNA，16 μL ddH₂O，37 ℃处理1 h）后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，确定克隆子携带的外源DNA片段是否是目的DNA片段。取1 mL含有目的DNA片段的克隆子菌液送交擎科测序公司测序，测序结果证实该克隆子的确含有目的DNA片段，且目的DNA片段没有出现突变。将该阳性克隆子的重组质粒命名为pEASY -Blunt-AuOS。

实施例2 AuOS蛋白的表达和纯化

1、含AuOS基因大肠杆菌表达载体的构建

构建含AuOS基因的大肠杆菌表达载体，经热激转化法转入大肠杆菌BL21（DE3），进一步验证AuOS基因的功能。

用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ从含有目的基因的重组质粒pEASY -Blunt-AuOS中切下目的片段，同时用NdeⅠ和HindⅢ双酶切pET28a载体，琼脂糖凝胶电泳分离后，用OMEGA胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和pET28a载体的大片段。利用T4 DNA连接酶将AuOS基因正向插入到pET28a载体中，将连接产物转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，经克隆子快速检验和质粒酶切验证鉴定后，获得大肠杆菌重组表达载体pET28a-AuOS。

2、AuOS基因的表达

将重组质粒pET28a-AuOS及pET28a质粒通过热激转化法分别转入表达宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）中，用武汉麦克莱博生物科技有限公司的质粒小量提取试剂盒对转化子进行质粒抽提，经限制性内切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ 酶切验证鉴定，成功获得分别含重组质粒pET28a-AuOS及pET28a质粒的大肠杆菌表达菌株。

分别挑取含重组质粒pET28a-AuOS及pET28a质粒的大肠杆菌BL21（DE3）单菌落接种至含卡那霉素抗性（50 μg/mL）的5 mL LB培养基，于37 ℃，220 r/min过夜培养。按1%的接种量将新鲜菌液接种至含卡那霉素抗性（50 μg/mL）的5 mL LB培养基中，继续培养2-3 h至OD₆₀₀达到0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mM，于37 ℃下诱导培养约3-5 h （诱导前分别取出1 mL菌液作为对照）。分别取出诱导前和诱导后的菌液200 μL，加入5×SDS-PAGE样品缓冲液煮沸30 min，室温12000×g离心10 min，各取10 μL上清液进行SDS-PAGE检测，结果（图3）表明目的蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达。

3、AuOS蛋白的纯化

取5 mL过夜培养的含重组质粒pET28a-AuOS的大肠杆菌BL21（DE3）菌液按1%的接种量接种至含卡那霉素抗性（50 μg/mL）的500 mL LB培养基中，于37 ℃条件下，220 r/min培养至OD₆₀₀达到0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mM，于37 ℃下诱导培养约3-5 h。然后室温5000 r/min离心5 min收集诱导表达后的大肠杆菌菌体，用无菌ddH₂O悬浮菌体，室温5000 r/min离心5 min后去除上清（重复两次，彻底清洗细胞）。之后用HEPES缓冲液悬浮菌体，室温5000 r/min离心后去除上清。将10 mL HEPES缓冲液加入菌体细胞中，充分混匀后将细胞悬液置冰水浴中超声（参数：超声5 mS，间歇5 mS，功率300 W）处理30 min。然后室温23000 rpm离心20 min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤后进行蛋白纯化。纯化方法如下：

（1）取适量镍珠基质上柱，使基质里的无水乙醇在重力作用下充分流出。

（2）用20 mL无菌ddH₂O冲洗柱子。

（3）用20 mL HEPES缓冲液平衡柱子。

（4）将含有目标蛋白的上清液加入柱子中，收集流穿液，进行SDS-PAGE检测。

（5）分别以含2 mM、5 mM、25 mM、50 mM、100 mM、200 mM、300 mM和500mM咪唑的洗脱液（用HEPES缓冲液稀释的咪唑溶液）进行洗脱，收集流出液，进行SDS-PAGE检测。

SDS-PAGE检测结果显示用含50 mM和100 mM咪唑的洗脱液进行洗脱时，获得较纯的蛋白（图4）。用10kDa的超滤浓缩管浓缩该较纯的蛋白溶液至2.5 mL后，用GE Healthcare的PD-10脱盐柱（货号为17-0851-01）对浓缩后的蛋白溶液进行脱盐处理，具体操作如下：

（1）用10 mL平衡缓冲液平衡柱子，弃废液，重复4次。

（2）加入2.5 mL蛋白液至完全浸入柱子，弃废液。

（3）加入3.5mL洗脱液并收集流出液（该流出液即为完成脱盐处理的蛋白溶液）-80℃保藏备用。

实施例3 AuOS蛋白的功能分析

为了确定AuOS蛋白的功能，以美国Sigma-Aldrich公司的DMAPP（二甲基烯丙基焦磷酸）、GPP（香叶基焦磷酸），FPP（法尼基焦磷酸）和GGPP（香叶基香叶基焦磷酸）为底物，分别添加IPP（异戊烯焦磷酸）来设计体外反应。反应体系（50 μL）：220 μM DMAPP（或GPP、FPP、GGPP），340 μM IPP，0.1 M Tris-HCl（pH 7.4）、2 mM DTT（二硫苏糖醇）、5 mM MgCl₂和9.4 μM AuOS，30 ℃反应3 h。反应结束后，用等体积乙酸乙酯萃取3次，用氮吹仪将有机溶剂吹干，50 μL乙酸乙酯溶解后进行GC-MS（气相色谱-质谱）检测。检测结果如下：

（1）以DMAPP和IPP为底物按照上述反应体系进行体外反应，反应产物用上述方法处理后进行GC-MS检测，检测结果：通过分析色谱图，在T=16.986 min时检测到蛇孢假壳素类化合物母核的吸收峰，通过分析质谱图，得到蛇孢假壳素类化合物母核的特征质荷比（Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3), 594-597）（如m/z=55、69、81、95、121、135、147、229、247、325、358等），色谱图如图5所示，质谱图如图6所示。

（2）以FPP和IPP为底物按照上述反应体系进行体外反应，反应产物用上述方法处理后进行GC-MS检测，检测结果：通过分析色谱图，在T=16.974 min时检测到蛇孢假壳素类化合物母核的吸收峰，通过分析质谱图，得到蛇孢假壳素类化合物母核的特征质荷比（Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3), 594-597）（如m/z=55、69、81、95、121、135、147、229、247、325、358等），色谱图如图7所示，质谱图如图8所示。

（3）以GPP和IPP为底物按照上述反应体系进行体外反应，反应产物用上述方法处理后进行GC-MS检测，检测结果：通过分析色谱图，在T=16.983 min时检测到蛇孢假壳素类化合物母核的吸收峰，通过分析质谱图，得到蛇孢假壳素类化合物母核的特征质荷比（Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3), 594-597）（如m/z=55、69、81、95、121、135、147、229、247、325、358等），色谱图如图9所示，质谱图如图10所示。

（4）以GGPP和IPP为底物按照上述反应体系进行体外反应，反应产物用上述方法处理后进行GC-MS检测，检测结果：通过分析色谱图，在T=16.978 min时检测到蛇孢假壳素类化合物母核的吸收峰，通过分析质谱图，得到蛇孢假壳素类化合物母核的特征质荷比（Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Aspergillus clavatus. Organic Letters. 2013, 15 (3), 594-597）（如m/z=55、69、81、95、121、135、147、229、247、325、358等），色谱图如图11所示，质谱图如图12所示。

以上结果表明AuOS蛋白能用DMAPP、GPP、FPP和GGPP这4种化合物为底物，分别添加IPP时合成蛇孢假壳素类化合物的母核。由此可知AuOS蛋白同时具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，能够以DMAPP从头合成C5-C8-C5骈环母核结构。

Claims

1.一种蛇孢假壳素类化合物母核合成基因，其特征在于：为焦曲霉094102的AuOS基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的蛇孢假壳素类化合物母核合成基因，其特征在于：所述的AuOS基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1或2所述的蛇孢假壳素类化合物母核合成基因编码的AuOS蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种表达权利要求3所述的AuOS蛋白的载体，其特征在于：为含有权利要求1或2所述基因的真核或原核表达载体。

5.一种表达权利要求3所述的AuOS蛋白的宿主细胞，其特征在于：含有权利要求4所述的载体。

6.权利要求1或2所述的基因或权利要求3所述的蛋白在制备蛇孢假壳素类化合物中的应用。

7.权利要求1或2所述的基因或权利要求3所述的蛋白在研究蛇孢假壳素类化合物的生物合成途径中的应用。